Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kehittyvät näyttöä siitä, että kasvaimeen aloittamista solujen (-lämpökameroissa) ovat kaikkein pahanlaatuinen solu alaryhmän kasvaimia, koska niiden kestävyys kemoterapiaa tai sädehoitoa. Kohdistaminen -lämpökameroissa voi olla keskeinen innovaatio syövän hoitoon. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että PPARy-agonistit estivät syöpä kantasolun kaltainen fenotyyppi ja heikennettyjä kasvaimen kasvua ihmisen maksasolusyövän (HCC) soluja. Reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) aloitetaan NOX2 säätelyä olivat osittain vastuussa estäviä vaikutuksia välittävät PPARy-agonisteja. Kuitenkin PPARy-agonisti välittämä ROS tuotanto merkittävästi aktivoitu AKT, mikä puolestaan ​​edistää TIC selviytymistä rajoittamalla ROS sukupolvi. Esto AKT, joko farmakologiset inhibiittorit tai AKT siRNA, merkittävästi parannettu PPARy-agonisti estoa solujen lisääntymisen ja kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC-soluissa. Tärkeää on, nude-hiirillä, jotka inokuloitiin HCC Huh7-soluissa, olemme osoittaneet synergistisen estävän vaikutuksen PPARy-agonistin rosiglitatsoni ja AKT-estäjällä trisiribiinin kasvaimen kasvua. Lopuksi havaitsimme negatiivinen kierre välillä oksidatiivisen stressin ja AKT hyperactivation in PPARy agonistin välittämä tukahduttava vaikutus HCCs. Kombinatoorista soveltaminen AKT- estäjällä ja PPAR-agonistin voi tarjota uuden strategian eston kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia HCCs ja hoitoon maksasyövän.

Citation: Liu L, Yang Z, Xu Y, Li J , Xu K, Zhang L, et ai. (2013) hapettavan stressin inhibiittoreina-herättänyt AKT Activation Helpottaa PPARy Agonist estoa Stem Cell Character ja kasvaimen kasvu maksasyövän solut. PLoS ONE 8 (8): e73038. doi: 10,1371 /journal.pone.0073038

Editor: Yin Tintut, University of California, Los Angeles, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 16 heinäkuu 2013; Julkaistu: 30 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Kiinan National Key Project (2013ZX10002-011). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) riveissä viidenneksi yleisin syöpä maailmassa. Kuitenkin HCC on korkea kemoterapian resistenssin ja yleisyydestä toistuminen ja etäpesäke jälkeen kirurginen hoito, mikä tekee siitä kolmanneksi suurin syy syöpään kuolleisuus [1], [2]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että HCC voi olla peräisin alaryhmästä kantasolujen kaltaisia ​​soluja, kutsutaan kasvaimen aloittamista solut (-lämpökameroissa) tai syövän kantasoluja, jotka on tunnettu siitä, että spesifisten pintamarkkereiden ja näytön itseuudistumisen, erilaistumiseen, kasvaimen aloittamista ja lääkeresistenssideterminantit [3] – [10]. Vaikka lääke sorafenibin on äskettäin hyväksytty HCC hoitoon, rajoitettu selviytymisen etuja potilaille, joilla myöhäisvaiheen HCC eikä vahvaa tehoa kasvainten etäpesäkkeitä on osoitettu [11], [12]. Siksi vaihtoehto hoitomuodot poistamaan tai rajoittamaan alapopulaatio -lämpökameroissa voi olla tehokas strategia HCC hoitoon.

