Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA ovat sekaantuneet monia kriittisiä soluprosesseihin myös apoptoosin. Olemme aikaisemmin havainneet, että apoptoosin haimasyöpäsoluissa indusoitiin adamantyyli retinoidi liittyvien (ARR) molekyyli 3-CI-AHPC. Kirjoittajat raportoivat, että 3-CI-AHPC riippuvaisen apoptoosin liittyy säännellä lukuisia MikroRNA lukien miR-150 * ja miR-630. 3-CI-AHPC stimuloi miR-150 * ilmaisun ja aiheutti vähentynyttä ilmentymistä c-Myb ja IGF-1 R haiman syöpäsoluja. 3-CI-AHPC välittämää vähentäminen c-Myb johti vähentynyt sitoutuminen c-Myb IGF-1 R: n ja Bcl-2 promoottorit, mikä aiheuttaa tukahduttaminen niiden transkriptio ja proteiinin ilmentymiseen. Yli-ilmentyminen miR-150 * johti myös vähentynyt tasoilla c-Myb: n ja Bcl-2-proteiinien. Lisäksi lisäämällä miRNA inhibiittorin 2′-O-metyloitua miR-150 esti 3-CI-AHPC-välitteisen kasvu miR-150 * tasoja ja kumotaan menetys c-Myb-proteiinia. Pudotus c-Myb in PANC-1-soluissa johti parantuneeseen apoptoosin sekä läsnä ollessa tai puuttuessa 3-CI-AHPC vahvistaa anti-apoptoottisen ominaisuus c-Myb. Yli-ilmentymisen miR-630 myös aiheuttaman apoptoosin haiman syöpäsoluissa ja estivät kohdeproteiinin IGF-1 R-mRNA ja proteiinin ilmentymisen. Yhdessä nämä tulokset osoittavat avainroolit Mir-150 * ja miR-630 ja niiden kohdentamista IGF-1 R edistää apoptoosin haiman syöpäsoluja.

Citation: farhana L, Dawson MI, Murshed F, Das JK, Rishi AK, Fontana jA (2013) lisääntymisen merkkejä miR-150 * ja miR-630 indusoi apoptoosia haimasyöpäsoluissa by Targeting IGF-1 R. PLoS ONE 8 (5): e61015. doi: 10,1371 /journal.pone.0061015

Editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: 14 joulukuu 2012; Hyväksytty 5 maaliskuuta 2013 Julkaistu: 10 toukokuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Veterans Affairs Merit Review Grant (JAF, MID) ja National Cancer Institute (NCI) avustukset (JAF, MID) . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

jälkeen alkuperäisen löytö vuonna 1993, MikroRNA on tutkittu niiden tarkoitukseen useita kirjoittajat [1]. Kyky MikroRNA säädellä ilmentymistä erilaisia ​​geenien transkription jälkeisellä tasolla on hyvin dokumentoitu [2]. Näitä pieniä RNA-molekyylit ovat säilyneet ja ilmaistu useita organismien, kuten

Homo sapiens

ja tärkeitä rooleja säätelyssä ratkaiseva biologisten prosessien kuten solujen lisääntymisen, erilaistumisen ja apoptoosin.

MikroRNA ovat transkriboidaan tumassa ensisijaisesti RNA-polymeraasi niin kauan ensisijaisena selostukset (pre-MikroRNA). Nämä molekyylit ovat sitten jalostetaan tumassa RNAasi III Drosha osaksi 70- 100-nukleotidin pre-MikroRNA ja sitten viedään sytoplasmaan, jossa ne myöhemmin käsitellä niitä RNAasi III Dicer tuottaa kaksijuosteista RNA: t (dsRNA) noin 22 nukleotidin [3]. Olipa, on hajoaminen antisense-juosteen tässä vaiheessa on kiistanalainen. Viimeaikaiset todisteet osoittavat selvästi, että käännetyn mRNA säikeen ehkä ole huonontunut, ja voi olla merkittävä rooli sääntelyn useiden solutoiminnoille [4]. Jäljellä oleva kypsä yksijuosteinen mikro-RNA estää käännös liittymällä monimutkainen, joka sitoutuu komplementaarinen 3′-UTR kohdegeenin. Kautta ilmainen sitovia erityisiä MikroRNA on osoitettu kohdistaa useita geenejä parantaa tai estämään niiden ilmentymistä, mikä pleiotrooppisia vaikutuksia useisiin solun funktioihin [5].

dysregulaatio mikroRNA ilmentyminen on yhdistetty syöpään aloittamista ja etenemistä säätelemällä ilmaus tuumorisuppressoreilla ja onkogeenit. Aikaisemmin on osoitettu, että microRNA profiileja löytyy haimakarsinooma- kudoksissa eroavat merkittävästi havaittu normaalissa haima- kudoksessa tai haimatulehdus [6]. On oletettu, että parannettu tai alentunut spesifisten MikroRNA voi olla tehokas lähestymistapa terapiassa useiden maligniteettien [5]. Useita lähestymistapoja moduloida microRNA ilmentyminen on kehitetty. Adamantly-substituoitu retinoidi liittyvät (ARR) molekyylien on havaittu indusoivan apoptoosia eri pahanlaatuisia soluja sekä

in vitro

ja

in vivo

[7]. Useita mekanismeja on ehdotettu, joiden kautta apoptoosin saavutetaan tämän luokan molekyylien [7].

