Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA) ovat sekaantuneet valvonnassa monien biologisten prosessien ja niiden purkamista on liittynyt moniin syöpiin. Viime vuosina syöpä kantasolu (CSC) käsite on sovellettu moniin syöpiin kuten lapsipotilailla. Oletimme, että yhteinen allekirjoitus vapautetuilla miRNA että CSCS fraktio voi selittää häiriintynyt signalointireittejä vuonna CSCS.

Menetelmät /Tulokset

Käyttämällä korkean suoritustehon qPCR lähestymistapa tunnistimme 26 CSC Associated ilmentyvät eri miRNA (DEmiRs). Käyttämällä BCmicrO algoritmi 865 potentiaali CSC liittyy Demir tavoitteet saatiin. Näitä mahdollisia kohteita alistettiin Kegg, BioCarta ja Gene ontologia polku ja biologisten prosessien analyysi. Neljä selityksin reittejä rikastettiin: solusyklin, solujen lisääntymistä p53: n ja TGF-beeta /BMP. Kaatamalla

HSA-miR-21-5p

,

HSA-miR-181C-5p

ja

HSA-miR-135b-5p

käyttäen antisense-oligonukleotidit ja Sirna solulinjoissa johti ehtyminen CSC fraktion ja heikentyvän pallo muodostumista (CSC korvike määritykset).

Johtopäätös

Tutkimustulosten mukaan CSC liittyvien DEmiRs ja oletetun reitit ne säätelevät voivat olla potentiaalisia terapeuttisia sovelluksia lapsipotilaiden syövissä.

Citation: Sanchez-Diaz PC, Hsiao TH, Chang JC, Yue D, Tan MC, Chen H-IH, et al. (2013) De säätelemät MikroRNA in Pediatric Cancer Kantasolut Target Pathways Mukana Cell Proliferation, Cell Cycle ja kehittäminen. PLoS ONE 8 (4): e61622. doi: 10,1371 /journal.pone.0061622

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 19 syyskuu 2012; Hyväksytty: 11 maaliskuu 2013; Julkaistu: 17 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Sanchez Diaz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: semp Russ säätiö San Antonio Area Foundation (myönnetään JYH), Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT, RP101195, myönnetään GET ja YC), National Institutes of Health (NIH-NCI P30CA54174, myönnetään CTRC at UTHSCSA, YC ja NIH-NCATS UL1TR000149, myönnetään CTSA at UTHSCSA, YC), The Greehey Graduate Fellowship Lasten terveys (myönnetään valvontakomission) ja suurlähettiläiden Circle Fund on Greehey Lasten Cancer Research Institute rahoitetaan osa tätä työtä. FACS tehtiin virtaussytometria Shared Resource Facility, jota tukee NIH-NCI P30CA54174 (CTRC at UTHSCSA). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat runsas luokka pieniä (~22 nukleotidia) ei-koodaavan yksijuosteisen RNA: t (ncRNA), jotka säätelevät geenien ilmentymistä klo transkription jälkeisellä tasolla. Nämä sääntelyn ncRNAs tärkeitä rooleja valvonnassa monia biologisia prosesseja ja niiden purkamista on liitetty erilaisia ​​patologisia tiloja, mukaan lukien monet syövät.

Kehittyvät näyttö tukee käsitystä, että useimmat syövät on omat ”kantasolut ”kutsutaan” syöpä kantasolut ”(CSCS). Tämä säiliö kantasolujen kaltaisia ​​soluja sisällä kasvain massa on kyky itse uudistaa ja ylläpitää armoton kasvu massan. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA osallistuvat itseuudistumisen ja solu-kohtalo päätökset kantasoluja, solusyklin ja ylläpitää tasapainoa solujen lisääntymisen, erilaistumisen ja apoptoosin [1], [2], [3], [ ,,,0],4]. Viime aikoina tutkimukset ovat osoittaneet, että mekanismit säätelevät itseuudistumisen luonne näiden solujen ovat vahingollisia syövän kantasoluja [5]. Ehdotamme, että piirteistä CSCS voidaan kuvata yhtenäisen kuvion geenin ilmentymisen, joka säätelee erityinen, poikkeavasti ilmaisi miRNA koordinoi kohti huolto- ja itseuudistumisen syövän kantasoluja. Asetus itseuudistumisen ja kyky tuottaa jälkeläisiä perustuu yhteisiin geeneihin ja mekanismeja. Tämä alaryhmä geenejä, joiden ilmentyminen on vapautettu, että miRNA voi selittää häiritsi signalointireitit on CSCS.

