Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lääkeaineresistenssi on este tehokkaan hoidon munasarjasyövän. Me ja muut ovat osoittaneet, että insuliinin kaltainen kasvutekijä (IGF) signalointireitin on uusi mahdollinen kohde voittamiseksi lääkeresistenssin. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli vahvistaa IGF2 mahdollisena terapeuttisena kohteena lääkkeille vastustuskykyiset munasarjasyöpää ja tehon määrittämiseksi kohdistaminen IGF2

in vivo

. Analyysi Cancer Genome Atlas (TCGA) tiedot serous munasarjasyövän kohortin osoitti, että korkea IGF2 mRNA ilmentyminen liittyy merkittävästi lyhentää välein sairauden etenemiseen ja kuolemaan, kliininen indikaattorit lääkeresistenssin. Geneettisesti erilaisia ​​paneelin munasarjasyövän solulinjoissa IGF2 mRNA-tasot mitattiin solulinjoissa resistenttejä eri mikrotubulia stabiloivia aineita, kuten Taxol todettiin olevan merkittävästi kohonneita verrattuna lääkkeen herkkiä solulinjoja. Vaikutus IGF2 Knockdown taksoliin resistenssi tutkittiin

in vitro

ja

in vivo

. Ohimenevä IGF2 Knockdown merkittävästi herkistyneet lääkkeille vastustuskykyiset solut Taxol hoitoon. Taksoliresistenttiä munasarjasyöpä ksenograftimalli, kehitettiin HEY-T30-soluissa, osoittivat äärimmäistä lääkeresistenssi, jossa suurimmalla siedetyllä annoksella paklitakselia ei viive kasvaimen kasvua hiirissä. Estämällä IGF1 R (transmembraanireseptoriproteiinia joka välittää signaaleja IGF1 ja IGF2) käyttämällä monoklonaalista vasta eivät muuttaneet vastaus Taxol. Kuitenkin vakaa IGF2 pudotus lyhyillä-hiusneula-RNA: HEY-T30 tehokkaasti palauttaa Taxol herkkyys. Nämä havainnot vahvistaa IGF2 mahdollisena terapeuttisena kohteena lääkkeille vastustuskykyiset munasarjasyövän ja osoittavat, että suoraan kohdistaminen IGF2 voi olla paras strategia verrattuna kohdistaminen IGF1 R yksin.

Citation: Brouwer-Visser J, Lee J, McCullagh K, Cossio MJ, Wang Y, Huang GS (2014) Insuliini kasvutekijä 2 hiljentäminen Palauttaa Taxol Herkkyys lääkkeille vastustuskykyiset munasarjasyöpä. PLoS ONE 9 (6): e100165. doi: 10,1371 /journal.pone.0100165

Toimittaja: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 helmikuu 2014; Hyväksytty: 22 toukokuu 2014; Julkaistu: 16 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Brouwer-Visser et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Grant tuki saatiin, kun National Cancer Institute-National Institute of Child Health and Human Development (K12 HD00849) ja Yhdysvaltain kongressi Gynekologit kautta Reproductive Scientist Development Program palkinto GSH. Tekijät myöntävät käytön Albert Einstein Cancer Center Shared Resources (virtaussytometria Core, histologia ja vertaileva patologia Core) tukemana National Cancer Institute Cancer Center Support apurahan P30CA013330. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on johtava syy gynecologic syövän kuolemaan Yhdysvalloissa. Koska 1990-luvun puolivälistä, vakiohoito munasarjasyövän on kirurginen cytoreduction ja systeemistä kemoterapiaa, yleensä Taxol ja platina [1]. Kuitenkin suurin osa potilaista lopulta kuolevat uusiutuva, etenevä sairaus johtuu vastustuskyky kemoterapia.

Sen lisäksi vakiintuneita rooleja kehityksen ja kasvun, ikääntyminen ja syövän syntymistä [2] – [6], insuliinin kaltaisen kasvutekijän (IGF) signalointireitin on äskettäin ollut mukana lääkeresistenssin [7] – [11]. Kuten olemme aiemmin raportoitu, ylössäätely insuliinin kaltainen kasvutekijä 2 (IGF2) on akuutti soluvastetta Taxol hoitoon, ja sen ilmentyminen moduloi vaste taksolin lääkkeille vastustuskykyiset munasarjasyövän solulinjoissa. [7]. Koska Taxol käytetään ensilinjan munasarjasyövän hoitoon, me arveltu, että korkea IGF2 liittyisi luontainen kliinisen lääkeresistenssi, joka ilmenee vähentynyt aika taudin etenemiseen /uusiutumisen potilailla. Tätä hypoteesia tukevat, meidän ennen tutkimusta käyttäen kudosta mikrosirulla lähestymistapa osoitti, että korkea IGF2 ilmentyminen munasarjojen kasvainkudoksessa oli todellakin ennustava lyhentää aikaväli etenemisen /uusiutumisen.

