PLoS ONE: Rokotus Alkion kantasolut Suojaa Keuhkosyöpä: Onko laajakirjoinen ehkäisevää rokotetta syöpää mahdollista?
tiivistelmä
Antigeenisuspension samankaltaisuutta kasvainten ja alkioiden on arvostettu monta vuotta ja heijastaa ilmentymistä alkion geenituotteiden syöpäsolujen ja /tai syöpään aloittamista kantasoluja. Hyödyntämällä tätä samankaltaisuus olemme testanneet ehkäisevää keuhkosyöpä rokote koostuu allogeenista hiiren alkion kantasolut (ESC). Naiivi C57BL /6-hiiriä rokotettiin ESC yhdessä lähde granulosyyttimakrofagin pesäkkeitä stimuloiva tekijä (GM-CSF), jotta immunostimulatorisen adjuvanttiaktiivisuus. Rokotetut hiiret olivat suojattuja myöhempää altistusta implantoitavan Lewisin keuhkokarsinooma (LLC). ESC-indusoi anti-kasvain immuniteettia ei johtunut epäspesifisestä ”allo-vaste”, kuten rokotus allogeenisen hiiren alkion fibroblasteja ei suojaa kasvaimen kasvulta. Rokotteen teho liittyi vankka kasvaimeen reaktiivinen ensisijainen ja muistin CD8
+ T efektori vasteita, Th1 sytokiinivasteeseen, korkeampi kasvaimeen CD8
+ T efektori /CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ T sääntelyn solujen suhteen, ja pienentää myelooinen johdettujen vaimentimen soluja pernassa. Ehkäisy tumorigeneesin todettiin edellyttävän CD8-välitteisen sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) vasteen, koska
in vivo
CD8
+ T-lymfosyyttien kumosi kokonaan suojaavan vaikutuksen rokotuksen. Tärkeintä, tämä rokotusstrategia tukahdutti myös kehitystä keuhkosyövän aiheuttama yhdistelmä karsinogeeni hallinnon ja krooninen keuhkotulehdus. Yksityiskohtaisempi jaottelu tämän uuden rokotteen strategia ja tunnistetaan yhteisiä ESC /kasvaimen antigeenejä voi johtaa immunoterapeuttisia vaihtoehtoja keuhkosyöpäpotilaita ja ehkä vielä tärkeämpää, voisi olla ensimmäinen askel kohti kehitystä ennalta ehkäisevää syövän rokotteita.
Citation : Yaddanapudi K, Mitchell RA, Kitti K, Willer S, Sharma RK, Yan J, et al. (2012) Rokotus Alkion kantasolut Suojaa Keuhkosyöpä: Onko laajakirjoinen ehkäisevää rokotetta syöpää mahdollista? PLoS ONE 7 (7): e42289. doi: 10,1371 /journal.pone.0042289
Editor: Lucia Gabriele, Instituto Superiore di Sanità, Italia
vastaanotettu: 14 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 05 heinäkuu 2012; Julkaistu: 31 heinäkuu 2012
Copyright: © Yaddanapudi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tukivat NIH /NCRR P20RR018733 (KY), American Lung Association (JWE, RAM) ja Kentucky Lung Cancer Research Program (RAM). JWE tukee Kentuckyn Research Challenge Trust Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Tekijät ovat seuraavat edut: Vaikutukset raportoitu tässä ovat aiheena vireillä US Letters patenttihakemus, johon Drs. Mitchell ja Eaton on nimetty keksijät, hakemusnumero 60/782672 (US PTO), otsikolla ”menetelmät ja -välineet immunisointiin syöpä”. Se on jätetty 15. maaliskuuta 2007 mennessä (seuraava ensimmäinen esittämisen 15 maaliskuu 2006). Parhaan kirjoittajien tietoon, ei ole toimisto toimia sitä ja se pysyy sovelluksen. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.
Johdanto
Yksi vanha teoriaa oncogenesis oli, että syöpä syntyi pesiä alkion kantasoluja, läsnä normaaleissa kudoksissa ja stimuloi kasvavan jonkinlainen ärsytys [1]. Vaikka tämä käsite oli suurelta osin huomiotta yli vuosisadan, nyt on olemassa todisteita siitä, että mutatoitunut kudosspesifisiä kantasolut toimivat itse uudistaa ”syöpä aloittamista solujen”, joka vastaa aloittamisesta monien pahanlaatuisten kasvainten [2]. Epäsuorassa Tämän periaatteen tueksi, on olemassa runsaasti todisteita siitä, että suurin osa kiinteä kasvain tyypit ilmaista alkioantigeenit vaihtelevasti [3], [4], [5]. Esimerkiksi ”karsinoembryonaalisesta antigeenejä”, ensimmäinen kuvattu 1960-luvun puolivälissä, ovat antigeenejä yhteinen alkioiden ja kasvainten ruoansulatuskanavan [6], [7]. Huolimatta jonkin verran menestystä käyttämällä näitä yhteisiä alkion /kasvaimen antigeenejä kohteina immunoterapiassa syöpäpotilailla, joka on pysyvä este nämä lähestymistavat on ollut, että kasvainten aiheuttaman siedätyshoitoa [8].
