Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolut (CSCS) ovat pienessä määrässä syöpäsolujen ylläpidosta vastaavien ja etenemisen useiden syöpätyyppien. Isolation, eteneminen, ja erilaistuminen CSCS oikeassa varren markkinaraon paljastaa luontainen vaikeuksia lisätutkimuksia. Tässä osoitamme, että aiheuttama syöpä, kuten kantasoluja (iCLSCs) voidaan muodostaa

in vitro

onkogeenisia manipulointi hiiren alkion kantasoluja (mESCs), joilla on hyvin määritellyt onkogeenistä elementtejä; SV40 LTG ja H

ras

V12 hiirellä varsi virus long terminal repeat (MSCV-LTR) -pohjaisen retrovirus- järjestelmä. Ohjelmoida mESCs käyttäen sekä onkogeenien luonnehdittiin kautta kasvaimia synnyttävän geenin ilmentymistä, parantamiseksi leviämisen, ja esteetön ylläpito varren ominaisuuksien

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi nämä transformoidut solut johti muodostumista pahanlaatuisia, epäkypsä munasarjojen teratomas

in viv

o. Onnistuneesti laajentaa näitä ominaisuuksia muihin elimiin ja lajeja, enemmän tutkimusta on tehtävä täysin ymmärtää rooli kasvain- suotuisa mikroympäristön. Nykyinen tutkimus on tarjonnut uusi lähestymistapa tuottaa aiheuttama syöpä kuten kantasolujen avulla

in vitro

onkogeeninen uudelleenohjelmointi ja onnistuneesti aloittanut elinspesifiseen pahanlaatuinen kasvain muodostumista käytettäessä potilaalle tehdä pieneläinten syövän malli.

Citation : Cho S, Park H, Jarboe EA, Peterson CM, Bae YH, Janát-Amsbury MM (2015) suunnittelu ja karakterisointi biotekniikalla Cancer-Like Kantasolut. PLoS ONE 10 (10): e0141172. doi: 10,1371 /journal.pone.0141172

Editor: Masaharu Seno, Okayama University, Japani

vastaanotettu: 21 heinäkuu 2015; Hyväksytty: 03 lokakuu 2015; Julkaistu: 21 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Cho et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

hierarkkinen teoria järjestämistä syöpä viittaa siihen, että vain pieni joukko soluja vastaa aloittamisesta ja edelleen syöpäsolujen kasvun [1-3]. Ne pienet populaatiot solut on määritelty syövän kantasolut (CSCS). Muun muassa CSCS näytteille ominaisuuksia, kuten itseuudistumiseen ja kyky erilaistumaan heterogeenisiä ja tuumorigeeniset syöpäsoluja [1, 4]. Otaksuttu CSCS eri kasvaimia, mukaan lukien aivot, rinta, ja munasarjasyöpä eristettiin tasalla perustuu niiden spesifisten molekyylien tai yhdistelmän solumarkkerit (esim CD133, CD44, ALDH) [5-9]. Tuumorigeenisen potentiaalin näiden solujen on osoitettu eri ksenografti-tutkimukset käyttäen immuunikatopotilaiden hiirissä [5, 6, 10]. Kuitenkin edelleen karakterisointia CSCS ’ominaisuuksia ja voimavaroja on haitannut luontainen vaikeudet eristää puhdasta CSCS populaatiot, eteneminen näistä eristetty CSCS, ja erilaistuminen CSCS oikeassa varren markkinaraon [11].

Normal fibroblasti ja rintojen soluja voidaan muuntaa niiden aiheuttama syöpäsolujen

in vitro

uudelleenohjelmointi kautta eksogeenisen geneettisen vuorottelujen vastuussa pidentämisen osalta telomere (hTERT), joka tarjoaa konstitutiivista leviämisen signaaleja (H

ras

V12), ja kasvun estämiseen vaimennin reittejä, kuten p53 ja pRB, jonka apinan virus 40 (SV40), antigeenit [12, 13]. Samoilla linjoilla on

in vitro

uudelleenohjelmointi, Scaffidi

et al

raportoitu, että somaattisten solujen saanut tarpeeksi plastisuus ohjelmoitava uudelleen ja hankkia CSC ominaisuuksien kautta

in vitro

onkogeenisia käyttöönotto [ ,,,0],14]. Lukuisia viittauksia, erityisesti tutkimuksessa hematologisten syöpien, osoitti, että CSCS voi olla peräisin kudoksesta varsi, progenitorisolujen, ja jopa somaattisten solujen [10, 14-18]. Kuitenkin potentiaali

in vitro

uudelleen ohjelmointi alkion kantasolujen CSCS on jäänyt epäselväksi.