Näiden laboratorio- ja kliiniset tiedot, huomasimme, että IGF2 on potentiaalinen terapeuttinen kohde lievittävät lääkeresistenssin munasarjasyöpä, mutta tietojemme mukaan ole aiempaa

in vivo

validointitutkimukset on tehty. Sen vuoksi, kuten tässä on kuvattu, me suoritetaan tutkimuksia sen selvittämiseksi, Taxol resistanssi voidaan voittaa

in vivo

kohdistamalla IGF2. Tutkimme vaikutus IGF2 Knockdown on paitsi Taxol vaikutuksista, vaan myös vastaus ei taksaania mikrotubulusten vuorovaikutuksessa lääkkeitä, ja muut lääkkeet, joita käytetään yleisesti hoitoon munasarjasyöpä. Vahvista kliinistä merkitystä havaintomme, analyysi vakavien munasarjasyöpä kohortin Cancer Genome Atlas (TCGA) tehtiin arvioimaan suhdetta IGF2 ilmaisun ja kliinisiä tuloksia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet tehtiin suostumuksella Institutional animal Care ja Käytä komitea (Protocol 20130604) Albert Einstein College of Medicine Yeshiva yliopistosta. Institutionaalinen Animal Welfare Assurance (A3312-01) tässä laitoksessa on täysin akkreditoitu Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care (AAALAC) lähtien 22. helmikuuta 1983. Eläimet hoidettiin kohti eläinsuojelulaissa ja NIH ”Guide for Care ja käyttö Laboratory Animals”.

solulinjat ja reagenssit

munasarjasyöpäsolulinjoihin A2780 [12] ja HEI [13] (eräänlainen lahja tri Susan Band Horwitz), ja munasarjakarsinooman solulinja NIH: OVCAR8 [14] (ystävällinen lahja Dr. David Goldman) kasvatettiin RPMI-1640 (Life Technologies), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Life Technologies) ja 1% penisilliini /streptomysiinistä (Life Technologies) lämpötilassa 37 ° C 5% CO

2. Kaikki lääkkeille vastustuskykyiset solulinjat tekijät, paitsi HEY-Epo8 (lahja tri Susan Band Horwitz), joka on kehittänyt Dr. C-P Huang Yang käyttäen epotiloni B [15]. Taksoliresistenttiä HEI-T30-solulinja muodostettiin HEI soluja, kuten aiemmin on kuvattu [7]. A2780-T15 solulinja samoin vuoden A2780 käyttämällä taksolin valinta vaan jatkuvassa läsnä oli 15 uM verapamiilia (Sigma). A2780-B20 ja HEY-B20 valittiin vastustuskyky ixabepilone (Ixempra Bristol-Myers Squibb), ja OVCAR8-D30 diskodermolidiin. Solulinjoja oikeaksi käyttäen Genemarker 10 Kit (Promega). Resistenttejä solulinjoja sovitettu niiden herkkä linjat ja julkaistujen tiedot saadaan. Solulinjat seulottiin rutiininomaisesti mykoplasman kanssa MycoAlert (Lonza). Soluja viljeltiin huumeeton media vähintään 18 tuntia ennen kokeita paitsi A2780-T15, joka oli kasvatettu 0,5 nM paklitakselia. Kliinisesti muotoiltu Taxol (Hospira) laimennettiin 6-kertaisesti 5% dekstroosi vedessä (Hospira) lopulliseen pitoisuuteen 1 mg /ml vierassiirrekokeissa. NVP-AEW541, pieni molekyylipaino kinaasiestäjän IGF1 R, saatiin Novartis Pharma AG [16]. Monoklonaalinen vasta-aine IGF1 R, IMC-A12 (Cixutumumab) tarjosi Imclone, täysin omistama tytäryhtiö Eli Lilly and Company.