Peroksisomiproliferaattori aktivoituvan reseptorin γ (PPARy) on ligandista riippuvan transkriptiotekijä, joka kuuluu nukleaarihormonireseptorit superperheen. Agonistit aktivoimiseksi PPARy ovat endogeenisten lipofiilisiä ligandit, kuten 15-deoksi-Δ

12,14-prostaglandiini J

2 (15d-PGJ

2), ja rasvahapot, samoin kuin synteettiset tiatsolidiinidionien (luokka diabeteksen lääkkeet), kuten rosiglitatsonin, troglitazone, siglitatsoni, pioglitatsoni ja englitatso- [13]. Ligandin aktivaation tämän transkriptiotekijän johtaa ilmentymistä kohde- geenien ohjata monia olennaisia ​​fysiologisia prosesseja, kuten aineenvaihdunta, solujen erilaistuminen, apoptoosi ja kudosten tulehdus [14]. PPARy-agonistit ovat myös osoitettu pidättämään solujen lisääntymistä, apoptoosin, vähentää soluadheesiota ja muuttoliike sekä edistää erilaistumista syöpäsoluja eri alkuperää [15] – [22]. PPARy lohkot syövän synnyn ja invasiivisen ja metastaattisen potentiaalit HCC [23], [24], mikä osoittaa, että soveltaminen PPARy-agonistit voivat olla terapeuttista etsintään HCC hoitoon. Mielenkiintoista, PPARy-agonistit ovat viime aikoina liitetty ajo ET-743-välitteistä erilaistuminen myxoid kierroksen solujen liposarkooma [15] ja esto -lämpökameroissa vuonna aivosyövän [25].

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että PPARy agonistit (15d-PGJ

2 tai rosiglitatsoni) esti kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia ihmisen maksan syöpäsoluja, ja että NADPH oksidaasin-2 (NOX2) aiheuttama reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) sukupolvi toimi keskeisenä loppupään tapahtuma. Koska negatiivista palautetta vastauksen, lisääntynyt ROS herättivät hyperactivation AKT: n, joka merkittävästi torjua PPARy-agonisti estoa kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC-soluissa.

In vivo

kokeita osoitti lisäksi, että häiriöt negatiivinen kierre, jonka AKT-estäjällä trisiribiinin merkittävästi helpottanut PPARy-agonisti rosiglitatsoni estoa kasvaimen kasvua. Nämä havainnot viittaavat siihen, että yhdistelmä AKT- estäjällä ja PPAR-agonistin voi tarjota lupaavia hoitoon maksasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeiden pöytäkirjat hyväksynyt Medical Experimental Animal Care komitean Shanghai Cancer Institute (Hyväksyntätunnus. ShCI-11-020).

Cell Culture

SK-HEP1 ja Hep3B solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Huh7 solulinja oli peräisin riken Cell Bank (Tsukuba Science City, Japani). SMMC 7721 solulinja saatiin patologian osaston toisen Military Medical University (Shanghai, Kiina) [26]. Kaikkia solulinjoja viljeltiin DMEM: ssä, jossa on runsaasti glukoosia (GIBCO, Grand Island, NY) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (GIBCO) ja penisilliiniä /streptomysiiniä (1% [v /v]; GIBCO), 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO

2 ilmakehässä. Sen jälkeen, kun soluja kasvatettiin aluksi, useita eriä kryosäilöttiin ja kaikki solulinjoja käytettiin 6 kuukauden kuluessa elvytys.

Hoitokokeissa solut maljattiin ja kasvatettiin yön yli, väliaine korvattiin sitten korkean glukoosin DMEM joka sisälsi 1% naudan sikiön seerumia, ja niitä inkuboitiin 15d-PGJ

2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), rosiglitatsonin (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), N-acetylatedcysteine ​​(NAC) (Calbiochem, Darmstadt, Saksa), trisiribiinin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), ja /tai LY294002 (Sigma-Aldrich), että ilmoitettu kertaa. Kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa.