Vaihtoehtona immuunipohjaiset anti- syöpä strategia voisi olla ehkäisevät rokotukset kasvainantigeenejä
ennen
ulkonäön syöpä – ja siihen liittyvä immuunitoleranssi – mutta tämä lähestymistapa on myös ongelmalliseksi. Vaikka nyt on joitakin tehokkaita rokotteita syövät, jotka johtuvat infektoivien aineiden (esim, ihmisen papilloomavirus [9]), syövät johtuvat ”itse” ja suurin antigeenien näytetään kasvaimen solut ovat myös läsnä normaalin aikuisen soluissa. Kuitenkin nyt näyttää siltä, että useimmat kasvaimet ilmentävät tiettyjä alkion antigeenejä. Tärkeää on, että ilmaus joidenkin alkioantigeenit voi päättyä ensimmäiseen tai toisen raskauskolmanneksen aikana, paljon ennen nisäkkäiden immuunijärjestelmä määrittää ”itse” vastaan ”ei-itse”. Niinpä geenituotteiden ilmaistuna sekä alkioiden ja kasvainsoluja ei saa sisällyttää ”itse” ohjelmistoon ja ovat siksi potentiaalisesti immunogeenisiä.
alussa 20-luvulla todettiin, että ennen injektion hiirten sikiön kudoksissa johti hylkäämiseen transplantable kasvaimia (tarkistetaan [10]). Klavins
et al.
Myöhemmin kertoi, että antiseerumit kaneissa emulgoitu koko ihmisen alkion (6-7 viikkoa) – adsorboitu vastaan aikuisen ihmisen kudoksissa – tunnustettu ihmisen erilaisten kasvainten muodoissaan, mukaan lukien iho, keuhkoputkien, munuaisten, paksusuolen, maksan, keuhkojen ja rintojen [11]. Nämä havainnot tukevat käsitystä, että eläimille tai ihmisille rokotettu alkion materiaali saattaa kyetä tunnistamaan ja tuhoamaan kasvainsoluja. Erittäin viimeaikaiset tutkimukset kuvaavat mahdollisuuksia ESC prime kasvaimen vastaisen immuniteetin. Nämä raportit osoittivat, että pluripotenttien ESC aiheuttaa vaatimaton viivästyksiä kasvaimen kasvua hiirimalleissa transplantable paksusuolen syöpä ja keuhkosyöpä [12], [13].
Immunostimulaatiotesteissä sytokiineja, kuten GM-CSF, interleukiini (IL) -2 , IL-12, interferoni (IFN) -α ovat osoittaneet merkittävää tuumorin vastaista vaikutusta. Näistä, GM-CSF on yksi tehokas ja spesifinen indusoijia kasvaimen vastaisen systeemisen immuniteetin [14], [15]. GM-CSF välittää sen vaikutusta edistämällä aktivaatio antigeeniä esittelevien solujen (APC: t), eli dendriittisolut (DC) ja makrofagit. APC: t puolestaan prosessoida ja tarjota kasvaimen antigeenejä hälyttämään auttaja-T-solujen ja sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) [16], [17]. Lisääntynyt paikallisen tuotannon GM-CSF muuntogeenisten kasvainsolut aiheuttama spesifinen kasvaimen vastaisen soluimmuniteetista sekä
in vitro
ja
in vivo
[15], [17], [18], [19]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme pyrkineet parantamaan kun syöpä immunoterapeuttista potentiaalia kantasolujen antigeeninen ristireaktiivisuus pahanlaatuisia soluja yrittää tunnistaa tehokkaampia ESC-pohjainen syöpärokote.
Täällä raportoimme että rokotus ESC yhdistettynä lähde GM-CSF on tehokas estämään implantoitavista ja karsinogeeni aiheuttama keuhkokasvaimia ilman havaittavaa myrkyllisyyttä tai merkkejä autoimmuniteetin. Terapeuttinen teho ESC /GM-CSF yhdistelmärokote liittyi vankka kasvainspesifisiä ensisijainen ja pitkäkestoinen muisti CD8
+ T efektori vasteita, soluttautuminen CD8
+ T-solut kasvaimeen mikä lisää kasvaimensisäisenä CD8
+ T efektori /säätelijä-T-solujen suhde ja alennetaan myelooinen johdettujen suppressorisolut (MDSCs) perna. Yhdessä meidän havainnot tarjoavat vahva perusta kehittää edelleen tätä uutta muotoa rokotetta immunoterapeuttisen strategian syövän ehkäisemiseen.
