Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

seerumimarkkereiden edustavat mahdollisia työkaluja havaitsemiseksi peräsuolen syöpä (CRC). Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia saada proteomic ekspressioprofiileja ja tunnistaa seerumimarkkereiden varhaiseen havaitsemiseen CRC.

Methods

proteomiikan profiilit seeruminäytteitä kerätään 35 terveillä vapaaehtoisilla, 35, joilla on pitkälle suolen kasvainten (ACA), ja 40 potilasta, joilla CRC verrattiin käyttämällä Clinprot tekniikkaa. Käyttämällä entsyymi-immunologiset määritykset (ELISA), 366 seeruminäytteet analysoitiin lisäksi, ja Immunohistokemiatutkimukset 400 kudoksia käytettiin tarkistaa ilmentymistä kininogeeniä-1 ja sen arvo varhaiseen toteamiseen CRC.

Tulokset

Hoitojen mallit luotiin kolmesta ryhmästä, ja kininogeeniä-1 identifioidaan potentiaaliseksi merkkiaineena CRC avulla Clinprot tekniikkaa. ELISA havaitsi myös merkittävästi korkeampi seerumin kininogeenista-1 tasot ACA ja CRC potilailla verrattuna kontrolleihin (

P

0,05). Lisäksi alla oleva alue receiver operating ominaiskäyrä (AUC) seerumin kininogeenista-1: n diagnosoinnissa ACA oli 0,635 (P = 0,003), ja seerumin karsinoembryonaalinen antigeeni (CEA) oli 0,453 (P = 0,358). Herkkyys, spesifisyys ja tarkkuus seerumin kininogeeniä-1 diagnosoinnissa Duke vaiheessa A ja B CRC oli 70,13%, 65,88%, ja 67,90%: lla, kun taas seerumin CEA oli 38,96%, 85,88%, ja 63,58%: lla. Lisäksi immunohistokemia osoitti, että ilmentyminen kininogeeniä-1 oli merkitsevästi korkeampi CRC ja ACA kudosten kuin normaalissa limakalvo (48,39% vs. 15,58% vs. 0%,

P

0,05).

Johtopäätökset

Nämä tulokset viittaavat siihen, että Clinprot tekniikka on hyödyllinen väline diagnoosi CRC, ja kininogeeniä-1 on mahdollinen seerumi biomarkkeri varhaiseen toteamiseen kehittyneiden suolen kasvainten ja CRC.

Citation: Wang J, Wang X, Lin S, Chen C, Wang C, Ma Q, et al. (2013) tunnistaminen kininogeeniä-1 kuin Serum biomarkkeri Early Detection of Advanced peräsuolen adenooma ja peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (7): e70519. doi: 10,1371 /journal.pone.0070519

Toimittaja: Mitsunobu R. Kano, Okayama yliopistossa Japanissa

vastaanotettu: 14 marraskuu 2012; Hyväksytty: 25 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 23 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia tieteen ja teknologian suunnittelu projekti Guangdong (2010B031600098) ja tieteen ja teknologian kehityksen ohjelma Guangzhou kunta (2060402). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on arvioitu, että yli 143.000 yksilöiden Yhdysvalloissa diagnosoidaan peräsuolen syöpä (CRC) vuonna 2012, ja yli 50000 yksilöitä kuolee tähän sairauteen [1]. Seulomalla keskimäärin riskin yksilöitä, se on arveltu, että CRC voitaisiin havaita varhaisessa vaiheessa, mikä vähentää kuolleisuus liittyy CRC [2] – [4]. Nykyisin CRC seulonta voi sisältää ulosteen piilevän veren testi, sigmoidoskopiaa, ja kolonoskopia [5]. Monissa resursseja rajoitettu maissa ulosteen piilevän veren testi käytetään pääasiassa huolimatta riittämätön Tämän määrityksen herkkyys [6], [7]. Lisäksi kun sigmoidoskopiaa ja kolonoskopia ovat invasiivisia ja hankalia menettelyjä, niiden soveltamista CRC seulonnat on rajoitettu [8]. Siksi vähemmän invasiivisia ja ei-invasiivisia lähestymistapoja tarvitaan parantaa herkkyyttä ja potilaan hoitomyöntyvyyttä CRC seulonnat.