IGF2 geeniekspressioanalyysissä kliinisissä näytteissä munasarjasyövän

cBioPortal for Cancer Genomics käytettiin käsiksi geenien ilmentymistä ja kliinisiä tuloksia Cancer Genome Atlas Project (TGCA) [17]. Kysely suoritettiin käyttäen Kaikki Täydellinen kasvaimet Munasarjojen seroosit kystadenokarsinooma (TCGA, Nature 2011) aineisto, joka sisältää 489 tapausta korkealaatuisesta vakavasta munasarjasyöpä. Sillä IGF2 mRNA Expression Z-tulokset, jonka kynnys on 1,6 standardipoikkeamaa yli keskiarvon määritteli IGF-korkea ryhmä; Kaikissa muissa tapauksissa sisällytettiin IGF2-normaali ryhmä.

kvantitatiivinen PCR

Solulysaatit homogenoitiin käyttäen QIAshredder sarakkeita (Qiagen Inc., Valencia, CA) ja kokonais-RNA eristettiin RNeasy Mini (Qiagen). RNA-pitoisuus ja puhtaus arvioitiin käyttäen NanoDrop spektrofotometriä (Fisher Thermo Scientific), joka osoittaa OD 260/280 suhde välillä 2,03-2,11. RNA eheys otettiin näytteitä käyttäen Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies), osoittaa RIN pisteet välillä 9,8 ja 10. Täydentävät DNA tehtiin suorittamalla käänteistranskriptio (RT) käyttäen SuperScript Vilo cDNA Synthesis Kit (Life Technologies) valmistajan ohjeiden käyttäen 1 ug kokonais-RNA: kaikkien solulinjojen paitsi A2780, A2780-T15 ja A2780-B20, jota varten 2 ug kokonais-RNA: ta käytettiin. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin käyttäen Eppendorf Mastercycler ep

realplex2

käyttämällä 3-vaihe menetelmällä (95 ° C 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 10 sekuntia, 60 ° C 20 sekuntia, 72 ° C 20 sekuntia; sitten sulatukseen käyrä 95C 15 sekuntia, 60C ja 95C yli 20 min). Kukin reaktio käytetään 1/20-cDNA: n reaktio, eteen- ja taaksepäin alukkeita loppukonsentraatioon 200 nM, ja PowerSYBR (Applied Biosystems, Foster City, CA) laimennettuna erittäin puhdasta vettä (Life Technologies) ja 1X lopullinen konsentraatio lopullisessa reaktiossa tilavuus on 10 ui. Eksoni junction-ulottuu alukkeet (taulukko S1) on vahvistettu analysoimalla sulamiskäyriä ja monistuksen tehokkuus. MRNA ilmaisun pisteet laskettiin käyttämällä kaavaa * 1000, jossa ACk

t on ero C

t (sykli kynnys) väliin geeni ja sisäisen normalisoinnin geeni,

PPIB

( peptidylprolyl isomeraasi B; syklofiliini B).

PPIB

varmistettiin olevan vakaa mRNA: n ilmentymisen tasoa vanhempien, lääkkeille vastustuskykyisten, ja transfektoituja munasarjojen solulinjojen: Hei, Hey-T30, HEY-B20, HEY-T30 shIGF2-p, HEY-T30 shIGF2 -v, HEY-T30 shScrambled, A2780, A2780-T15, A2780-B20. Keskimääräinen ero C

t-arvot, kun arvioidaan

PPIB

ilmaisun pairwise vertailuissa näistä solulinjoista oli 0,2 (95% luottamusväli -0,1-0,5). Fold-muutos suhteellisessa mRNA: n ekspressio laskettiin käyttäen menetelmää [7]. Genominen DNA eristettiin AllPrep mini -kittiä (Qiagen). Alukkeet suunniteltiin ulottumaan introni-eksoni risteyksessä ja validoitiin sulattamalla ja tehokkuus käyrän analysointi. Albumiini (

ALB

) käytettiin sisäisen normalisoinnin. By array vertaileva genominen hybridisaatio, HEI solujen havaittiin kaksi kopiota

IGF2

,

ABCB1

ja

ALB

geenejä (tuloksia ei ole esitetty). Kopioluvun muutos määritettiin qPCR genomi-DNA: sta käyttäen menetelmää, ja jossa HEI 2: sta [18].

leviämisen kinetiikkaa ja sytotoksisuusmääritykset

proliferaation kinetiikka, solut ympättiin 6- kuoppalevyille. 24 tunnin välein, Rinnakkaiskuoppien laskettiin käyttäen Scepter Counter (Millipore). Sytotoksisuuden määritykset, solut ympättiin 96-kuoppaiselle levylle. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin sarjalaimennoksia ilmoitettu lääkkeen, jossa on kiinteä pitoisuus on 1 uM NVP-AEW541 tai 10 ug /ml IMC-A12, jos tarpeen. 72 tunnin kuluttua hoidon suhteellinen solujen lukumäärä kussakin kuopassa määritettiin käyttämällä sulforodamiini B-määritys [7]. IC

50 on lääkeaineen pitoisuus, joka vastaa 50%: n lasku solujen määrä lasketaan annos-vaikutus-käyrä.