Tulokset
ESC rokotus estää seuraus implantoidun keuhkoadenokarsinooma
Alkuperäiset tutkimuksemme yritetty arvioida suhteellisen suojaava vaikutus TSK rokotteen puuttuessa immunostimulatorista apuaineita. Hiirten säteilytettyjen ESC yksinään ei ollut vaikutusta alkamisajankohta Lewisin keuhkosyöpä (LLC) kasvaimen kasvulta mutta ei aiheutuisi kohtalainen lasku alkuperäiseen kasvaintaakkaa verrattuna kasvaimiin immunisoimattomilla kontrollihiiriin (
tiedot eivät esitetty
) yhdenmukaisia aikaisempien tutkimusten [12], [13]. Parantaakseen vaikutuksen TSK rokotteen GM-CSF samanaikainen, ensin yrittänyt liikaa express hiiren GM-CSF: n ES-D3 ES solulinjaan käyttämällä retroviruksen transduktion kuin aiemmassa B16 /GM-CSF rokotteiden [15]. Kuitenkin, koska vaikeuksia saavuttaa tuntuva GM-CSF ilmaisun käyttämällä tätä lähestymistapaa – mikä johtuu todennäköisesti retrovirus- promoottorielementtiä hiljentäminen ESC [20] – me sen sijaan vakaasti yliekspressoitujen GM-CSF STO fibroblasteissa, joita käytetään yleisesti syöttölaite kerrosta ES -D3-soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, meinfektoiduissa STO-fibroblastit ilmaisi mitätön hiiren GM-CSF, kun GM-CSF transdusoitiin retroviraalisesti STO-fibroblastit ilmaista ja erittää supra-fysiologisia määriä sytokiinin. Käyttäen standardia rokotuksen ajoitus hoito (Fig. 1 B), naiivi C57BL /6-hiiriä immunisoitiin kahdesti (päivinä 0 ja 14) kanssa HBSS (kontrolli), säteilytetty ESC kanssa annetaan STO fibroblastien ilmentävät GM-CSF (ESC /STO-GM ), tai STO-GM soluja yksinään. Seitsemän päivää toisen immunisaation jälkeen hiiret altistettiin elävälle LLC-soluja ja seurattiin kasvaimen kasvulta, koska ajan funktiona. Kuten on esitetty kuviossa. 1C, hiirten rokottaminen ESC /STO-GM oli 70% tehokas estämään kasvaimen kasvulta taas kaikki ei-rokotetun eläimillä oli kehittänyt palpoitavissa kasvaimia päivällä 24 altistuksen jälkeen. Tärkeää on, säteilytetty STO-GM solujen tarjonnut mitään suojaa seuraus LLC kasvaimia (Fig. 1 C) viittaa siihen, että havaitut suojelun ESC /STO-GM ei johdu epäspesifisten immuunivasteiden allogeeninen kokosoluantigeeneihin. Lopuksi on tärkeää huomata, että nämä LLC kasvaimia, jotka eivät kehittyä ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä (n = 3) olivat merkittävästi pienempiä ja kasvoi ulos paljon hitaammin kuin kehittymässä rokottamattomien ohjaus hiirillä (n = 10) (Fig. 1 D). Me seuraavaksi määritetään, onko meidän rokotusstrategia suojaa uloskasvamisen muiden C57BL /6-johdettu kasvaimia. Kohti Tämän vuoksi meidän haastoi ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä syngeenisellä B16F0 melanoomasolulinjaa joka sai alkunsa C57BL /6-hiiristä ja seurattiin kasvaimen kasvua ajan myötä. Kuten kuvassa S2, ESC /STO-GM rokotus vähensi tehokkaasti koko melanooman kasvaimia ja myös aiheutti merkittävää viivettä kasvaimen outgrowh verrattuna valvoa, rokottamattomiin hiiriin.
(A) pylväsdiagrammi, joka esittää GM-CSF ilmentymisen transdusoimattomien ja transdusoitiin retroviraalisesti STO fibroblasteissa. Virhe palkit edustavat keskiarvoa ± SD. *, P 0,05; suhteessa transdusoimattomien STO-solut;
t
testiä. (B) Scheme of immunisaation. C57BL /6-hiiriä immunisoitiin kaksi kertaa (päivinä 0 ja 14) HBSS: llä (kontrolli), tai säteilytetään 1 x 10
6 ESC + säteilytettiin 1 x 10
6 GM-CSF-proteiinia ekspressoivien STO hiiren alkion fibroblasteja (STO -GM) sc oikeaan kylkeen. Seitsemän päivää tehosteannoksen jälkeen hiiret altistettiin 1 x 10
5 Lewisin keuhkokarsinooma solut (LLC) s.c. in vasempaan kylkeen. (C) C57BL /6-hiirten (10 /ryhmä) immunisoitiin kahdesti (päivinä 0 ja 14) kanssa HBSS (kontrolli), tai säteilytetään 1 x 10
6 ESC + säteilytetään 1 x 10
6 STO-GM, tai säteilytetään 1 x 10
6 STO-GM solujen yksin sc oikeaan kylkeen ennen s.c. haaste LLC päivänä 21. Kasvaimen kasvua seurattiin päivittäin kaikissa eläimissä lopettamiseen asti kun kasvain on suurempi kuin 5% kehon painosta. Rokotetuilla kasvain hiiriin pysyi niin jopa 4 kuukautta myöhemmin ilman selviä merkkejä kärsimystä tai autoimmuniteetin. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. **,
p
0,001; suhteessa kontrolliin ryhmään; log-rank-testi. (D). Kasvaimen kasvu mitattiin harpilla joka 2. tai 3. päivä ja kasvainten tilavuudet piirrettiin kuten on osoitettu. Tulokset edustavat keskiarvoa kasvainten 10 hiirtä /kontrolliryhmän ja 3 hiirtä /ESC /STO-GM-yhtymä ja edustavat kolmen erillisen kokeen. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SEM.
