Krooninen sairaus

tiivistelmä

aikana kemoterapiaa, lääkeresistenssin aiheuttama autophagy edelleen suuri haaste onnistuneen hoidon syöpäpotilailla. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on osoittaa, että ulinastatin (UTI), trypsiini-inhibiittori, voi vähentää vastusta maksasyövän solujen kemoterapeuttisen aineen epirubisiini (EPI). Olemme saavuttaneet tämän päätelmän analysoimalla vaikutus EPI yksin tai virtsatietulehdus plus EPI on SMMC-7721 ja MHCC-LM3 maksan syöpäsoluja. Olemme myös tuotti EPI kestävä maksasyöpä solulinja (MHCC-LM3er soluja), ja totesi, että UTI voi herkistää LM3er solujen EPI. Autophagy yleensä toimii suojella syöpäsoluja kemoterapian aikana. Tutkimuksemme osoittivat, että UTI esti autophagy aiheuttama EPI maksan syöpäsoluja, joka edistää apoptoosia, ja sen vuoksi, vähentää vastus syöpäsolujen EPI. Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että UTI-välitteinen inhibitio autophagy saatiin aikaan estämällä transkriptiotekijä tumatekijä-KB: n (NF-KB) signalointireitin. Tarkistaa, tuloksemme in vivo, me ruiskutetaan MHCC-LM3 maksasyöpä soluja tai EPI-resistenttejä LM3er soluja hiiriin, ja totesi, että EPI voi ainoastaan ​​estää tehokkaasti kasvainsolujen kasvua in MHCC-LM3 cell-hiiriin on injektoitu, mutta ei LM3er solussa : itä hiirillä. Kuitenkin, kun UTI annettiin myös, kasvua kasvaimen estyy MHCC-LM3er cell-hiiriin on injektoitu samoin. Tuloksemme viittaavat siihen, että UTI voidaan käyttää yhdessä syöpälääkkeiden, kuten EPI, parantaa tulosten syövän hoidossa.

Citation: Song B, Bian Q, Shao CH, Li G, Liu AA , Jing W, et al. (2015) Ulinastatin Vähentää resistanssi Maksa syöpäsolujen epirubisiini estämällä Autophagy. PLoS ONE 10 (3): e0120694. doi: 10,1371 /journal.pone.0120694

Academic Editor: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung yliopisto, Taiwan

vastaanotettu: 27 syyskuu 2014; Hyväksytty 26. tammikuuta 2015 Julkaistu: 27 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Song et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

rahoitus: kirjoittajat saanut mitään erityistä rahoitusta tähän työhön.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Autophagy on olennainen soluprosessiin vastuussa hajoamista vaurioitunut ja huonosti soluelinten ja proteiinin aggregaatteja. Tämä on prosessi säilyneitä hiiva-, kasvi- ja eläinsolut ja on tärkeää tarjota energialähteiden vastauksena ravinteiden stressiä ja kriittisinä aikoina kehitys [1]. Yleensä autophagy on kasvaimen suppression mekanismi normaaleissa soluissa ja alkupuolella onkogeeniset transformaatio, mutta se voi toimia myös kriittinen selviytymisen koulutusjakson perustettu kasvaimia. Kehittäminen ja vakiintunut kasvaimet ovat suuri metabolinen vaatimuksia lisääntyneen proliferaation ja korkea apoptoottisten kynnysarvot. Tässä tapauksessa, autophagy toimii selviytymismekanismi monissa kasvainsoluissa, joiden avulla ne voivat paeta apoptoottista kuolemaa vastauksena aineenvaihdunnan kriisiin. Monet syöpälääkkeet on suunniteltu kemiallisesti matkivat ravinteiden puutteesta ja nälkään, mutta autophagy on usein säädelty vahvistavasti hoitovasteesi poistamalla vaurioitunut organellista paeta kuolemaa, ja siksi tuottaa terapeuttisia vastus [2-4]. On osoitettu, että lisäämällä reaktiivisten hapen lajien mitokondrioita, kemoterapeuttiset aineet, kuten histonideasetylaasi-estäjät [5] ja sisplatiinin [6] aiheuttaa autophagy, ja monissa tapauksissa autophagic vastaus näihin hoitoihin on cyto suojaava [ ,,,0],5]. Viime aikoina on ehdotettu, että yhdistämällä aineiden kanssa, jotka häiritsevät autophagy, tehokkuutta syövän lääke voidaan tehostaa [5].