Tässä tutkittiin, onko hiiren alkion kantasoluja (mESCs) voidaan onnistuneesti ohjelmoida uudelleen osaksi aiheuttaman syövän kuten kantasolut (iCLSCs) kautta

in vitro

onkogeenisia manipulointia. Lisäksi altistamalla iCLSCs erilaisiin erityisiä mikroympäristöihin

in vivo

, voisimme tarkkailla mahdollisia näiden iCLSCs tuottaa paikkakohtaisia ​​iCLSC kasvaimia immuuni hiirissä.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja Plasmidit

seuraavat materiaalit hankittiin valmistajilta osoitti: (a) Fugene 6 (Promega, Madison, WI), (b) Polybrene ja FBS (Sigma-Aldrich, St-Louis , MO), (c) Geltrex (Invitrogen, Carlsbad, CA) (d) Mycozap plus CL (Lonza, Allendale, NJ), (e) pBabe-H

ras

V12 (# 1768), pBabe- SV40 LTG (# 10891), pMSCV-GFP (# 33336), ja pMSCV-RFP (# 33337) (Addgene, Cambridge, MA), (f) VSV-G (Clontech, Mountain view, CA).

Cell Culture

GP2-293 soluja (Clontech) ja niiden johdannaiset, ja γ-säteilytettyjä hiiren alkion fibroblasti (MEF-solut) (Cyagen, Santa Clara, CA) pidettiin DMEM: ssä (ATCC, Manassas, VA ), jota oli täydennetty joko 10% tai 15% naudan sikiön seerumia (Sigma-Aldrich,), vastaavasti. Hiiren alkion kantasoluja (mESCs) (C57BL /6-hiiren alkion kantasoluja, # MUBES-01001, Cyagen) pidettiin Knockout DMEM (Invitrogen), jota oli täydennetty 15%: knockout seerumin vaihto (Invitrogen), 1% L-glutamiinia (Invitrogen) , 1% ei-välttämättömiä aminohappoja (Invitrogen), 0,1% beta-mercaptanol (Invitrogen), leukemiaa estävä tekijä (LIF, 10 ng /ml elatusaineissa, StemRD, Burlingame, CA). Kaikki soluja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C: ssa.

Sub-kloonaus geenien pMSCV

Jos haluat tehdä osa-kloonaus, H

ras

V12 ja SV40: n suuren T antigene (LTG) erotettiin pBabe-H

ras

V12 ja pBabe-SV40 LTG entsymaattisella pilkkomalla BamHI ja EcoRI (NEB, Ipswich, MA), tai BamHI (NEB), tässä järjestyksessä. Integrointi H

ras

V12 ja SV40LTg kumpaankaan pMSCV-GFP tai pMSCV-RFP suoritettiin ligaatio T4-ligaasia (NEB) ja tuotti pMSCV-H

ras

V12-GFP ja pMSCV -SV40 LTG-RFP. Integrointi inserttien varmistettiin sekä entsymaattisella digestiolla ja DNA-sekvensoinnilla.

Generation of Retrovirus

tuottaa retrovirussupernatanttia, GP2-293 solut transfektoitiin lyhytaikaisesti joko pMSCV-H

ras

V12-GFP tai pMSCV-SV40 LTG-RFP yhdistettynä replikaatiokyvyttömäksi auttaja vektorin VSV-G on 60 mm viljelymaljalta käyttämällä Fugene 6. soluja syötettiin 24 tuntia transfektion jälkeen, ja retrovirussupernatanttia oli yhdistettiin keräämisestä 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen. Supernatantti jaettiin eriin jälkeen sentrifugoimalla ja säilytettiin -80 ° C: ssa tulevaa käyttöä varten. Virustitteri varmistettiin FACS-analyysillä (FACSCanto Analyzer, BD Biosciences, San Jose, CA) infektion jälkeen 1x 10

5 NIH-3T3 (ATCC) hiiren fibroblastisoluissa.

vakaiden GP2- 293 johdannaiset

tuottaa GP2-293 johdannaiset vakaa geenin integraatio, GP2-293 solut joko tartutettiin H

ras

V12 tai SV40 LTG käyttämällä retroviruksen järjestelmää. FACS lajittelu suoritettiin valita pysyvästi infektoituneiden solujen mukaan GFP tai RFP lauseke (FACSAria solulajittelupus-, BD Biosciences, San Jose, CA). Geeni ilmentyminen stabiili soluissa varmistettiin western blot.

