Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Yleisimpiä ihmisen syöpäsairauksia, invasiivisia duktaalikarsinooma haiman on pahin ennuste. Köyhät tulos näyttää olevan johtuvan vaikeuksia varhaiseen havaitsemiseen.

Methods

Vertasimme plasman proteiineihin profiilit 112 haimasyövän potilaalla on kuin 103, sukupuolen ja iän terveisiin ( kohortin 1) käyttäen äskettäin kehitetty matriisi laserdesorptio /ionisaatio (oMALDI) QqTOF (kvadrupoli-of-lennon) massaspektrometrialla (MS) järjestelmä.

tulokset

Huomasimme, että hemi -truncated apolipoproteiini AII dimeeriä (ApoAII-2; 17252

m /z

), glykosyloitumatonta apolipoproteiini C III (ApoCIII-0; 8766

m /z

), ja niiden summattu arvo oli merkitsevästi väheni haiman syöpäpotilaiden [

P

= 1.36 x 10

-21,

P

= 4,35 x 10

-14, ja

P

= 1,83 × 10

-24 (Mann-Whitney

U

-testi); area under käyrän arvot 0,877, 0,798 ja 0,903, vastaavasti]. Merkitys edelleen validoitu yhteensä 1099 plasma /seerumi näytteitä, jotka koostuvat 2 retrospektiivinen kohortteja [Cohort 2 (

n

= 103) ja Cohort 3 (

n

= 163)] ja prospektiivinen kohortti [Cohort 4 (

n

= 833)] kerätään 8 hoitolaitosten Japanissa ja Saksassa.

Johtopäätökset

Olemme rakentaneet vankan määrällinen MS profilointitoimilaitteen ja käytti sitä vahvistaa korjauksilla muutettu apolipoproteiinien useita ikäluokat potilaiden haimasyöpä.

Citation: Honda K, Okusaka T, Felix K, Nakamori S, Sata N, Nagai H, et al. (2012) Altered plasma apolipoproteiini Muutokset Potilaat, joilla Haimasyöpä: Proteiinin karakterisointi ja Multi-Institutional Validation. PLoS ONE 7 (10): e46908. doi: 10,1371 /journal.pone.0046908

Editor: Hana Algul, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: toukokuu 30, 2012; Hyväksytty: 06 syyskuu 2012; Julkaistu: 08 lokakuu 2012

Copyright: © Honda et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Program edistämisen Fundamental Studies in Health Sciences suoritti National Institute of Biomedical Innovation Japanin terveysministeriön sekä työ- Sciences Research Avustukset terveysministeriön, Labour and Welfare Japanin National Cancer Center tutkimus- ja kehitysrahasto , ja osittain Saksan Research Foundation (DFG) (FE 940 /2-1). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: HK ja TS ovat työntekijöitä Mitsui TIETOTEOLLISUUS, ja YO ja NO käytetään kuuluvat Molecuence Corporation. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että mikään muu kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

5 vuoden pysyvyys on alle 10%, invasiivisia duktaalikarsinooma haiman on pahin ennuste joukossa enemmän yleisissä ihmisen maligniteettien [1], [2], [3]. Huono tulos haimasyövän potilaat näyttää johtuneen vaikeuksia varhaiseen havaitsemiseen. Useimmat potilaat, joilla alkuvaiheen haimasyöpä ei aiheuta oireita, ja eivät käy klinikoilla ennen kuin sairaus on edennyt jo pitkälle. Koska kirurginen resektio on tällä hetkellä ainoa parantava hoito haimasyöpä, varhaista havaitsemista ennen etäpesäkkeiden kehittymisessä on tärkeää parantaa sen tulosta. Ei kuitenkaan seulontamenetelmä on perustettu haimasyövän [2]. Enhanced tietokonetomografia (CT) ja positroniemissiotomografia (PET) ovat käyttökelpoisia diagnosointiin haiman sairauksien, mutta nämä säännöt ovat mahdollisesti vaarallisia ja olisi todennäköisesti liian työvoimavaltaista ja kustannus-tehoton joukkoseulonnan, koska suhteellisen vähäinen ilmaantuvuus haimasyövän.

verenkierrossa proteomiin erittäin lupaava varastona on tietoa, jota voidaan käyttää diagnosoinnissa erilaisten fysiologisten ja patologisten tilojen [4]. Olemme aiemmin löydetty plasmasta biomarkkereiden joukko, joka pystyi erottamaan haimasyövän potilaille mukaan lukien ne, joilla on vaiheen I ja II sairaus terveistä yksilöistä massaspektrometrialla (MS) -pohjaisen proteomiikka [5]. Kuitenkin, se ei ollut mahdollista tunnistaa markkeriproteiinien, ja numerot /lähteet tapauksissa ja tyypit taudin rajoittuivat [6].