Ulinastatin (UTI) on glykoproteiini, joka sisältää glykosaminoglykaanien ja N-kytkettyjä glykaaneja . Se estää toiminnan monenlaisia ​​entsyymejä, kuten trypsiiniä, chymo-trypsiini, kallikreiini, plasmiini, jne [7]. Kliinisesti, virtsatieinfektio pääasiassa käytetään akuutin haimatulehduksen, kroonisen toistuvat haimatulehdus ja akuutit verenkierron toimintahäiriö [8, 9]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että virtsatietulehdus estää niiden kasvun monien syöpien, mukaan lukien ruoansulatuskanavan syöpä ja rintasyöpä, ja saattavat aiheuttaa solukuoleman, jos sitä käytetään yhdessä muiden terapeuttisten aineiden [10-12]. Meidän alustavien tutkimusten, virtsatieinfektio havaittiin olevan estävä vaikutus autophagy. Koska autophagy tärkeä rooli lääkeresistenssin monenlaisissa syöpäsolujen [13, 14], siksi arveltu, että virtsatietulehdus voisi vähentää lääkeresistenssin syöpäsolujen estämällä autophagy.

epirubisiini (EPI) on antrasykliini lääkettä käytetään laajasti syövän kemoterapiaa [15]. Siinä saavutetaan hoidon indusoimalla apoptoosin syöpäsoluissa. Kuitenkin ainakin MCF-7-rintasyöpäsolut, EPI indusoi myös autophagy, joka suojaa syöpäsolujen aiheuttamalla lääkeresistenssideterminantit [15]. Tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutus virtsatietulehdus on autophagy aiheuttama EPI maksan syöpäsoluja. Me tuotti EPI kestävä maksasyövän solulinjoja (MHCC-LM3er solut) ja tutkinut sääntelyyn autophagy näissä soluissa. Tutkimme myös vaikutusta UTI on autophagy ja lääkeresistenssin näissä syöpäsoluissa, ja todentaa tulokset in vivo. On havaittu, että UTI tukahdutti autophagy aiheuttama EPI, joka saatiin aikaan estämällä transkriptiotekijä tumatekijä-KB: n (NF-KB) signalointireitin. Tuloksemme viittaavat siihen, että UTI voidaan käyttää terapeuttisena aineena avustamaan syövän hoitoon vähentämällä lääkeresistenssin syöpäsoluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineen, Cell Lines, plasmidit ja muut materiaalit

hiiren anti ACTB, kanin anti-p-IKKα, p-Nemo vasta-aineita (Santa Cruz, USA) käytettiin 1: 200 laimennus. Kanin anti LC3, hiiren anti IKKα, hiiren anti Nemo, ja kanin anti-PARP, ATG5, ATG7, SQSTM1, BECN1 vasta-aineita (Cell Signaling, USA) käytettiin 1: 1000 laimennus. HRP–leimatun kanin anti-hiiri EnVision merkintäjärjestelmä oli Shanghaista Changdao Biotech Inc.

Maksasyövän solulinjoissa SMMC-7721 ja MHCC-LM3, ja normaalit maksasolut olivat lahjoja Second Military Medical University, Shanghai. PcDNA3.1-GFP-LC3 saatiin Itä Maksa Surgery Hospital, toinen Military Medical University, Kiina. Syöpä solulinjoja käytettiin tutkimuksessa ostettiin Cell Bank of Type Culture Collection of Kiinan tiedeakatemia, Shanghai Institute of Cell Biology, Kiinan tiedeakatemia, jossa he olivat tyypillistä solujen elinvoimaisuus tunnistus, DNA-sormenjälkien, isotsyymi havaitseminen ja mykoplasma tunnistus. Nämä solulinjat välittömästi laajennettiin ja pakastettiin, jotta ne voitaisiin käynnistää uudelleen joka 3-4 kuukautta pakastetusta injektiopullo samassa erässä soluja.

EPI (Itä Maksa Surgery Hospital, toinen Military Medical University, Kiina) käytettiin pitoisuutena 2,5 uM. UTI (Techpool Bio-Pharma, Guangdong, Kiina) käytettiin pitoisuutena 1000 U /ml. Pyrrolidiiniditiokarbamaatin (PDTC) (Beyotime Inc., Shanghai, Kiina) käytettiin konsentraatiossa 10 uM. Klorokiini (CQ, 10 uM) ja 3-metyyliadeniini (3-MA, 10 mM) (Sigma-Aldrich, USA) käytettiin inhibition autophagy. Hiiriä pidettiin ja hoidetaan mukaan yliopiston ohjeiden ja eläinten käyttö pöytäkirjat hyväksyttiin eettisen hallitusten Itä Maksa Surgery Hospital.