ESC rokotus saa aikaan kasvainsolujen CD8-riippuvainen sytotoksinen T-lymfosyytti vastaus
Useimmat onnistunut syövän immunoterapian vaativat vankkaa CD8-riippuvaisen CTL-vaste [21 ], [22]. Sen tutkimiseksi, ESC /STO-GM rokotus saa aikaan CD8 vastauksia splenosyytit ESC /STO-GM rokotettu ja rokottamattomien (kontrolli) hiiriä arvioitiin
in vitro
tuumorisoluja tappava kymmenen päivän kuluttua immunisaation. Tulokset osoittavat, että läsnä on CTL-vasteen myöhemmän ESC /STO-GM rokotuksen (Fig. 2A). Tärkeää on, tämä tappaminen on spesifinen kasvainsolujen (ja ESC) tältä sytotoksisuutta ei havaittu vastaan ensisijainen aikuinen hiiren keuhkon fibroblastit tai STO fibroblasteja (
tuloksia ei ole esitetty
). Tutkimme lisäksi fenotyyppisiä markkereita CD8
+ pernasoluja ESC /STO-GM rokotettu ja ohjaus hiirillä. Granzyme B on sytolyyttinen molekyyli tyypillisesti ilmaistaan efektori, mutta ei naiivi tai muistin, CD8
+ pernasolujen [23], [24]. Pernasolut saatu rokottamattomista /kasvaimen kyseenalaiseksi (kontrolliryhmä), rokotettiin /kasvaimen haastoi ja rokotetut /ei-kasvain hiiriin ja värjättiin suoraan
ex vivo
ilman -uudelleenstimulaation. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, vain hyvin pieni osa CD8
+ pernasolujen eristetty immunisoimattomista verrokkihiirten ilmaisi grantsyymi B, kun taas 25,6% CD8
+ pernasoluja rokotetuista /kasvaimen hiiriin ilmaisi tämän CTL efektori (n = 6 /ryhmä;
t
testi,
p
0,05; vertailuryhmään nähden ryhmään; Fig. 2B, D). Lisäksi mitään eroja prosentteina CD8
+ granzymeB
+ soluja, havaittiin pernasoluja eristettiin rokotetuista hiiristä, jotka eivät olleet altistettiin LLC-soluja verrattuna rokotetut /kasvaimen altistetuissa hiirissä (Fig. 2C), joka tarjoaa lisätodisteita että lisääntynyt grantsyymi B vaste vietämme rokotettujen /kasvain hiiriin on nimenomaan syöpäsoluja. Koska lisätestissä tärkeydestä CD8-riippuvaisen CTL-välitteinen antituumorivaikutuksia, CD4
+ tai CD8
+ T-lymfosyytit köyhdytettyä
in vivo
käyttäen anti-CD4- tai anti-CD8 monoklonaalisia vasta-aineita [25]. Kun taas hiiret köyhdytettyä CD4
+ lymfosyytit ainakin osittain suojattu uloskasvamisen LLC, CD8
+ T-solujen poistamista kumosi kokonaan suojaavan vaikutuksen ESC /STO-GM rokotus (Taulukko 1).