Retrovirusinfektio on mESCs

mESCs pestiin ja trypsinisoitiin. Sentrifugoinnin jälkeen ne suspendoitiin uudelleen seerumia mESCs väliaineessa, joka sisälsi 8 ​​ug polybreeniä per ml PBS: ssä ja maljattiin 1×10

5 solua /1 ml per kuoppa kahdentoista kuoppalevylle. Retrovirussupernatanttia yksinkertaisesta virusta lisättiin 1 ml /1×10

5-soluja tai sama tilavuus suhde retrovirussupernatanttia yksittäisten virus lisättiin-infektio. Sen jälkeen 1h inkuboitu CO

2 yrityshautomo, levy sentrifugoitiin 2 tuntia 1,000 g huoneenlämmössä. Seuraavana päivänä, retroviruksen supernatantit poistettiin; solut suspensoitiin uudelleen mESCs keskipitkällä ja maljattiin ruokia joko päällystetty Geltrex tai päällystetty säteilytettyä MEF. Stabiilisti tartunnan mESCs lajiteltiin FACS perustuen GFP tai RFP ilmentymisen (FACSAria solujen lajittelija).

Western-blottaus

solut lyysattiin RIPA-puskurilla (# 9806, Cell Signaling), johon on lisätty 1 mM PMSF (Sigma-Aldrich). Western-blottaus suoritettiin käyttäen 4-20% gradientti SDS-polyakryyliamidi-Tris-HCl: lä (Mini-PROTEAN tgx

®, BioRad) mukaan valmistajan protokollan (Biorad). Vasta-aineita käytetään western blotting olivat anti-ras (# 610001, 1: 1000, BD Bioscience), anti-SV40: n suuren T ja pieniä t-antigeenin (# 554150, 1: 1000, BD Bioscience), anti-β-aktiini (# A5441 1: 2500, Sigma-Aldrich), ja anti-hiiri-IgG-HRP: tä (# 7076S, 1: 5000, Cell Signaling).

alkalisella fosfataasilla Värjäys ja Immunosytokemia Elävien solujen värjääminen

alkalinen fosfataasi värjäys suoritettiin käyttäen alkalista fosfataasia -värjäyspakkausta II mukaisesti valmistajan protokollan (Stemgent). Immunosytokemiaa värjäys elävien solujen, solujen viljeltiin 12-kuoppaisella levyllä, kunnes näkyviä pesäkkeitä, käsiteltiin vasta-aineella (StainAlive ™ SSEA-1 (DyLight 550 ™), Stemgent), joka oli valmistettu tuoreeseen soluviljelyalustaan ​​kanssa loppupitoisuuteen 2,5 ug /ml. Kun on inkuboitu 30 min 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, solut tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla (automatisoitu mikroskooppi, Nikon, Japani) ja TRITC-suodatin.

proliferaatiomääritystä

Soluproliferaatiomääritys suoritettiin käyttämällä solujen laskenta iinianalyysikitissä-8 (CCK-8, Dojindo, Rockville, MD). Lyhyesti, 100 ui solususpensiota (3000 solua /kuoppa) maljattiin 96-kuoppaiselle viljelylevylle päällystetty Geltrex (Invitrogen). Kasvukauden aikana, solujen lisääntyminen kussakin kuopassa mitattiin 1 h inkuboinnin 10 ui CCK-8 liuoksesta käyttämällä mikrolevyn lukijaa (Spectramax 250, Molecular Device Inc., Sunnyvale, CA) aallonpituudella 540 nm. Vähentämisen jälkeen luontainen absorbanssin median aallonpituudella 540 nm, suhteellinen solujen lisääntymistä (%) laskettiin ([absorbanssi]

testi /[Absorbanssi]

ohjaus) x 100. [Absorbanssi]

valvontaa tarkoitetaan absorbanssin viljeltyjen solujen media päivänä 1 kylvämisen jälkeen solut levylle.

in vivo kasvaimen valmistukseen muutettu mESCs ja histo-patologisen kudoksen arviointi

tutkimus toteutettiin out tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden yliopiston Utahin (Luvan numero: 14-08011).

Sekä muutettu mESCs ja naiivi (valvonta) mESCs viljeltiin yhden viikon MEF tukisolut kunnes näkyvissä pesäkkeitä kuin ennen istutusta. Sillä ortotooppisten munasarjojen bursa ymppäyksen solujen eläinten kuudesta kahdeksaan viikkoa vanhoja, C57BL /6-hiiriä (Jackson Lab, Bar Harbor, ME) punnittiin ennen vatsaonteloon anestesia-injektiot (xylazein-ketamiini; 0,1 ml /10 g kehon paino). Jokainen eläin sijoitetaan makuuasento vastaanotettiin noin ~ 1,5 cm pitkä ja selkä viilto, hieman vasemmalle keskiviivan. Dermis erotettiin ihonalaiskudokset ja pienempi tehtiin viilto selkäpuolen kojelauta tasainen lihas päästä vatsan vatsakalvon. Tunnistamisen jälkeen vasen munuainen, alue välittömästi alapuolella munuainen leikeltiin paikallistaa vasemmalla munasarja, joka sitten ulkoistaa läpi viillon. 1x 10

5-soluja (50 ui 1: 1 seosta, PBS: ää ja Matrigel (# 354248, Corning, Andover, MA)), injektoitiin suoraan munasarja- bursa käyttäen Hamilton-ruiskua (30 G: n neulalla). Soluinokulaation jälkeen, munasarja oli paikka takaisin alkuperäiseen asentoon vatsaonteloon. 4-0 ompeleita käytettiin ommella viillon takaseinän ja iho [19, 20]. Orthotopic ymppäyksen solujen rintojen hiirten suoritettiin injektoimalla 1 x 10

5-soluja (50 ui 1: 1 seosta, PBS: ää ja Matrigel (# 354248, Corning, Andover, MA)), jolloin oikeassa alareunassa nisäkkään rasvaa pad.