Olemme aiemmin osoittaneet, että ARRS indusoivat apoptoosin haimasyöpäsoluissa – synkkä sairaus, jossa on usein tuhoisia ennuste [8]. Oletimme, että solujen altistaminen on 3-CI-AHPC voi johtaa modulaatio mikroRNA ilmaisun ja että tämä ero microRNA ilmentyminen voi myötävaikuttaa ARR-välitteistä solun proliferaation inhibitio ja solukuoleman induktio. Esillä olevassa sarja kokeita, osoitamme, että ARRS todellakin moduloida MikroRNA ilmaisun ja että tämä lisälaite erityisiä mikroRNA ilmentymisen miR-150 * ja miR-630 tulokset säätelyä alaspäin IGF-1 R-proteiinia, jotka ovat tärkeä välittäjä solun kasvun ja apoptoosin induktio.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja solut

(

E

) -4- [3- (1-adamantyyli) -4- hydroksifenyyli] -3-kloo- happo (3-CI-AHPC) syntetisoitiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [9]. Ihmisen haiman karsinooma solulinjat, PANC-1 ja MiaPaca-2 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) ja pidettiin DMEM-F12-elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 100 ug /ml gentamysiiniä. DMEM-F12 -alustassa, naudan sikiön seerumia (FBS) ja Lipofectamine-2000 ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Vasta-aineet ja niiden lähteet olivat seuraavat: vasta-virtaussytometrillä CD44-PE, CD24-FITC BD Biosciences (San Jose, CA); anti- IGF-1Rβ, anti-SMAD1, anti-katkaistuun kaspaasi 3 (Asp-175), anti-kaspaasi-3 oli peräisin Cell Signaling Technology (Boston, MA); anti-EGFR, anti-CDK6, anti-c-Myb ja anti-Bcl2 vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); Cdc14A ja ABCC1 alkaen Abcam, Cambridge, MA ja Thermo Scientific, Rockford, IL, vastaavasti; ja anti-α-tubuliinin ja β-aktiini-vasta-aine (Oncogene Research Products, Boston, MA). Puromysiini oli ostettu Sigma-Aldrichilta (St. Louise, MO).

miRNA microarray-analyysi ja validointi

PANC-1-soluja altistettiin 1 uM 3-CI-AHPC 30 tuntia. Kokonais-RNA 3-CI-AHPC käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen uutettiin TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA), ja sitten näytteen valmistus, hybridisaatio G4470A 15K Human miRNA Microarray (V2) (Agilent Technologies) ja analyysi suoritettiin Asuragen, Inc. (Austin, TX). Sillä miRNA validointi, kokonais-RNA puhdistettiin RNeasy Mini Kit (Qiagen) ja 100 ng RNA: ta käytettiin cDNA: n valmistamiseen käyttäen TaqMan microRNA käänteistranskriptio Kit (Applied Biosystems) käyttäen spesifisiä microRNA alukkeita. Mirna sekvenssi aluke ja koetin Mir-134, miR-150 *, miR-630, miR-345, miR-382, miR410, ja miR129-5P, endogeeninen kontrolli RNU6B ja TaqMan 2 x PCR Master Mix for TaqMan microRNA määrityksiä hankittiin Applied Biosystems ja seurasi protokollan kuten kuvataan valmistajan ohjeita. Reaaliaikainen qRT-PCR ja analyysi suoritettiin Applied Biosystems 7500 Real Time PCR-järjestelmä. Data-analyysi suoritettiin ACt-arvot miRNA kustakin näytteestä laskettiin normalisoimalla sisäisen valvonnan RNU6B ja kukin arvo oli keskiarvo kolme toistoa.

mRNA: n kvantitointi

Kokonais-RNA valmistettiin PANC- 1 solulinjoja käyttämällä TRIzol kuin valmistajan suosittelemia ja puhdistettiin käyttämällä Rneasy Mini Kit (Qiagen). Reaaliaikaista PCR cDNA valmistettiin SuperScript III Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi järjestelmä RT-PCR: llä (Invitrogen) ja analysoitiin kolmena kappaleena käyttäen 2 x SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) ja ABI Prism 7500 Sequence Detection järjestelmän . PCR koostui 40 sykliä 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan ja sitten 95 ° C 15 sekuntia, 60 ° C 60 sekunnin ajan. Oligonukleotidi Alukesarjat syntetisoitiin Integrated DNA-tekniikka Inc. (Coralville, IA). Aluke asettaa kullekin geenille on lueteltu alla:

EGFR, eteenpäin 5’CTTTCGATACCCAGGACCAAG-3 ’; käänteinen 5’CAACTTCCCAAAATGTGCCC -3 ’; CDK6, eteenpäin 5’TGCACAGTGTCACGAACAGA -3 ’;

reverse 5′- ACCTCGGAGAAGCTGAAACA-3′; ABCC1,

eteenpäin 5’AGGTGGACCTGTTTCGTGAC-3 ’;

reverse 5′- ACCCTGTGGATCCACCAGAAG-3′; SMAD1 eteenpäin

5’CAACAATCGTGTGGGTGAAG -3 ’; käänteinen 5’TCCGGTTAACATTGGAGAGC -3 ’;

CDC14A, eteenpäin 5’GCACACCCAGTGACAACATC -3′; käänteinen

5’CCTTCACTGGATGGTCGATT -3 ’; IGF-1 R, eteenpäin

5’AACCCCAAGACTGAGGTGTG -3 ’; käänteinen 5’TGACATCTCTCCGCTTCCTT -3 ’;

c-Myb, eteenpäin 5’GTCCGAAACGTTGGTCTGTT -3′; käänteinen

5’GGCAGTAGCTTTGCGATTTC-3 ’; Bcl2, eteenpäin 5’ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA -3 ’

käänteinen 5’ACAGTTCCACAAAGGCATCC -3′; β-aktiini, eteenpäin

5′-TCCTTCCTGGGCATGGAG-3 ’; reverse 5’- AGGAGGGGCAATGATCTT-3 ’.

miRNAexpression vektorin rakentaminen ja shRNA-c-Myb plasmidin

rakentaminen miR-150 * ekspressiovektorin, pre-miR-150 * sekvenssit syntetisoitiin Integrated Technologies Inc. ja hehkutettu miR-150 * sekvenssi oli klooneja osaksi pcDNA6.2-GW /EmGFP-miR vektorin BLOCK-iT-Poll II miR RNAi ekspressiovektoriin (Invitrogen). miR-150 * sekvenssin plasmidirungosta valmiiksi miR-150 * varmistettiin sekvensoimalla. miR-150 * ekspressiovektori transfektoitiin stabiilisti PANC-1-soluihin käyttäen lipofektamiinia 2000 ja stabiileja solulinjoja valittu puromycin.Vector sisälsi sekoitetun sekvenssin käytettiin kontrollina.

Pieni hiusneula (sh) -RNA Myb ekspressiovektori rakennettiin suunnatusti kloonaamalla 5 ’-

Bam

HI ja 3

EcoRI

I ylitys nukleotidin pSIREN-RetroQ mukaisen vektorin valmistajan ohjeiden (Clontech, Mountain View, CA). Geenin hiljentäminen kohdesekvenssien olivat koodaavan sekvenssin PubMed liittymistä numerot NM_001130172 ja sh-RNA-sekvenssit, 5’TGAAGAAGCTGGTGGAACA -3 ’(Myb-KD1) ja 5′-ACAGATGACTGGAAAGTTA -3’ (Myb-Kd2), 5 ’ – CAGAAGAGGAAGACAGAAT-3 ’(Myb-KD3) syntetisoitiin Integrated DNA-tekniikalla Inc. shRNA alueilla plasmidirungosta vahvistettiin sekvensoimalla. shRNA-Myb pudotus plasmidit transfektoitiin stabiilisti PANC-1 soluissa käyttäen Lipofectamine 2000 ja stabiileja solulinjoja valittu puromysiini. SH-vektori-, joka sisältää sekoitetun sekvenssejä pSIREN-RetroQ vektoria käytettiin kontrollina. Mir-630 yli-ilmentymisen, PEP-on-miR-630 ekspressiovektori ostettiin Cell Biolabs. Inc. (San Diego, CA). Estävän miR-150 * ja miR-630 miRNA, solut transfektoitiin antisense O’methylated miR-150 * (OME-miR-150) ja miR-630 (OME-miR-630) sekvenssejä; sekvenssit syntetisoitiin Integrated DNA Technology Inc.

Apoptoosi ja Kasvunestymistutkimus

Haimasyöpä solulinjat käsiteltiin 1 uM 3-CI-AHPC eri ilmoitettuina ajankohtina. Apoptoosin soluissa analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä anneksiini V-FITC sitova yhdessä propidiumjodidilla (PI) värjäämällä (anneksiini V-FITC apoptoosin Detection Kit 1, BD Biosciences, San Diego, CA). Tietojen hankinta suoritettiin FACS Calibur virtaussytometrillä (BD) ja analysoitiin CellQuest ohjelmisto (BD Biosciences). Solukuoleman induktioon ja miR-630 transfektoitiin ohimenevästi PANC-1-soluissa arvioitiin Cell Death Dectection ELISAplus kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Solujen kasvun esto määritettiin 3- (4,5-di- metyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT). Solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 10

4 solua /kuoppa tilavuudessa 200 ui viljelyalustaa ja pre-miR-630 ekspressiovektoriin, miR vektorit transfektoitiin lipofektamiinia. 48 tunnin kuluttua transfektion 25 ul /kuoppa MTT: tä (5 mg /ml) lisättiin elatusaineeseen ja inkuboitiin 4 h ja MTT sakat liuotettiin 200 ui DMSO: ta, ja levyt luetaan BioTek Synergy HT (BioTek Instrument Inc ., Vermont) absorbanssilla 590 nm. Kaikki kokeet suoritettiin neljänä rinnakkaisena määrittämiseksi keskiarvot ja keskihajonnat.