ELISA reseptoreiden fosforylaation

Soluja kasvatettiin täydellisessä median 24 tuntia, sitten seerumia 12 tuntia ennen stimulaatiota 10 minuuttia rekombinantti IGF2 (50 ng /ml; Abcam) tai insuliinia (50 nM; Sigma) kanssa tai ilman sitä solujen esikäsittely NVP-AEW541 (1 uM) tai IMC-A12 (10 ug /ml) 2 tuntia. Solut hajotettiin käyttäen NP40-pohjainen lyysipuskuri PhosSTOP (Roche) ja proteaasiestäjäseostabletit (Sigma). Jälkeen proteiini kvantitointi, The DuoSet IC Human Phospho-IGF-1 R: n ja Phospho-insuliini R (R validointi Näiden havaintojen tehtiin tämän käsikirjoituksen käyttäen kahta uutta ainutlaatuista oligonukleotidisekvenssiä mielivaltaisesti nimetty siIGF2-1 ja siIGF2-2. Sillä A2780-T15-soluissa, kaksi oligonukleotidisekvenssit käytettiin, joka vastaa ensimmäistä siRNA käytetään HEI-T30 (mielivaltaisesti nimetty siIGF2-3) sekä uuden oligonukleotidin siIGF2-1. Vakaan Knockdown käyttäen BLOCK-IT indusoituva H1 Lentivirusvektorikonstruktit RNAi System (Life Technologies), vektorit suunniteltiin ilmaista shRNA kohdistamista IGF2, tai ei-kohdistuksen ohjaus (shScrambled). HEI-T30-solut transfektoitiin plasmidi suoraan tai lentiviruksen hiukkasia, sitten valitaan Zeocin (Life Technologies). Klooneja plasmidi-transfektoitujen solujen ja lentiviruksen-transfektoituja soluja seulottiin IGF2 pudotus. Klooni, jossa oli alhaisin IGF2 mRNA: n ilmentymisen kustakin ryhmästä käytettiin myöhemmissä kokeissa.

Cell Cycle ja apoptoosi analyysi

Soluja käsiteltiin kuten on kuvattu kuviossa legendoja. 16 tunnin kuluttua, joka tarttuu ja kelluvat solut kerättiin. Solusyklin analyysi, solut kiinnitettiin 70% kylmällä etanolilla 1 tunnin ajan, sitten inkuboitiin 20 ug /ml propidiumjodidia (Sigma) ja 100 ug /ml RNaasi (Fisher Thermo Scientific) PBS: ssä. Apoptoosin analyysi, Violet Ratiometrinen Kalvo Epäsymmetria anturi /Dead solukuoleman Kit (Life Technologies) käytettiin mukaisesti valmistajan protokollaa. Violetti herkkä väriaine 4′-N, N-dietyyliamino-6- (N, N, N-dodekyyli-metyyliamino-sulfopropyyli) metyyli-3-hydroxyflavone (F2N12S) käytettiin havaitsemiseen kalvon epäsymmetrian tapahtuvat muutokset alkupuolella apoptoosin, mikä johtaa vähentyneeseen suhde 585 nm: 530 nm emissio. Samanaikaisesti SYTOX (R) AADvanced käytettiin kuolleiden solujen tahra. Käyttämällä unstained solut ja ohjaus käsittelemättömiä soluja, ruiskutus kvadranttien määritettiin; elävät, apoptoottiset, ja kuolleet solut kvantitoitiin käyttäen FlowJo (Treestar).

lääkevuoto- Analysis

Kaksisataatuhatta HEY ja HEY-T30 solut suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan lämmintä PBS + 5% FBS . Kaikki inkubointivaiheet tehdään 37 ° C soluviljelmässä inkubaattorissa. Verapamiili (15 uM) tai NVP-AEW541 (1 uM) lisättiin ja näytteitä inkuboitiin 1 tunnin ajan. Sitten 50 uM Tubulin Tracker Green reagenssia (Oregon Green 488 Taxol, bis-asetaatti) (Life Technologies) lisättiin ja näytteitä inkuboitiin 45 minuuttia. Solut pelletoitiin sitten uudelleen PBS: ään + 5% FBS: ää, verapamiilin tai NVP-AEW541 jos osoitettu, ja inkuboitiin vielä 20 minuuttia, pestiin PBS: ssä ja värjättiin TO-PRO-3 (Life Technologies). Solut analysoitiin välittömästi käyttämällä FACSCanto II (BD) ja FlowJo; TO-PRO-3-positiivisten solujen (kuolleita soluja) saatiin erotettua pois ja loput solut piirretään määrittävät merkitty Taxol säilyttäminen [19].