Tässä tutkimuksessa, päätimme aminohapposekvenssit ja muunnoksia merkki proteiinit ja validoitu niiden merkitys suurempien ikäryhmät. Kirjoittajat raportoivat, että molemmat modifioidut muodot plasman /seerumin apolipoproteiinien vähenevät potilailla, joilla haiman tauteja.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasnäytteet

neljä kohortteja (eli Kohorteissa 1 -4), joka koostuu yhteensä 1314 plasma- tai seeruminäytteet kerättiin seuraavat hoitolaitosten kahdessa maassa (Japani ja Saksa) (taulukot S1 ja S2):

kohortti 1.

215 plasmanäytteet [, sukupuolen ja iän sovitettu histologisesti tai sytologisesti todistettu haiman adenokarsinooma (

n

= 103) ja terveillä verrokeilla (

n

= 112)] kerätään National Cancer center Hospital (NCCH) (Tokio, Japani) ja Tokion Medical University Hospital (TMUH) (Tokio, Japani) välillä elokuussa 2002 ja helmikuussa 2005 kuten raportoitu aiemmin [5].

kohortti 2.

103 plasmanäytteistä [, sukupuolen ja iän sovitettu haimasyövän potilaat (

n

= 62) ja terveillä verrokeilla (

n

= 41)] hiljattain kerätty NCCH elokuun 2003 Toukokuu 2005.

kohortti 3.

163 seeruminäytettä [haimasyövän potilaat (

n

= 52), potilailla, joilla on krooninen haimatulehdus (

n

= 58) ja terveillä verrokeilla (

n

= 53)] kerätään laitoksella General Surgery, University of Heidelberg (Heidelberg, Saksa) vuosien 2003 ja 2006 [7], [8].

Kohortti 4.

833 plasmaa (ja seerumin) näytteet kerättiin takautuvasti 7 hoitolaitosten Japanissa [NCCH, Osaka National Hospital (Osaka, Japani), Jichi Medical School Hospital (Shimotsuke, Japani), Osaka Medical Center syövän ja sydän- ja verisuonisairaudet (Osaka, Japani), TMUH, Osaka Medical College Hospital (Osaka, Japani), ja Fukuoka University Hospital (Fukuoka, Japani)] elo 2006 lokakuuta 2008 tätä tutkimusta. Asiakirja yksityiskohtaisesti toimintaohjeistojaan jaettiin jokaiseen instituutin, ja kaikki plasmanäytteet kerättiin prospektiivisesti identtisissä oloissa. Tämä oli olennaisesti sairaalassa-kohortti koostuu terveillä vapaaehtoisilla ja tulokkaita lähinnä ruoansulatuskanavan palveluihin sairaaloiden. Lopullinen diagnoosit potilaista kerättiin erikseen niiden verinäytteistä. Kirjallinen suostumus saatiin kaikista aiheista. Tutkimuksen protokolla tarkasteli ja hyväksynyt eettinen komitea kunkin osallistuvan toimielimen.

kerääminen ja varastointiolosuhteet (kuten kerääminen putket, antikoagulantit, lämpötila, ja numero sulatus ja jäädytys syklit) pidettiin täsmälleen samoja keskuudessa plasmanäytteet saman kohortin. Ilmeisesti hemolysoituneet näytteet jätettiin pois. Kaikki näytteet sokaisi ja satunnaistettiin ennen MS-analyysiä (yksityiskohtaiset menettelyt ovat saatavilla Methods S1). Vain plasmanäytteistä käytettiin MS-analyysi kohortti 4. Varmistaakseen mittauksien toistettavuus, näytteiden Cohort 4 analysoitiin itsenäisesti kaksi tutkimusryhmät eri laboratorioissa [NCCRI (Tokio, Japani) ja Molecuence Corporation (Yokohama, Japani)] .

Immunosaostusanalyysi ja Immunoblottausmääritys

Anti-pan ApoAII kanin polyklonaalinen vasta-aine hankittiin Abcam (Cambridge, UK). Immunosaostus suoritettiin käyttäen immunoaffiniteettikromatografisesti (IAC) Protein G-helmiä (Bruker Daltonics). Kaksi kanin polyklonaalisia vasta-aineita nostettiin vastaan ​​ApoAII monomeerin peptidien -ATQ ja -AT C-päät. cDNA-fragmentit ApoAII (koodaa aminohappoja 1-100 ja 1-99; NP_001634) monistettiin PCR: llä ja subkloonattiin pGEX-6P-2-plasmidit (GE Healthcare). N-terminaalisesti glutationi-S-transferaasin (GST) leimatun fuusioproteiinit ekspressoitiin

Escherichia coli

ja affiniteettipuhdistettiin glutationi-Sepharose 4B (GE Healthcare), kuten aiemmin on kuvattu [9]. Reaktiivisuutta vasta-aineiden kanssa GST-merkittyjen proteiinien arvioitiin kuten aiemmin on kuvattu [10].

