Krooninen sairaus

tiivistelmä

kehittäminen riippumattoman verenkierron kasvain on tärkeää säilyttää kasvu ylittää tietyn rajoitettu koko ja tarjota portaali metastaattinen levittämiseen. Isännästä peräisin endoteelisolujen (EC) asuvat ja vaarantamatta kasvaimen verisuoniston peräisin kautta erillistä prosessia kutsutaan itävät angiogeneesin ja vaskulogeneesin. Viime aikoina hankittua peräisin suoraan itse kasvainsoluihin on kuvattu, vaikka pohjana tämän ilmiön edelleen huonosti. Ohessa kuvataan

in vitro

olosuhteet, että keuhkosyövän ja munasarjasyövän solujen läpikäymään nopean ja tehokkaan siirtymisen hankittua jotka voi erottaa saadaan

in vivo

. Erilaisia ​​menetelmiä käytettiin osoittamaan, että hankitun fenotyypit ja käyttäytymistä näiden kasvainperäinen EC (TDECs) muistuttavat läheisesti aitoja hankittua. Ksenografteissa johtuvat co-ympätty

in vitro

-johdannainen TDECs ja kasvainsolut olivat myös erittäin vascularized kuin kontrolli kasvaimet; Lisäksi niiden verisuonet olivat keskimäärin suurempia ja usein sisälsivät seoksia isännästä peräisin hankittua ja TDECs johdettu alkuperäisestä inokulaatin. Nämä tulokset osoittavat, että syöpäsolut voidaan manipuloida tarkkaan määritellyin

in vitro

olosuhteissa aloittaa kasvain solu-EY siirtyminen, joka on pitkälti solu-autonominen, erittäin tehokas ja tiiviisti jäljittelee

in vivo

prosessi. Nämä tutkimukset tarjoavat sopivan keinoja, joilla voidaan tunnistaa ja mahdollisesti tehdä aikaisintaan vaiheet TDEC sukupolven.

Citation: Elster JD, McGuire TF, Lu J, Prochownik EV (2013) Rapid

In vitro

johtaminen endoteelin Suoraan ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (10): e77675. doi: 10,1371 /journal.pone.0077675

Editor: Ken Arai, Massachusetts General Hospital /Harvard Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 28, 2013; Hyväksytty: 11 syyskuu 2013; Julkaistu: 09 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Elster et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NIH avustus RO1 CA140624 EVP ja jonka St. Baldrick n tohtorintutkinnon apurahan palkinnon J.D.E. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

pitämässään alkuvaiheista, alkavaa kasvain täyttää metabolisen tarvitsee yksinkertaisen diffuusion ravinteiden ja kuona [1-3]. Päästyään tietty kriittinen massa, mutta diffuusio ei enää riitä tähän tarkoitukseen ja kasvun vuoksi on tarpeen kehittää riippumattoman verisuoniston [3,4]. Ilman tätä, kasvain lepotilamuotoja ensues ja voi kestää vuosia, jona aikana lisää kasvainsoluproliferaation tasapainottavat apoptoottisen tai nekroottisen kuoleman [5,6]. Induktion ”angiogeenisten kytkin”, jolloin verisuonten tarjonta ei enää ole nopeutta rajoittava, on nyt tunnustettu kriittinen tekijä kasvaimen myöhemmän kasvun, kommunikoi verenkiertoon, ja sen metastasoitunut levittämistä [3,4]. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, verisuonten tiheys on hyvin tunnustettu ennustetekijä monenlaisia ​​syövän kuten rintasyövän, neuroblastooma, ja astrosytooma /glioblastooma [7-10].

angiogeenisten kytkin on monimutkainen prosessi, johon liittyy laatimiseen, jonka suonettoman kasvain sytokiinien ja kasvutekijöiden, kuten verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF), fibroblastikasvutekijä (bFGF), verihiutaleperäinen kasvutekijä (PDGF) , transformoiva kasvutekijä beeta (TGF-β), ja erilaisia ​​angiopoietins [1,11-13]. Jotkut näistä ovat kemoterapian houkutusaineille mobilisoida sekä kypsät ja kantaisä endoteelisolujen (EC) luuytimestä ja ajaa niiden kypsymistä ja organisaatiosta verisuoniin ( ”vaskulo-”), kun taas toiset aiheuttaa endoteelin viereisten verisuonten lisääntyä ja tunkeutua kasvain ( ”itäminen angiogeneesi”) [14-16].