Western blotit

Solut uutettiin lyysipuskurilla, joka sisälsi 25 mM Tris-Cl-puskuria (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,2 % nonidet P-40, 10% glyserolia 10 mM NaF, 8 mM β-glyserofosfaatti, 0,2 mM Na

3Vo

4, 1 mM DTT, ja 10 pl /ml proteaasiestäjäseostabletit (Sigma Aldrich, St. Louise , MO) ja Western blotit suoritettiin, kuten olemme aiemmin on kuvattu [10].

Kromatiini immunosaostus (ChIP) määritys

PANC-1 ohjaus-soluja käsiteltiin 1 uM 3-CI-AHPC varten 24 h ja formaldehydin silloitus ja immunosaostus analyysi suoritettiin käyttäen kuvattua menetelmää [10]. Kromatiinin lysaattia inkuboitiin 1 ug anti-c-Myb-vasta-ainetta yli yön 4 ° C: ssa ja immuunisaostumassa kompleksit kerättiin Dynal magntic helmiä (Invitrogen). Seuraavia alukkeita käytettiin siru määrityksessä näytteet IGF-1 R ja Bcl2 promoottorialueen,

IGF-1 R, eteenpäin, 5’AGGGGAATTTCATCCCAAAT-3 ’; käänteinen,

5′-AGGAAAAGTTCCCGCAGTG – 3 ’; Bcl2, eteenpäin,

5’CAGAGGAGGGCTTTCTTTCTTCTT-3 ’; käänteinen, 5’-CCCGGCCTCTTACTTCATTCT -3 ’

Real-Time PCR suoritettiin kuten aikaisemmin on kuvattu mRNA kvantitointiin osassa. Aineisto analyysi suoritettiin ACt arvot kustakin c-Myb sidottu ohjaus. 3-CI-AHPC käsiteltyjen näytteiden laskettiin normalisoimalla kanssa tulo-ohjaus ja syöttää käsitellyn arvo ja kunkin arvo oli keskiarvo kolme toistoa. PCR-tuotteet ajettiin elektroforeesilla 2% agaroosigeelissä ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä ja tallentama Gel Logic 2200 kuvantamisjärjestelmä, Molecular Imaging System Carestream Health, Inc.

Fluoresenssi solulajittelutekniikkaa (FACS ) ja CD44

+ /CD24

+ solut ja pallo muodostumista

solut kasvatettiin 70-80% konfluenssiin, trypsinoitiin ja pestiin lajittelu-puskurilla (1 x PBS, 5% FCS). Solut suspendoitiin uudelleen 100 ul: lla lajittelu ja inkuboitiin 15-20 ui anti-CD44-PE: n ja anti-CD24-FITC: llä ensisijainen vasta-aineita 30 minuutin ajan jäillä. Solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan lajittelu puskuria ja lajitella virtaussytometrialla FACSAria järjestelmän (BD Immunosytokemia Systems, Franklin Lakes, NJ).

Lajiteltu CD44

+ /CD24

+ soluja keskeytetään seerumittomassa kantasolujen alustassa, joka sisälsi DMEM /F12 (01:01), johon oli lisätty B27 (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 20 ng /ml EGF: ää (Biomol International, Plymouth, PA), 20 ng /ml fibroblastikasvutekijää (Biomol International, Plymouth, PA), ja 100 ug /ml gentamysiiniä. Noin 150-200 solua kuoppaa kohti siemennettiin ultra low-kiinnitys 96-kuoppalevylle (Corning Inc, Lowell, MA). 3-CI-AHPC (1,0 uM) lisättiin seuraavana päivänä sen jälkeen, kun solut levytettiin tai sen jälkeen 7 päivää sekä alalla muodostumista. Kuulat valokuvattiin ja mitattiin käyttämällä Olympus mikroskooppi (OLYMPUS CKX41) ja Olympus mikroskooppi digitaalikamera DP2-BSW ohjelmisto (Olympus pehmeä kuvantamisen ratkaisujen GmbH, Saksa). Kaikki tilastot suoritettiin käyttäen VassarStats web tilasto-ohjelmalla (Richard Lowry, Poughkeepsie, NY, USA). Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) suoritettiin havaita mitään eroja ryhmien välillä pallo ohjaus, 3-Cl AHPC käsitelty aloilla. Jos tulos ANOVA oli merkitsevä (** P 0,01 vs. kontrolli), pareittain vertailut Ryhmien välillä tehtiin post-hoc-testi (Tukeyn HSD menettely). Merkitys asetettiin arvoon ** P 0,01 vs. kontrolli ja * P 0,05 kontrolliryhmään. Hakasulkeet käytettiin luvut osoittavat hoitoja, jotka ovat merkittävästi erilaisia ​​kuin kontrolli.