Proteiininäytteet erotettiin SDS-PAGE: lla ja elektroblotattiin päälle polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore, Billerica, MA). Täplät visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi kit (GE Healthcare) ja määrällisesti kuten aiemmin on kuvattu [11].

CA19-9 Measurement

seeruminäytteitä kohortti 4 analysoitiin käyttämällä kaupallisesti saatavilla kemiluminesenssin entsyymi-immunomääritys sarjoja CA19-9 (LUMIPULSE Presto CA19-9, Fujirebio Inc., Tokio, Japani) [5].

tilastot

tilastollisesti merkitseviä eroja havaittiin käyttämällä Mann-Whitney

U

-, Student

t

– ja χ

2 testiä. Vastaanotin operaattori (ROC) dikäyrät ja AUC-arvot laskettiin käyttäen StatFlexs ohjelmistoa (versio 5.0, Artech, Osaka, Japani) ja moduulien R-projektin (https://www.r-project.org/) [5 ], [12], [13].

tulokset

kehittäminen MS mittaus High uusittavuus

Olemme kehittäneet plasman proteiineihin profilointitoimilaitteen käyttämällä automatisoitua hydrofobinen kromatografia ja oMALDI QqTOF-MS. Eräässä laadunvalvonta kokeilu, 2173 riippumaton alhaisen molekyylipainon (alueella 1000-30,000

m /z

) proteiinin piikkiä havaitaan 5 ui näytettä sekoitettu plasmaa terveillä vapaaehtoisilla. Keskimääräinen korrelaatiokerroin (CC) arvo kaikille 2173 huippujen joukossa kolmena mittauksissa oli 0,983 (Fig. 1A). Toistettavuus mittauksen varmistettiin edelleen laskemalla variaatiokerroin (CV) arvot huiput kohteisiin (katso jäljempänä) (Fig. 1 B).

(A) Kaksiulotteinen käyräanalyysillä osoittaa korrelaatiota 2173 vastaava huiput välillä kahden kolmena mittausten (merkitty punaisella, sininen ja vihreä) standardin plasman sekoitus. Viivat osoittavat 2-kertaiseksi eroja. (B) Standardi plasma seos analysoitiin 24 kertaa, ja CV-arvot [= SD (baaria) /keskiarvo (sarakkeet)] edustavien proteiinin huiput (ApoAI, ApoAII-2ox, ApoAII-2, ja ApoCIII-0) laskettiin . (C) Transition of CC-arvojen kahden mittauksen standardin plasma seoksen 12 levyjen (24 mittausta) ja Cohort 1. (D ja E) korrelaatiomatriisille (D) ja jakelu (E) keskinäisen samankaltaisuuden (CC-arvot) että 24 kahden mittauksen (1-24) .18.

valmiita suuri varasto plasma seoksen laadunvalvontastandardi, ja kaksi erää kannan käsiteltiin samanaikaisesti jokaisen 22 testinäytteiden . CC arvo standardin seurattiin yhdenmukaisuuden varmistamiseksi mittauksen jokaiselle levylle (Fig. 1 C-E).

Proteiinin tunnistaminen tandem-massaspektrometrialla (MS /MS) B

Quantitative plasma MS tiedot saatiin 103 potilasta haimasyöpä ja 112, sukupuolen ja iän terveisiin (kohortti 1). Löysimme 17252-

m /z

MS huippu (Fig. 2, kaksinkertaisella tähdellä), joka erottui, jolla on suurin tilastollinen merkittävyys (

P

= 1.36 x 10

-21, Mann-Whitney

U

-testi) (Fig. S1). Molekyylimassa oli lähes identtinen merkki proteiinin olimme tunnistettu aiemmin käyttää eri MS järjestelmä [5]. MS /MS-analyysillä ja tietokanta /kirjallisuusselvityksiä paljasti, että 17252-m /z-proteiini oli heterodimeeri ApoAII, yhden peptidin ketju, joka puuttui glutamiini (Q) tähde C-päässä (-ATQ /-AT) (eli , ApoAII-2) (kuviot. S2 ja S3) [7], [14]. Hapettunut muoto ApoAII-2 (17269

m /z

, ApoAII-2ox) [14] osoitti toiseksi korkein tilastollinen merkitsevyys (

P

= 5.14 x 10

-20) (taulukko S3).