Tilastollinen analyysi

Kunkin analyysin osalta tiedot vähintään kahdesta itsenäisestä kokeesta. Numerot toistojen per koe on kuvattu kuvassa legendoja. Erot avulla kahden ryhmän analysoitiin käyttämällä t-testiä. Välisten erojen kolme tai useampia ryhmiä, yksisuuntainen ANOVA, jossa Bonferronin post-testiä käytettiin. Analyysiä varten kaksi riippumatonta muuttujaa, kaksisuuntainen ANOVA kanssa Bonferronin post-testiä käytettiin. Eloonjäämisanalyysiä varten logrank- testillä. Kaikki P-arvot ovat kaksisuuntaisia ​​ja P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Supplemental Methods

Tiedoston S2 sisältää materiaaleja ja menetelmiä käytetään tuottamaan β-tubuliinia mutaatio data (kuvassa . S1 File S1) ja IGF2 western blot data (kuvassa. S2E File S1).

tulokset

ennen tutkimuksen IGF2 proteiinin ilmentymisen käyttäen kudosta microarray munasarjan epiteelin kasvaimia osoittanut, että erittäin kudosten ekspressiotasot IGF2 liittyivät lyhennetty välein taudin etenemiseen /toistumisen [7]. Sittemmin geenien ilmentyminen tietoja 489 kliinisesti-selityksin vaiheen II-IV korkealaatuisesta serous munasarjasyöpään näytteitä Cancer Genome Atlas hanke (TCGA) on saatavilla kautta cBioPortal syövän Genomics [17]. Käyttämällä näitä tietoja portaali, testasimme suhdetta IGF2 ilmaisun ja luontainen lääkeresistenssi, jossa korkea IGF2 määriteltiin 1,6 SD tavallista lämpimämpää, joka vastaa 94-95th persentiilin vuonna normaalijakaumaa. Käyttämällä tätä leikkaus pisteet, koko IGF2 korkea ryhmä lähennetään osa munasarjasyöpä potilaiden odotetaan olevan luonnostaan ​​lääkkeille vastustuskykyiset kasvaimet, joka ilmenee etenemistä aikana tai pian sen jälkeen täyttämällä kemoterapiaa. Meidän analyysi TCGA tietojen me todellakin havaittu, että korkeat IGF2 mRNA ilmentyminen kasvainkudoksessa korreloi merkitsevästi lyhennetty välein taudin etenemiseen /uusiutumisen eli ilman taudin etenemistä (Fig. 1A). Mediaani ilman taudin etenemistä oli tässä ryhmässä 12 kuukauden ohjeellinen luontaisten lääkeresistenssin. Korkea IGF2 mRNA ilmaisun myös korreloi merkittävästi lyhentää kokonaiselinaikaa (Fig. 1 B). Monimuuttujamenetelmin ei käytössä näitä tietoja portaalin, mutta meidän ennakkojulkaisemista olemme huomanneet yhdistys IGF2 ilmaisutapoja korkeampi vaiheessa ja laatu [7].

IGF2 ilmaisun ja munasarjasyöpä selviytymistä. Käyttämällä cBioPortal for Cancer Genomics analysoida dataa Cancer Genome Atlas tutkimuksessa munasarjojen vakavien kystadenokarsinooma, vertasimme ilman taudin etenemistä ja kokonaiselinaika potilailla, joilla on korkea kasvain tasoja IGF2 mRNA (yli 1,6 standardipoikkeamaa yli keskiarvon; harmaa viiva) ja ne, joilla on normaali kasvain tasoja IGF2 mRNA (kaikki muut potilaat, musta viiva). Potilaat, joilla on korkea IGF2 mRNA oli merkittävästi lyhentynyt ilman taudin etenemistä (A) ja kokonaiseloonjääminen (B). (C) IGF2 ilmentymistä herkkiä tai resistenttejä solulinjoja. RT-qPCR, mittasimme IGF2 mRNA tasolle kuuteen lääkkeille vastustuskykyiset munasarjasyöpäsolulinjoihin ja heidän kolme solulinjojen alkuperän. Kaikki lääkkeille vastustuskykyiset solulinjat ovat merkittävästi korkeammat IGF2 mRNA: n ilmentymisen verrattuna niiden herkkä solulinjan alkuperän. Bars esittävät keskiarvoa ± SEM IGF2 mRNA ilmaisun pisteet vähintään kahden itsenäisen kokeen kullekin solulinjan, jokainen tehdään kolmena kappaleena, ja symboli baarin yläpuolella ilmaisee tilastollista merkittävyyttä vertaillaan että kestävä solulinja sen vanhempien vastine; * P 0,05, *** p 0,001, **** p 0,0001 yksisuuntaisella ANOVA Bonferronin posttest. (D) ABCB1 ilmaisua. ABCB1 mRNA ekspressiotasot mitattiin RT-qPCR in HEY, HEY-T30, A2780 ja A2780-T15. HEI-T30 on suurempi ABCB1 mRNA: n ilmentymisen verrattuna muita solulinjoja. Palkit esittävät keskiarvoa ± SEM ABCB1 mRNA: n ilmentymisen pisteet vähintään neljän itsenäisen kokeen kunkin solulinjan, kukin tehty kolmena kappaleena (E) ABCB1 DNA: n kopioiden määrää. By qPCR suoritetaan perimän DNA HEY-T30 on kuusi-kertainen ABCB1 DNA kopiomäärä osoittaa geenimonistuman. Bars esittävät keskiarvoa ± SEM kahden itsenäisen kokeen, jokainen tehdään kolmena kappaleena.