Tämä pilotti

in vivo

tutkimuksessa oli mukana (n = 16; S1 taulukko) eläimiä. Lyhyesti, riippuen kasvaimen päällä (maitorauhasen vs. munasarjojen bursa) joko epäkypsä teratomas joilla on pahanlaatuinen ominaisuudet (munasarja) tai kypsä teratomas (rinta) muodostunut. Kokonaismäärä eläinten (n = 16) jaettiin neljään koeryhmään. Ryhmä 1: rintarauhanen ympätty mESC; Ryhmä 2: Munasarjojen Bursa ympätty mESC; Ryhmä 3: maitorauhasen ympätty mESC-Ras-LTG (iCLSCs), Ryhmä 4: Munasarjojen Bursa ympätty mESC-Ras-LTG (iCLSCs). Sen jälkeen potilaalle tehdä soluinokulaation, Hiiriä seurattiin joka toinen viikko koko 15 viikkoa kokeellinen aikoja. Eläimiä pidettiin standardiolosuhteissa Center for Comparative Medicine Animal Facility suuntaviivojen mukaisesti, että institutionaalisten Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) yliopiston Utah. Sillä histo-patologinen arviointi kudosten, hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 käytettiin tilastollisen merkitsevyyden.

Tulokset

rakentaminen pMSCV-HrasV12 ja pMSCV-LTG

retrovirus-plasmidit kanssa MSCV LTR (hiiren kantasolun viruksen pitkää terminaalista toistoa) konstruoitiin kautta osa-kloonaus joko H

ras

V12 tai SV40 LTG geeni moninkertaisen kloonauskohdan (MSC), jota seuraa IRES-ajo ilmaisu GFP tai RFP geenin esitetty kaaviokuva kuviossa 1A. Insertit konstruktit todennettiin entsymaattisesti (kuvio 1 B), ja DNA-sekvensoinnilla.

(A) Genes kohteisiin (eli HrasV12 tai LTG) on asetettu väliin MSCV LTR, ja joko GFP tai RFP geeni oli käytetään merkkikaasuna geeni. (B) Lisäykset kloonattu pMSCV plasmidit varmistettiin entsymaattisella Pilkkomisista joko BamHI: n tai EcoRI. M: DNA tikkaat, 1: pMSCV-GFP; 2: pMSCV-H

ras

V12-GFP; 3: pMSCV-GFP

leikkaus; 4: pMSCV-H

ras

V12-GFP

leikkaus; 5: pBabe-H

ras

V12

leikkaus (+ kontrolli); 6: pMSCV-RFP; 7: pMSCV-SV40 LTG-RFP; 8: pMSCV-RFP

cut 9: pMSCV-SV40 LTG-RFP

leikkaus; 10: pBabe-SV40 LTG

leikkaus (+ kontrolli). Valkoinen nuolet osoittavat inserttejä. Sekvenssit insertin myös varmistettiin DNA-sekvensoinnilla.

perustaminen GP2-293 johdannaisten tuottamiseksi retrovirus

vakaan tuottavien solulinjojen retrovirus, GP2-293 solujen johdannainen 293 ihmisen munuaisen solulinjan stabiili integrointi

gag /pol

retrovirus- komponentit olivat transdusoitiin pMSCV plasmideilla. Solut ilmentävät joko GFP tai RFP lajiteltu FACS (kuvio 2A ja 2B) on edelleen vahvistanut tarkkailemaan niiden vastaavan geenin ilmaisuja immunoblottausanalyysillä kuviossa 2C. Todennetut stabiileja soluja edelleen käytetään tuottamaan retroviruksia kautta transfektion virus kirjekuoren plasmidi, VSV-G. Infektio kyky näiden retrovirusten on osoitettu FACS-analyysillä läpi määrän mittaus retrovi- tartunnan-NIH3T3-hiiren fibroblastien soluja, jotka ilmentävät joko GFP tai RFP (kuvio 2D).