(A) Spectra edustavien haimasyövän potilaiden ja verrokkien vaihteluvälien rajoissa 16900 ja 17500

m /z

(ylhäällä) ja 8500-9250

m /z

(alhaalla). (B) Hyytelömäiset kuvia ApoAII ja ApoCIII-0 Cohort 1 (215 tapausta). (A ja B) Musta single tähdellä (*), punainen kaksinkertainen tähdellä (**), musta kolminkertainen tähdellä (***), ja punainen nelinkertaistaa tähtiä (****) ilmoitettava MS huiput ApoAII-1, ApoAII-2 , ApoAII-3, ja ApoCIII-0, vastaavasti.

jotta varmentaa proteiinin, suoritimme immunosaostuksella vasta-aineen spesifinen ApoAII, ja immunosaostettiin proteiinit analysoitiin oMALDI -QqTOF-MS (Fig. S4). ApoAII-2 (-ATQ /-AT) ja sen hapettuneen muodon (ApoAII-2ox) havaittiin yhdessä muiden translaation jälkeen modifioidut muodot ApoAII [AII-1 (17380

m /z

) ja AII- 3 (17124

m /z

)]. ApoAII-1 on homodimeeri untruncated ApoAII peptidien C-terminaalisten päiden -ATQ /-ATQ. ApoAII-3 on homodimeeri AII peptidiketjujen, sekä C-päät, joista puuttuu glutamiini (Q) tähteet (-AT /-AT) (Fig. 3) [14].

(A) ennustettu kolmiulotteinen rakenne dimerisoidun ApoAII proteiinia. Malli rakennettiin käyttäen MOE ohjelmistopakettia (Ryoka Systems Inc., Tokio, Japani). Punainen väri osoittaa disulfidisidoksella. (B) aminohapposekvenssit ja laskettua teoreettista moolimassat ApoAII homo /heterodimeerejä (ApoAII-1–5). Kaksi peptidit dimerisoidaan kautta N-terminaalinen disulfidisidoksen.

Toinen proteiini, jonka molekyylipaino koko 8766

m /z

osoitti myös erittäin merkittävää eroa (

P

= 4,35 x 10

-14) välillä haimasyövän potilaiden ja terveiden verrokkien (Fig. 2, merkitty nelinkertainen tähdellä). Molekyyli proteiinin koko oli lähes sama kuin jokin 4 markkeriproteiinien että meillä oli raportoitu edellisessä tutkimuksessa [5]. MS /MS-analyysi (kuvio. S5) tunnistaa 8766-

m /z

proteiinia ApoCIII, joka on 79 aminohapon glykoproteiini, tiedetään olevan kolme eri glykosyloitu isoformeja {glykosyloimattoman (CIII-0), monosialyated (CIII-2), ja disialylated (CIII-2) [15], [16]}, ja 8766-

m /z

proteiini vastaa ApoCIII-0. Identiteetti varmistettiin MS-analyysillä proteiineja immunosaostettiin anti-ApoCIII vasta-ainetta (tuloksia ei ole esitetty).

yhdistelmä ApoAII-2 ja ApoCIII-0 ja sen Validation

ApoAII-2 ja ApoCIII -0 pystyivät erottamaan 103 haimasyövän potilasta 112 terveiden verrokkien (kohortti 1), jossa ala-under-käyrän (AUC) arvo 0,877 ja 0,798, tässä järjestyksessä (Kuva. 4A ja taulukko S3). Koska molemmat ApoAII-2 ja ApoCIII-0 pieneni haiman syöpäpotilaiden ja jakelu on toisistaan ​​riippumattomia (Fig. S6), yksinkertainen summaus kahden biomarkkereiden parantunut AUC-arvo on 0,903.

(A ja B ) ROC-analyysi ApoAII-2, ApoCIII-0, ja niiden yhdistelmä (ApoAII-2 + CIII-0) in Kohorttien 1 (A) ja 2 (B). (C) ROC-analyysi osoittaa kapasiteettia ApoAII-2, ApoCIII-0, ApoAII-2 + CIII-0, ja CA19-9 syrjinnän haimasyövän potilaiden terveiden verrokkien Saksan kohortin (kohortti 3). (D) ROC-analyysi ApoAII-2 + CIII-0 kohortti 4 kliinisen vaiheen (kohortti 4). (E) jakautuminen ApoAII-2 + CIII-0 mukaan kliiniseen vaiheeseen. Viivat osoittavat mediaaniarvot (kohortti 4).

korkea syrjintä kyky ApoAII-2, ApoCIII-0, ja niiden summattu arvo (jäljempänä merkitty ApoAII-2 + CIII-0) välillä haimasyöpä potilaiden ja verrokkien validoitiin riippumattomalla kohortin koostuu 41, sukupuolen ja iän terveisiin ja 62 haimasyövän potilaat (kohortti 2) (Fig. 4B ja taulukko S3).