Ylimääräiset kasvaimen alkuperän uudissuoniston merkitsee, että sen komponentti solut ovat sekä geneettisesti normaali ja vakaa ja siten pitkälti immuuni kehittämään kemoterapeuttisia vastus että yleisesti syntyy sisällä genomisesti epävakaa tuumorisolupopulaatioon. Todellakin, anti-angiogeneesiä hoitoja ovat osittain siihen olettamukseen, että kasvaimen verisuonistossa säilyttää genomisen vakautta sen esiaste solupopulaation [17,18]. Bevasitsumabi, ensimmäinen kliinisesti käyttökelpoisia angiogeneesi-inhibiittori, on humanisoitu anti-VEGF monoklonaalinen vasta-aine (mAb), joka osoitti alussa lupauksen hoidettaessa erilaisia ​​kehittyneitä syöpiä [19-22]. Kuitenkin lähes kaikki vastaukset ovat epätäydellisiä ja /tai ohimenevää kuten kasvaimia lopulta uudelleen suonittuvat ja jumiutua jatkokäsittelyyn kanssa mAb. Tämän seurauksena yleinen elossaololuku on parannettu vain vähän, jos ollenkaan [19-23].

Viime aikoina olemme ja muut ovat antaneet sille mahdollinen selitys epätäydellisiä vastauksia Antiangiogeneesiaineita osoittamalla, että merkittävä osa-populaatio kasvaimeen liittyvien hankittua perustuvat suoraan itse kasvainsoluihin [24-28]. Nämä ”kasvainperäinen hankittua” (TDECs) ilmentävät erilaisia ​​EY markkereita, alas-säädellä epiteelin markkereita ja muodostavat toiminnallisen alukset

in vivo

missä ne sekoittaa extra-tumorally johdettu hankittua. Koska ne sisältävät samoja Marker-kromosomi kuin tuumorisolupopulaatioon, ehdotettiin, että, kuten itse kasvainsoluihin, TDECs olivat genomisesti epävakaa [24-28]. Tämän mukaisesti idea, sarjareittien TDECs johtaa lopulta syntymistä kloonaamalla johdettujen populaatioiden ilmaista asteittain vankempi EY fenotyypit ja ovat geneettisesti liittyvät mutta eroaa sekä tuumorisoluissa ja varhaisen passage TDECs [24]. TDEC n on todettu hiirimallissa glioblastoma [27] ja ihmisen glioblastooma ksenografteissa [26,28]. Aikaisemmat mutta tuloksettomia tutkimukset ehdotti myös läsnäolon TDECs muissa ensisijainen ihmisen kasvaimissa [29-31]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että TDEC sukupolvi on laajalle levinnyt, jos ei ole yleistä, ilmiö, ja että vastus antiangiogeeninen hoitoja voi syntyä seurauksena luontainen TDEC genomin epästabiilisuuden.

Havainto, että TDECs muodostavat toiminnallisesti merkittävä ja erillinen EY väestön herättää monia kysymyksiä, joita on vaikea tai mahdoton käsitellä tutkimalla ensisijainen kasvaimia tai tuumoriksenograftien. Näitä ovat luonne ja suhteellinen merkitys signaaleja, jotka aloittavat kasvain solun TDEC siirtyminen, aikaväli, jonka aikana tämä tapahtuu riippumatta siitä, onko TDEC kehittämiseen ja ylläpitoon ovat solun itsenäisiä ja onko kaikki solujen kasvain pystyvät tuottamaan TDECs. Kuvaamme tässä kehittämään

in vitro

järjestelmä, jonka avulla voimme käsitellä näitä kysymyksiä. Käyttäen olosuhteita, jotka suosivat kasvua hankittua ja matkivat hypoksinen ja ravinteiden vailla kasvain microenvironment, osoitamme, että vankka EY fenotyyppi voidaan helposti syntyvät kasvainsoluista ja että optimaalinen induktio vaatii synergistinen yhteistyötä näistä tekijöistä. Ominaisuudet

vuonna vitro-

peräisin TDECs ovat lähes mahdoton erottaa nämä eristetty suoraan kasvaimia. Lisäksi niiden co-istuttamisen kasvainsolujen johtaa kehittäminen ksenograftien kanssa tiheämpi kasvaimen verisuonistoon ja, joissakin tapauksissa, nopeampi kasvuvauhti. Nämä tutkimukset siten tarjota yksinkertainen ja kvantitatiivinen keinoja, joilla TDEC ontogeny voidaan tutkia ja manipuloida lähtien määrätyissä olosuhteissa.

Tulokset

ilmentäminen EY merkkiaineiden ihmisen kasvainsoluissa määritellyin

in vitro

olosuhteissa

aluksi pyrittiin määrittämään olosuhteet, jotka edistävät tuumorisolun TDEC siirtyminen

in vitro

. Näissä tutkimuksissa, käytimme ihmisen H460 ja CaLu1 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, PC3 eturauhassyöpä ja OVCAR3 munasarjasyövän solulinjoissa. Valitessaan viljelyolosuhteet, me arveltu, että yhdistelmä EY-erityisiä kasvualustasta ja kohtalainen hypoksia, ehkä yhdistettynä ehtyminen tiettyjen ravintoaineiden, voisi kerrata