Cell Culture, transfektio, Cell Growth määritys ja Generation lääkeaineresistenttien MHCC-LM3 Cell Line

Kaikki maksasyövän soluja viljeltiin DMEM 10% FBS, 37 ° C: ssa 7% CO

2 yrityshautomo, ja transfektoitu Lipo2000 (Genechem Inc., Korea) yhtymäkohdassa 60-70%. Solukasvu määritettiin MTS-kitillä (Promega, USA) noudattaen valmistajan ohjeita. Lääkeresistenttiä MHCC-LM3 solulinja kuten aiemmin on kuvattu [15]. Lyhyesti, MHCC-LM3 Solut ympättiin dosviljelypulloihin ja annettiin saavuttaa ~ 80% konfluenssiin tuoreeseen kasvualustaan ​​ennen hoidetaan EPI. Aloitusannos EPI oli 0,05 uM, ja kukin seuraava annos oli 25-50% korkeampi pitoisuus kuin edellisestä annoksesta, kunnes solut olivat stabiileja leviämisen ilman merkittävää solukuoleman.

Reaaliaikainen PCR

Yhteensä-RNA uutettiin RNeasy Mini Kit ja QIAshredder (Qiagen), ja ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin First-Strand cDNA Synthesis Kit (Abigen Biotechnology Co. Ltd.) noudattamalla valmistajan ohjeita. Reaaliaikainen PCR suoritettiin LightCycler 1,5 (Roche) noudattamalla valmistajan protokollaa, ja käytetyt alukkeet olivat: for Beclin1: 5′-GGCTGAGGGATGGAAGGGTCTAAG-3 ’ja 5′-GTTTCGCCTGGGCTGTGGTAAGTA-3′; for Atg5: 5’-ATGACAGATGACAAAGATG-3 ’ja 5′-CTCATAACCTTCTGAAAGTG-3′; At g7: 5’-ATGGGGGACCCTGGACTGG-3 ’ja 5′-GCAGAGTCACCATTGTAG-3′; ja P62: 5’-ACTGATGGCTGTAACGGTCTA-3 ’ja 5′-GGAAGCAGATGGCACAGAGG-3′; ja GAPDH: 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ’ja 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’.

Apoptosis Assay

Solut pestiin kylmällä PBS: llä suspendoitiin uudelleen sitomispuskuriin (Beyotime Inc. , Shanghai, Kiina) ja täydennettiin sitten 2 ui anneksiini-V-FITC: tä (20 ug /ml), ennen kuin analysoitiin virtaussytometrialla.

Autophagy määritykset

Solut 70-80% konfluenssiin transfektoitiin pcDNA3.1-GFP-LC3 kanssa Lipo2000. Sitten solut tarkkailtiin fluoresenssimikroskoopilla ja soluja, joilla on vähintään 3 vihreitä pisteitä pidettiin autophagic soluja. Prosenttiosuus autophagy = autophagic solua /solua yhteensä x 100%. Havainnon alla elektronimikroskoopilla, solut pestiin PBS: llä pelletoitiin ja solupelletti kiinnitetään 2,5%: glutardialdehydin ja 1% osmic happoa 2 tuntia. Pesun jälkeen pelletti oli kuivattu ja upotettiin epoksihartsiin. Ultraohut osat (45 nm) värjättiin lyijyasetaatilla, ja värjätyt leikkeet tarkkailtiin JEM-2000EX elektronimikroskoopilla [16]. Valvomaan autophagic flux, tandem MRFP-GFP-LC3 adenovirus konstrukti saatu Hanbio Inc (Shanghai, Kiina) käytettiin tässä tutkimuksessa. Näyttelyssä vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) ja punainen fluoresoiva proteiini (OVH) tukeutunut eri herkkyys pH seurata etenemistä päässä autophagic vuon. Lyhyesti, MRFP-GFP-LC3 konstruktio aktivoidaan pH ero happaman autolysosome ja neutraali autophagosome seurata etenemistä alkaen autophagosome ja autolysosome käyttämällä konfokaalimikroskopiaa [17].

karvattomilla hiiret

Mies karvattomia hiiriä (4-6 viikkoa vanhoja ja 15-20 g paino, ostettu Institute of Material Medical Shanghai, kiina Academy of Medical Sciences) pidettiin 25 ~ 27 ° C, jossa 45 ~ 50% kosteus . Nude-hiiriä pidettiin ja hoidetaan mukaan yliopiston ohjeiden ja eläinten käyttö pöytäkirjat hyväksyttiin eettisen hallitusten Itä Maksa Surgery Hospital. MHCC-LM3 solujen ja MHCC-LM3er lääke-resistentit solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen PBS: ssä 5 x 10

6 solua /0,2 ml PBS: ää. Kullekin hiirelle, 200 ui solususpensiota injektoitiin ihon alle oikeaan olkapäähän. EPI (5 mg /kg) ja virtsatieinfektio (20000 /hiiri) injektoitiin kasvaimen välein 3 days.30 päivää myöhemmin hiiret tapettiin jatkotutkimuksen. Kasvain koot laskettiin käyttäen kaavaa V = ab

2/2 (a: pisin halkaisija kasvaimen, b: lyhin halkaisija).