(A) vahvistus onnistuu GFP ekspression GP2 -293 soluja, ja (B) vahvistus onnistuneesta RFP ilmentymisen GP2-293 soluissa käyttöönoton jälkeen pMSCV plasmideihin. BF: kirkaskenttäkuvassa; FL: fluoresenssikuvan. Mittakaava paljas on 400 um. (C) immunoblottianalyysi havainnollistaa stabiili ilmentyminen H

ras

V12 ja SV40 LTG in GP2-293 solujohdannaiset; 1. BL: GP2-293 tyhjä solu; 2. GFP: GFP sisältävä GP2-293 cell 3. HrasV12-GFP: H

ras sisältävä

GP2-293 solu; 4. BL: GP2-293 tyhjä solu; 5. RFP: RFP sisältävä GP2-293 solu 6. SV40LTg-RFP: SV40LTg ja RFP sisältävien GP2-293 solu; M: Proteiini tikkaat. (D) Virtaussytometrianalyysi (FACS) ja 1x 10

5 NIH-3T3 hiiren fibroblastien infektion jälkeen retrovirus valmistettu GP2-293 johdannaisista.

Generation muuntogeenisten mESCs

hiiren alkion kantasolut (mESC) transformoitiin infektion retrovirusten tuotetaan vakaa GP2-293 solujohdannaiset. Geenien ilmentymistä tuodaan mESCs varmennettiin immunoblot-analyysillä (kuvio 3A ja 3B). Vahvista muutokset soluproliferaation, soluproliferaatiota määritykset suoritettiin transformoitiin mESCs, joita verrattiin myös kontrolloida mESCs (kuvio 3C). mESC-H

ras

V12 /SV40 LTG osoitti merkittävää kasvua lisääntymistä verrattuna mESC-GFP ja H

Ras

V12 päivänä 7 (kuvio 3D). Edelleen vertaamalla leviämisen mESC-SV40 LTG ja mESC-H

ras

V12 /SV40 LTG kanssa mESC-RFP, mESC-SV40 LTG ja mESC-H

ras

V12 /SV40 LTG osoitti merkittävää parannusta leviämisen (kuvio 3D). Kuitenkin, ei ollut eroa leviämisen välillä mESC-H

ras

V12 /SV40 LTG ja mESC-SV40 LTG (kuvio 3D).

edustaja kuvia immunoblot-analyysi: (A) H

ras

V12, (B) SV40 LTG. (C) CCK-solulisäkasvumääritykselle 7 päivä proliferaation aikana mESCs ja transformoitujen mESCs. (D) vertailu proliferaatiot 7. päivänä keskiarvo ± S.D. (N = 3), *, ** ja #, ## p 0,05. ANOVA Testi suoritettiin Tukeyn testin jälkeen käyttäen GraphPad Prism-ohjelmiston.

ylläpito stemness jälkeen retroviruksen muuttaminen mESCs

Vahvista stemness transformoituneiden mESCs, ilmaus emäksinen fosfataasi (AP) ja vaihe-erityisiä alkion anitigen-1 (SSEA-1) kantasolujen markkeri arvioitiin. Transformoitujen mESCs (kuvio 4a- (c) – (e)) ilmaistuna samalla tasolla AP värjäys verrattuna infektoitunut (ei-transformoituja) mESCs (kuvio 4a- (b)), joka ilmaisee keskeytymätön ylläpito erilaistumattomien solujen säilyttäen itseuudistuminen potentiaalia . Aikana lisätarkastamista erilaistumattoman tilan transformoitujen mESCs kanssa SSEA-1 spesifistä vasta-ainetta, joka on muunnettu mESCs (kuvio 4B- (b) – (d)) osoitti positiivisia tämän pinnan merkkiainetta, kuten ei-transformoidun mESCs (kuvio 4B- (a )). Havaitsemiseksi sekä AP ja SSEA-1 transformoitiin mESCs osoitti, että muutos menettelyt eivät näytä vaikuttavan stemness on mESCs.

(A) Alkalinen fosfataasi (AP) värjäys. Red-väri näyttää alkalisen fosfataasin aktiivisuuden. (A). Kirkas kuva mESCs; AP-värjäys: (b). mESCs; (C). mESC-H

ras

V12; (D). mESC-SV40 LTG; (E). mESC-H

ras

V12 /SV40 LTG. Mittakaava paljas on 10 pm. (B) Immunosytokemia värjäys elävien-solut, jotka ilmentävät SSEA1. Paria kirkkaita arkistoida ja SSEA1 kuvia: (a). mESCs; (B). mESC-H

ras

V12; (C) .mESC-SV40 LTG; (D). mESC-H

ras

V12 /SV40 LTG. Edustaja kuvat saatiin fluoresoiva mikroskooppi TRITC suodatin. Mittakaava on 100 pm.