tunnistaminen serologisia biomarkkereita spesifinen CRC voisivat olla melko ei-invasiivisia ja edullisin menetelmäksi CRC verrattuna nykyiseen seulontaan vaihtoehtoja. Kuitenkin seerumi on monimutkainen kehon nesteen, joka sisältää monia erilaisia ​​proteiineja. Esimerkiksi yli 10000 erilaisia ​​proteiineja on havaittu ihmisen seerumissa, ja monet proteiineista erittyy tai irtoa solujen aikana erilaiset fysiologiset tai patologisia [9], [10]. Siksi on vaikeaa tunnistaa taudin aiheuttaman seerumimarkkerin. Johtuen edistysaskeleet proteomiikan menetelmiä, se on nyt mahdollista nopeasti tunnistaa uusia ehdokas merkkiaineita syöpään. Esimerkiksi, monet tutkimukset ovat osoittaneet, että kapasiteettia matriisin laserdesorptio /ionisaatio-lentoaika-massaspektrometrialla (MALDI-TOF-MS) erottamiseksi monimutkaisia ​​seoksia proteiineista, mikä helpottaa vertailua vaihtelut proteiinin ilmentyminen normaalissa ja syöpä seeruminäytteet [11] – [13]. Erityisesti Clinprot tekniikka, joka perustuu MALDI-TOF-MS, on monia etuja kliinisissä sovelluksissa, mukaan lukien sen herkkyys, helppokäyttöisyys, ja kapasiteetti suuren suorituskyvyn analyysi [14], [15].

käyttäen MALDI-MS, Seraglia

et al.

[16] aiemmin raportoitu kininogeeniä-1 olevan mahdollisesti uusi plasma merkkiaine CRC. Kininogeeniä-1 on monitoiminen proteiini, joka on tärkeä rooli monissa patofysiologisissa prosesseissa [17], mukaan lukien fibrinolyysin, tromboosi, ja tulehdus, sekä ottaa rooli syövän synnyssä [18]. Näiden tulosten vahvistamiseksi ja tunnistaa muita uusia plasma merkkiaineita CRC, sairastavien potilaiden seerumi CRC, joilla on pitkälle suolen kasvainten (ACA), ja terveet yksilöt analysoitiin käyttämällä Clinprot tekniikkaa, entsyymi-immunologiset määritykset (ELISA), ja immunohistokemia.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasvalinta

Kaikki näytteet kerättiin Nanfang Hospital. Seerumit kerättiin välillä 01 lokakuu 2009 ja 31. joulukuuta 2010. parafinoidut kudokset kerättiin välillä 1 huhtikuu 1999 ja 31. joulukuuta 2007. Potilaat, joilla tiedetään olleen familiaalinen adenomatoottisen polypoosin, perinnöllinen polypoottinen peräsuolen syöpä, verenpainetauti, muita kasvaimet, ja ilmeinen tulehdussairaudet, jätettiin pois. Seuraavat tekijät kirjataan kunkin kudoksen: potilaan ikä, potilaan sukupuoli, kasvaimen koko, kasvain sijainti CRC ja ACA, kudosten histologia ja kasvaimen varten intraepiteliaalisten neoplasia varten ACA, erilaistumiseen, Duke vaiheessa ja kasvain-Node-Metastasis (TNM) vaiheessa (seitsemäs EDN) CRC. Suolen kasvainten potilaat, joilla on vähintään yksi adenooma ≥10 mm, tai joiden villous rakenne tai karsinooma

in situ

, luokiteltiin ACA potilaille [19].

Tämä tutkimus tehtiin mukaisesti institutionaalisten eettiset ohjeet ja hyväksyi Medical Ethics komitean Southern Medical University (# 2011119). Kirjallinen suostumuslomakkeet saatiin kaikista potilaista.

Näytteiden esikäsittely

otettiin seerumit terveillä vapaaehtoisilla, ACA potilaat, ennen leikkausta CRC potilaat (saatu ennen mahdollisia kliinisiä hoitoa), ja postoperatiivinen CRC potilaiden (saatu seitsemän päivää leikkauksen). Sillä Clinprot analyysi, yhteensä 110 seeruminäytteitä saatiin terveiltä vapaaehtoisilta (n = 35), ACA potilaiden (n = 35), ja ennen leikkausta CRC potilaiden (n = 40). Varten ELISA-määrityksissä, yhteensä 366 seerumit saatiin ylimääräinen 85 tervettä vapaaehtoista, 80 ACA potilailla, 143 ennen leikkausta CRC potilaille, ja 58 leikkauksen jälkeen CRC potilailla. Oireettomia ja ilmeisesti tervettä vapaaehtoista valittiin joka ei ollut aiempi syövän. Kaikki näytteet kerättiin 5 ml: n seerumista erotin putkia, ja sitten inkuboitiin huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Sentrifugoinnin jälkeen 3000 rpm 10 minuuttia, seerumit jaettiin 50 ul: n eriä ja säilytettiin -70 ° C: ssa, kunnes niitä tarvittiin.