(A) C57BL /6-hiirten (5 /ryhmä) immunisoitiin kahdesti (päivinä 0 ja 14) kanssa HBSS (kontrolli) tai säteilytetään 1 x 10
6 ESC + säteilytetään 1 x 10
6 STO-GM solut sc oikeaan kylkeen. Kymmenen päivää tehosteen jälkeen hiiret tapettiin ja pernat poistettiin. Splenosyytit rokotetuista hiiristä ja kontrollihiiristä, lisättiin kuoppiin ennen kylvetään LLC-solujen ja co-viljeltiin vielä 16 tuntia, jossa on valittu efektori-to-kohde-suhteilla, menetys viimeksi mainitun tarkkailtiin Acea sähköisen impedanssin lukija. Tulokset esitetään edustavat neljää itsenäistä kuoppiin kullekin efektori-to-kohde-suhde ja virhepalkkeja edustavat keskiarvoa ± SD. (B-D) C57BL /6-hiiriä immunisoitiin kaksi kertaa (päivinä 0 ja 14) HBSS: llä (kontrolli) tai säteilytetään 1 x 10
6 ESC + säteilytettiin 1 x 10
6 STO-GM-solujen s.c. oikeaan kylkeen. Seitsemän päivää viimeisen immunisaation jälkeen hiiret altistettiin 1 x 10
5 LLC solujen s.c. in vasempaan kylkeen. 18-21 päivää sen jälkeen, kun kasvain haaste, hiiret lopetettiin ja pernat poistettiin. Lisäksi yhdet hiiret rokotettiin ESC /STO-GM yksin eikä altistettiin kasvain. Pernasoluja rokotetuista /kasvaimen altistettiin, rokotetut /ei-kasvain altistettiin ja kontrollihiiret pestiin, Fc-reseptorit olivat tukossa, ja värjättiin pinnan ilmentymistä CD8 ja solunsisäistä ekspressiota grantsyymi B ja analysoitiin virtaussytometrialla. (B, D) CD8
+ soluja, jotka ilmentävät grantsyymi B splenosyyteissä saatu rokotetuista /kasvaimen haastoi ja valvonta hiiret (6 /ryhmä). (C) CD8
+ soluja, jotka ilmentävät grantsyymi B splenosyyteissä saatu rokotetuista /ei-kasvain hiiriin (6 /ryhmä). Tulokset ilmaistaan prosentteina aidatulla CD8
+ pernasolua (*, p 0,05; vertailuryhmään nähden ryhmään;
t
testi). Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD.
ESC rokotus indusoi kasvainsolun-specific, Th1-välitteinen sytokiinivasteeseen CD8
+ T-solujen
Seuraava määritti kyky CD8
+ T-solut rokotetuista hiiristä tuottamiseksi efek- sytokiinien tarvitaan tehokkaan kasvaimia torjuvaa sytolyyttinen aktiivisuus. Vasteena uudelleen stimulaatio LLC solulysaatti, joka on huomattavasti korkeampi taajuus IFN-γ: n, TNF-α: n ja IL-2 tuottavien CD8
+ pernasoluja saatu ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä verrattuna ei- rokotetun kontrolliryhmän (n = 6 /ryhmä; ANOVA,
p
0,05, suhteessa kontrolliin ryhmä; Fig. 3A-D). Koska LLC uudelleen stimulaatio, ei lisätä sytokiinien tuotannon havaittiin CD8
+ pernasoluja rokotetuista hiirillä verrattuna stimuloimattoman, ohjaamaan ei-rokotettuja hiiriä (Fig. 3E, F). Kun analysoidaan riippumaton osuudet ESC ja STO-GM immunizations CD8
+ T-solu effektorifunktioita, havaitsimme, että ESC yksin tai STO-GM hoitoja yksin onnistunut indusoimaan merkittävää kasvua prosenttiosuudet pernan CD8
+ TNF-α
+ ja CD8
+ IFNy
+ soluja verrattuna ohjaamaan rokottamattomiin hiiriin (Fig. 3C). Sen määrittämiseksi, ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä indusoi samanlaisia CD8
+ T efektori vastausten muihin C57BL /6 johdetut kasvainsoluja, suoritimme
in vitro
sytokiinianalyysi lysaateilla johdettu B16F0 melanoomasoluja. Kuten odotettua, vasteena uudelleen stimulaatio B16 solulysaatti, havaitsimme merkittävää kasvua taajuuden IFN-γ: n ja TNF-α tuottavien CD8
+ splenosyyttien ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä verrattuna uudelleen stimuloitujen pernasolujen viljelmiä on saatu ei-rokotetun kontrolliryhmän (kuvio S2).
C57BL /6-hiiriä (6 /ryhmä) immunisoitiin kahdesti (päivinä 0 ja 14) HBSS: llä (kontrolli) tai säteilytetään 1 x 10
6 ESC yksin tai säteilytetään 1 x 10
6 ESC + säteilytetään 1 x 10
6 STO-GM, tai säteilytetään 1 x 10
6 STO-GM pelkät solut, sc oikeaan kylkeen. Kymmenen päivän kuluttua vauhtia, hiiret lopetettiin ja pernat poistettiin. Splenosyytit rokotetuista hiiristä ja kontrollihiiristä olivat viljeltiin yhdessä LLC lysaatin (50 ug /ml) vielä 4 päivää. Efektorit kerättiin ja stimuloitiin 4 tuntia PMA: lla (50 ng /ml) ja ionomysiinillä (500 ng /ml) läsnä ollessa Brefeldin A: n (1 ui /ml). Jälkeen direstimulaatioon, efektoreja kerättiin, Fc-reseptorit olivat tukossa, ja värjättiin ilmentymiseen pinnassa CD4, CD8 ja solunsisäinen sytokiinien ja analysoitiin virtaussytometrialla. (A, B) Dot tontteja osoittavat TNF-α ja IFN-γ ilmentymistä CD8
+ solujen pemasolu kulttuureissa saatu ohjaus ja ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä. Numerot neljännesten edustavat prosenttiosuudet kustakin alaryhmästä. (C, D) Bar kaavioita prosenttiosuudet CD8
+ TNF-α
+, CD8
+ IFN-γ
+ ja CD8
+ IL2
+ solujen splenosyyttien johdetut viljelmät ohjaus, ESC yksin, STO-GM yksin ja ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä. Tulokset ilmaistaan prosentteina solujen kokonaismäärään. *, P 0,05; suhteessa kontrolliin ryhmään; ANOVA. (E, F) Stimuloimattoman pernasoluja rokotetuista hiiristä ja kontrollihiiristä käsiteltiin suoraan PMA /ionomysiinillä /Brefeldin A ja värjättiin solunsisäisen sytokiinin ilmentymistä. Kaksi itsenäistä soluviljelymäärityksillä suoritettiin eristetyt solut 6 hiirtä ryhmää kohti; tiedot yhdestä edustaja määrityksen on esitetty. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD.