luonnehdintoja bioengineered syövän kaltaisia ​​kantasoluja

Vahvista kasvaimia synnyttävän potentiaalin ohjelmoida mESCs, mESC-H

ras

V12 /SV40 LTG soluja joko ortotooppisesti ympättiin vasemmalle munasarjojen Bursa tai tyhjennetään imusolmukkeet utarerasvaa tyynyjä. 31 päivää rokottamisen, munasarjojen massa oli muodostunut hiirillä, jotka tehtiin potilaalle tehdä rokotus on munasarjojen Bursa. Sitä vastoin hiirillä läpikäyneet potilaalle tehdä siirrostamalla imusolmukkeet utarerasvaa pad ei muodostanut massoja. Vatsan sijaintipaikan Hiiren munasarjan rokotus osoitti munasarjamassaa (kuvio 5A) muodossa laajentuneessa vasemmalla munasarja verrattuna normaaliin vasta-sivusuunnassa, ei-ruiskutetaan oikea munasarja (kuvio 5B). Lisäpäätelmien brutto tarkastelun perusteella pistetään vasen munasarja myös näkyvästi osoittanut muodostunut massa murtaa munasarjojen pinnan sekä sitoutumalla vatsakalvon kyljessä. Retroperitoneaalitilan todettiin myös varatusta massan tarttuminen takaseinään, ja vasen munuainen (kuvio 5C). Ei ollut brutto näyttöä vatsan etäpesäkkeiden tästä syntyvät munasarjamassaa.

(A). Vatsan sivuston munasarjamassaa (sininen ympyrä); (B). Kohdunkaula on Kohtu hiiren normaali munasarja (sininen nuoli) ja vasen munasarjamassaa (valkoinen nuoli); (C). Vasen munasarja kanssa osittain ehjä kapselin ja massa murtaa munasarjojen pinnan (sininen ympyrä).

histo-patologinen analyysi munasarjat ruiskutetaan mESC paljasti sukupolven kypsä teratoma näytteille hyvin erilaistunut levyepiteelillä jossa keratinization ja hengityselinten kaltainen epiteelin (kuvio 6a- (b)) verrattuna histologisia piirteitä normaalin munasarjan (kuvio 6a- (a)). Mielenkiintoista, munasarjat pistetään mESC-H

ras

V12 /SV40 LTG myös muodostunut kypsä teratoomat, mutta lisäksi paljasti osilla kehittymätön teratoma sisältävä hajallaan pesäkkeitä korkealaatuinen pahanlaatuinen kasvain, tunnettu pahanlaatuisia soluja järjestetty lineaarisesti , pienissä klustereissa, ja joskus sillä alkeellisia rauhanen kaltaisia ​​rakenteita (kuvio 6a- (c) pieni ikkuna). Korkeampi suurennos paljasti nämä pahanlaatuiset solut olevan huonosti eriytetty korkea tuma: sytoplasmaan suhteet, selvästi epätyypillinen ytimet karkeaksi kokkareista kromatiinin vaihtelevasti näkyvä nucleoli, ja lukuisat mitoottisia (kuvio 6a- (c)). Hiiret, joilla oli imusolmukkeet utarerasvaa tyynyjä pistetään mESCs näytti syntyy kypsä teratomas näytteille hyvin erilaistunut levyepiteelillä, joka sisältää myös haima- kudosta, ja hengityselinten kaltainen epiteelin hyvin muodostuneita värekarvojen (kuvio 6B- (b)) verrattuna histologinen arviointi normaalissa rintakudoksessa (kuvio 6B- (a). Sitä vastoin, rintojen ruiskutetaan mESC-H

ras

V12 /SV40 LTG ei osoittanut mitään merkittäviä histologisia eroja verrattuna normaaliin, ei-ruiskutetaan rintojen kudosta.

(A) Munasarjojen paneeli: (a). Normaali oikeaan (ei-pistetään) munasarja (100X). Mittakaava on 100 pm (b). Vasen Munasarjojen massa (seuraava potilaalle tehdä istuttamisen mESC ) osoittaa merkkejä kypsä teratoma (pieni ikkuna, 100X), tunnettu jossa keskitytään kypsä, keratinisoituvissa levyepiteelillä alueella kuvattu laatikon sisällä (200X). Mittakaava on 100 pm, (c). Munasarjojen massa (seuraavat potilaalle tehdä rokotus jossa mESC-H

ras

V12 /SV40-LTG) merkkejä kypsymättömiä teratoma (pieni ikkuna, 100X) tunnettu hajanaisen pesäkkeitä korkealaatuinen pahanlaatuinen kasvain alueella kuvattu laatikon sisällä (400X). Mittakaava on 100 pm. (B) Rintojen Paneeli: (a). Normaali hiiren maitorauhasen kudoksen (100X). Mittakaava on 100 pm; (B). Rintojen massa (seuraava potilaalle tehdä inokulointi mESC osaksi selvitetty imusolmukkeet utarerasvaa pad) esiintyneen merkkejä kypsä teratoma (pieni ikkuna, 100X) luonnehditaan hengitysteiden kaltainen epiteelin ottaa hyvin muodostuneita cilia alueella kuvattu laatikon sisällä (200X). Mittakaava on 100 pm.