yhteensä 400 parafinoidut kudokset analysoitiin immunohistokemiallisesti, mukaan lukien 75 normaali peräsuolen limakalvo kudoksia, jotka kerättiin terveillä vapaaehtoisilla, joille tehtiin endoskooppinen limakalvon koepala. Lisäksi 77 ACA kudokset kerättiin ACA potilailla, joille tehtiin endoskooppiset resektio, ja 248 CRC kudokset kerättiin CRC potilailla, joille tehtiin leikkaus. Kaikki näytteet fiksoitiin 10% formaliiniliuokseen ja upotettiin parafiiniin. Osaa (4 pm) leikattiin ja valmistettiin värjäys hematoksyliini-eosiinilla, ja immunohistokemialliset määritykset.

uuttaminen peptidien seerumin avulla magneettiset helmet, Seuraaja MALDI-TOF-MS-analyysi

Serum peptidit erotettiin ja puhdistettiin käyttäen magneettisia helmi-pohjainen heikko kationinvaihtokromatografia puhdistuspakkausta (Bruker Daltonics GmbH). Kaikkiaan 110 seeruminäytettä fraktioitiin standardin protokollan ehdotettu valmistaja. Tiukka laadunvalvonta säilyi tarkkuuden varmistamiseksi ja toistettavuus tuloksista. Seerumin peptidi profiilit analysoitiin sen jälkeen käyttäen Ultraflex MALDI-TOF /TOF-MS (Bruker Daltonik, Bremen, Saksa). Spectra hankittiin massa /varaus (m /z) välillä 1000 ja 10000 avulla FlexAnalysis ohjelmistoa (Bruker Daltonics).

Clinpro Tools ohjelmisto 2.2 (Bruker, Daltonik) käytettiin analysointiin kaikki tiedot johdettujen seeruminäytteistä. Tämä sisältyi raaka saadut ennen hoitoa, Perustason vähentämisen spektrien, normalisoituminen spektri, sisäinen huippu linjaus näkyvä huiput, ja huippu poiminta menettely. Lisäksi esikäsitelty data visualisoitiin ja analysoitiin tilastollisesti käyttämällä Studentin t-testiä ja geneettisten algoritmien (GA). Lisäksi ennustemallit perustettiin käyttäen GA. Voit selvittää tarkkuus ennustemallit syntyy, ristivalidointi suoritettiin. Lyhyesti, kaikki näytteet valittiin koulutus asetettu luokassa ennustajan algoritmia, niin sama näytteet lukuun ottamatta yhtä Satunnaisotos käytettiin Koepakettia. A ’test ”suoritettiin sitten kymmenen kertaa satunnaisesti.

Peptide tunnistaminen MALDI-TOF /TOF

Suoritettuaan tilastollinen analyysi, ilmentyvät eri peptidit tunnistettiin. Aluksi, mono-isotooppinen massat peptidien m /z välillä 1000 3000 määritettiin käyttämällä on heijastava tila. Sen jälkeen kun MS /MS-spektrit esiaste ionien hankittiin TOF /TOF-tilassa, MS /MS-tiedot alistettiin Mascot tietokantahaku tunnistaa vastaavan täyspitkän proteiinin ottelut.

entsyymi-immunologinen määritys ( ELISA) B

Kaikki seerumit analysoitiin sokkona, ja standardeja ja näytteet ajettiin kolmena kappaleena. Kininogeeniä-1 pitoisuus kvantitoitiin käyttäen Human kininogeeniä ELISA Kit (nro EK2001-1, Assaypro, MO, USA). Lyhyesti: (1) 25 ui standardia tai näytettä ja 25 ui biotinyloitua kininogeeniä lisättiin 96-kuoppaisille polystyreeni mikrolevyt päällystetty polyklonaalisella vasta-aineella ihmisen kininogeeniä. 2 h kuluttua huoneenlämpötilassa, levyt pestiin viisi kertaa, sitten 50 ui streptavidiini-peroksidaasikonjugaatin lisättiin kuhunkin kuoppaan. 30 min jälkeen huoneenlämpötilassa, levyt pestiin viisi kertaa ja 50 ui kromogeeni substraattia lisättiin kuhunkin kuoppaan. Sen jälkeen, kun sininen väri riittävän kehittynyt, 50 ui stop-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja absorbanssi on 450 nm: ssä rekisteröitiin käyttämällä mikrolevyn lukijaa. Standardikäyrä muodostetaan ja käytettiin pitoisuuksien määrittämiseksi kininogeeniä-1 näytteissä analysoitiin.