ESC rokotus vähentää myelooinen johdettuja suppressorisolut mutta ei muuta säätelijä-T-solujen pernassa
lisätutkimuksia immunomodulaarisia vaikutuksia ESC /STO -GM rokotus, analysoitiin fenotyyppi pernasolujen virtaussytometrialla. On osoitettu, että CD11
+ Gr1
+ myelooinen johdettuja vaimennin soluja (MDSCs) ja CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ T sääntelyn solujen (T
regs) ovat kaksi vaimennin populaatiot, jotka haittaavat kasvaimia torjuvaa efektorin vasteet pernan [26], [27]. Huomasimme, että prosenttiosuus MDSCs pieneni merkitsevästi 33,8%: sta 9,8% pernat rokotetut hiiret ESC /STO-GM ja altistettiin LLC solujen verrattuna rokottamattomiin, LLC haastoi kontrollihiiret (n = 5 /ryhmä
t
testi,
p
0,05; vertailuryhmään nähden ryhmään; Fig. 4A, B). ESC /STO-GM rokotus, ei kuitenkaan vähentää prosenttiosuudet pernan T
regs (Fig. 4C) tai aiheuttaa mitään muutosta suhde CD8
+ T-solujen T
regs pernassa (Fig. 4D). Lisäksi emme noudata mitään merkittäviä eroja prosenttiosuudet CD4
+ ja CD8
+ T-solut (Fig. 4E) tai niiden absoluuttisen määrän (
ei esitetty
) kun pernat rokotettujen ja kontrollihiirten.
C57BL /6-hiiriä immunisoitiin kaksi kertaa (päivinä 0 ja 14) HBSS: llä (kontrolli) tai säteilytetään 1 x 10
6 ESC + säteilytettiin 1 x 10
6 tarinoiden GM solujen sc oikeaan kylkeen. Seitsemän päivää viimeisen immunisaation jälkeen hiiret altistettiin 1 x 10
5 LLC solujen s.c. in vasempaan kylkeen. 18-21 päivää sen jälkeen, kun kasvain haaste, hiiret lopetettiin ja pernat poistettiin. Splenosyytit rokotetuista hiiristä ja kontrollihiiristä pestiin, Fc-reseptorit olivat tukossa, ja värjättiin pinnan ilmentyminen eri merkkejä ja analysoitiin virtaussytometrialla. (A) Dot tontteja osoittavat prosenttiosuudet pernan CD11
+ GR1
+ myelooinen johdettuja vaimennin soluja (MDSCs) valvonta ja ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä. Numerot neljännesten edustavat prosenttiosuudet kustakin alaryhmästä. (B) Bar kaavioita prosenttiosuudet CD11
+ GR1
+ MDSCs pernasoluissa saatu ohjaus ja ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä. Tulokset ilmaistaan prosentteina solujen kokonaismäärään. *, P 0,05; suhteessa kontrolliin ryhmään;
t
testiä. (C) Bar kaavioita prosenttiosuudet CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ T sääntelyn solujen (T
reg) pernasoluissa saatu ohjaus ja ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä. Tulokset ilmaistaan prosentteina solujen kokonaismäärään. (D) suhde CD8
+ Foxp3
– ja CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ T
reg solua laskettiin ja verrattiin saatuja pernasoluja ohjaus ja ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä. (E) Pylväsdiagrammi osoittaa prosenttiosuudet CD4
+ T ja CD8
+ T-solujen splenosyyteissä saatu ohjaus ja ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä. Tulokset ilmaistaan prosentteina solujen kokonaismäärään. Kolme erillistä määritystä tehtiin eristetyt solut 5 hiirtä per ryhmä; tiedot yhdestä edustaja määrityksen on esitetty. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD.