Fluoresenssi-soluerottelulla (FACS) analyysi

inkubaation jälkeen alle merkitty viljelyolosuhteissa, solut hajotettiin ja pestiin kahdesti PBS: llä, joka sisälsi 0,5% BSA: ta 4 ° C. PE-konjugoitu anti-ihmis-CD133-vasta-aine (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksa) lisättiin inkuboitu 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Virtaussytometria tehtiin FACSCalibur virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA). Rat IgG1 /κ-vasta konjugoituna fykoerytriini- toimi isotyyppikontrolli. Kuolleet solut jätettiin värjäämällä 7-AAD (Sigma-Aldrich) ennen analyysiä. Solujen lajittelu, CD133

+ tai GFP

+ solut tiukasti porteilla ja eristettiin käyttäen MoFlo XDP- (Beckman Coulter, Fullerton, CA).

solunelinkykyisyysmääritys

Cell elinkelpoisuus määritettiin 3- (4,5-dimetyyli-2-tiatsolyyli) -2,5- difenyyli-2H-tetratsoliumbromidia (MTT) (Sigma-Aldrich) menetelmällä. Lyhyesti, yhteensä 1000 solua /kuoppa siirrostettiin 96-kuoppaisen levyn lopullisessa tilavuudessa 200 ui. Inkuboinnin jälkeen 15d-PGJ

2 osoitetun kertaa, 20 ui MTT-liuosta (5 mg /ml PBS: ssä) lisättiin elatusaineeseen ja viljeltiin vielä 3 tuntia. Sitten MTT-liuos heitettiin pois ja 150 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO, Sigma-Aldrich) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Imukyky kustakin kuopasta mitattiin aallonpituudella 540 nm.

Apoptosis Assay

laajuus apoptoosin arvioitiin Pharmingen ™ FITC anneksiini V Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences) mukaisesti edellyttäen valmistajan ohjeita. Sitten fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu analyysi tehtiin sen FACSCalibur-virtaussytometrillä (BD Biosciences). Yhden värjäystä käyttämällä anneksiini V-FITC tai 7-AAD yksin suoritettiin kontrolleina.

BrdU Pitoisuus

Pharmingen ™ APC BrdU Flow Kit (BD Biosciences) käytettiin bromideoksiuridiinia (BrdU) sisällyttäminen määritys mukaan valmistajan ohjeiden.

RNA ja Reaaliaikainen PCR

Yhteensä RNA eristettiin solujen RNAiso Reagent (TaKaRa, Dalian, Kiina). Käänteistranskriptio (RT) suoritettiin käyttäen 500 ng kokonais-RNA cDNA-synteesiä varten on 10 ui reaktiotilavuudessa, käyttäen PrimeScript ™ RT reagenssipakkauksen (TaKaRa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käyttämällä Premix Ex Taq ™ (Takara), kvantitatiivinen PCR suoritettiin

Nanog

,

Oct4

, ja

AFP

. Havaitsemiseksi

Notch1

,

SMO

,

NOX2, NOX4, P22

phox, P47

phox, P67

phox

ja

rac

ilme, kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttämällä SYBR green mix Takara on 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA).

GAPDH

käytettiin sisäisenä kontrollina. Alukkeet luetellaan taulukossa S1.

Sirna (siRNA) Transfektio

siRNA ominaisia ​​

NOX2

,

PPARy

,

AKT1

ja

AKT2

ostettiin Sigma-Aldrich. SiRNA-sekvenssit on esitetty taulukossa S2. Yksi päivä ennen transfektiota soluja siirrostettiin kuuteen-kuoppaisille levyille ilman antibiootteja. SiRNA (60 nM) transfektoitiin soluihin Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carisbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Western-blottaus-analyysi

Solut lyysattiin RIPA lyysipuskuria ( Beyotime, Nantong, Kiina), joka sisältää proteaasiestäjäseostabletit ja PhosSTOP fosfataasinestäjällä (Roche, Monza, IT). Proteiinit analysoitiin osoitti vasta-aineita: anti-CD133, anti-PPARy, anti-AKT, anti-fosfo-AKT (Ser473) (kaikki Cell Signaling Technology, Beverly, MA); anti-GAPDH, anti-α-tubuliinin (kaikki Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); ja anti-NOX2 (Abcam, Cambridge, UK). ChemiDoc ™ XRS-järjestelmä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) käytettiin kuvien saamiseksi.