TULOKSET

virtsatietulehdus Estää Autophagy aiheuttama EPI

EPI on raportoitu aiheuttavan autophagy rintasyövän soluja ja aiheuttaa lääkeresistensseihin [15]. Jotta Verity jos sillä on samanlainen vaikutus maksan syöpäsoluja, käsittelimme SMMC-7721-solujen EPI eri konsentraatioina alueen määrittämiseksi, joka EPI voitaisiin tehokkaasti aiheuttaa autophagy [15, 18]. Kuten on esitetty kuviossa 1A, autophagy lisääntynyt EPI pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Perustuen tähän tulokseen, päätimme kohtalainen pitoisuus 2,5 uM myöhempää tutkimuksiin. Seuraavaksi tarkistetaan, että onko EPI aiheuttama autophagy muissa maksan syöpäsoluja. EPI voitaisiin parantaa huomattavasti autophagy in SMMC-7721, Huh-7 ja HCC-LM3 solujen ja lievästi vuonna 97H soluissa (kuvio 1 B). On osoitettu, että CQ voi estää infuusion autophagosomes ja lysosomeihin, jolloin kertyminen autophagosomes ja LC3-II ilmentymistä. Samaan aikaan, 3-MA estää luokan I sekä luokan III PtdIns3Ks, joka on tarpeen autophagosomes muodostumisen [16]. Kun kaksi autophagy inhibiittorit, me validoitu että EPI voisi tehostaa koko autophagy prosessi, mukaan lukien autophagosomes ja autolysosomes muodostumiseen (kuvio 1 C). Seuraavaksi halusimme tietää, jos EPI aiheuttama autophagy voitiin estää virtsatieinfektio. Tätä tarkoitusta varten olemme käsiteltiin SMMC-7721 ja MHCC-LM3 solujen EPI tai EPI + UTI, lisääntyminen LC3-II ja lasku SQSTM1 merkittävästi inhiboi EPI + UTI hoito, viittaa siihen, että EPI-indusoidun autophagy inhiboitui lisäämällä virtsatietulehdus (kuvio 1 D). Tämä tulos tukee lisäksi havainto, että ATG7, ATG5 ja BECN1 ilmaisuja vähentynyt ja SQSTM1 ilmaisua lisäsi sekä mRNA-tasolla (kuvio 1E) ja proteiini taso (kuvio 1 F) soluissa hoidetaan EPI + virtsatietulehdus vertaamalla solujen ollessa käsitelty EPI yksin. Soluissa, jotka on transfektoitu pcDNA3.1-GFP-LC3, ilmentymisen GFP-LC3 (vihreä pisteet) vähensi myös merkittävästi soluissa, joita hoidetaan EPI + UTI vertaamalla, että soluissa, joita hoidetaan EPI yksinään (kuvio 1G ). Lisäksi vertaamalla soluja hoidetaan EPI määrä autophagic rakkuloiden soluissa hoidetaan EPI + UTI vähensi myös merkittävästi tarkasteltiin elektronimikroskoopilla (kuvio 1 H). Edelleen vahvistaa toiminnon virtsatietulehdus on autophagic flux, tarkistamme määrä autophagosomes ja autolysosomes in MHCC-LM3 soluja käsiteltiin joko EPI tai EPI + virtsatietulehdus, virtsatietulehdus voisi merkittävästi vähentää autophgic vuon (kuvio 1 i). Yhdessä nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että UTI estää EPI-indusoitua autophagy maksan syöpäsoluja.

(A): n ekspressio LC3-II havaittiin lysaateista SMMC-7721-soluja käsiteltiin eri annoksilla EPI. (B) toinen LC3 taso havaittiin eri maksasyövän solut käsiteltiin EPI (2.5μM) tai 24 tuntia. (C) Western blot osoitti tason LC3-II SMMC-7721-soluja käsiteltiin EPI (2.5μM) kanssa /ilman SA (10 uM) /3-MA (10 mM) eri ajankohtina. (D) Indikoitu molekyylit tunnistettiin immunobloteilla in SMMC-7721 ja MHCC-LM3 soluja käsiteltiin EPI /EPI + virtsatietulehdus varten osoitettuun kertaa. (E) Reaaliaikainen PCR osoittaa mRNA: iden tasot autophagy liittyvien geenien MHCC-LM3 ja SMMC-7721 solut käsitellään EPI tai EPI + virtsatieinfektio. (F) Western blot osoittaa proteiinin tasot autophagy liittyvien geenien MHCC-LM3 ja SMMC-7721-soluja käsiteltiin EPI /EPI + UTI 24 tuntia. (G) EPI /EPI + virtsatietulehdus lisättiin MHCC-LM3 solujen kanssa 24 tunnin kuluttua GFP-LC3 transfektiota. Ylempi paneeli, GFP-LC3 värjäys; alempi paneeli, kaavio näyttää osa autophagic soluja. (H) elektronimikroskoopilla autophagic rakkulat MHCC-LM3 soluja käsiteltiin EPI + EPI + virtsatieinfektio. Laajentunut korkean resoluution kuvia neliön alueilla näytettiin. (I) MHCC-LM3 solut infektoitiin GFP-MRFP-LC3 adenovirus 24 tuntia, sitten käsiteltiin withEPI /EPI + virtsatieinfektio. Kuvat ovat ja kaavioita näytettiin. Koe toistettiin 3 kertaa. (* P 0,05, ** P 0,01).