havaita seerumin CEA, kaupallisesti saatavilla entsyymi-immuno- (Whiga, Guangzhou, Kiina) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeita.

immunohistokemia

kininogeeniä-1-vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology (sc-25799, CA, USA). Aiemmin julkaistu protokollaa käytettiin immunohistokemialliset määritykset [20], jossa kininogeeniä-1-vasta-aine laimennettiin 1:150. Kaikki leikkeet sokeasti ja itsenäisesti arvioineet mikroskooppisen kaksi hyvin koulutettu patologia. Värjäytymisen intensiteetti arvioitiin käyttäen puoli- kvantitatiivista pisteytysjärjestelmää seuraavasti: 0, negatiivinen värjäys; 1, heikko värjäytyminen; 2, kohtalainen värjäytyminen; ja 3, vahva värjäytyminen. Jakauma värjäys myös porrastettu prosenttiosuus värjäytyneiden solujen läsnä kohdealueen: 0, positiiviset solut muodostivat 10% syöpäsoluja; 1, positiiviset solut muodostivat 10-50% syöpäsoluja; 2, positiiviset solut muodostivat 50-75% syöpäsoluja; tai 3, positiivisia soluja muodosti 75% syöpäsoluja. Pistemäärät intensiteetin ja jakeluun lisättiin antaa yleisarvosanaksi jokaisesta näytteestä. Lyhyesti, näytteet sai nolla pistettä katsottiin negatiivinen (0), tapaukset vastaanotetaan 1-3 pistettä pidettiin heikosti positiivinen (1+), tapaukset vastaanotetaan 4-7 pistettä pidettiin kohtalaisen positiivinen (2+), ja tapaukset sai lopputuloksen 0,01, yksityiskohtia Materials S1). Lisäksi, 61 huiput olivat erotti kontrolliseerumia ja CRC-potilaiden seerumit, 54 näiden huippujen ollessa tilastollisesti merkitsevä (P 0,01, yksityiskohdat Materiaalit S2).

: edustaja massaspektrit kontrolliseerumin (a ), seerumia potilaalta, jolla ACA (b), ja seerumia potilaalta, jolla on CRC (c). B: MALDI /MS /MS-spektrit ionien m /z 1943,95 (a) ja m /z 2081,01 (b). Paneeli c antaa tulokset Mascot tietokantahaku, mikä osoitti molemmat piikit vastaavat kininogeenista-1.

Käyttäen joka viides huippu, GA pystyi tuottamaan rajat validoitu luokitus malleja eri ryhmille. Paras ennustemallit (tiedot taulukossa 1) saavutettiin tunnustamista kapasiteetti 98,96%, 100,00%, ja 100,00% vertailtaessa CRC ja valvontaa, ACA ja valvontaa sekä ACA ja CRC, vastaavasti. Lisäksi rajat pätevyyttä arviot olivat 95,49%, 100,00%, ja 98,19%: lla.

tunnistaminen CRC Markers

Suurempi pitoisuus peptidien m /z-arvot 1943 ja 2081 näkyivät CRC spektreissä, mutta ei hallitse spektrit (

P

0,01). Käyttämällä MALDI-TOF /TOF-MS ja Mascot tietokannan (Fig. 1 B), MS /MS pirstoutuminen näiden kahden peptidin tunnistanut seuraavat sekvenssit, NLGHGHKHERDQGHGHQ ja HNLGHGHKHERDQGHGHQ, vastaavasti. Lisäksi näiden peptidien todettiin vastaavan alueille samaa kininogeeniä-1 esiaste, a2-tioli proteinaasinestäjä.

seerumipitoisuudet kininogeeniä-1 ja CEA eri Sera Ryhmät

Validoida ekspressio kininogeeniä-1 havaittu potilaiden seerumeista kanssa CRC, seerumin ELISA-määritykset suoritettiin käyttäen 366 saatujen seerumien 85 tervettä vapaaehtoista, 80 ACA potilailla, 143 ennen leikkausta CRC potilaille, ja 58 leikkauksen jälkeen CRC potilailla. Ikä, sukupuoli, seerumin kininogeeniä-1 pitoisuuksien ja CEA pitoisuudet eri ryhmät esitetään taulukossa 2. Keskimääräiset pitoisuudet kininogeeniä-1 havaittu kontrolleissa ja ennen leikkausta CRC potilasta oli 153,22 ± 8,43 mikrog /ml ja 215,62 ± 7,63 ng /ml, vastaavasti, että jälkimmäinen on merkittävästi suurempi (