in vivo

ympäristössä, joka antaa signaalin (t) TDEC aloittamista. Kasvainsolut olivat siten viljeltiin joko EY-specific EGM-2 väliaine + normoksia (ehto 1), vakio kasvualusta + hypoksian (ehto 2) tai näiden yhdistelmä EGM-2 väliaine + hypoksian (ehto 3). Sillä OVCAR3 soluja, myös käytetty Glutama- jota on täydennetty EY tekijät identtisiä EGM2 väliaineessa mutta vailla asparagiinia, asparagiinihappoa, glutamiini ja proliini + hypoksia (ehto 4) tai samalla alustalla + normoksia (ehto 5). Viittaamme nämä olosuhteet yhdessä ”EY-edistää”. Kasvainsoluja ylläpidetään niiden vakio suositeltu kasvualustaan ​​alle happiolosuhteissa toimi lähtökohtana valvontaa. Solulysaatit valmistettiin näistä näytteistä ja analysoitiin immunoblottauksella ekspressiota varten von Willebrandin tekijä (vWF), joka on luotettavasti indusoi aikana tuumorisolun TDEC siirtymistä

in vivo

[24,25]. Kuten kuviossa S1, useimmat kasvainsolulinjojen kasvatettu vakio-olosuhteissa osoitti vähän tai ei lainkaan ekspressiota vWF. Sitä vastoin vWF aiheutettiin vaihtelevasti eri EY-edistävät olosuhteet, joilla on korkein ja eniten jatkuvia tasoilla yleensä nähdään ehdolla 3. Vaikka aikaa saavuttaa maksimaalinen induktio vaihteli välillä testattujen linjojen ja toisinaan ohimenevä, se oli yleensä maksimaalinen välillä d 3-5 ja ei tämän jälkeen lisätä.

Todettuaan edellytykset, joilla saavutetaan maksimaalinen vWF ilmentymistä kussakin solulinjassa, laajensimme alkuperäisen analysoi siihen sisältyvät EY-markkereita käyttäen immunoblottaus fluoresenssiin perustuvissa määrityksissä, kuten aiemmin on kuvattu [24,25]. Näitä tutkimuksia varten olemme keskittyneet H460 ja OVCAR3 soluja viljeltiin 5 d olosuhteissa 3 ja 4, vastaavasti. EY-spesifisten proteiinien analysoidaan jälleen mukana vWF sekä VEGFR1, VEGFR2 VE-kadheriinin ja EY-selektiivinen adheesiomolekyyli (ESAM). Lisäksi sitoutuminen

Ulex europeus

lektiini (E-lektiini), otto asetyloitua LDL-(AcLDL), ja morfologia seurattiin indikaattoreina monimutkaisempia EY fenotyyppejä. Sytokeratiineja 7 (CK7) ja 19 (CK19) tutkittiin markkereina epiteelin fenotyyppi. Kuten kuviossa 1, kaikki EY markkereita indusoitiin molemmissa solulinjoissa, kun taas sekä sytokeratiineja olivat merkittävästi alassäädetty. Nämä muutokset liittyvät sekä solujen prosenttiosuus, jotka värjättiin markkereita sekä intensiteetti positiivinen solu värjäystä. Siten ilmaus kuviot kaikkien merkkiaineiden tarkasti jäljitteli niitä nähnyt TDECs perustuvat todellisiin tuumoriksenografteja [24,25].

(

) H460 soluja kasvatettiin 5 d ehdolla 3 . (

B

) OVCAR3 soluja kasvatettiin 5 d ehdolla 4. Vasta värjäytymistä EY-spesifisten vWF, VEGFR1, VEGFR2 VE-cadhherin, ESAM sitominen E-lektiinin ja käyttöönottoa asetyloitua AcLDL suoritettiin molempien solujen kuten aiemmin on kuvattu [24,25]. Epiteelin merkki värjäys suoritettiin CK7 ja CK19. Counterstaining DAPI suoritettiin visualisoida ytimiä. Kirkas kuvia kasvainsolujen ja TDECs ovat myös mukana. Kuvat saatiin joko 40-60X suurennos (konfokaali) tai 10-kertainen suurennus (Kirkas). Numeroita oikeassa yläkulmassa kunkin paneelin osoittavat prosenttiosuus kunkin populaation, jotka osoittivat todisteita värjäys, riippumatta sen voimakkuuden. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Asteikko bar = 25 um.

toiminnallinen analyysi

in vitro

-johdannainen TDECs

Jos haluat vertailla edelleen EY fenotyypit

in vitro-

johdettu TDECs kanssa todellisista tuumoriksenografteja, tutkimme ensin solut niiden kyky muodostaa putkimaisia ​​rakenteita puolikiinteässä alustassa. Näitä tutkimuksia varten H460 soluja viljeltiin tavanomaisissa kasvuolosuhteissa (kontrolli) tai olosuhteissa 1-3 5 d jolloin ne maljattiin puolikiinteää keskipitkän ja viljeltiin normoksia vielä 5 päivää. Sekä vakio- ja EY-edistävät olosuhteet 1 tai 2, H460 soluja jatkunut kuin yksittäiset solut tai muodostettu amorfinen acini taas viljelemällä kunto 3 huomattavasti lisätä putken muodostumiseen (kuvio 2A). Kvantifiointi Tämän osoittivat putken muodostusta H460 solut nostetaan 10- 50-kertaiseksi, joka nähdään olosuhteissa 1 tai 2 ja lähes 25-kertaiseksi, että vakioedellytyksiin (kuvio 2B). Vaikka määrä putkia muodostuu ja niiden laatu oli huonompi kuin peräisin ihmisen napalaskimon EC (HUVEC) (kuvio 2C), ne olivat erotettavissa putkista muodostettu