vahvista universaalisuus tämän syrjintää eri etnisten ryhmien, tutkimme seuraavaksi 163 seeruminäytteet kerätään Saksassa (kohortti 3) (Fig. 4C ja taulukko S4) [7], [8]. Vähentäminen ApoAII-2 ja ApoCIII-0 haiman syöpäpotilaiden näkyi tässäkin kohortissa. Kuitenkin väheneminen ApoAII-2 ja ApoCIII-0 ei havaittu olevan erityisiä haimasyövän. ApoAII-2 + CIII-0 vähennettiin merkittävästi kroonista haimatulehdus (

P

= 8,86 x 10

-11).

keski-ikä terveillä verrokeilla vuonna Cohort 3 ( 39,1 vuotta) merkittävästi pienempi, että potilailla, joilla on haimasyöpä (63,1 vuotta) tai haimatulehdus (50,3 vuotta) (taulukko S1). Siksi mahdollisuus, että erittäin suuri arvo ApoAII-2 (0,958) tässä kohortissa johtui tässä iässä eroa ei voida sulkea pois.

Mahdollinen Multi toimielinten Validation

Plasma /seerumin proteiineihin profilointi suoralla MS otettiin käyttöön vallankumouksellinen uusi työkalu biomarkkereiden löytö [17], [18]. Kuitenkin sen pätevyys on usein keskusteltu [6], [19], pääasiassa pohjalta mahdollisten harhat näytteiden keräämiseen, säilyttämiseen, ja jäädytys /sulatus, sekä huono massa tarkkuus, mikä luo vaikeuksia proteiinin tunnistaminen. Varmistaakseen puuttuminen vinoutunut otos, me sitten kerätään plasmanäytteistä takautuvasti 7 hoitolaitosten Japanissa (kohortti 4) käyttäen samaa ennalta määrättyä protokollaa veren kerääminen, varastointi, ja jäädytys /sulatus. Tämä multi yhteistyöjärjestelyitä valmisteluryhmä järjesti ”kolmannen aikavälin Kattava ohjaus Research for Cancer” tekemä MHLWJ ja sidoksissa kansainvälisen Cancer biomarkkereiden Consortium (ICBC) (https://www.fhcrc.org/science/international_biomarker /) ja noudattaa periaatetta sondirakenne (mahdollisille näytteenotosta ennen tuloksen toteamista ja takautuva sokaissut arviointi).

Kaikki takautuvasti kerätyt näytteet sokkoutetussa, ja lähetetään laboratorioon klo Molecuence Corporation. Tämäkin itsenäinen /sokaissut validointi osoitti, että haimasyövän potilaat, myös ne, joilla taudin alkuvaiheessa, oli helposti erotettavissa terveiden verrokkien käyttämällä yhdistelmä ApoAII-2 ja ApoCIII-0 (ApoAII-2 + CIII-0). AUC-arvot ApoAII -2 + CIII-0 olivat 0,920, 0,918 ja 0,919 haimasyövän potilaille kliinisessä vaiheessa I-II, III-IV, ja kaikissa vaiheissa [TNM luokittelu, UICC (International Union syöpää vastaan)], tässä järjestyksessä (kuvio. 4D).

Vertailu ja yhdistelmähoito CA19-9

Yhdistelmä ApoAII-2 ja ApoCIII-0 (ApoAII-2 + CIII-0) pystyi havaitsemaan 66,1% (160 /242) haiman syöpäpotilaiden terveisiin yksilöihin verrattuna (taulukko S5) kanssa raja-arvo [189 mielivaltaista yksikköä (AU)], joka oli mielivaltaisesti määritetty saada spesifisyys 95% tai enemmän [97,5% (115/118) ]. Tämän cut-off, herkkyys ApoAII-2 + CIII-0 tuli huonompi kuin CA19-9 [79,8% (193/242)], mutta spesifisyys oli parempi kuin CA19-9 [94,9% (112 /118)], ja AUC-arvo on ApoAII-2 + CIII-0 oli lähes sama kuin CA19-9. Kuitenkin vähentäminen ApoAII-2 + CIII-0 ei vaikuttanut kliinisen sairauden vaiheesta, ja oli havaittavissa myös potilailla, joilla on vaiheen I haimasyöpä (Fig. 4E). AUC-arvo on ApoAII-2 + ApoCIII0 vaiheen I haimasyöpä (0,868) oli suurempi kuin CA19-9 (0,774) (taulukko S5), mikä viittaa siihen, mahdollinen etu ApoAII-2 + ApoCIII0 yli CA19-9 havaitsemiseen alkuvaiheen haimasyöpä. Kuitenkin määrä vaiheen I haimasyövän potilaat tutkittiin tässä tutkimuksessa oli vielä pieni (7 tapausta), ja tämä asia on vielä vahvistamatta.