aiemmin osoittaneet, että IGF2 mRNA tasot nousevat akuutin Taxol hoidon, ja me arveltu, että säätelyä IGF2 liittyy pysyviä eloon jäänyt solut, jotka aiheuttavat lääkkeille vastustuskykyiset uusiutuva sairaus. Tutkia lääkeresistenssin laboratoriossa, Taxol, samoin kuin ei-taksaanin mikrotubulusta stabiloivia aineita (MSAS), ixabepilone, diskodermolidi, ja epotiloni B käytettiin kehittämään kuuden erillisen resistenttejä solulinjoja. Määritettynä reaaliaikaisia ​​PCR, kaikki MSA-resistentti solulinja mallit olivat kohonneet IGF2 mRNA ilmaisun suhteessa niiden herkkä vanhempien linja (Fig. 1 C). Koska Taxol on ylivoimaisesti kliinisesti käytetty näistä lääkkeiden, myöhemmissä kokeissa keskityttiin taksoliresistenteille solulinjat HEI-T30 ja A2780-T15.

arvioitiin lääkkeille vastustuskykyiset solulinjat muita mekanismeja Taxol resistenssin [ ,,,0],20], [21]. HEY-T30 on ABCB1 mRNA yli lauseke (Fig. 1 D) liittyy genomivahvistuksen on

ABCB1

(Fig. 1 E), kun taas HEI ei kopioluku muutosta

ABCB1

. Nämä havainnot varmistettiin array vertaileva genominen hybridisaatio (tuloksia ei ole esitetty). A2780-T15 valittiin läsnä verapamiilin ja ei-ilmentävät ABCB1 (Fig. 1 D), eikä A2780-T15 eikä A2780 on DNA: n kopioiden määrän muutos

ABCB1

(Fig. 1 E). Löysimme ole merkittävää korrelaatiota IGF2 ja ABCB1 ilmaisun meidän paneelissa solulinjojen (Fig. S3 File S1). DNA: n sekvensointi paljasti, että A2780-T15 on mutaatio (Glycine asemassa 360 muutetaan asparagiinihapolla) on Taxol sitovaan taskuun β-tubuliinia (Fig. S1A ja S1B File S1), kun taas HEY-T30 ei ole mutaatio β-tubuliinia.

HEY-T30 lisääntynyt samalla tavalla Taxol-vapaa media tai median, joka sisältää pieniä pitoisuuksia Taxol (≤30 nM) (Fig. 2A). A2780-T15 lisääntyneet huomattavasti hitaammin Taxol-vapaa media kuin nesteessä, joka Taxol (≤15 nM) (Fig. 2B), mikä viittaa mahdollinen Taxol riippuvainen kasvun liittyy sen β-tubuliinia mutaatio. Kun pieniannoksisen Taxol oli läsnä, A2780-T15 lisääntyneet samalla nopeudella kuin A2780. Resistentti solulinjat osoittivat ristiresistenssiä ixabepilone, MSA, joka on yhteinen β-tubuliinin sitoutumispaikan paklitakselia. Laajennetut profilointi HEY-T30 (Fig. 2C, vasen paneeli) osoitti vastustuskykyä mikrotubuleihin horjuttaa huumeiden vinblastiinin ja kestävyys doksorubisiini, mutta samanlainen herkkyys sisplatiinia, verrattuna vanhempien hei. A2780-T15 (Fig. 2C, oikea paneeli) oli ristiresistenttejä sekä doksorubisiinille ja CDDP, mutta oli herkempi vinblastiini. Yliherkkyys mikrotubulia horjuttanut lääkkeiden on havaittu aiemmin toisessa lääkkeille vastustuskykyiset solulinjaa kätkeminen β-tubuliinia mutaatio, joka liittyi riippuvuus mikrotubulia vakauttava lääkkeitä lisääntymistä [22].