Tulokset

3-CI-AHPC välittämää modulaatio erityisiä MikroRNA

PANC-1 solujen altistuksen 1 uM 3-CI-AHPC moduloitu ilmentymisen määrä MikroRNA (taulukko 1 microarray-analyysi). Up-regulation miR-134, miR-150 *, miR-630, miR-345, miR-382, miR-410 ja miR-129-5p ja alas-säätely miR-202 ja miR-578 on myös havaittu ( ei näytetty). Lisätodisteita 3-CI-AHPC-välitteisen miRNA modulaatio saatiin real-time-PCR: llä käyttäen Taqman koetinta. Reaaliaikainen PCR oli tilastollisesti merkittävä kasvu esiintyvien eri mikroRNA lajit 24 h (kuvio 1)

MikroRNA todensi kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR. Soluja käsiteltiin 3-CI-AHPC 24 tuntia. Yksityiskohta menetelmiä olivat, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Virhepalkit edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä määrityksestä ± keskihajonta (SD). *, ** Ja *** ( 0,05 0,01 0,001) olivat merkittävästi erilaiset verrattuna kontrollin ja käsiteltyjen välillä näytteitä

t

-testissä.

PANC-1 ja MiaPaca-2-soluissa. Olemme myös päättäneet, onko 3-CI-AHPC modulaatio mikroRNA ilmaisun johti ylös- tai alaspäin-geenien säätelystä kohteena näiden MikroRNA; kohdegeenien tunnistettiin käyttäen TargeScanHuman 5,0 tietokantaan. Modulaatio kohteena geenejä, mukaan lukien EGFR, c-Myb, CDC14A, IGF-1 R, SMAD1, ABCC1, CPEB3, ja CDK6 sekä mRNA: sta (kuvio 2A ja B), ja proteiinin taso (kuvio 2C ja E) todettiin 24 h 3-CI-AHPC altistumista. Huomasimme myös, että altistuminen PANC-1-solujen 3-CI-AHPC 24 h tai 48 h lisääntynyt ilmentyminen miR-150 * väheni ilmaus c-Myb proteiini ja IGF-1 R soluissa (kuvio 2D ja E) .

(A ja B) Alennettu ilmentymistä mRNA SYBR-vihreällä RT-PCR; (C ja E) laski proteiinien tasot osoitettiin Western-blotit analyysi. D). 3-CI-AHPC altistus suureni miR-150 * ilmentymisen ja sen jälkeen vähentynyttä ilmentymistä c-Myb: n ja IGF-1 R-proteiinien (E). Virhepalkit edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä määrityksestä ± keskihajonta (SD). *, ** Ja *** ( 0,05 0,01 0,001) olivat merkittävästi erilaiset verrattuna kontrollin ja käsiteltyjen välillä näytteitä

t

-testissä.

Yli-ilmentyminen miR150 * tehostetun apoptoosin säätelemällä c-Myb ja IGF-1 R ja esti CD44

+ /CD24

+ kantasolun kaltainen pallojen muodostumista

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että asennuspalveli- 150 tavoitteet esikasvaintekijän transkriptiotekijä c-Myb aikana moniportaisuudesta lymfosyyttien kehityksen [11]. Jotta voitaisiin edelleen osoittaa miR-150 * modulaatio c-Myb, ja IGF-1 R on PANC-1-solut, esi-miR-150 * oli stabiilisti yli-ilmentynyt käyttäen ennalta miR-150 * ekspressiovektoriin (pre-miR -150 *) in PANC-1-soluissa johtaa 7-kertainen ennalta miR-150 * ilmaisu (kuvio 3A); pre-miR-150 * yli-ilmentyminen johti 80%: n inhibition IGF-1 R ja c-Myb-mRNA-tasoja, 50% vähentynyt ilmentyminen c-Myb-proteiinin tasot, ja 32%: n lasku IGF-1 R ilmentyminen (kuvio 3B D). Lisäksi sekä lisääntyneen ekspression pre-miR-150 * itse ja, kun läsnä on 3-CI-AHPC tehostaa merkittävästi apoptoosin PANC-1-soluissa (kuvio 3E). Pre-miR-150 * aktivoitu kaspaasi 3 1,5-kertaiseksi, osoittaa proteolyyttinen lohkaista-kaspaasi 3 fragmentteja (kuva 3E, ylempi oikea paneeli) ja indusoimalla DNA pirstoutuminen (kuvio 3E, alempi oikea paneeli). Nämä tulokset yhdessä syytöstä proapoptoottinen roolia miR-150 kautta sääntelyn sen kohdegeenien. Inkubointi PANC-1-solujen estäjä 2′-O-meyhylated miR-150 * antisense (OME-miR150 *) esti 3-CI-AHPC välittämää kohoaminen miR-150 * tasot ja laski C-Myb ilmentymisen voimakkaasti . Tämä tulos viittaa siihen, että 3-CI-AHPC kykenee sen vaikutukset c-Myb ja IGF-1 R ilmentymistä moduloimalla MikroRNA (kuva 4A-C).