sferoidi muodostava määritys

Single-solut ympättiin ultra-low kiinnitys viljelymaljoihin (Costar , Coring, NY) tiheydellä 500 solua /ml seerumivapaassa 1:01 DMEM: F12 (GIBCO), jota oli täydennetty B27 (01:50; GIBCO), 20 ng /ml epidermaalinen kasvutekijä (EGF) ja 20 ng /ml emäksistä fibroblastikasvutekijää (bFGF) (R 0,05; **,

P

0,01, versus kontrolli soluja. B, Huh7-soluja käsiteltiin 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2 osoitetut ajat ja värjättiin CD133-PE. Ennen analyysin 7-AAD käytettiin jättää kuolleita soluja. Edustavia FACS-profiilit näkyvät (vasen paneeli). Prosenttiosuudet CD133

+ solut on esitetty keskiarvoina ± SEM (n = 3) (oikea paneeli). *,

P

0,05; **,

P

0,01. C, Huh7-soluja käsiteltiin 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2: ssa 24 tuntia, ja koko proteiini uutettiin analyysiä varten CD133 ilmaisua. Kaikki näytteet normalisoitiin GAPDH ilmentymisen. D, Huh7-soluja käsiteltiin 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2: ssa 24 tuntia. Solut kerättiin BrdU ja CD133 värjäystä. Quantitative pylväskaaviot esitetään keskiarvoina ± SEM (n = 3). *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001, verrattuna kontrolli-soluissa. E, Huh7-soluja viljeltiin pallomainen muodostava väliaine, joka sisältää 15d-PGJ

2 (1 ug /ml) 7 päivää. Edustavia mikroskooppiset kuvat näkyvät (vasen paneeli). Asteikko bar = 100 pm. Quantitative pylväskaaviot esitetään keskiarvoina ± SEM (N = 3) (oikea paneeli). *,

P

0,05.

Tukeakseen havaintojemme kanssa

in vivo

kokeissa käsittelimme hiirillä GFP

+ Huh7 kasvaimia kanssa PPARy-agonisti. Koska biologinen aktiivisuus 15d-PGJ

2 on yleensä rajoitettu

in vivo

[30], [31], rosiglitatsoni, synteettinen PPARy-agonisti, jota käytettiin

in vivo

kokeiluja annoksella 100 mg /kg /päivä (hoito-kuviossa 2A). Kasvainta torjuvaa kasvua vaikutusta rosiglitatsonin havaittiin (kuvio 2B). Kasvaimen kasvu inhiboituu noin 60% (

P

0,001). Olemme edelleen arvioinut pallomainen muodostava potentiaalia syöpäsolujen johdettu ohjaus ja rosiglitatsoni käsitellyillä hiirillä. Merkillistä, GFP

+ kasvainsolut eristettiin ensisijainen kasvaimia rosiglitatsoni-käsitellyissä hiirissä muodostuu pienempiä ja vähemmän palloja kuin kontrolliryhmästä (kuvio 2C). Antaminen 100 mg /kg /vrk rosiglitatsonia myös merkittävästi vähentynyt osuus GFP

+ CD133

+ kasvainsoluja (kuvio 2D). Nämä tulokset viittaavat siihen, näkyvä estävä vaikutus PPAR-agonistin kasvaimen kasvua ja kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC Huh7 solujen

in vivo

.