virtsatietulehdus Edistää indusoiman apoptoosin EPI

Koska kemoterapia huume, EPI eliminoi syöpäsolut indusoimalla apoptoosin [19]. Koska olemme osoittaneet, että virtsatietulehdus estää autophagy aiheuttama EPI, epäilemme, että UTI voi myös edistää syövän apoptoosia näissä soluissa. Voit selvittää, onko virtsatietulehdus on vaikutusta indusoiman apoptoosin EPI, ensin tarkistetaan onko yhdistelmä EPI ja UTI voi aiheuttaa myrkyllinen vaikutus normaalissa maksasolujen. Kuten kuvassa 2A, ei ollut merkitsevää eroa Elossa hinnat välillä EPI ryhmä ja EPI + UTI ryhmä, mikä viittaa siihen, että EPI + virtsatietulehdus ei aiheuttaisi lisää solukuolemaa normaaleilla maksasoluissa. Seuraavaksi tutkimme määrä SMMC-7721 ja MHCC-LM3 maksasyövän käsiteltyjen solujen EPI tai EPI + virtsatietulehdus, ja totesi, että solujen lukumäärät väheni merkittävästi, jos molemmat EPI ja UTI lisättiin (kuvio 2B). Pilkkominen PARP, indikaattori apoptoosin, myös parannettu käsitellyissä soluissa EPI + UTI vertaamalla, että solut käsiteltiin EPI yksinään (kuvio 2C). Lisäksi hoito EPI + UTI johti apoptoosin pienentyneeseen määrään estäjä Bcl-2 ja lisääntynyt pilkkominen kaspaasi-3 (kuvio 2D). In tukee tätä tulosta, anneksiini V-värjäys osoitti, että solujen prosenttiosuus koki apoptoosin oli korkeampi soluissa, joita käsiteltiin EPI + UTI (kuvio 2E). Yhdessä nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että virtsatietulehdus edistää apoptoosia kun sitä käytetään yhdessä EPI, ja voisi mahdollisesti tehostaa EPI syövän hoidossa.

(A) Prosenttia elossa L02 käsiteltyjen solujen EPI /EPI + UTI /UTI. (B) Prosenttia elossa SMMC-7721 ja MHCC-LM3 maksasyöpä soluja hoidossa EPI /EPI + virtsatietulehdus /UTI varten osoitettu kertaa. (C, D) Western blot näyttämän molekyylien näytettiin SMMC-7721 ja MHCC- LM3 maksasyöpä soluja hoidossa EPI /EPI + virtsatieinfektion (Treatment in D 24 tuntia). ACTB blotattiin latauskontrollina. (E) anneksiini V värjäys näyttää prosentteina solujen tehtiin apoptoosin alle hoitoon EPI /EPI + virtsatietulehdus varten ilmoitettu kertaa. Vasen paneeli oli keskimääräinen tulos 3 kokeen; Oikeassa paneelissa oli edustava tulos. Tulokset ovat keskiarvo 3 riippumattomasta kokeesta (* P 0,05, ** P 0,01).