in vivo

-johdannainen TDECs [24,25 ]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että H460-johdettu TDECs voisivat muodostaa putkien normoxic olosuhteet, joissa putki-muodostumisen määritys suoritettiin ja ehdotti, että TDEC fenotyyppi voi olla vakaa. Tämän testaamiseksi H460 soluja, ensimmäinen altistuvat kunto 3, maljattiin suoraan puoliksi myyty väliaineessa, kuten on kuvattu kuviossa 2A tai pidettiin standardi- olosuhteissa vielä 7 vrk ennen plating vuonna putkeen muodostumista määrityksessä. Yllättäen tämän jälkimmäisen hoito, putkenmuotoilu- kyky TDECs ei ainoastaan ​​yllä vaan tuloksena putket muistuttaa enemmän ne muodostetaan HUVEC (kuvio 2C). Siten, vaikka TDEC putken muodostava potentiaalia on osoitettu vaatia hypoksia, sitä säilytetään vähintään 2 viikkoa jälkeen paluu tavanomaisissa kasvuolosuhteissa.

(

) H460 kasvaimen solut indusoitiin muodostaa TDECs 5 d altistumisen ilmoitettu olosuhteissa. 2 x 10

4 solut kustakin ryhmästä sitten maljattiin Matrigel on putken muodostumiseen määrityksen mukaisesti happiolosuhteissa 5 d, kuten aiemmin on kuvattu [24,25]. Käsittelemättömät H460 soluja kasvatettiin vakio-olosuhteissa toimivat vertailuryhmänä. Tyypillisiä valomikroskooppisella kentät näytetään. Kaikki kuvat näkyvät samat suurennoksilla. (

B

) Tulokset esitetään (

) on graafisesti kuvattu keskimääräinen lukumäärä täysin suljettu putkia per kenttä ± SEM. p-arvot saatiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA (**: p 0,01). (

C

) H460 kasvainsolut kasvatettiin standardeissa olosuhteissa tai tila 3 osoitetut ajat. Puolet solut sitten välittömästi maljattiin Matrigel ja kasvatettu happiolosuhteissa vielä 6 d. Loput solut palautettiin vakio-olosuhteet, 7 d ennen kuin se maljattiin Matrigel 6 d arvioida pysyvyys putken muodostavan potentiaalia. HUVEC käytettiin positiivisena kontrollina putken muodostumiseen. Brightfield valokuvat otettiin 10-kertainen suurennus. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin neljä itsenäistä kokeissa (A) ja kaksi erillistä koetta (C). Asteikko bar = 100 um.

biosenser perustuva määritys seurata

in vitro

TDEC induktion

Vahvista ja paremmin mitata

in vitro

kasvain cellTDEC siirrosta, syntyy erillisiä populaatioita H460 ja OVCAR3 solut ilmensivät stabiilisti tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin (EGFP) valvonnassa EY-erityinen angiopoietiiniterapia reseptorin (Tie2) promoottori [32]. Tavanomaisissa kasvuolosuhteissa, nämä solut ekspressoivat vähän EGFP, jopa silloin, kun arvioidaan virtaussytometrialla (kuvio 3). Sen jälkeen TDEC induktio olosuhteessa 3 H460-solujen ja edellytys 4 OVCAR3 soluja, 3-5-kertainen nousu EGFP signaalin rutiininomaisesti havaittu (kuva 3). Siten Tie2-EGFP induktio toimii yksinkertainen, toistettavissa ja mitattavissa korvike määritys TDEC erilaistumiseen, että elävät solut, tarkasti heijastaa saadut tulokset enemmän vakio määrityksistä EY fenotyypin. Se tarjoaa myös suoraa näyttöä varten transkription säätely ylöspäin ainakin joidenkin merkkien aikana TDEC erilaistumisen ja auttaa perustelemaan niiden koordinoida ylössäätöä yli 4-5 päivää aikataulun (Kuva S2).