leviämisen kinetiikkaa solulinjoissa. Soluja kasvatettiin täydellisessä median kanssa ilmoitetun pitoisuuden taksolin 6-kuopan astioihin, ja soluja rinnakkaisista kuopista laskettiin 24 tunnin välein. (A) HEI-T30-solujen läsnä tai poissa ollessa 30 nM Taxol lisääntyvät hitaammin kuin HEI-soluja (p 0,05, Toistuva toimenpiteet Kaksisuuntainen ANOVA, Bonferronin posttest). (B) A2780-T15, kun läsnä on 2 nM ja 15 nM Taxol kasvaa samalla A2780. Kuitenkin puuttuessa Taxol, A2780-T15 proliferates hitaammin, mikä viittaa Taxol riippuvuus (p 0,01, kaksisuuntainen ANOVA, Bonferronin posttest). Jokainen kasvukäyrän edustaa keskiarvoa vähintään kahden itsenäisen kokeen kunkin tehdään kaksoiskappaleita, jokainen piste on yhtä kuin keskiarvo ± SEM. (C) IC

50: n kemoterapeuttisten lääkkeiden herkkiä tai resistenttejä solulinjoja. 96-kuoppaisilla levyillä, soluja käsiteltiin sarjalaimennoksia ilmoitettu huumeiden ja pitoisuus 50% proliferaation inhibition (IC

50) määritettiin käyttämällä SRB sytotoksisuusmääritys. HEI-T30 ovat ristiresistenttejä ixabepilone ja vinblastiinin. On vaatimaton ristiresistenssiä doksorubisiinin mutta ei CDDP. A2780-T15 ovat ristiresistenttejä ixabepilone, ja hieman ristiresistenttejä doksorubisiinin ja CDDP, mutta herkempiä vinblastiini. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen suoritettiin kuusi rinnakkaista. P-arvot lasketaan pariton t-testi. (D, E) vertailu HEY-T30 ja HEI vierassiirrettä vastaus Taxol. Ihonalaisen injektion HEI-T30 tai HEI soluja, hiiret jaettiin hoitoryhmiin kussakin oli 6 eläintä. Kun keskimääräinen ksenograftissa määrä oli 120 mm

3, Taxol hoito annettiin maksimaalinen siedetty annos (MTD) 20 mg /kg intraperitoneaalisesti joka kolmas päivä viiden hoitoja (hoitopäiville: 0, 3, 6, 9, 12 ), jolloin kumulatiivinen annos on 100 mg /kg. Kontrollieläimet saivat intraperitoneaalisesti injektoimalla laimennusaine (5% dekstroosia vedessä, D5W) mukaisesti samassa aikataulussa. Kasvaimet mitattiin joka kolmas päivä, ja kasvaimen tilavuutta ± SEM kullekin ryhmälle on esitetty kussakin aikapisteessä. HEI ksenograftit vastasi Taxol hoitoa, joka voimakkaasti tukahdutti kasvaimen kasvua (Fig. 2D; katkoviiva sininen viiva). HEY-T30 ksenografteissa ei vastannut Taxol hoitoon (Fig. 2E; romutti oranssi viiva) ja kasvoi samaan tahtiin kuin ajoneuvon saaneilla HEY-T30 ksenografteissa. HEI Taxol vs HEI D5W päivänä 19, p 0,001; pariton t-testi.

kriittinen vaihe kääntää laboratoriolöydöksiä potentiaalisiksi hoitoja potilaille on tehdä

in vivo

testaus käyttämällä eläinmalleissa. Koska A2780-T15-soluissa olivat riippuvaisia ​​Taxol’ia niiden kasvua mutta hei-T30 ei, arvioimme HEY-T30 kuin ksenograftimallia varten

in vivo

testaukseen hoitostrategioita huumeita vastus. Me annettiin Taxol käyttäen aiemmin määritetty suurin siedetty annos (MTD, kumulatiivinen annos 100 mg /kg) [23] arvioida lääkeresistenssin

in vivo

. Vanhempien HEI -ksenografti kasvua tehokkaasti tukahdutettiin Taxol, osoittaa herkkyys Taxol (Fig. 2D). Sen sijaan, Taxol eivät estäneet HEY-T30 vierassiirrettä kasvu verrattuna ajoneuvoon (5% glukoosi veteen D5W) käsittely, mikä osoittaa lääkeresistenssin (Fig. 2E).