Keskustelu

Tämä tutkimus osoittaa, että hiiren alkion kantasolut (mESCs) voidaan reprogramed osaksi aiheuttama syöpä kuten kantasolut (iCLSC) tuomalla hyvin määritelty onkogeeniset elementtejä, (apinan virus 40 suuri T onkogeenin (SV40 LTG) ja onkogeenisessä ras (H

ras

V12)) hiirellä varsi virus long terminal repeat (MSCV-LTR) -pohjaisen retrovirusplasmidiin .

in vitro

ohjelmoida mESCs näytteillä parantamiseksi leviämisen ja ylläpito kantasolujen ominaisuutensa

in vitro

viljelyolosuhteissa. Lisäksi nämä transformoidut solut osoitettiin myös paikkakohtaisia ​​eroja on potilaalle tehdä kasvaimen muodostumista istuttamisen jälkeen munasarja- ja rintasyövän kudosten immuuni hiirissä. Niinpä ehdotamme, että

in vitro

kyseeseen mESCs onkogeenisella elementtejä voi olla mahdollinen lähestymistapa tuottaa aiheuttama syöpä kuten kantasoluja.

MSCV-LTR retroviruksen on todettu olevan mahdollisesti hyödyllinen väline tehokkaan, onkogeenisen muutos mESCs. Infektoimalla retroviruksia mESCs näyttää erittäin riippuvainen virukset erilaisista retroviruksen plasmideja. Meidän MSCV-LTR retroviruksen järjestelmä, havaitsimme suuremman tartunnan kyky ja ylläpito stabiilin geeni-ilmentymisen, verrattuna yhteiseen Moloney-virus-pohjainen retroviruksen järjestelmä (eli pBabe-sarja). Viimeaikaiset havainnot ovat yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien että retrovirus, joka syntyvät MSCV-LTR-pohjainen retrovirusplasmidiin, voisi ylläpitää pitkäaikaisia ​​ja vakaa geenien ilmentymistä sekä alkion kantasoluja (ES-solut) ja hematopoieettisten kantasolu- (HS) solut [ ,,,0],21, 22].

In vitro

kyseeseen mESCs jotta iCLSC täyttänyt vaatimukset hyvin määriteltyjä onkogeenisen geenejä, H

ras

V12 ja SV40 LTG, sekä neoplastisia transformaatio ja anti apoptoosin. Onkogeeniset ras-mutaatio, jota esiintyy noin 30% kaikista ihmisen kasvaimista, tiedetään mukana prosessissa neoplastisten solujen transformointi

in vitro

ja on hyvin raportoitu [13, 23, 24]. Kuitenkin käyttöönotto konstitutiivisesti aktiivisen muodon ras yksin (eli H

ras

V12) osoitti sen potentiaali herkistävät soluja apoptoosin [24-26] ja jopa induktio ennenaikaisen solun vanhenemista kautta yhdistys p53 kertymistä [27 ]. Meidän proliferaatiomääritys ohjelmoida uudelleen mESC puute paranevat merkittävästi leviämisen ohjelmoidaan uudelleen mESC H

ras

V12 yksin voisi olla osittain selittää induktioon joko solujen vanhenemista tai apoptoosin kautta ilmaus konstitutiivisesti aktiivinen muoto H

ras

V12 yksin. Sen sijaan mESC-SV40 LTG ja mESC-H

ras

V12 /SV40 LTG osoittaneet parantaa proliferatiiviset vaikutukset. Ottaen huomioon antiapoptoottisena asemaa SV40 LTG inaktivoimalla p53 [28], suosittelemme, että käyttöönotto SV40 LTG osaksi mESC voi olla merkitystä estää mESC ennenaikaiselta solu- vanhenemista tai apoptoosin induktion. Lisäksi SV40-LTG voisi tehdä yhteistyötä H

ras

V12 aikana neoplastisen transformaation mESCs kanssa ehkäisy H

ras

V12-solukuolema, jonka todettiin olevan yhdenmukainen eri aikaisempien raporttien [13, 29, 30].