ESC rokotus suurentaa suhdetta CD8
+ T efektorisolujen T
regs kasvaimen
tulokset osoittavat, että ESC /STO-GM-indusoi anti-kasvain efektoritoiminto välittyy pääasiassa CD8
+ T-soluja. Siksi tutkittiin vaikutusta tämän rokotteen hoito funktion sisäisen kasvaimen CD8
+ solujen ja niiden vuorovaikutus T
regs. Hyödyntämällä pieniä määriä ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä, jotka tekivät kehittää LLC vaurioita – vaikkakin hieman viiveellä (Fig. 1 C, D), kasvainten valvontaa ja rokotetuista hiiristä kerättiin ja käytettiin tutkimaan osajoukon profiilit kasvaimeen tunkeutuva lymfosyyttien (TIL). Flow rianalyysit CD45.2
+ TIL paljasti lasku prosenttiosuus CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ T
regs kasvaimen suodattuu rokotetuista hiiristä
versus
ohjaimet (Kuva. 5A). Vaikka olemme edelleen havaittu läsnäolo T
regs näissä kasvaimissa, suhde CD8
+ T-solujen T
regs lisääntyi merkitsevästi kasvaimen tunkeutuu välillä ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä (n = 3 /ryhmä;
t
testi,
p
0,05; vertailuryhmään nähden ryhmään; Fig. 5B, C). Laadun arvioimiseksi CD8
+ T-solu kasvain infiltraatiota seuraavat ESC /STO-GM rokotus, olemme analysoineet ilmaus aktivaatiomerkkiaine CD25 ja efektori sytokiini IFN-γ. CD8
+ solujen ESC /STO-GM kasvain infiltraatit oli kohonneet CD25 ilmaisun ja kykenivät tuottamaan suurempia määriä IFN-γ vastauksena uudelleen stimulaatiota PMA /ionomysiinillä (n = 3 /ryhmä;
t
testi,
p
0,05; vertailuryhmään nähden ryhmään; Fig. 5D, E). Täten ESC ja STO-GM yhdistelmä rokote lisää merkittävästi suhdetta CD8
+ T-solujen T
regs ja prosenttiosuudet CD8
+ CD25
+ ja CD8
+ IFN- γ
+ efektorisolujen tuumoreissa ja ovat viitteellisiä tehokkaan rokotteen indusoima kasvain-reaktiivinen immuunijärjestelmää esikäsittely.
C57BL /6-hiiriä immunisoitiin kaksi kertaa (päivinä 0 ja 14) HBSS: llä (kontrolli) tai säteilytetään 1 x 10
6 ESC + säteilytetään 1 x 10
6 STO-GM solujen sc oikeaan kylkeen. Seitsemän päivän kuluttua vauhtia, hiiret altistettiin 1 x 10
5 Lewisin keuhkosyöpä solut s.c. in vasempaan kylkeen. 18-21 päivää sen jälkeen, kun kasvaimen haaste, kasvaimeen infiltroituvat solut kerättiin kontrollista ja ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä, ja analysoitiin virtaussytometrialla. (A) histogrammit osoittavat prosenttiosuudet CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ T
regs vuonna CD45.2
+ kasvain infiltroituvat solut saatu ohjaus ja ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä . (B) Dot tontteja osoittavat prosenttiosuudet CD8
+ ja Foxp3
+ alaryhmien CD45.2
+ kasvain infiltroituvat solut. (C) Pylväsdiagrammi, joka osoittaa suhdetta CD8
+ Foxp3
– CD8
-Foxp3
+ soluja 1 2 edustavia kokeita 3 itsenäisesti analysoida hiirtä /ryhmä. *, P 0,05; suhteessa kontrolliin ryhmään;
t
testiä. (D, E) TSK rokotus taajuudet suurenevat funktionaalisten CD8
+ T-solujen kasvaimia. (D) Pylväsdiagrammi, joka osoittaa prosenttiosuudet CD25
+ CD8
+ in CD45.2
+ kasvain infiltroituvat solut saatu ohjaus ja ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä. (E) Kasvaimen infiltroivia soluja stimuloitiin uudelleen PMA: lla ja ionomysiinillä ja analysoitiin ilmentymisen solunsisäisen IFN-γ. Bar kaavioita prosenttiosuudet CD8
+ IFN-γ
+ kasvainsoluissa soluttautua solujen ohjaus ja ESC /STO-GM-rokotetuista hiiristä. Tulokset ilmaistaan prosentteina solujen kokonaismäärään. Tulokset edustavat tulokset 2 itsenäisen kokeen 3 hiirtä /ryhmä. *, P 0,05; suhteessa kontrolliin ryhmään;
t
testiä. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD.