Erilliset viljelmiä H460- ja OVCAR3 kasvainsolut olivat stabiilisti ko-transfektoitiin Tie2-EGFP-plasmidi ja pFR400 koodaa mutantti muoto dihydrofolaattireduktaasin [36,37], ja valitaan G-418 ja kasvavia konsentraatioita metotreksaattia mahdollistavat monistaminen kahden peräkkäin integroidun vektorit ja vastaava lisäys EGFP signaalin intensiteettiä. Solut altistettiin esitettyjen edellytysten aikaisemmin indusoivan maksimaalisen TDEC fenotyyppiä (so ehto 3 H460: n ja kunto 4 OVCAR3) ja sitä verrataan kontrolliarvoihin soluja kasvatettiin standardeissa olosuhteissa. (

) Fluoresenssi micrographs kunkin solulinjan viiden päivän kasvun kunkin joukon ehtoja. (

B

) virtaussytometrinen analyysi samojen solujen. Edustavia tuloksia vähintään kolmen itsenäisen kokeen on kuvattu. Asteikko bar = 25 um.

Edellä olevat tulokset, sekä ne kuviossa 2, osoittavat, että suurin osa kasvainsolujen näyttää riittävän plastisuus mahdollistaa niiden

in vitro

siirtyminen TDECs. Testata tätä suoraan, tutkimme 80 yksisoluklooneista peräisin H460- ja OVCAR3 solujen määrittää, missä määrin ne voivat ilmaista EY markkereita. Kuten taulukosta 1, lähes jokainen klooni osoitti korkean tason oton AcLDL, E-lektiinisitoutumisella ja Tie2-odotuksiin EGFP ilmentymistä EY-edistävät olosuhteet taas vain heikko ilmentyminen näiden merkkiaineiden voitiin havaita soluissa säilytetään normaaliolosuhteissa. Näin ollen, kuten aiemmin ehdotettu

vuonna vivo-

johdettu TDECs [25], hankinta EY: n fenotyyppiä ei rajoitu mihinkään tiettyyn solujen osajoukkoa.

H460

OVCAR -3

% + soluista (Std kunto /kunto 3)

% + soluista (Std kunto /kunto 4) B Clone nro

E-lektiini

AcLDL

Clone No.

Tie-2-GFP

Clone nro

E-lektiini

AcLDL

Clone No.

Tie-2-GFP

1 3/90-95 3/ 9521 3/90-9541 3/80 3/9061 3/ 952 3/90-95 3/ 9522 5/90-9542 3/90 3/9062 3/ 9535/80 3/90-9523 5/ 9543 3/ 95 3/9563 3/ 345/ 95 3/ 9524 3/ 9544 3/ 95 3/9064 3/ 9555/ 95 3/80253-5/ 9545 3/ 95 3/9065 3/ 9565/ 95 3/90-9526 3/ 9546 3/90 3/9566 3/ 9575/90-95 3/ 9527 3/ 347 3/80 3/9567 3/ 9585/ 955/90-9528 3/ 9548 3/90 3/9068 3/ 395/ 955/ 9529 3/90-9549 3/90 3/9069 3/ 95105/80-855/ 9530 3/ 9550 3/50 3/9070 3/ 31110/ 955/90-9531 3/ 9551 3/ 95 3/9571 3/ 9512 3/ 95 3/ 9532 3/ 352 3/ 3 3/5072 3/ 95135/ 95 3/ 9533 3/ 9553 3/30-40 3/9573 3/ 951410/ 953/ 95345/ 9554 3/30-40 3/8074 3/ 31510/90-95 3/ 9535 3/ 95555/90-95 3/9575 3/ 316 3/90-953/ 9536 3/ 95565/ 95 3/9576 3/ 9517 3/90-95 3/ 9537 3/ 95575/ 95 3/9577 3/ 95185/ 953/ 9538 3/ 3585/90-95 3/9578 3/ 95195/ 95 3/ 9539 3/ 3595/ 95 3/9579 3/ 320 3/ 95 3/90-95405/ 9560 3/ 95 3/9580 3/ 95Table 1. endoteelisolujen erilaistumista ihmisen kasvaimen line yhden solun klooneja.

Cell lajittelua käytettiin siementen yksittäisten H460 ja OVCAR3 soluja 96-kuoppaisille levyille. 20 peräisin olevat kloonit kustakin solutyypistä laajennettiin ja arvioitiin standardeissa tai EY-edistävät olosuhteet E-lektiinisitoutumisella ja AcLDL ottoa. Vielä 20 kloonia, kukin johdettu H460-Tie2-GFP: n ja OVCAR3-Tie2-GFP-soluja arvioitiin myös, että GFP: n ilmentämistä. Prosentuaalinen positiivisten solujen jokaiselle näistä EY-spesifisten seuraavien 5 vuorokauden etenemisen mitattiin vakio-olosuhteissa tai olosuhteissa 3 tai 4 ja kaksi saadut arvot erotetaan ”/”. Näitä tutkimuksia ei oteta huomioon suuria eroja merkki intensiteetti, joka tapahtui seuraavat hypoksinen eteneminen, joka on esitetty kuvassa S2. CSV Lataa CSV

TDECs sisällyttää kasvaimeen uudissuonittumisen, parantaa kasvaimen kasvua ja lisätä suonitiheys

aikaisempia havaintoja,

vuonna vivo-

johdettu TDECs voi sisällyttää kasvaimen neo-verisuoniston ja lisätä verisuonitiheyttä [24,25] ehdotti, että

in vitro

-johdannainen TDECs saattavat käyttäytyä samalla tavalla. Tilanteen korjaamiseksi, EGFP-merkinnällä H460 tuumorisoluissa [25] viljeltiin olosuhteessa 3 5 d, sekoitetaan 20-kertainen ylimäärä

Discosoma

sp.