Huomionarvoista oli se, että 93,4% (226/242) potilaista, joilla haimasyöpä havaittiin joko ApoAII-2 + CIII-0 tai CA19-9 tinkimättä spesifisyys terveille henkilöille [93,2% (110/118)]. Lisäksi ApoAII-2 + CIII-0 pystyi havaitsemaan laajan kirjon sairauksien haiman ja sappiteiden alue, herkkyys 60% (taulukko 1). Kuitenkin vähentäminen ApoAII-2 + CIII-0 ei näytä olevan erityinen haiman ja Maksa-sairaudet. Potilaat, joilla on ruokatorven, mahalaukun ja paksusuolen ja peräsuolen syöpiä osoitti myös laskee plasman ApoAII-2 + CIII-0: n taajuudella 36,4% (4/11), 23,9% (34/142), ja 32,4% (46/142), vastaavasti.

Vastaavia merkitys on toistettavasti saatiin MS mittausten itsenäisesti National Cancer Center Research Institute (NCCRI) (Fig. 5 ja tietoja ei näytetty).

Distribution (peak intensiteetti mielivaltaisina yksikköinä) (A), spektrit edustavien tapausten (B), ja ROC-analyysi (C) osoitti muunnettuja muotoja ApoAII vuonna Kohortti 4. C, terveisiin (

n

= 128); P, haimasyöpä (

n

= 249).

Novel muuttaminen ApoAII

Suurin osa ( 95%) kiertävän ApoAII proteiinimolekyylien muodostavat N terminaalisesti disulfidisidoksellisia dimeerejä. Lisäksi 3 tunnettuja isoformeja ApoAII (ApoAII-1–3) [14] me äskettäin tunnistettu kaksi muuta eri modifioitu ApoAII dimeerejä (ApoAII-4 ja AII-5) (kuviot. 3 ja 5):

ApoAII-4 (17023

m /z

), josta puuttuu C-terminaalista glutamiinia (Q) ja treoniini (T) tähteet yhdestä peptidin ja glutamiinitähde muista (-A /-AT) .

ApoAII-5 (16922

m /z

), josta puuttuu C-terminaalista glutamiinia ja treoniiniryhmä sekä peptidit (-A /-A).

ApoAII -1 (ehjä ApoAII kanssa -ATQ /-ATQ päät) ei ole vähentynyt haiman syöpäpotilailla (Fig. 5A), mikä osoittaa, että väheneminen ApoAII-2 ei aiheuttanut yksinkertaisella vähennetään yleisiä proteiinin tuotantoa, mutta proteiini muutos . Erityinen lisäys ApoAII-5 haimasyövän potilaille osoittaa, että nopeutettu ruoansulatus voi olla yksi niistä mekanismeista vastaavan vähentämiseksi ApoAII-2 (katso keskustelu osiossa).

Tuotanto spesifistä vasta-ainetta ApoAII peptidi -ATQ tai -AT lopussa.

todentamiseksi katkaisu ApoAII potilailla, joilla on haiman sairauksia, olemme äskettäin tuotettu polyklonaalinen vasta-aine, joka tunnistaa spesifisesti ApoAII peptidi, jossa on ehjä C-pää (-ATQ), mutta ei, että pilkotun C-pää (-AT) (Fig. 6A), sekä polyklonaalinen vasta-aine, joka tunnistaa spesifisesti Apo-AII peptidi, jossa on lohkaista (-AT) C-päähän, mutta ei, jossa on koskematon ( -ATQ) C-päähän (Fig. 6B).

(A ja B) reaktiivisuus anti-ApoAII (-ATQ) (A) ja anti-ApoAII (-AT) (B) peptidin vasta-aineiden kanssa, GST leimatun ApoAII monomeerejä laakeri -ATQ (GST-ATQ) (aminohapot 1-100) ja -AT (GST-AT) (aminohapot 1-99) päät. (C) Muut kuin denaturointi immunoblottaus analyysi plasmanäytteistä peräisin terveiden verrokkien (kaistat af) ja edustava haiman syöpäpotilaiden (kaistat gl) kanssa vasta-aineiden pannulla ApoAII proteiinia (ylhäällä), ApoAII (-ATQ) peptidi (keskellä), ja ApoAII ( -ATQ) peptidi (alhaalla). Haimasyöpä potilaan (kaista i) esittää hitaammin liikkuvasta ApoAII proteiinin (merkitty ‡), mutta sen molekyyli luonne on vielä määrittämättä. (D) Hyytelömäiset kuva oMALDI-QqTOF-MS-spektrit alueella 16,900-18,100 m /z edustavien terveiden verrokkien (kaistat AF vastaa C) ja haiman syöpäpotilailla (kaistat gl vastaa C).