(A) lisääntynyt ilmentyminen ennalta miR-150 * ekspressiovektoriin ja pre-miR-150 * vähentää ilmentymistä c-Myb, ja IGF-1 R-mRNA: n ja proteiinin pre-miR-150 * stabiilisti transfektoitujen solujen (B-D). Soluja käsiteltiin 1 uM 3-CI-AHPC 24 tuntia. (E) ennalta miR-150 * aiheuttaman apoptoosin itsestään ja tehostetun 3-CI-AHPC välittämää apoptoosia PANC-1-soluissa. Solut transfektoitiin lyhytaikaisesti ennalta miR-150 * ekspressiovektoriin 24 tuntia ja sitten altistettiin 3-Cl-AHPC 24 tuntia. Apoptoosin induktio arvioitiin käyttäen Annexin V-FITC merkintöjä propidiumjodidilla (PI) värjäys soluissa ja virhepalkit edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä määrityksestä ± keskihajonta (SD). Kaikki Käsitellyt näytteet eroavat merkittävästi miR-vektorin. * ( 0,05), ** ( 0,01) ja *** ( 0,001) merkittävästi erilainen verrattuna miR-vektorin

t

-testi. Yli-ilmentyminen miR-150 * indusoiman kaspaasi 3 kuten on esitetty katkaistun kaspaasi 3-fragmenttien ennalta miR-150 * lyhytaikaisesti transfektoiduissa soluissa (ylempi oikea paneeli). pre-miR-150 * ilmaisi PANC-1-solujen aiheuttaman apoptoosin merkityllä akridiiniorans- /etidiumbromidilla värjätty solut oikea alapaneeli. Solut transfektoitiin ennen miR-150 *: ssa 48 tuntia ja sitten värjätään ja valokuvattiin käyttäen Olympus fluoresenssimikroskooppia digitaalisen kameran ohjelmisto ja DP2-BSW ohjelmisto.

(A) Inhibitor 2′-O-metyloitu miR-150 * (OME-150) esti 3-CI-AHPC välitteisen miR-150 * ilmentymisen lyhytaikaisesti transfektoiduissa soluissa. (B ja C) miR-150 estäjä esti 3-CI-AHPC välitteisen c-Myb hajoamista. Soluja käsiteltiin 1 uM 3-CI-AHPC 24 tuntia. (D) Knock alas c-Myb ilmentymistä soluissa. (E) Knock alas c-Myb tehosti apoptoosin soluissa. Solut, jotka on transfektoitu stabiilisti kolme sh-Myb pudotus ekspressiovektorit ja scrumble sekvenssi kontrollivektorilla altistettiin 3-Cl-AHPC 24 tuntia. Apoptoosin induktio arvioitiin käyttäen Annexin V-FITC merkintöjä propidiumjodidilla (PI) värjäys soluissa ja virhepalkit edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä määrityksestä ± keskihajonta (SD). Kaikki Käsitellyt näytteet ja sh-Myb poikkeavat merkittävästi ohjaus ja sh-vektori; • ja ••, ** ( 0,05 ja 0,01 vastaavasti) ovat huomattavan erilaiset by

t

-testin ja • edusti vertailu 3-CI-AHPC kohteeseen OME-150 * + 3-CI -AHPC käsiteltyjen näytteiden.

Oletimme, että c-Myb oli anti-apoptoottisen on PANC-1-soluissa ja pudotus c-Myb parantaisi apoptoosia solujen sekä puuttuessa ja läsnä ollessa 3-CI-AHPC. Kolme kloonia sh-Myb knockdovvn kertyi PANC-1-soluissa ja alhainen c-Myb ilmentyminen havaittiin (kuvio 4D). Knockdovvn Myb osoitti parannetun apoptoosin sh-Myb-KD soluissa. Lisäämällä 3-CI-AHPC näihin soluihin johti myös merkittävästi suurempaan apoptoosin kuin pani transfektoitu vain vektorilla (kuvio 4E).