Punainen fluoresoiva proteiini (DsRed ) hännitetty H460 kasvainsolut ja lisätty ihonalainen ksenografteja immuunipuutteisilla hiirillä. Ohjaus injektiot suoritettiin identtisesti mutta EGFP + väestöstä kasvatettu vakio-olosuhteissa. Kasvaimet, jotka johtuvat entisen soluseos kasvoi merkittävästi nopeammin kuin jälkimmäisestä (kuva 4A). Fluoresenssimikroskopia Jääleikkeiden osoitti myös verisuonten entisen kasvainten voidaan rikastaa EGFP + EC (kuva 4B), joka osoittaa mieltymys

in vitro

-johdannainen TDECs sisällyttää kasvaimen verisuonistoon. Lopuksi, verisuonten entisen kasvaimet olivat molemmat tiheämpi ja suurempi kuin jälkimmäinen kasvaimia (kuvio 4C-4F). Samanlaisia ​​kokeita suoritettiin OVCAR3 solut osoittivat, että tuloksena tuumoriksenografteja, vaikka ei kasva huomattavasti nopeammin kuin niiden ohjaus kollegansa, sisältyi suurempi osuus EGFP + luminaalisen TDECs ja tiheämpi verisuonisto (kuva S3). Siten co-injektio

in vitro-

peräisin TDECs helpottaa kasvaimen uudissuonittumisen, joka, joissakin tapauksissa, mahdollistaa nopeutetun kasvaimen kasvua.

EGFP-merkitty H460-soluja ylläpidettiin 5 d sillä ehdolla, 3. tuloksena saatu TDECs sekoitettiin sitten 20-kertaisella ylimäärällä DsRed-tagged H460 kasvainsolut kasvatettiin standardeissa olosuhteissa, ja yhteensä 10

6 solua istutettiin ihonalaisesti paljaiden hiirien kylkiin ja jota lisätään, kuten kasvaimen ksenograftit. Kontrollituumorit koostui sama sekoitus DsRed-merkitty kasvainsoluja ja EGFP-merkityt kasvainsolut kasvatettiin tavanomaisissa olosuhteissa. (

) Graafinen esitys kasvaimen kasvua. Kasvaintilavuudet määritettiin ilmoitettuina aikoina ja keskiarvot piirrettiin (± SEM).

p

arvo esitetään päivän 17 kasvainten oli johdettu käyttämällä yksisuuntaista Studentin t-testiä. (

B

) konfokaali fluoresenssi kuvaa Jääleikkeiden kasvainten kustakin kaksi ryhmää. Asteikko bar = 25 um. (

C

) edustaja pienitehoisia hematoksyliini-eosiini-värjättyä parafinoidut kudosleikkeiden otettu tyypillinen kasvaimia kussakin kaksi ryhmää. (

D

) graafinen esitys keskimääräinen lukumäärä kasvaimen verisuonten per kenttä (± SEM) tyypillisissä aloilla kunkin kasvaimen tyypistä. Kokonaismäärä kenttien tutkittiin oli 32 kunto 3 kasvaimia ja 24 vakio kunnossa kasvaimia. Ainoastaan ​​alukset näytteille erillisiä lumenia ja joka sisältää punasoluja, osoittaa

musta

nuolet

, laskettiin. (

E

) graafinen esitys keskimääräisestä verisuonen poikkipinta-ala (± SEM) näissä kahdessa kasvaimen tyyppiä. Kokonaismäärä alusten mitattuna oli 85 vakio kunnossa kasvaimia ja 248 välillä kunto 3 kasvaimia. (

F

) keskimääräinen lukumäärä kasvaimen verisuonten poikittaistutkimuksen alueilla (± SEM), jotka olivat pienet (30-499 um

2), keskipitkän (500-1999 um

2) , suuri (2000-4999 um

2), ja hyvin suuri (≥ 5000 um

2), mitattuna käyttämällä ImageJ ohjelmistoa. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen yksisuuntaista Studentin

t

testi (*,

p

0,01; **,

p

0,001; ***,

p

0,0001). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kahdessa itsenäisessä kokeessa.