tulokset immuunianalyyseilla käyttää näitä vasta-aineita (Fig. 6C) olivat yhdenmukaisia ​​saadut oMALDI-QqTOF-MS (Fig. 6D). 2 haimasyövän potilailla (kaistat g ja h), joilla ei ollut ApoAII-1 ja ApoAII-2, mutta hallussaan ApoAII-4 ja ApoAII-5 (Fig. 6D), immunoblot-analyysi ei-denaturoivissa (natiivi) olosuhteissa paljasti menetys 17 -kDa ApoAII peptidi havaittavaa anti-ApoAII (-ATQ) vasta-aine (keskellä, Fig. 6C), ja nopeammin vaeltavat (pienempi) ApoAII peptidin havaittiin anti-Pan Apo-AII-vasta-ainetta (alkuun, on merkitty tähdellä, kuvio . 6C).

keskustelu

Haimasyöpä on tuhoisa sairaus, mutta huomattava osa potilaista voidaan parantaa, jos tunnistus on mahdollista varhaisessa vaiheessa [20], [21]. Parantaa tulosten haimasyövän, luomaan tehokkaan seulontamenetelmä on välttämätöntä. Vaikka lasku modifioidun plasman /seerumin apolipoproteiinien ilmoitetaan tässä ei ole spesifinen haimasyöpä, tämä testi on vähän invasiivisia ja tässä mielessä voidaan katsoa levitettäväksi alustavaan seulontaan oireettomilla potilailla, joilla haimasyöpä sekä muut ruoansulatuskanavan sairauksien joukossa yleiset (ilmeisesti terve) väestöä, jos sen perässä on asiaan toinen seulonta erotusdiagnostiikkaan, kuten tehostettu CT tai ultraäänitutkimus [22]. Seulonta veren MS antaisi oireettomilla potilailla, joilla on arvokas mahdollisuus saada kliinistä huomiota ja lopulta nostamaan löytö alkuvaiheen haimasyöpä. Kuitenkin herkkyys ja spesifisyys nykyisten (ApoAII-2 + CIII-0), vaikka yhdistettynä CA19-9, ei näytä olevan riittäviä, ja potilaiden määrä alkuvaiheen haimasyövän tutkittu tässä tutkimuksessa oli pieni. On välttämätöntä tehdä mahdolliselle satunnaistetussa tutkimuksessa ennen lopullisia johtopäätöksiä voidaan tehdä hyödyllisyys alennetun ApoAII-2 ja ApoCIII-0 asettamisessa syövän seulontaa.

Useimmat kasvainmerkkiaineet erittävät syöpäsolujen osaksi liikkeeseen eivät osoita merkittävää kasvua, kun syöpä on varhaisessa vaiheessa ja kasvaintaakkaa suhteessa koko keho on pieni. Tämä luonne useimpien tavanomaisten kasvainmerkkiaineet tekee niiden soveltamisesta syöpäseulontaan vaikea [3], [23]. Toisin kuin tavanomaiset kasvainmerkkiaineet, modifioitu apolipoproteiinit oli pienennettävä potilailla, joilla haimasyöpä ja muita ruoansulatuskanavan sairaudet. Apolipoproteiinit tuotetaan pääasiassa maksassa, ja ApoAII ja ApoCIII proteiinit ovat todennäköisesti tuottaa syöpäsoluja. Kuitenkin, 17252-

m /z

ApoAII heterodimeerin -AT /-ATQ C-päät (ApoAII-2) ja 8766-

m /z

glykosyloimattoman ApoCIII (ApoCIII-0) proteiini havaittiin väheni eniten merkittävästi potilailla, joilla on haimasyöpä, mukaan lukien ne, joilla on varhaisen vaiheen (vaiheet I ja II) sairaus. Nämä havainnot viittaavat siihen, että vähentäminen näiden eri muotojen apolipoproteiini ei ole seurausta vähentää proteiinin tuotannon takia tuhoutuminen haiman kudoksen, mutta johtuu tiettyjen translaation jälkeisten mekanismien.

On raportoitu, että seerumin karboksyyli- ja aminopeptidaasi toiminta tuottaa syövän erityisiä peptidomin kuviot pilkkomalla C- tai N-päässä eri plasman /seerumin proteiineihin [24]. Seerumin karboksipeptidaasi aktiviteetti on raportoitu potilailla, joilla on varhaisvaiheen haimasyöpä [25]. Synteettinen

N

asetyyli-fenyyli-L-3-thiaphenylamine on käytetty herkkä substraatti mitata entsyymin, mutta pieni ensimmäisessä katkaisussa C-terminaalista glutamiinia (Q) jäännös voi prime /herkistää ApoAII proteiinin edelleen proteolyyttistä ruoansulatusta ja siten hajoaminen /väheneminen ApoAII-2 saatetaan havaita herkästi myös potilailla, joilla alkuvaiheen haimasyöpä. Vastavuoroiset kasvu ApoAII homodimeerin kanssa -A /-A päät (ApoAII-5) tukee käsitystä (Kuva. 5A). Jotkut haimasyövän potilaille jopa osoitti täydellistä ehtyminen ApoAII-1 ja -2-proteiinit ja ulkonäkö uusien ApoAII-4: n ja -5-proteiineja (kaistat f ja g, Fig. 6C ja 6D), mikä osoittaa, että lisälaite proteolyyttisen digestion on vastuussa vähentäminen ApoAII-2 näillä potilailla.