P =

0,000). Lisäksi tasot kininogeeniä-1 olivat merkitsevästi vähemmän CRC potilailla leikkauksen jälkeen (188,04 ± 11,70 ug /ml;

P =

0,044). ACA potilaiden keskimääräinen kininogeenista-1 konsentraatio oli 194,26 ± 10,14 pg /ml, joka oli merkitsevästi suurempi kuin kontrolliryhmän (

P =

0,003). Sen sijaan ei ollut merkittävää eroa kininogeeniä-1 pitoisuuksien havaittiin preoperative CRC potilaille ja ACA potilaat (

P =

0,082).

seerumin CEA pitoisuudet, tasot ennen leikkausta CRC potilaille, leikkauksen jälkeinen CRC potilaat, ACA potilaita, ja tarkastukset olivat 14,66 ± 2,25 ng /l, 4,48 ± 0,72 ng /l, 3,10 ± 1,15 ug /l, ja 2,43 ± 0,28 ng /l (ACA

vs.

terveillä verrokeilla,

P =

0,797; CRC

vs.

terveillä verrokeilla,

P =

0,000).

Diagnostic arvo Serum kininogeeniä -1 ja CEA Kolorektaalituumorien

arvioimiseksi diagnostinen arvo kininogeeniä-1, ROC käyrä analyysi. Kuten on esitetty kuviossa. 2 Aa, alla oleva pinta-ROC-käyrän (AUC) seerumin kininogeenista-1 yhdessä diagnoosi ACA oli 0,635 (95% CI: +0,551-+0,719, P = 0,003), kun taas AUC liittyy diagnoosi CRC oli 0,706 (95% CI: 0,635-0,777, P = 0,000; Fig. 2 Ac). Näiden pohjalta ROC käyrät, seerumin kininogeenista-1 pitoisuus 162,99 ug /ml valittiin optimaalinen kynnysarvon erottamiselle ACA potilaiden ja verrokkien, joissa herkkyys, spesifisyys, positiiviset ja negatiiviset ennustearvot, ja tarkkuus hinnat ovat 51,25%, 63,53 %, 56,94%, 58,06%, ja 57,58% vastaavasti. Samoin seerumin kininogeenista-1 pitoisuus 173,96 ug /ml valittiin optimaalinen kynnysarvon erottamiselle CRC potilaiden ja verrokkien, kanssa liittyy herkkyys, spesifisyys, positiiviset ja negatiiviset ennustearvot, ja tarkkuus hinnat ovat 63,64%, 65,88%, 75.83%, 51,85%, ja 64,47%: lla.

V: ROC käyrä seerumin kininogeenista-1 (a) ja CEA (b) diagnoosi ACA, ja ROC käyrä seerumin kininogen- 1 (c) ja CEA (d) diagnoosi CRC. B: vertailu herkkyys (Se), spesifisyys (Sp), positiivinen ennustearvo (Pv +), negatiivinen ennustearvo (Pv-), ja tarkkuus (Ac) hinnat havaitsemiseksi kininogeeniä-1 ja CEA diagnoosi Duken vaiheessa A ja b CRC (a) tai Duke vaiheessa C ja D CRC (b).

AUC seerumin CEA koska diagnoosi ACA oli 0,459 (95% CI: 0,370-0,547, P = 0,358; Kuva. 2 Ab), ja koska diagnoosi CRC oli 0,695 (95% CI: 0,627-0,767, P = 0,000; Kuva. 2 Ad). Laajalti hyväksytty raja-arvo on 5 ug /l seerumia CEA on käytetty tässä tutkimuksessa, koska raja-arvo lasketaan ROC-käyrä oli 5,095 ug /L. Siksi käytetään tätä raja-arvo eriyttää CRC potilaiden ja verrokkien, herkkyys, spesifisyys, positiiviset ja negatiiviset ennustearvot, ja tarkkuus hinnat todettiin olevan 38,46%, 85,88%, 82,09%, 45,34%, ja 56.14%: lla. Täten CEA liittyi alhaisempi herkkyys ja tarkkuus verrattuna kininogeeniä-1.