Bcl-2 myös merkittävä rooli antagonoimaan apoptoosin useat aineet [12]. Aikaisemmin on raportoitu, että c-Myb on sitoutumiskohta Bcl-2-promoottori, ja se on positiivinen säätelijä Bcl-2: n ilmentymisen. Vähentynyt c-Myb tasot indusoituva dominanttinegatiivivaikutus Myb proteiini FDCP-mix klooni A4 solujen alensivat Bcl-2: n ilmentymisen [13]. Siksi tutkittiin Bcl-2: n ilmentymisen soluissa altistettiin 3-CI-AHPC. Löysimme merkittävästi vähentynyt Bcl-2: n mRNA ja proteiinin ilmentyminen sekä PANC-1 ja MiaPaca-2-soluja (kuvio 5A ja B). Lisäksi yli ilmentyminen pre-miR-150 * alensivat Bcl-2-proteiinin ekspressio viittaa siihen, se säätelee miR-150 *-c-Myb (kuvio 5C). Kromatiinin immunosaostusmäärityksissä oli esimuotoillut valaista mekanismi, jonka 3-CI-AHPC pienenee Bcl-2 ja IGF-1 R ilmentymisen. 3-CI-AHPC altistus johti merkittävään väheneminen sitoutumisen c-Myb IGF-1 R: n ja Bcl-2 promoottorit (kuvio 5D).

(A ja B) 3-CI-AHPC väheni Bcl-2: n mRNA ja proteiinin ilmentymisen. (C) yli-ilmentyminen pre-miR-150 * vähensi Bcl-2-proteiinin ilmentymisen. (D) 3-Cl-AHPC laski c-Myb- sitoutumista IGF-1 R: n ja Bcl-2-promoottorin sivustoja kromatiinin immuunisaostustesti. Solut altistettiin 3-Cl-AHPC 24 tuntia. Virhepalkit edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä määrityksestä ± keskihajonta (SD). ** Ja *** ( 0,01 0,001) olivat merkittävästi erilaiset verrattuna välillä ohjaimen 3-CI-AHPC käsitelty mRNA ja Myb sitoutuminen promoottori sivustot käyttämällä

t

-testi.

Olemme aikaisemmin havainneet, että PANC-1-soluissa rikastettu CD24 /CD44 positiivisuus hallussaan kantasolun kaltainen ominaisuus muodostaa pallojen tarttumattomat kasvuolosuhteet [8]. Lisäämällä 3-CI-AHPC näiden pallojen inhiboi niiden kasvua ja johti apoptoosin. Siksi arvioitiin vaikutusta kohonneet ennalta miR-150 * ja knockdown c-Myb ilmentymisen kasvuun näillä aloilla (kuviot 6A, B ja C). Molemmat kohonneet ennalta miR-150 * ja knockdown c-Myb ilmaus johti merkittävään kasvuun esto pallojen 7 ja 14 päivää. Samoin Zhang

et al.

[14] ovat äskettäin osoittaneet, että lisääntynyt miR-150 lauseke estää CD133 positiivisia maksasyövän kantasoluja kautta estämällä c-Myb ilme.

(A ja C ) Pre-miR-150 * esti pallo muodostumista CD44

+ /CD24

+ soluja. (B ja C) c-Myb Knockdown esti pallo muodostumista CD44

+ /CD24

+ PANC-1-soluissa. Saat pallo muodostumista, CD44

+ /CD24

+ solut lajiteltiin virtaussytometrialla stabiilisti transfektoiduista ennalta miR150 * ja sh-Myb kaataa soluja, tässä järjestyksessä. Koot palloja valokuvattiin ja mitattiin 100 nm mittakaavassa ja suurennus 400 × käyttäen Olympus fluoresenssimikroskooppia digitaalikameran ohjelmisto ja DP2-BSW ohjelmisto. Virhe palkit edustavat keskiarvoa 15 pallo määrityksen ± keskihajonta. ** Oli merkittävästi erilainen verrattuna hallita aloilla. Tiedot analysoitiin ANOVA; Tukey HSD testi monivertailuja. ** P 0,0001 kontrolliryhmään verrattuna. (D) Kaavio osoittaa ennakoi maalin säilynyt sivusto miR-630 3’UTR IGF-1 R.

Target proteiini IGF-1 R säätelee miR-630

Galluzzi

et al.

ovat osoittaneet, että miR-630 säätelee sisplatiinin aiheuttama kasvun pysähtymisen säätelemällä solukierron inhibiittori p27

Kip1 ja indusoi apoptoosia ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [14]. Olemme havainneet, että PANC- 1-solut altistettiin 3-CI-AHPC parannettu miR-630 ilmentymisen 6-kertaiseksi. Käyttäen TargetScanHuman 5,1-ohjelmisto (taulukko 1), löydettiin mahdollisia miR-630 kohdegeenien IGF-1 R ja Cdc14A. miR-630 paria 7 nukleotidin konservoitunut alue sijaitsee asemassa 2658-2665 IGF-1 R 3′-UTR (kuvio 6D). Yli-ilmentyminen pre-miR-630 vähensi IGF-1 R-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen väliaikaisesti transfektoiduissa soluissa (kuvio 7A-D), kun taas ei ollut mitään muutosta mRNA-tasolla kohdegeenin Cdc14A. 3-CI-AHPC laski Cdc14A mRNA ja proteiinin ilmentyminen (kuvio 2A ja C). Mekanismi, jonka 3-CI-AHPC laukaisi laski Cdc14A ilmaus on vielä määrittämättä. Antisense-inhibiittori 2′-O-metyloitua miR-630 esti pre-miR-630 välittämä IGF-1 R-mRNA: n hajoamista osoitti, että miR-630 kohdegeeni on IGF-1 R (kuvio 7E). Lisäksi yli-ilmentyminen esi- miR-630 tehostetun eston ja apoptoosin merkittävästi PANC-1 solun (kuviot 7F ja G). Nämä tulokset osoittavat merkittävää roolia miR-630 apoptoosin haiman syöpäsoluissa.