UTI Edistää EPI-aiheutti apoptoosia Maksasyöpä Cell estämällä Autophagy

Autophagy näyttelee välttämätön suojaava rooli EPI solukuolema syöpäsoluissa [15, 20]. Tietäen, että UTI edistää indusoiman apoptoosin EPI, halusimme tietää, jos tämä saavutettiin estämällä autophagy että indusoitui myös EPI. Tätä tarkoitusta varten olemme tuotti EPI-resistentti solulinja LM3er käyttämällä pientä annosta EPI soluviljelyalustoihin ajanjakson ajan (katso materiaalit ja menetelmät). Sekä MHCC-LM3er solujen ja ei EPI-resistenttejä (MHCC-LM3) kontrollisoluja, lisäsimme EPI ja totesi, että Eloonjääneiden MHCC-LM3er solut oli suurempi kuin MHCC-LM3 soluja, ja vähemmän MHCC- LM3er solut tehtiin apoptoosin kuin kontrollisolut (kuvio 3A). Tämä tulos osoitti, että EPI-resistenttien solujen (MHCC-LM3er) on paremmin suojassa EPI: n indusoiman apoptoosin. Voit selvittää, onko vastus EPI johtui lisääntyneestä autophagic aktiivisuutta MHCC-LM3er soluissa, tutkimme perusekspression useiden autophagy markkereita ja totesi, että MHCC-LM3er solujen mRNA tasot ATG7, ATG5 ja BECN1 olivat korkeampia kuin että kontrolli-soluissa (kuvio 3B). Tutkimme myös pohjapinta tasoilla useita autophagy liittyviä proteiineja, ja totesi, että tasot LC3-II, ATG7, ATG5 ja BECN1 kasvoi MHCC-LM3er soluja samoin, kun taas taso SQSTM1 väheni (kuvio 3C). Fluoresenssimikroskopia osoitti myös, että vertaamalla kontrolliin soluja oli enemmän autophagic soluja MHCC-LM3er ryhmä (kuvio 3D). Lisäksi alle elektronimikroskoopilla, löysimme enemmän autophagic rakkulat on MHCC-LM3er soluissa (kuvio 3E). Täten nämä tulokset viittaavat siihen, että EPI-resistenttejä MHCC-LM3er soluilla on korkeampi pohjapinta autophagic aktiivisuus kuin kontrolliryhmän soluissa. Lisäksi olemme havainneet, että MHCC-LM3er solut voitaisiin vastustaa EPI-solukuolema vertaamalla MHCC-LM3 soluja, ja inhibitio autophagy 3-MA voi täysin estää vastus MHCC-LM3er solujen EPI. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös, kun UTI on käytetty (kuvio 3F ja 3G). Tämä tulos viittaa vahvasti siihen, että UTI edistää EPI aiheuttaman apoptoosin maksasyövän soluissa estämällä autophagy.

(A) Prosenttia elossa MHCC-LM3 ja LM3er soluja hoidossa EPI. Alempi paneeli osoitti prosenttiosuudet anneksiini V-positiivisia MHCC-LM3 tai MHCC-LM3er soluissa. (B) Reaaliaikainen PCR osoitti mRNA-tasot ATG5, ATG7 ja BECN1 in MHCC-LM3 ja MHCC-LM3er soluja. (C) VVestern LC3-I, LC3-II, ATG7, ATG5, BECN1 ja SQSTM1 vuonna LM3 ja LM3er soluja. ACTB oli latauskontrollina. (D) GFP-LC3 pisteitä MHCC-LM3 ja LM3er soluja. Ylempi paneeli, immunofluoresenssimikroskoopilla osoitti edustaja kuvaa GFP-LC3 pisteitä, ja alempi paneeli oli osa autophagic solujen MHCC-LM3 tai MHCC-LM3er soluissa. (E) elektronimikroskoopilla autophagic rakkulat MHCC-LM3 ja LM3er soluja. Laajentunut korkean resoluution kuvia neliön alueilla näytettiin. (F) Suhteellinen elossa (yläpaneeli) ja anneksiini V-positiivisia soluja (alempi paneeli) in MHCC-LM3 ja LM3er soluja hoidossa EPI /EPI + 3-MA tai EPI /EPI + virtsatieinfektio. Tulokset ovat keskiarvo 3 itsenäisen kokeen (* P 0,05, ** P 0,01).

virtsatieinfektioiden Säätelee Autophagy estämällä NF-KB signalointireittiin

NF-KB signalointireittiin säätelee positiivisesti autophagy [14, 21, 22]. UTI voi estää aktivointi NF-KB: n signalointireitin [23, 24]. Siksi arveltu, että UTI voi estää autophagy maksassa syöpäsolujen estämällä NF-KB: n signalointireitin. Tämän hypoteesin testaamiseksi, käsittelimme SMMC-7721 ja MHCC-LM3 solujen EPI yksinään tai EPI + virtsatietulehdus, ja totesi, että aktiivisuutta NF-KB tukahdutettiin virtsatieinfektioiden hoitoon täydennetty soluissa (kuvio 4A). Tämä tulos tukee inhibitio fosforylaation IKK-α ja Nemo (kuvio 4B). Lisäksi olemme havainneet, että lisäämällä PDTC, estäjä NF-KB: n signalointireitin, että MHCC-LM3 soluissa inhiboi fosforylaatiota IKK-α ja ilmentymistä LC3-II (kuvio 4C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että UTI estää autophagy estämällä NF-KB: n signalointireitin. Selvittää, jos lisäämisen huumeiden, virtsatietulehdus tai PDTC, edistänyt epirubisiini aiheuttaman apoptoosin maksan syöpäsoluja, lisäsimme EPI EPI + virtsatietulehdus, EPI + PDTC tai EPI + virtsatietulehdus + PDTC ja SMMC-7721 ja MHCC -LM3 maksan syöpäsoluja, ja havaittiin samanlainen prosenttiosuus eloonjääneiden solujen EPI + virtsatietulehdus, EPI + PDTC tai EPI + virtsatietulehdus + PDTC täydennetty soluja. Erityisesti ei ollut lisättyä vaikutus solukuolemaan jos molemmat UTI ja PDTC lisätään, mikä viittaa siihen, että molemmat UTI ja PDTC edistää apoptoosin samaa mekanismia, joka on estää NF-KB-signalointireitin säädelty autophagy (kuvio 4D ja 4E) .