Edellä mainitut viisi parametreja käytettiin myös arvioida kininogeeniä-1 ja CEA tunnistus Duke vaiheessa A ja B CRC potilailla. Sillä kininogeeniä-1, hinnat olivat 70,13%, 65,88%, 65.06%, 70.88% ja 67,90%, tässä järjestyksessä. CEA, hinnat olivat 38,96%, 85,88%, 71,43%, 60,83%, ja 63,58%: lla. Lukuun ottamatta spesifisyys ja positiivinen ennustearvo arvot, arvot muiden parametrien, jotka liittyvät kininogeeniä-1 olivat paremmat kuin CEA (Fig. 2 Ba). Kun Duke vaiheessa C ja D CRC potilaat analysoitiin, edellä mainitut viisi parametrit kininogeeniä-1 olivat 72,73%, 65,88%, 62,34%, 75,68%, ja 68.87%: lla, ja CEA, olivat 34,85%, 85,88%, 65,71 %, 62,93%, ja 63,58% vastaavasti. Samanlainen Duke vaiheessa A ja B CRC potilaita, parametrit kininogeeniä-1, lukuun ottamatta spesifisyys ja positiivinen ennustearvo arvojen, olivat paremmat kuin CEA (Fig. 2 Bb). Lisäksi herkkyys, negatiiviset ennustearvot, ja tarkkuus hinnat paranivat, kun CRC potilaalla oli positiivinen tulos seerumin kininogeeniä-1 ja /tai seerumin CEA. Sen sijaan, spesifisyys hinnat liittyvät näihin positiiviset väheni huomattavasti (taulukko 3).

ekspressiotasot kininogeeniä-1 Normaali peräsuolen limakalvon, ACA Kudokset, ja CRC kudokset

kininogeeniä -1 voidaan havaita verestä fysiologisissa olosuhteissa. On kuitenkin epäselvää, onko korkeampi kininogeeniä-1 havaittu seerumissa potilailla, joilla Kolorektaalituumorien juontuu peräsuolen kasvain itse. Näin ollen, immunohistokemialliset määritykset suoritettiin arvioimaan ilmentymisen kininogeeniä-1 peräsuolen kudoksiin. Kaikkiaan 75 normaalin peräsuolen limakalvon kudoksissa, 77 ACA kudoksia, ja 248 CRC kudokset tutkittiin. Ei merkittävää eroa ilmentymistä kininogeeniä-1 havaittiin miehillä naaraita kolmesta ryhmästä (

P

0,05). Lisäksi immunoreaktiivisuus kininogeeniä-1 havaittiin sytoplasmassa ACA ja CRC-solut (Fig. 3 A-C), ja ilmentymistaso kininogeeniä-1 oli merkitsevästi korkeampi CRC kudoksissa kuin ACA kudoksissa tai normaali limakalvo (48,39 %

vs.

15.58%

vs.

0%,

P

0,05; Fig. 3d).

edustaja immunovärjäyksin of kininogeeniä-1 normaalissa peräsuolen limakalvo (A), ACA kudos (B), ja CRC kudos (C). Molemmat katsauksen (20 x) ja suurennus (40 ×) kuvaa tarjotaan, sen kanssa palvelee upotettavat laatikoita vasemmassa yläkulmassa kunkin paneelin. D: kvantifiointi kininogeeniä-1 tasot valvonnassa, ACA, ja CRC ryhmiä. E: Eloonjäämiskäyrät valvontaa, ACA, ja CRC ryhmiä. Sininen viiva CRC potilaiden negatiivinen kininogeeniä-1 ilmentymisen ja vihreä viiva CRC potilaiden positiivisia kininogeeniä-1 ilmentymisen.

Korrelaatio kininogeeniä-1 Expression kanssa kliinis-ACA ja CRC Potilaat

väliset korrelaatiot sytoplasminen kininogeeniä-1 tasot ja kliinis-ACA ja CRC potilaat analysoitiin erikseen. Vaikka sytoplasmisen kerääntymisen kininogeeniä-1 havaittiin negatiivisesti korreloivan kudosta histologisesti ACA potilaille (

r

s

= -0,250, p = 0,029), se ei korreloinut kasvaimen sijainti, kasvaimen koko, tai luokan intraepiteliaalisia neoplasia (kaikki

P

0,05, tiedot taulukossa S2). Sen sijaan, sytoplasmisen kerääntymisen kininogeeniä-1 korreloi merkitsevästi Duke vaiheessa ja imusolmuke etäpesäke asema CRC (

r

s

= 0,151, P = 0,018 ja

r

s

= 0,128, P = 0,045, vastaavasti). Kuitenkin, se ei korreloinut kasvaimen sijainti, kasvaimen koko, tuumorisolun erilaistumisen, tai kaukaisia ​​etäpesäkkeitä (kaikki

P

0,05, tiedot taulukossa S3).