Keskustelu

Viimeaikaiset havainnot erilaisia ​​syöpiä ovat osoittaneet, että EC käsittää kasvaimen neo-verisuonistossa voi peräisin suoraan kasvaimeen solut itse ja rinnakkain hankittua johdettu extra kasvaimen lähteistä [24-28]. Aivan kuten heidän kasvainsolun edeltäjänsä, nämä TDECs ovat genomisesti epävakaita [24]. Tämä voi antaa selviytymisen etu edessä anti-angiogeneesiä hoitoja, mikä ehkä osuus siirtymävaiheesta vaikutuksia näillä aineilla [19-22]. Todellakin, olemme havainneet, että

vuonna vitro-

johdettu TDECs kuvatun kaltaisia ​​tässä voidaan johtaa EGM2 josta puuttui VEGF ja siten näyttävät olevan riippumattomia tämän kasvutekijän jopa ilman ennalta valinnan. Lisäksi erittäin pieniä määriä VEGF-transkriptien, jotka havaittiin H460 ja OVCAR3 solujen reaaliaikaista qRT-PCR, eivät muuttuneet merkitsevästi jälkeen, induktion TDEC fenotyypin (ei esitetty).

tulokset osoittavat, että kasvaimen soluja voidaan manipuloida

in vitro

määrätyissä olosuhteissa tuottaa TDECs jotka ovat molemmat biokemiallisesti ja toiminnallisesti samanlaisia ​​kuin peräisin

in vivo

[24,25]. Että lähes kaikki kasvainsolut voivat hankkia EY kaltaisia ​​ominaisuuksia (taulukko 1), kun taas menettävät epiteelin ominaisuudet on johdonmukainen aiempaan toteamukseen yksisoluiset klooneja peräisin kasvainsoluista voi tuottaa TDECs

in vivo

[25]. Siten kyky TDEC sukupolvi näyttää olevan yleinen, jos ei universaali piirre, joka on jaettu enemmistö tuumorisolupopulaatioon ja on solu autonominen. Muuttuva osuus TDECs löytyy eri kasvaimissa [25] voi siten olla vähemmän osoitus luontaista sukupolvien kapasiteettia kuin kilpailevien prosessien kuten itävät angiogeneesin ja vaskulogeneesin optimaalista olosuhteet TDEC induktion ja puute muiden selektiivisten paineiden kuten ennen terapeuttista interventiot. Ominaisuus näyttää rajoittuvan kasvainsolupopulaatioissa emme ole havaittu hankittua aiheutua ei-transformoiduista soluista, kuten ihmisen sikiön munuaisen tai primaarisia tai immortalisoituja keuhkoputken ja maitorauhasen epiteelisolut, kun viljeltiin samanlaisissa olosuhteissa, jotka on kuvattu tässä (ei esitetty).

kyky tuottaa TDECs määrätyissä

in vitro

olosuhteissa vastauksia useita kysymyksiä, joita ei voida helposti käsiteltävä käyttämällä

in vivo

malleihin, joissa kasvain microenvironment on usein heterogeeninen , muuttuvat nopeasti [1,33] ja missä TDEC muodostuminen on todennäköisesti kilpailevat ylimääräisiä verisuonten remontin prosesseja. Nämä kysymykset kuuluvat luonne ja keskinäiset induktiivisen signaalit TDECs ja niiden ajoitus. Ilmeisiä ehdokkaita tällaisten signalointimolekyylien ovat EC-spesifisiä kasvutekijöitä, kuten VEGF, bFGF ja TGF-beeta, sekä hypoksian, jotka kaikki ovat voimakkaita indusoijia kasvaimen uudissuonittumisen [3-5,11-14]. Tuloksemme osoittavat, että ainakin

in vitro

kumpikaan kasvutekijät toimittamat EY-erityisiä kasvualustaan ​​eikä hypoksiaa yksin ovat erityisen voimakkaita indusoijia kasvain solun TDEC siirtyminen vaan, että yhdessä, ne ovat erittäin synergistinen. Tämä ei ole täysin odottamaton, koska nämä tekijät ovat pitkään tiedetään olevan välttämättömiä sukupolvi ja ylläpito kasvaimen uudissuonittumisen johtuvat enemmän perinteisistä lähteistä [34,35]. Joissakin tapauksissa, kuten esimerkkinä meidän tuloksia OVCAR3 soluihin, muut tekijät, kuten valikoivaa ravinteiden puutteen tai asidoosia saattaa olla ylimääräisiä tukiroolit ja vielä tutkittava perusteellisemmin. Tarkka luonne efektorien ja niiden suhteellinen merkitys TDEC sukupolvi ovat todennäköisesti melko riippuvainen luontaisia ​​ominaisuuksia tietyn kasvaintyypeille, hankittu toissijainen muutoksia ja erilaisia ​​muita kilpailevia ja yhteistyössä ympäristötekijät. On myös todennäköistä, että altistuksen keston eri induktiiviset tekijät sekä milloin aikana kasvain solun TDEC siirtymäajan ne ovat operatiivinen tulee olemaan tärkeä rooli. Kaikki nämä kysymykset olisi osoitettavissa käyttäen Määritystyyppejä tässä kuvatut, jotka mahdollistavat tarkan ohjauksen ja ajoitusta mahdollisten ympäristön ärsykkeille.