GFP

+ Huh7 soluja (2 x 10

6) olivat sc ympätty paljaisiin hiiriin. 4 päivän jälkeen, hiiret kasvaimia käsiteltiin päivittäin vehikkeliä tai rosiglitatsoni (100 mg /kg /vrk) Ig 12 päivää (n = 7 ryhmää kohden). A Kaavamainen ääriviivat koejärjestely. B, Alkuperäiset kuvat ksenograftikasvaimissa näkyvät (vasen paneeli). Kasvaimen paino mitattiin hoidon päättyessä (oikea paneeli). Jokainen piste edustaa paino yksittäisen ksenograftin kasvain. Vaakapalkeilla edustavat keskiarvoa ± SD (n = 7). ***,

P

0,001. C, kasvain kudoksia kontrolli- ja testiryhmään entsymaatti hajotettiin yksisoluiset suspensiot ja GFP

+ kasvainsoluja kerättiin virtauksen lajittelu ja viljeltiin sferoidiviljelmiä muodostava väliaine 7 päivää. Edustava valokuva näkyy (vasen paneeli). Asteikko bar = 100 pm. Yhteenveto pylväsdiagrammi (keskiarvo ± SD) näkyy oikeanpuoleisessa paneelissa. *,

P

0,05. D, The dissosioituneissa single kasvainsolut kustakin hiirestä värjättiin CD133-PE. Prosenttiosuus GFP

+ CD133

+ solut määritettiin virtaussytometrialla. Edustavia virtaussytometria analyysi profiilit näkyvät (vasen paneeli). Osuus CD133

+ solujen GFP

+ kasvainsoluihin esitetään keskiarvo ± SD (oikea paneeli). ***,

P

0,001.

PPARy agonistit esto Cancer kantasolun kaltainen Fenotyypit kautta NOX2 riippuvan ROS Generation

On raportoitu, että PPARy-agonistit indusoivat ROS tuotanto erilaatuisia syöpäsolujen [32], [33]. Koska asetuksessa solujen erilaistumisen on havaittu olevan kriittinen funktio ROS [34], [35], tutkimme mahdollisuutta, että ROS tuotanto osaltaan PPARy agonistin aiheuttamaa tukahduttaminen kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC-soluissa. Ensin testataan ROS tasoilla HCC-soluissa altistumisen jälkeen 15d-PGJ

2. Tulokset osoittivat, että Solunsisäiset ROS dramaattisesti lisääntyi sekä Huh7 ja SK-HEP1 soluista hoidon jälkeen 15d-PGJ

2 72 tuntia (kuvio S2A). Olemme edelleen eristää CD133

+ alapopulaatioiden Huh7-soluissa FACS: llä lajittelu ja viljellään niitä in läsnä ollessa tai poissa ollessa 15d-PGJ

2 ja antioksidantin NAC, edeltäjä solunsisäisen glutationin, joka estää ROS. Kun 3 päivän viljelyn osuus CD133

+ solujen kontrolli soluissa vähennettiin 74,84%, kun taas 15d-PGJ

2 hoito aiheutti merkittävästi suurempia vähennyksiä osuuden CD133

+ soluja annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 3A). Huomiota herättävää on, taajuus CD133

+ solut laskettiin 20,39%, kun pitoisuus 15d-PGJ

2 oli 1,0 ug /ml. Kuitenkin NAC hoito voimakkaasti heikennettyä tämä 15d-PGJ

2 estoa ja suojeli CD133

+ lokero (kuvio 3A). Tämän mukaisesti havainnon estovaikutus 15d-PGJ

2 sferoidiviljelmiä muodostumiseen dramaattisesti vähentynyt, kun Huh7 solut esikäsiteltiin NAC (kuva S2B). Lisäksi NAC heikensi myös ekspression stemness liittyviä geenejä sekä Huh7 ja SK-HEP1 soluissa (kuvio S2C). Nämä havainnot viittaavat siihen, että PPARy-agonistit estivät syöpä kantasolun kaltainen fenotyypit positiivisten sääntelyn ROS tuotanto. Lisäksi, ehtyminen PPARy siRNA oli vain hienovaraisia ​​vaikutuksia ROS: n syntyminen indusoi 15d-PGJ

2 (kuvio S3), mikä osoittaa, että PPAR-käsittely johtaa ROS induktion pääasiassa kautta PPARy-riippumattoman reitin.