Survival Analysis

CRC potilailla (n = 110) analysoitiin lisää arvioida mahdollisen yhteydestä kininogeeniä-1 immunoreaktiivisuus ja potilaan selviytymistä. Kuviossa 3E, selviytymisen käyrä mukaan sytoplasminen kininogeeniä-1 tasot näytetään. Keskimääräinen elinaika CRC potilaille, joilla on negatiivinen verrattuna positiivinen kininogeeniä-1 ilmentyminen oli 45,21 ± 3,17 kuukautta ja 38,15 ± 3,07 kuukautta, vastaavasti. Siten potilailla, joilla on negatiivinen kininogeeniä-1 ilmentymisen oli pidempi elinaikajakson kuin ne, joilla on positiivinen kininogeeniä-1 ilmentymisen, vaikka ero ei ollut merkittävä (

P =

0,166).

Keskustelu

seulonta adenoomien ja varhaisvaiheen CRC on vähentynyt esiintyvyys ja kuolleisuus CRC Yhdysvalloissa viime vuosikymmeninä [3]. Kuitenkin nykyinen seulontamenetelmät eivät tarjoa hyvää herkkyyttä. Siksi ponnisteluja jatketaan suunnattava kehittää uusia diagnostisia tai seulonta seerumimarkkereiden CRC. Lisäksi edistysaskeleet proteomiikan tekniikka ovat helpottaneet tunnistamisen uusien biomarkkereiden. Erityisesti Clinprot tekniikka on todettu tarjoavan erittäin tarkkoja ja toistettavia tuloksia, hyvä taso herkkyys, ja on yhteensopiva suurikapasiteettisten muoto nopeaa tunnistamista proteiineista [21]. Näin ollen, proteomiikka profiileja erilaisten ihmisten sairauksia on saatu käyttämällä Clinprot metodologiaa [22] – [24]. Esillä olevassa tutkimuksessa Clinprot protokolla säädetty ennustavat mallit CRC ja ACA vs. terveiden verrokkien, ja myös välillä ACA ja CRC. Lisäksi tunnustaminen valmiudet näiden mallien olivat 98,96%, 100,00%, ja 100,00%, tässä järjestyksessä. Näin ollen, kininogeenista-1 identifioidaan potentiaaliseksi markkeri CRC ja ACA, ja nämä tulokset on validoitu käyttämällä ELISA: aa. Yhdessä nämä tulokset vahvistavat tarkkuutta Clinprot teknologia.

Kertyvät todisteita osoittaa edelleen rooli kininogeeniä-1 karsinogeneesis- [25]. Esimerkiksi vähensi tasot kininogeeniä-1 on havaittu virtsassa munasarjasyöpäpotilaalla verrattuna verrokkeihin [26]. Aikaisemmat tutkimukset ovat myös osoittaneet, että kininogeeniä-1 esittelee antiangiogeenistä ominaisuuksia ja välittää estävä vaikutus on endoteelisolujen proliferaatiota [27]. Lisäksi syöpäpotilailla, alhaisempi kininogeeniä-1 ilmentymisen on havaittu verinäytteitä, ja nämä tasot voivat edistää eloonjäämistä syöpäsolujen esillä [28]. Kuitenkin rooli kininogeeniä-1 karsinogeneesis- erityisesti CRC, on jäänyt epäselväksi. Esillä olevassa tutkimuksessa seerumin kininogeenista-1 tasot potilailla, joilla ACA tai CRC havaittiin olevan huomattavasti korkeampi verrattuna terveisiin kontrolleihin. On yleisesti hyväksyttyä, että ACA on precancerous vaurio CRC [29]. Siten merkittävä kasvu seerumin kininogeenista-1 tasot näillä potilailla voi edustaa merkkiaine varhaiseen toteamiseen CRC, ja tämä on sopusoinnussa tulokset Qiu

et al.