onnistunut ylläpitäminen kantasolujen ominaisuuksia ohjelmoida mESCs voitaisiin vahvistaa

in vitro

ja

in vivo

. Tässä prosessissa

in vitro

kyseeseen mESCs, käytimme retrovirusinfektiolla käyttöön onkogeenisen komponentteja. Vaikka retrovi- geenien etuna on korkea infektio ja vakaa integrointi eksogeenisten geenien isäntäkromosomeista sattumanvaraista Retroviraalisten komponentteja isäntä genomit ei voi sulkea pois häiritseekin tai menetys ilmentymisen kantasolujen ominaisuuksia mESCs. Emme kuitenkaan havaita stabiilia ekspressiota kahden kantasolujen merkkiaineita, alkalinen fosfataasi (AP) ja SSEA-1, seuraavat retroviruksen muutos mESCs. Saadaksemme kattavampi käsitys mekanismien taustalla ylläpito varren geeniekspression seuraavat retrovirusinfektiolla, lisätutkimuksia tarvitaan. Sen lisäksi, että ylläpito kantasolujen ominaisuudet

in vitro

, potilaalle tehdä inokulointi ohjelmoida mESCs

in vivo

osoitti myös muodostumista kehittymätön teratomas munasarjassa hiirillä. Itse asiassa havaitut teratooma muodostumista

in vivo

, mukaan lukien surkastuneet, pahanlaatuiset komponentteja myös esimerkkinä onnistuneesta huolto kantasolujen ominaisuudet

in vivo

koko uudelleenohjelmointi prosessia.

Jos kehittää erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia kantasoluista todellakin mahdollista, tämä voi vaatia lisätutkimuksia tutkia tarkemmin erityistä roolia eri mikroympäristöjen kasvainten synnyssä [31]. Meidän eläinkokeet pystyimme tarkkailemaan erot teratoma muodostuminen kahdessa eri potilaalle tehdä implantaatiokohtien (munasarja- ja rintasyövän). Vuonna potilaalle tehdä munasarjojen istutusta, mESC-H

ras

V12 /SV40 LTG indusoi sukupolven kehittymätön teratoma näytteille hajallaan pesäkkeitä korkealaatuista pahanlaatuinen kasvain. Kuitenkin rinta sijoitettu kanssa mESC-H

ras

V12 /SV40 LTG eivät osoittaneet muodostumista teratoma. Vaikka panos microenvironment näissä kahdessa sivusto sukupolven maligniteetin jää tutkittavaksi, tuoreessa raportissa Yan T

et al

ehdotti mahdollinen panos kasvaimeen suotuisat microenvironmental tekijät aikana muutosta hiiren aiheuttama pluripotenttien kantasoluja (miPSCs) syöpä kantasolut (CSCS) [32]. Siksi uskomme, että munasarjojen microenvironment voi olla paikka suotuisa etenemistä tumorigeneesin on mESC- H

ras

V12 /SV40 LTG verrattuna paikka rinnan.

Yhteenvetona me osoitti onnistuneen sukupolven aiheuttama syöpä kuten kantasoluja käyttämällä onkogeeninen

in vitro

uudelleen ohjelmointi mESCs. Ohjelmoida mESCs luonnehdittiin kautta kasvaimia synnyttävän geenin ilmentymisen ja esteetön ylläpito varren ominaisuuksien

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi nämä muunnetut solut osoittivat muodostumista teratoomat sisältävien kehittymätön, pahanlaatuinen osia, kun kasvava ortotooppisesti at implantointikohdassa suotuisa kasvaimien synnyn. Rajoitukset Tämän tutkimuksen olemassa perustuu muodostumista kehittyneen teratomas

in vivo

Suhteen kysymys kasvain- suotuisa mikroympäristöihin. Lisäksi ehdotamme välttämättömyyttä poikkeavan mikroympäristön kehittämiseen ja ylläpitoon kasvaimia peräisin aiheuttama syöpä kuten kantasoluja. Jotta paremmin ymmärtää prosesseja luonnon tumorigeneesin sekä luoda ennustettavampi syöpä eläinmalleissa, jatkuva tutkimus yksityiskohtaisen roolit kasvain microenvironment sekä tunnistamiseen mahdollisesti poikkeavien microenvironmental tekijöitä tarvitaan saada tietoa

in vivo

sukupolven erilaisten syöpien peräisin aiheuttama syöpä kuten kantasoluja. Työmme on tarjonnut uraauurtava perustyötä mahdollistaa erilaisia ​​muita tulevaisuuden tutkimusta niiden sovellusten aiheuttama syöpä kuten kantasoluja, mutta lisää tutkimusta tarvitaan paremmin ymmärtämään taustalla olevien mekanismien iCLSCs kasvaimen kehittymisen.

tukeminen Information

S1 Taulukko . Kasvainten muodostumista hiirillä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0141172.s001

(TIF) B

Kiitokset

Tekijän kiittää Dr.Yongen Sun hänen tuki suorittaa kaikki eläinten leikkauksia, Kathy Harvey hänen oikolukua käsikirjoituksen, The biorepository ja molekyylitason patologia (BMP) ryhmä Huntsman Cancer Institute ystävällisestä tuesta käsittelyssä histopatologinen värjäytyminen kudoksissa, ja tohtori James Marvin ja Mr. Chris Leukel heidän tällaista tukea FACS lajittelu solujen Utahin yliopistossa virtaussytometrialla ydin.