strategioita miten kohdistaa IGF2 välittämää huume vastus, tutkimme reseptorin ilmentymisen ja aktivoinnin lääkeaineille ja herkkiä solulinjoja. Aiemmin julkaistut tutkimukset osoittivat, että IGF2 sitova indusoi autofosforyloinnin IGF1 R ja insuliinin-isoformi A, IR-A [24], [25], mikä johtaa reseptorin aktivoitumista ja alavirran signalointia efektorimolekyyleille kuten AKT. Lisäksi korkea IR-A /IGF1 R ilmentyminen liittyi vastustuskykyä IGF1 R hoitoja, kuten signalointi kautta IR-A voi kiertää riippuvuutta IGF1 R [26]. Olemme todenneet, että IGF1 R-mRNA: n ilmentyminen oli korkeampi HEY ja HEY-T30, verrattuna A2780 ja A2780-T15, ilman merkittäviä eroja pariksi herkkä ja kestävä linjat (Fig. 3A). Kuten on esitetty kuviossa. 3B, IR-A tasot olivat alhaisempia HEY ja HEY-T30 verrattuna A2780 ja A2780-T15. Reaaliaikainen PCR tietoja analysoitiin myös korjaus eroja monistustehokkuudessa välillä alukesarjoista (taulukko S1 File S1), vastaavia löydöksiä. Western blot, IGF1 R ja IR-proteiinin ilmentyminen vastasi mRNA-tasot (tuloksia ei ole esitetty). Siten HEY ja HEY-T30 oli alempi IR-A /IGF1 R-suhteet kuin A2780 ja A2780-T15.

(A) IGF1 R mRNA herkkien ja resistenttien solulinjojen. Mitataan RT-qPCR (n = 5 itsenäisestä kokeesta kunkin tehdään kolmena kappaleena), IGF1 R-mRNA: n tasot ovat samankaltaisia, kun resistenttejä solulinjoja verrattuna niiden vanhempien solulinjojen alkuperän. Bars esittävät keskiarvo ± SEM. (B) IR mRNA herkkien ja resistenttien solulinjojen. Mitattuna RT-qPCR (n = 5 itsenäisestä kokeesta kukin tehdään kolmena kappaleena) IR-A- ja IR-B mRNA tasot HEY-T30 ovat merkittävästi vähentynyt verrattuna HEY, kun taas vastaavia tasoja havaitaan verrattaessa A2780-T15 ja A2780. Bars esittävät keskiarvo ± SEM, **** p 0,0001; paritonta t-testiä. (C) Phospho-IGF1 R ja fosfo-IR ELISA in HEY-T30. Solut nälässä yön yli, inkuboitiin 1 uM NVP-AEW541 tai 10 ug /ml IMC-A12: ssa 2 tuntia, stimuloitiin 50 ng /ml IGF2 tai 50 nM insuliinia 10 minuuttia, hajotettiin, ja tasot fosforyloitua IGF1 R ja IR määritettiin ELISA. Sekä IGF2 ja insuliinin aiheuttamaa 5- 6-kertainen-muutos kohonneeseen fosfo-IGF1 R, joita voitaisiin tukahduttaa NVP-AEW541 tai IMC-A12. Muutokset fosfo-IR stimulaation jälkeen IGF2 tai insuliinin olivat paljon pienempiä (fold-muutos 1,5). Bars kuvaavat keskiarvo ± SEM kertamuutosta fosforylaation tasoja ainakin kaksi erillistä koetta, jokainen kahtena kappaleena. (D) Phospho-AKT ja fosfo-ERK Western blot. Solulysaatit valmistettiin kuten on kuvattu (C) käytettiin immunoblottauksella käyttäen fosforylaation-spesifisiä AKT ja ERK-vasta-aineita. IGF2 aiheuttama AKT fosforylaation treoniini 308 ja seriini 473 tukahdutettiin NVP-AEW541 ja IMC-A12, kun koko AKT pysyi muuttumattomana. Ei vaikutusta nähtiin fosfo-ERK tasolle. Yksi edustava koe kahdesta itsenäisestä kokeesta. Equal Proteiinilisäyksen varmistettiin Ponceau värjäys ja GAPDH immunoblottauksella. (E) Phospho-IGF1 R ja fosfo-IR ELISA A2780-T15. Solut valmistettiin samalla tavalla kuin (C). IGF2 ja insuliini aiheutti 7-kertaiseksi ja 10-kertaisesti kohonnut fosfo-IGF1 R, vastaavasti, ja tämä voitaisiin tukahduttaa NVP-AEW541 tai IMC-A12. Tasot fosfo-IR jälkeen IGF2 tai insuliinistimulaation myös lisääntynyt, 4-kertainen ja 9-kertaiseksi. Kuten on esitetty kuviossa. ** P 0,01;