[30]. Vaikka tutkimus kininogeeniä-1 ilmentymisen havaittiin 118 plasmanäytteet saatiin potilailta, joilla ruoansulatuskanavan syöpään, huomattavasti vähemmän kininogeeniä-1 havaittu [31]. Vaikka tämä on vastoin tulosten kanssa tässä tutkimuksessa, tämä ero voi johtua eroista näytteen koko, näytteen resursseja, ja havaitsemiseen käytetty menetelmä.

mittaukset CEA tasojen on havaittu olevan sopimaton väestön seulonnat johtuen puutteesta tämän määrityksen herkkyys alkuvaiheessa CRC [32], [33]. Paneeli American Society of Clinical Oncology on myös suositellut vastaan ​​CEA testaus CRC seulonnan [34]. Vastaavasti CEA jotka suoritettiin esillä tutkimuksessa ei diagnostista arvoa ACA (AUC = 0,453), ja oli myös alempi herkkyys (38.96%

vs.

70,13%) ja tarkkuus (63.58%

vs.

67,90%) ja Duke vaiheessa A ja B CRC verrattuna kininogeeniä-1. Nämä tulokset osoittavat, että valvontaa seerumin kininogeeniä-1 on arvokkaampi kuin havaitaan CEA alkuvaiheessa CRC. Lisäksi kun molemmat seerumin kininogeeniä-1 ja tasot CEA seurattiin CRC potilailla, spesifisyys ja positiivinen ennustearvo nämä tulokset parantuneet. Näin ollen, havaitseminen kininogeeniä-1 yhdessä muiden tuumorimerkkiaineiden on suositeltavaa. Lisäksi jos potilas on todettu olevan positiivisia kininogeeniä-1 ja CEA, mutta negatiivinen alfa sikiön proteiinia, niin on mahdollista, hän /hän kärsii CRC sijaan maksasyövän. Lisätutkimuksia tarvitaan vahvistaa tämän hypoteesin.

postoperatiivista CRC potilailla, seerumin kininogeeniä-1 olivat pienempiä kuin preoperatiivisen CRC potilaista. Vaikka on vielä epäselvää, miksi tämä havaittiin, se on arveltu, että lisääntynyt tuotanto kininogeenista-1 juontuu kasvain kudoksista. Tämä tukee immunohistokemian saadut tulokset, jotka osoittivat kininogeeniä-1 kertynyt sytoplasmassa ja peräsuolen kasvainsoluissa. Kuitenkin mekanistinen yksityiskohtia tätä prosessia edelleen epäselviä. Lisäksi soluliman kertyminen kininogeeniä-1 korreloi merkitsevästi imusolmuke etäpesäke tila potilailla, joilla on CRC. Kuitenkin selviytymisen analyysin CRC potilaiden mukaan kininogeenista-1 ilmentymisen löydetty merkittävää eroa negatiivisen ja positiivisen kininogeeniä-1 ilmentymisen ryhmässä, mikä osoittaa ennustetta arvon kininogeeniä-1 on rajoitettu.

Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus raportoi havaitsemista kininogeeniä-1 in ACA ja CRC potilaita, joilla validointi ELISA ja immunohistokemiallisesti. Näiden tulosten perusteella, kininogeeniä-1 näyttää olevan potentiaalinen CRC markkeri, joka voi olla arvokas varhaiseen havaitsemiseen CRC, erityisesti yhdessä muiden biologisten merkkiaineiden väestöstä seulontoihin CRC. Analyysi ylimääräisiä potilaalla, joista standardoitu käsittely saatujen näytteiden, tarvitaan tarkistaa ja laajentaa nykyisen tuloksia. Lisäksi mekanistinen tutkimukset kininogeeniä-1 in Kolorektaalituumorien ovat aiheellisia.

tukeminen Information

Taulukko S1.

tärkeimmät kliinis ominaisuudet osallistuneista potilaista löytö ja validointi ikäryhmät.

doi: 10,1371 /journal.pone.0070519.s001

(DOC) B Taulukko S2.

Korrelaatio kininogeeniä-1 ilmentymisen ja viittaavia tekijöitä ACA potilaista.

doi: 10,1371 /journal.pone.0070519.s002

(DOC) B Taulukko S3.

Korrelaatio kininogeeniä-1 ilmentymisen ja viittaavia tekijöitä CRC potilaista.

doi: 10,1371 /journal.pone.0070519.s003

(DOC)

Materiaalit S1.

ClinProt Peak-tilasto välillä terveillä verrokeilla ja ACA potilaita.

doi: 10,1371 /journal.pone.0070519.s004

(XLS)

Materiaalit S2.

ClinProt Peak-tilasto välillä terveillä verrokeilla ja CRC potilaita.

doi: 10,1371 /journal.pone.0070519.s005

(XLS) B

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää Profs . Yali Zhang ja Yadong Wang, heidän ehdotuksia patologian.