(A) suhteellinen NF-KB aktiivisuuden SMMC-7721 ja MHCC-LM3 soluja hoidossa EPI /EPI + UTI 24 tunnin ajan. (B) Western-blotit p-IKK alfa ja p-Nemo verrattuna kokonaisproteiinia tasoilla IKK alfa ja Nemo, vastaavasti, SMMC-7721 ja MHCC-LM3 maksasyöpä soluja hoidossa EPI /EPI + UTI 24 hr. ACTB on latauskontrollina. (C) Western blot p-IKK alfa, yhteensä IKK alfa, LC3-I ja LC3-II MHCC-LM3 soluja hoidossa EPI /EPI + virtsatietulehdus /EPI + PDTC 24 tunnin (D, E) Prosenttia elossa (D) ja anneksiini V-positiivisten solujen (E) SMMC-7721 ja MHCC-LM3 soluja hoidossa EPI /EPI + virtsatietulehdus /EPI + PDTC /EPI + virtsatietulehdus + PDTC 24 tunnin ajan. Tulokset ovat keskiarvo 3 itsenäisen kokeen (* P 0,05, ** P 0,01).

virtsatietulehdus tukee myös Apoptoosi estämällä NF-KB signalointireittiin-indusoitu Autophagy in vivo

todistaa edellä tulos in vivo, me pistetään MHCC-LM3 tai EPI-resistenttejä MHCC-LM3er soluja ihon alle hiirillä (n = 6), ja totesi, että anto EPI voisi estää kasvun kasvain MHCC-LM3 solu-injektiona saaneiden hiirien, mutta vähemmän määrin MHCC-LM3er cell-hiiriin on injektoitu. Kuitenkin, kun UTI annettiin, kasvaimen kasvu MHCC-LM3er cell-hiiriin on injektoitu estyi, ja kasvu oli samanlainen, että MHCC-LM3 cell-injektoitiin hiiriin (kuvio 5A ja 5B). Voit selvittää, onko virtsatietulehdus esti NF-KB signalointireitin in vivo, meidän annettiin EPI yksin tai EPI + virtsatietulehdus hiirille ja analysoitiin aktiivisuus NF-KB signalointireitin kasvaimissa. Todettiin, että vertaamalla kontrollihiiriin, taso LC3-II ja fosforylaatiot IKKα ja Nemo olivat kaikki vähentää kasvaimissa hiirillä, joille annettiin sekä EPI + UTI, osoittaa NF-KB-signalointireitin (kuvio 5C ja 5D). Tämä tulos viittaa siihen, että virtsatieinfektioiden edistää apoptoosia estämällä NF-KB signalointireitistä säädelty autophagy in vivo.

(A, B) Kasvaimen koot (A) ja kasvaimen kasvukäyrä (B) hiiristä ksenosiirrettyjä kanssa MHCC-LM3 tai MHCC-LM3er soluja (n = 6), joita hoidettiin EPI /EPI + virtsatieinfektio. Kasvukäyrän saatiin useita mittauksia eri hiiriä samassa ryhmässä. (C) Histoimmunochemical analyysi osoittaa ekspressiota p-IKKα ja p-Nemo vierassiirrekokeissa hiirten hoito EPI /EPI + virtsatieinfektio. (D) Western blot p-IKKα ja p-Nemo näytteissä ksenograftin hiirten hoito EPI /EPI + virtsatieinfektio. ACTB on latauskontrollina. Tulokset ovat keskiarvo 3 itsenäisen kokeen (* P 0,05, ** P 0,01).

KESKUSTELU

Riippumatta syövän tyypistä, lääkeresistenssin edelleen suuri haaste onnistuneeseen kemoterapeuttisen hoidon syöpäpotilaiden [25]. On selvästi tärkeää tunnistaa ja kehittää uusia terapeuttisia strategioita parantavat sen tuloksia syövän hoidossa. Autophagy on kaksiteräinen miekka syövässä, se toimii sekä anti ja pro-syövän mekanismien [26]. Vuonna maksasyövän, autophagy voi suojella maksassa tukahduttamalla tulehdusta, kudosvauriota ja genomin epävakautta estävän syövän aloittamista; Toisaalta, se on tarpeen syövän solujen eloonjäämistä ja syövän kehitystä [26]. Monet nykyiset syövän hoitomuotoja, kuten kemoterapiaa ja sädehoitoon, asettavat metabolisen stressin syöpäsoluihin ja aiheuttaa autophagy, mikä puolestaan ​​suojaavat soluja apoptoosin ja aiheuttaa lääkeresistenssin. Näin ollen käyttöä autophagic estäjien yhdessä terapeuttisten aineiden voi erityisesti lisätä terapeuttista tehoa [25, 27].