A, Isolated CD133

+ Huh7 soluja käsiteltiin 15d-PGJ

2 (0,5, 0,75 tai 1,0 ug /ml) ja NAC (10 mM) joko yksinään tai yhdistelmänä, ja prosenttiosuus CD133

+ solujen havaittiin virtaussytometrillä 72 tunnin jälkeen. B, Huh7-soluja käsiteltiin 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2 osoitetun ajan. MRNA: n ilmentämistä NADPH-oksidaasin geenien (

NOX2

ja

NOX4

) mitattiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM (N = 3). ***,

P

0,001. C, Huh7-soluja käsiteltiin 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2: ssa 24 tuntia. Ilmaisu

P22

phox, P47

phox, P67

phox

ja

Rac

mRNA määritettiin kvantitatiivisen RT-PCR. *,

P

0,05; **,

P

0,01. D, Huh7 ja SK-HEP1 soluja käsiteltiin 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2 osoitetun kertaa ja koko proteiini uutettiin analyysiä varten NOX2 ilmaisua. E, Huh7-soluja transfektoitiin ohimenevästi negatiivinen kontrolli siRNA tai NOX2 siRNA-3, jonka jälkeen solut ympättiin ultra-low kiinnitys viljelyastioihin ja viljeltiin pallomainen muodostava väliaine, joka sisältää 15d-PGJ

2 7 päivää. Määrä pallosia muodostettu on esitetty keskiarvoina ± S.E.M. (N = 3). *,

P

0,05. F, Huh7-soluja transfektoitiin ohimenevästi negatiivinen kontrolli siRNA tai NOX2 siRNA-1. -Soluja käsiteltiin 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2: ssa 72 tuntia ja värjättiin CD133-PE. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM (N = 3). *,

P

0,05; **,

P

0,01.

NADPH oksidaasin (NOX) proteiinien perhe vastaa ROS tuotannosta [36]. Voit selvittää, onko NADPH oksidaasien voimistunut ja contributable lisääntynyt ROS sukupolvi stimulaatio PPARy-agonistit, olemme analysoineet runsaasti eri

NOX

mRNA: t, mukaan lukien

NOX2

ja

NOX4

, käsitellyissä soluissa 15d-PGJ

2. Ilmaisu on

NOX2

ja

NOX4

reagoitiin nopeasti voimistunut, alkaen noin 3 tuntia käsittelyn jälkeen 15d-PGJ

2 (kuvio 3B). Lisäksi olemme havainneet, että transfektio siRNA: iden spesifinen

NOX4

ei heikennä 15d-PGJ

2-indusoitu ROS: n syntyminen (tietoja ei esitetä), kun taas mRNA: n tasoja useita merkittäviä NOX2 komponentteja, kuten

P22

,

P47

,

P67

ja

Rac

, lisättiin merkittävästi 15d-PGJ

2-käsiteltyjen Huh7 soluja (kuvio 3C) . Lisäksi proteiini taso NOX2 oli huomattavasti koholla molemmissa Huh7 ja SK-HEP1 soluja käsiteltäessä 15d-PGJ

2 (kuvio 3D). Olemme edelleen köyhdytettyä NOX2 ilmaisu erityisiä siRNA sekä Huh7 ja SK-HEP1 soluja, ja havaitsi, että NOX2 vaje solujen osoitti heikompaa induktion ROS vastauksena 15d-PGJ

2 hoitoa verrattuna soluihin transfektoitu ohjaus siRNA (kuva S4A). Tehokkuus

NOX2

siRNA inhiboimaan NOX2 ilmentyminen oli validoitu Western-blottauksella ja kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi (kuvio S4b ja C). Todellakin, downregulation NOX2 merkittävästi torjua 15d-PGJ

2 estoa sferoidiviljelmiä muodostumisen ja altaan koosta CD133

+ osajoukko Huh7 soluissa (kuvio 3E ja F). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että säätelyä NOX2 vastasi PPARy-agonisti estoa kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia HCC-soluissa.