Aiemmat tutkimukset olivat osoittaneet, että sekä ilmaus EY-markkereita ja funktio

in vivo

-johdannainen TDECs olivat solulinjaa riippuvaisia ​​ja tämä oli vahvistettu nykyisen tutkimuksissa. Ehkä ilmeisin esimerkki tästä oli osoituksena erot H460 ja OVCAR3 TDECs osalta niiden kykyä vaikuttaa -tuumoriksenografti kasvu ja aluksen koko (kuviot 4 ja S3). Onko tämä heijastaa luontainen toiminnallisia eroja ja TDECs kasvu kuviot itse kasvainsoluihin, strooman vuorovaikutus tai näiden tekijöiden yhdistelmä ei tällä hetkellä tunneta. Lopulliset todisteet tällaisen syy-seuraus-suhteita odottaa tulevaa vahvistusta.

Kyky kerrata kasvain solun TDEC siirtyminen tehokkaasti, nopeasti ja tarkkaan määritellyin ja helposti muutettavissa olosuhteissa pitäisi antaa nyt perusteellisemmin arviointeja tarkka roolit soitti yksittäiset induktiivisen tekijät prosessin edistämisessä sekä niiden suhteellinen merkitys. Helppous, jolla TDECs voi syntyä myös siitä, että ne voivat toimia arvokkaina reagensseja, joita käytetään tunnistamisessa uusien aineiden, jotka estävät tämän prosessin.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kaikki hiiren tutkimukset suoritettiin mukaan Animal Welfare Act ja Public Health Service Policy ja hyväksymiä University of Pittsburgh Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) (Luvan numero: 0812276). Eläimiä pidettiin patogeenittomassa yksiköissä lastensairaala Pittsburgh noudattaen IACUC määräyksiä.

Eläimet

ikä ja sukupuoli-Hyväksytty nu /nu-hiiriä ostettiin Harlan Sprague-Dawley Laboratories ( Indianapolis, IN). -tuumoriksenografti Tutkimukset suoritettiin aikaisemmin kuvatulla [24,25].

In vitro

induktion TDECs ja -tuumoriksenografti kasvua

NCI-H460 ihmisen keuhkokarsinooma (H460) , CaLu-1 ihmisen keuhkokarsinooma, PC3 eturauhasen syöpä, ja OVCAR3 munasarjasyövän solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja niitä pidettiin alle normoxic ”standardi” olosuhteet, kuten aiemmin on kuvattu [24,25]. Elatusaineet sisältyvät alfa-Minimal Essential Medium ( ”MEM”) ja H460 ja PC3 sekä McCoyn 5a väline CaLu-1 ja OVCAR3, sekä jota on täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM glutamiinia, 110 ug /ml pyruvaatti, vähintään ei-keskeisiä aminohappoja, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 yksikköä /ml penisilliini G). Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) ja EY-erityisiä EGM-2 kasvualustasta ostettiin Cambrex Bio Science (Walkerville, MD). Kaikkia solulinjoja pidettiin 5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C. Useimpien tuumorilinjoja, induktio EY fenotyyppi saatiin aikaan viljelemällä soluja erilaisissa olosuhteissa. Näihin sisältyvät EGM-2 väliaineessa happiolosuhteissa (ehto 1); standardi keskitason hypoksisissa kunnossa [1% O

2 happiniukkaan hansikaslokerossa inkubaattoriin (Coy Laboratory Products Inc., Grass Lake, MI)] (ehto 2); tai EGM2 väliaine + hypoksian (ehto 3). Joitakin kokeita, optimaalisen induktion lisäksi tarvitaan ravinteiden puutteesta väliaineessa [Glutamax D-MEM-elatusainetta, josta puuttui ei-välttämättömiä aminohappoja asparagiini, asparagiinihappo, glutamiini, ja proliini (Invitrogen, Inc.)] hypoksisissa olosuhteissa, mutta muuten sisältävät samat kasvua tekijät ja ravintolisät EGM-2 alustaa (ehto 4). Lopullinen edellytys sisälly edellä ravintoaine puutosta väliaineessa plus normoksia (ehto 5). Lentiviruksen pakkaus ja infektiot tuottaa EGFP- tai DsRed-merkittyjä soluja suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [25].

Ihon alle tuumoriksenografteja saatiin siirrostamalla 10

6 kasvainsoluja, jotka koostuivat EGFP-merkittyjen TDECs ja DsRed-merkittyjä kasvainsoluja (01:20), subkutaanisesti kyljet nu /nu-hiiriä kuten aiemmin on kuvattu [25]. Kasvaimen tilavuus Mittaukset tehtiin 2-3 päivän välein, kunnes maksimaalinen sallitun halkaisija ca. 2 cm päästiin (tyypillisesti 4-6 viikkoa sekä H460 ja OVCAR3 solut), jossa vaiheessa kasvaimia leikattiin. Erilliset fragmentit kasvaimia valmistukseen käytettyjen jäädytettyjen ja parafiiniin upotetut leikkeet.