UTI on tärkeä estäjä trypsiinin, ja viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että se toimii yhdessä muiden kemoterapia-aineiden edistää apoptoosia, mikä johtaa tuumorin kasvun inhibitioon ainakin osittain johtuen sen estävä vaikutus moniin signalointireittien mukana kasvua [10, 11, 28-30]. Alustavissa tutkimuksissa havaittiin, että UTI oli inhibiittoria autophagy, ja näin ollen, hypoteesi, että se voi myös parantaa syövän hoitoon estämällä autophagy ja vähentää resistenssin kemoterapeuttisten syöpäsoluja. Todellakin, meidän tiedot osoittivat, että maksan syöpäsoluja, virtsatieinfektio esti korkeus autophagy aiheuttama EPI, yleisesti käytetty syövän kemoterapeuttista lääkettä. Kun sitä käytettiin yhdessä EPI, virtsatieinfektio edistänyt apoptoosin soluissa. Tämä tulos viittaa siihen, että maksan syöpäsoluja, UTI yksin oli vain vähäinen vaikutus solujen lisääntymistä, mutta kun se levitettiin yhdessä EPI, se parantaa EPI: n indusoiman apoptoosin, todennäköisimmin estämällä autophagy (kuvio 2B). Tämä tulos tukee lisäksi havainto, että EPI-resistentit solut, virtsatieinfektio pystyi tehokkaasti herkistää solut EPI estämällä autophagy (kuva 3).

Koska NF-KB on raportoitu positiivisesti säädellä autophagy, testasimme jos virtsatieinfektioiden esti autophagy tukahduttamalla NF-KB: n signalointireitin. Tuloksemme osoittivat, että lisäämällä sekä EPI ja UTI maksan syöpäsoluja inhiboi merkittävästi NF-KB: n lusiferaasiaktiivisuuden, ja vähentää fosforylaation IKK-α ja Nemo, tuloksena on myös vahvistettu in vivo tutkimuksissa. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että NF-KB signalointireitistä on estetty, kun sekä EPI ja virtsatieinfektio sovelletaan. Osoittaa, että suppressio NF-KB: n signalointireitin johtaisi inhibitioon autophagy, me inhiboi NF-KB-signalointireittiä lisäämällä PDTC, tunnettu inhibiittori NF-KB: n signalointireitin, soluihin yhdessä EPI, ja havaittiin estyminen autophagy odotetusti. Tämä tulos tukee vahvasti olettamusta, että kuten PDTC, virtsatietulehdus voi estää autophagy estämällä NF-KB-signalointireitin. Edelleen todistaa, että molemmat UTI ja PDTC toiminut samalla signalointireitin sijaan toimi itsenäisesti säännellä apoptoosin, lisäsimme molemmat PDTC ja virtsatieinfektio yhdessä EPI syöpäsoluja, mutta ei havainnut lisäkorotukset apoptoosin aktiivisuuden. Tämä tulos tukee vahvasti päätellä, että UTI ja PDTC ei toiminut synergisesti, ja virtsatieinfektio yksin oli yhtä tehokas kuin PDTC inhiboimaan NF-KB: n signalointireitin edistää apoptoosia.

Autophagy aiheuttama lääkeresistenssin syöpäsoluissa on ollut haaste syövän hoitoon [31]. Anti-autophagy strategioita on käytetty monissa kliinisissä tutkimuksissa rekisteröity National Cancer Institute USA erilaisissa ihmisen syövissä [32]. Kuitenkin CQ tai HCQ (Hydroksiklorokiini) käytettiin estämään infuusio autophagosomes ja lysosomeihin useimmissa kliinisissä kokeissa, käyttämällä muita autophagy estäjien, jotka voivat hillitä muodostumista autophagosomes Kliinisissä tutkimuksissa ei ole raportoitu. UTI on käytetty hoidettaessa muita sairauksia, kuten akuutti haimatulehdus, ja tuloksemme ovat osoittaneet, että UTI voi estää EPI-indusoitua autophagy ja edistämään apoptoosia syöpähoidon aikana, todennäköisimmin estämällä NF-KB: n signalointireitin. EPI on laajalti käytetty syövän kemoterapiassa agentti, mutta se voi myös aiheuttaa lääkeresistenssideterminantit aiheuttamalla autophagy. Meidän havainto merkitsee sitä, että UTI voidaan käyttää yhdessä syöpälääkkeiden, kuten EPI parantaa tulosten syövän hoidossa. Lisäksi tulokset voivat myös irtoa valot soveltamisesta virtsatieinfektion muilla kliinisillä aloilla.