on heikkous on voitettava ennen kuin nykyinen havaintoja voidaan soveltaa kliinisesti. On yleisesti hyväksytty, että tason lasku tahansa biomarkkerina on vaikea käyttää diagnostisena toimenpiteenä, koska erittäin toistettavissa mittausjärjestelmä on tarpeen, jotta vältetään väärät negatiivisuus. Pieni proteiini muutokset ilmoitetaan täällä voidaan tällä hetkellä havaita ja kvantifioida ainoastaan ​​MS. Olemme rakentaneet vankan analyyttisen jossa käytetään automatisoituja näytteen valmistus käyttäen magneettisia helmiä [26]. Tämä automaatio vähensi vaihtelun käsittelyn sekä käyttöä ortogonaalisia MS hävitettyä tahansa massa epätarkkuus aiheuttama hieman epätasainen pinnat MALDI levyjen. Olemme myös huolellisesti eliminoida mahdolliset preanalyyttiset bias näytteenottomenettelyjen ja välttää käyttämällä monimutkaisia ​​tietojenkäsittely algoritmeja. Kuitenkin MS-pohjainen proteiini kvantifiointi on edelleen monimutkainen teknologia rutiinikäyttöön kliinisessä käytössä, ja sen soveltaminen syövän seulonta vaatii edelleen parantaa luotettavuutta, suorituskykyyn ja kustannustehokkuus.

Tässä tutkimuksessa tuotettu onnistuneesti pari vasta-aineita, jotka tunnistavat spesifisesti ehjän ApoAII peptidin kanssa -ATQ päässä ja katkaistu ApoAII peptidin kanssa -AT päässä (Fig. 6). Olemme nyt luomassa sandwich entsyymi-immunologinen määritys määrittää ApoAII-2-heterodimeerin, jolla on hemi-typistetty C-päässä (-ATQ /-AT) käyttäen näitä vasta-aineita. Mielestämme täydellisyyttä Tämän määrityksen helpottaa huomattavasti kliininen sovellettavuus Esillä olevat havainnot.

tukeminen Information

Kuva S1.

aleneminen 17252-m /z huippu potilailla, joilla haimasyöpä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s001

(PDF) B Kuva S2.

tunnistaminen ApoAII-2-heterodimeeri.

doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s002

(PDF) B Kuva S3.

tunnistaminen ApoAII-2-heterodimeeri.

doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s003

(PDF) B Kuva S4.

Vahvistus proteiinin identiteetin immunosaostuksella ja MS.

doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s004

(PDF) B Kuva S5.

tunnistaminen ApoCIII.

doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s005

(PDF) B Kuva S6.

korrelaatio ApoAII-2 ja ApoCIII0.

doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s006

(PDF) B Taulukko S1.

kliiniset ominaisuudet yksilöiden Kohorteissa 1 3

doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s007

(PDF) B Taulukko S2.

kliiniset ominaisuudet yksilöiden Cohort 4 (n = 833).

doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s008

(PDF) B Taulukko S3.

vähentäminen plasmassa ApoAII-2 ja ApoCIII-0 potilailla, joilla on haimasyöpä (Kohorttien 1 ja 2).

doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s009

(PDF)

Taulukko S4 .

validointi ApoAII-2 ja ApoCIII-0 Saksan kohortin (kohortti 3).

doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s010

(PDF) B Taulukko S5.

vähentäminen ApoAII-2 + ApoCIII-0 potilailla, joilla alkuvaiheen haimasyöpä (kohortti 4).

doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s011

(PDF) Tool Menetelmät S1 .

doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s012

(PDF) B

Kiitokset

Kiitämme Drs. T. Yoshida, S. Hirohashi, N. Moriyama, ja T. Kakizoe (NCC) ja pohdinnan auttamiseksi ja kannustusta; Ms T. Umaki, ja Ms Y. Nakamura (NCC) ja apu; Ms C. Ebihara (Molecuence), Mr. T. Goto, M. Kikuchi, M. Hirata (PerkinElmer), Mr. I. Nakajima, Ms Y. Matsuyama (Bruker Daltonics), ja Ms I. Sakurai (Beckman Coulter) teknistä tukea; ja Mr. T. Hatakeyama (SRL Inc., Tokio, Japani) ja näytteiden.