vastavuoroinen asetukseen ROS Generation ja AKT Aktivointi PPARy Agonist saaneilla HCC Cells

Seuraavaksi tutkitaan mahdollisia muutoksia signalointireittien, jotka säätelevät vaikutukset välittyvät PPARy-agonistit. Kiehtovan, huomasimme, että molemmat 15d-PGJ

2 ja rosiglitatsoni paranee dramaattisesti fosforylaatiota AKT, ja tämä PPARy agonistin aiheuttama aktivaatio AKT lievitti NAC vuonna Huh7 soluissa (kuvio 4A). Sama ilmiö tapahtui myös SK-HEP1 soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että PPARy-agonisti-indusoidun ROS aiheuttanut AKT hyperactivation. Tutkia, millaisia ​​suhdetta AKT aktivointi ja ROS tuotanto, käytimme AKT-estäjällä trisiribiinin ja PI3K estäjä LY294002 tukahduttaa AKT-vaikutusta, ja huomasimme, että annoksesta tai ajasta riippuva tukahduttamisesta AKT fosforylaatio rinnastettiin asteittaisen muutoksen yhteydessä in NOX2 ilmentyminen (kuvio 4B ja C). Lisäksi kombinatorinen hoito Huh7 solujen sekä 15d-PGJ

2 ja trisiribiinin johti korkeampaa solunsisäisten ROS kuin jompikumpi hoito yksinään (kuvio 4D). Tämä synergistinen vaikutus havaittiin myös soluissa yhteistyössä käsitelty 15d-PGJ

2 ja LY294002 (kuvio 4E). Olemme edelleen vahvistaneet havainnot käyttämällä erityisiä siRNA: t vastaan ​​AKT1 ja AKT2. SiRNA vastaan ​​AKT1 entisestään ROS induktio läsnäollessa 15d-PGJ

2 (kuvio 4F). Tehokkuus AKT1 ja AKT2 siRNA inhiboimaan koko ja fosforyloituu AKT ilmentyminen vahvistanut Western blotting-analyysi (kuvio 4F). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että PPARy-agonisti-indusoidun AKT aktivointi moduloitu NOX2-välitteisen ROS kautta negatiivista palautetta.

A, Huh7-soluja esikäsiteltiin NAC (10 mM) 30 minuuttia, mitä seurasi 15d-PGJ

2 (0,5 ng /ml) ylimääräisen ilmoitettu ajat (yläpaneeli). Huh7-soluja käsiteltiin rosiglitatsonia (5, 20 tai 50 uM) ja NAC (10 mM), joko yksin tai yhdistelmänä: ssa 6 tuntia (alapaneeli). Yhteensä proteiini uutettiin analyysiä varten P-AKT, AKT, ja GAPDH ilme. B, Huh7-soluja käsiteltiin AKT-estäjällä trisiribiinin 3 tuntia ja yhteensä proteiini uutettiin analyysiä varten NOX2, P-AKT, AKT, ja GAPDH ilmaisun. C, Huh7-soluja käsiteltiin LY294002 (10 uM) ja osoitetut ajat, ja proteiini taso NOX2 tutkittiin Western blotting -analyysi. D, Huh7-soluja käsiteltiin 15d-PGJ

2 ja trisiribiinin joko yksinään tai yhdessä 48 tuntia, minkä jälkeen ne leimattiin DHE ja analysoitiin virtaussytometrialla. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM (N = 3). *,

P

0,05; **,

P

0,01. E, Huh7-soluja käsiteltiin 15d-PGJ

2 ja LY294002 joko yksinään tai yhdessä 72 tuntia, minkä jälkeen ne leimattiin DHE ja analysoitiin virtaussytometrialla. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM (N = 3). *,