ESC rokotuksen aiheuttama CD8
+ T-soluvälitteinen efektori vasteita ylläpidetään pitkään elossa animals
Seuraavaksi testasimme tehoa meidän ESC rokotusstrategiat ylläpito CD8
+ T-solujen muistin allas ja sukupolven toissijaisten vasteet hiirillä, jotka oli onnistuneesti rokotettu /suojattu 60 päivää aikaisemmin. Kontrollit sisälsivät naiivi, rokottamattomia hiirten altistettiin LLC soluihin. 80% hiiristä aiemmin rokotettu ESC /STO-GM ei ollut kehittynyt kasvaimia 90 päivän kuluttua kasvaimen uudelleen rokotus, kun taas 0% ikääntymiseen verrokeilla lainkaan tuumoria (n = 10 /ryhmä, log-rank testi,
p
0,001; suhteessa naiivi kontrolliryhmään, Fig. 6A). Tärkeää on, rokotettujen eläinten kanssa hävitettyä LLC kasvaimia säilyy pitkän aikavälin immunologisen muistin arvioituna lisääntynyt IFN-y pernan CD8
+ soluja (n = 4 hiirtä /ryhmä;
t
testi,
p
0,05, suhteessa naiivi kontrolliryhmään, Fig. 6B). Lisäksi havaitsimme merkittävän kasvun pernan CD8
+ CD44
hi muistisolujen pitkäaikainen rokotettujen hiirten uudelleen altistettiin LLC kasvainsolujen verrattuna naiivi kasvain hiiriin. (N = 4 hiirtä /ryhmä;
t
testi,
p
0,05, suhteessa naiivi kontrolliryhmään, Fig. 6C, D).
Pitkäaikainen elossa hiiriä ESC /STO-GM-yhtymä otettiin uudelleen haastoi sc 1 x 10
5 LLC-solut 60 päivän kuluttua alkuperäisestä tuumorin istuttamisen. (A) Kasvaimen kasvua seurattiin päivittäin kaikissa eläimissä, lopettamiseen asti kun kasvain on suurempi kuin 5% kehon painosta. Tulokset edustavat summattu kaksi erillistä koetta, joissa 10 hiirtä /ryhmä. **, P 0,001; suhteessa naiivi valvontaa; log-rank-testi. (B-D) pernat eristettiin rokotetuista perhe ja hallita naiiveja hiiriä 10 päivän kuluttua kasvaimen injektion. (B) Pernasoluja kerättiin ja stimuloitiin 4 tuntia PMA: lla (50 ng /ml) ja ionomysiinillä (500 ng /ml) läsnä ollessa Brefeldin A: n (1 ui /ml). Jälkeen direstimulaatioon, solut kerättiin, Fc-reseptorit olivat tukossa, ja värjättiin solunsisäisen sytokiinien, ja analysoitiin virtaussytometrialla. Bar kaavioita prosenttiosuus solunsisäisen IFN-γ ilmentymistä CD8
+ soluja (*,
p
0,05, suhteessa naiivi valvontaa;
t
testi). Tulokset ilmaistaan prosentteina solujen kokonaismäärään. (C) Dot tontteja osoittavat prosenttiosuudet CD44
+ ja CD8
+ solujen splenosyyteissä peräisin pitkään elossa ESC rokotettu ja hallita naiiveja hiiriä. Numerot kvadranteissa edustavat prosenttiosuudet kustakin alaryhmästä. (D) Pylväsdiagrammi, joka osoittaa prosenttiosuudet CD44
+ CD8
+ soluja (*,
p
0,05, suhteessa naiivi valvontaa;
t
testi). Tulokset ilmaistaan prosentteina solujen kokonaismäärään. Tiedot B-D edustavat kaksi erillistä koetta, joissa 4 hiirtä /ryhmä. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD.
ESC rokotus estää 3 metyylikolantreenilla aloitettu, butyylihydroksitolueenia edistänyt keuhko- syövän synnyn
estäminen seuraus implantoitavien keuhkotuumoreiden käyttämisen rokotusstrategia ei ennusta teho
in vivo
keuhkojen kasvaimien syntyyn. Testaa jälkimmäinen, käytimme hiirimallissa, johon karsinogeeni hallinto seurasi krooninen keuhkotulehdus jonka ajatellaan matkivat tupakointiin liittyvät keuhko syövän synnyn [28]. Uros Balb /c-hiiret altistettiin bolus 3 metyylikolantreenilla (kokeellinen viikko 1) ja toistuvia annon butyloitua hydroksitolueenia (BHT; viikkoa 3-8). Nämä eläimet sitten rokotettu (viikon 4, 6 ja 8) joko HBSS yksinään tai ESC /STO-GM. Tässä mallissa useita keuhkokasvaimia ennustettavasti muodostavat kuluu neljästä kuuden kuukauden kuluessa vireillepanosta. 18 viikkoa kuluttua ensimmäisen annoksen 3 metyylikolantreenilla, keuhkot kerättiin ja kiinteä. Alustava brutto tarkastelu keuhkojen paljasti, että ohjaus rokotettujen hiiren keuhkoissa kaikilla oli pinta kasvaimia oli keskimäärin 1,6 suurten vaurioiden hiirtä kohti (Fig. 7A). Sitä vastoin vain 1/8 hiiret rokotettiin ESC /STO-GM ollut näkyvää pintaa kasvain antaa keskimäärin ~0.2 keuhkotuumoreiden /hiiri (n = 8;
t
testi,
p
0,05; vertailuryhmään nähden ryhmään; Fig. 7A). Yhteensä keuhkojen kasvain massa arvioitiin edelleen 3 eläintä kustakin ryhmästä tutkimalla leikesarjojen keuhkoihin. Kuten on esitetty kuviossa.