(A) edeltävä miR-630 ilmentymisen PANC-1 ja MiaPaca-2-soluissa. (B ja C) lisääntynyt ilmentyminen pre-miR-630 vähentynyt IGF-1 R-mRNA: n, mutta ei Cdc14A soluissa. (D). Vähentynyt IGF-1 R-proteiinin ilmentymistä in pre-miR-630 ilmaistaan ​​soluissa. (E) Inhibitor 2′-O-metyloitua miR-630 (OME-630) esti IGF-1 R mRNA: n hajoamisen. Solut transfektoitiin lyhytaikaisesti ennalta miR-630: ssa 48 tuntia (F ja G) pre-miR-630 ilmentyminen inhiboi kasvun ja indusoi apoptoosia PANC-1-soluissa. Inhibitio solujen proliferaatioita arvioitiin 48 tunnin jälkeen pre-miR-630 transfektoitiin ohimenevästi solujen MTT-määrityksellä ja ilmaistiin prosenttina, joka inhiboi kerrallaan suhteessa miR-vektorisäätö. Virhepalkit edustavat keskiarvoa neljästä erillisen määrityksen ± keskihajonta (SD). *, ** Ja *** ( 0,05 0,01 0,001) olivat merkittävästi erilaiset verrattuna välillä miR-vektorin ja miR-630; • oli erittäin merkittävä ja edusti vertailu miR-630 miR-630 + OME-630 käyttämällä

t

-testi. Apoptoosin miR-630-soluissa arvioitiin 48 tunnin kuluttua transfektoitujen solujen. Solukuolema mitattiin sytoplasman histoni-liittyvä-DNA-fragmenteista ELISA (rikastumiskertoimen = OD miR-630 ilmaistaan ​​lysaatin /OD Mir-vektorin, OD 405 nm-490 nm).

keskustelu

tärkeys mikroRNA ilmentymisen ylläpitää normaalia solun fysiologiaa on hyvin dokumentoitu [15]. Esto mikroRNA jalostus on osoitettu parantavan solujen transformaatio [16]. Epätäydellisen knockdovvn Dicer 1 hiiren keuhkon adenokarsinoomasolua lisännyt soluproliferaatioon ja invasiivisuus sekä tehostettua

in vivo

kasvainmuodostusta [16]. Lisäksi vähentynyt microRNA ilmentyminen hiiren alkion fibroblasteissa johti epätäydellinen solujen muuntumista [16]. Mekanismeja, joilla microRNA ilmaisu pienenee pahanlaatuisia soluja vastakohtana normaalit solut ei ole selvä. Äskettäin, epigeneettinen säätely mikroRNA ilmentymisen on osoitettu erilaisissa kasvaimissa [17]. MicroRNA geenejä vaiennettu ihmisen kasvainten poikkeavan hypermetylaatiota CpG-saarekkeiden vieressä ja joka ympäröi microRNA geenejä ja asetyloimalla mikroRNA liittyvän geenin histonien [17]. On havaittu, että suurempi osa tunnettuja mikroRNA geenejä on havaittu olevan epigeneettiseltä säännellään metylaatio (11,6%) kuin löytyy koodaavan geenien (1-2%) [18], [19].

Tässä julkaisussa olemme osoittaneet, että 3-CI-AHPC moduloi ilmentymisen määrä MikroRNA jotka säätelevät käännös ja mRNA: n hajoaminen. Näiden mRNA: n koodaavat proteiinien ekspression on aiemmin osoitettu olevan tärkeitä fysiologisia rooleja solujen lisääntymisen ja kuolema. Olemme havainneet, että 3-CI-AHPC altistus johti säätely ylöspäin useita MikroRNA lukien miR-150 * ja miR-630. Merkitys Moduloivan näiden MikroRNA osoitettiin tarkkailemalla myöhemmin modulaatio niiden ennakoi maalin genes- kuten EGFR, c-Myb, SMAD1, ABCC1, CPEB3, IGF-1 R ja CDK6.

3-CI-AHPC up -regulation Mir-150 * johti vähentynyt ilmentyminen c-Myb ja IGF-1 R. Molemmat proteiinit kriittisiä rooleja parantaa solujen lisääntymistä. Yli-ilmentyminen IGF-1 R on löydetty erilaisia ​​maligniteetteja, mukaan lukien haimasyövän [20]. IGF-1 R hyödyntäen pienimolekyylisten estäjien on vähentänyt haimasyövän kasvua [21].