P

0,05; **,

P

0,01. F, Huh7-soluja transfektoitiin ohimenevästi AKT1 siRNA ja AKT2 siRNA joko yksin tai yhdistelmässä, minkä jälkeen soluja käsiteltiin 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2 vielä 3 tunnin ajan (vasen paneeli). Tasot P-AKT ja AKT proteiinit mitattiin Western blotting-analyysi. Huh7-solut transfektoitiin väliaikaisesti negatiivisen kontrollin siRNA tai AKT1 siRNA, minkä jälkeen soluja käsiteltiin 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2 vielä 72 tunnin ajan (oikea paneeli). Solunsisäinen ROS tuotanto analysoitiin virtaussytometrialla (keskiarvo ± S.E.M., n = 3). *,

P

0,05.

Akt Inhibitor trisiribiinin Tekee yhteistyötä PPARy agonistit estävän Cancer Stem Cell kaltainen Fenotyypit ja tuumorikasvun

Edellä mainitut tulokset sai meidät spekuloida, että yhdistetty hoito on PPAR-agonistin ja AKT-estäjällä voi estää kasvaimen kasvua tehokkaammin kuin kumpikaan reagenssi yksinään. Ensin arvioidaan, onko trisiribiinin lisäsi herkkyyttä HCC solujen PPARy agonistin indusoiman apoptoosin. Itse asiassa sekä Huh7 ja SK-HEP1 solujen yhdistelmä trisiribiinin kanssa 15d-PGJ

2 tai rosiglitatsoni tehosti merkittävästi apoptoosin verrattuna joko yksin (kuvio 5A). Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että yhdistelmä hoito Huh7 solujen sekä 15d-PGJ

2 ja trisiribiinin ei aiheuta edelleen vähentynyt osuus CD133

+ soluja verrattuna hoitoon 15d-PGJ

2 yksin. Kuitenkin yhdistelmä hoito oli tehokkaampi inhiboimaan soluproliferaatiota Huh7 soluissa verrattuna hoitoon joko yksittäisten ainetta yksinään (kuvio 5B), mikä osoittaa, että yhdistelmähoito laskivat edelleen absoluuttinen määrä CD133

+ Huh7 soluja. Soluissa käsitelty sekä 15d-PGJ

2 ja trisiribiinin, huomasimme, että määrä CD133

+ solujen väheni 70,9%, mikä oli korkeampi kuin 46,1% vuonna 15d-PGJ

2- käsitellyissä soluissa (kuvio 5C). Samoin määrä CD133

+ solujen väheni 89,6% yhdistelmähoidon rosiglitatsonin ja trisiribiinin, korkeampi kuin 37,5% rosiglitatsonilla hoito yksinään (kuvio 5C). Lisäksi yhdistelmähoito tukahdutti pallomainen muodostumista Huh7 solujen merkittävämmin kuin kumpikaan 15d-PGJ

2 tai AKT-estäjällä yksinään (kuvio 5D). Nämä tiedot osoittavat, että AKT esto trisiribiinin mahdollisesti pahentanut estäviä vaikutuksia PPARy-agonistit väestöön CD133

+ soluista suoraan indusoimalla solukuolemaa.

, Huh7 ja SK-HEP1 soluja käsiteltiin 15d-PGJ

2, rosiglitatsoni ja trisiribiinin joko yksinään tai yhdistelmänä. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen arvioitiin 48 tuntia myöhemmin anneksiini V-FITC /7-AAD värjäystä. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM (N = 3). *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001. B, Huh7 soluja käsiteltiin 15d-PGJ

2 ja trisiribiinin joko yksinään tai yhdistelmänä. ***,

P

0,001. *,

P

0,05; **,

P

0,01. Asteikko bar = 100 pm. *,

P

0,05. Tiedot ovat keskiarvo ± SD. *,

P

0,05; **,

P

0,01. *,

P

0,05; Asteikko bar = 100 pm. *,

P

0,05; *,

P

0,05; **,

P

0,01.