Perinteisissä geenin ilmentymisen analysointi, rikastus analyysi ero ilmentyvien geenien on onnistuneesti käytetty tutkimaan taustalla signalointireittien ja geeni ontologian toiminnot [6], [7], [8]. Strategia annetaan tulkinta prosessin ero ilmaistuna geenejä polkuja tai toimintoja voidaan ohjata geeni asettaa rikastamiseen algoritmien [9]. Viime aikoina useat algoritmeja on kehitetty ennustaa miRNA kohdegeenien kautta sekvenssihomologia 3 ’UTR ja miRNA siementen alueella [10], [11], [12]. Kautta ennustettu kohdegeenien miRNA [11], useat tutkimukset tutki menetelmiä merkitä toimintoja miRNA, kuten menetelmä koulutusjakson tavoitteiden säilyttämistä rikastukseen tai yhteistyössä kohdistaminen pareja niin, että hallitseva toiminnot saattavat ilmetä kautta ”hub” miRNA [13 ], permutaatio perustuva tilastollinen menetelmä, joka testaa yli- tai aliedustus miRNA tavoitteita nimetty joukko kohdegeenien [14], [15], [16], [17] ja äskettäin julkaissut mirDIP että yhdistetään 12 tavoite Ennustusalgoritmien muodostaa miRNA vuorovaikutuksen verkkojen [18]. Kuitenkin kaikki nämä algoritmit käyttävät vain kohde ennustuksen tietoja, riippumatta siitä, ekspressiotasot miRNA, yhdessä sen tosiseikan kanssa, että yksi miRNA tavoitteet yli 100 geenejä [19], mikä johtopäätös toimintoja tai polkuja sarjasta miRNA ole spesifinen biologinen tavoite liian monimutkaisia.

poiketen edellä mainituista algoritmien ehdotimme uusi algoritmi, joka yhdistetään joukko miRNA kohde Ennustusalgoritmien kanssa Bayes järjestelmä integroida ennusteen voimaa, ja sitten rakentaa miRNA-reitin pair edelleen integroimalla käsite geeniperimä rikastamiseen kanssa ilmentyvät eri miRNA (DEmiRs). Rikastamista vaihe saavutetaan ensin kartoitus miRNA ”ilmaisun omille kohdegeenien laskelmiin niiden ennustaminen vahvuus, niin molemmat rikastus pisteet (ES) ja Fisherin testiä tehtiin yli geeni asettaa tai väylän tutustua oletetun asetuksen kohdistuneeseen DEmiRs .

CSCS on kuvattu monissa lapsuuden kiinteitä kasvaimia. Nämä kasvaimet pidetään ryhmänä heterogeeninen kasvaimia, mutta vastaavanlaisia ​​ja ainutlaatuisia geneettiset ominaisuudet. Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että häiriön normaalin kehityksen prosesseja on merkittävä tekijä lapsuudessa kiinteiden kasvainten synnyssä. Biologiaan useimmat lapset syövät poikkeaa aikuisten syövistä, suurimmaksi osaksi, koska niiden blastoma alkuperää. Lapset, joilla on synnynnäinen genetiikan häiriöt usein kehittää useita erityyppisiä lapsuuden kiinteitä kasvaimia. Nämä havainnot viittaavat siihen, että saattaa olla tiettyjä polkuja, jotka ovat jaettu erilaisia ​​lapsuuden kiinteitä kasvaimia, [20].

Tässä tutkimuksessa tunnistettiin yhteinen CSCS liittyy DEmiRs 6 lapsipotilailla kiinteiden tuumorien solulinjoissa. Käytimme korkean suoritustehon qRT-PCR lähestymistapa Global miRNA ilmaus heidän CSC murto. Sitten levitetään myös uusia miRNA-polku yhdistyksen algoritmi valaista ominaisuudet CSC. Lisäksi olemme tutkineet mahdollisia vaikutuksia joidenkin DEmiRs in CSCS mukaan geenien.

Tulokset

Hierarkkinen klusterointi Cancer Stem Cells miRNA

käyttäminen neuropallon ja ALDEFLUOR® korvike määrityksissä lukema joilla pyritään rikastamiseksi varren kaltainen syöpäsolun (CSC) väestö, olimme paljastanut erityisiä DEmiRs jotka väärin säädellystä tässä potilasryhmässä. Olemme profiloitu kuusi lapsipotilailla solulinjoissa, Hep293TT, HepG2, MG-63, Daoy, SH-SY5Y, ja RD-ES käyttäen TaqMan MicroRNA Micro Fluid Card määritykset ja reaaliaikainen PCR-analyysi (Applied Biosystems). Suoritimme laadunvalvonnan tutkimalla sirontakuvaajiin kaikkien miRNA ekspressiotasot (ACt) on 6 testatut solulinjat (Kuva S1 File S1). Hajonta tontit ACt vertaamalla varsi kaltainen rikastetun fraktion vs. niiden ei varsi kaltaisia ​​vastineet näytteille konkordanssin (korrelaatiokerroin 0,75). Kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät -osiossa saimme 380 DEmiRs kanssa ekspressiotasot 2,2-kertaisesti ylös tai alas säännelty CSC jakeet verrattuna niiden ei-syöpä kantasolu viite murto. Näillä 380 DEmiRs, valitsimme miRNA jotka eri tavoin ilmaistuna vähintään 4 ulos meidän 6 solulinjojen sallia jonkin verran vikasietoisuutta. Mahdollisuus valitsemalla Demir sattuman oli 0,017 (binomijakauman). Hierarkkinen ryhmittely suoritettiin näiden 380 DEmiRs, kuten on esitetty kuviossa 1A. MiRNA HepG2 ja Hep293TT (hepatoblastooma) ja Daoy (medulloblastooma) ryhmittyivät yhteen, kun taas RD-ES (Ewingin sarkooma) ja MG-63 (osteosarkooma) ja SH-SY5Y (neuroblastooma) ryhmiteltiin. Ryhmä 26 DEmiRs (23 säädelty ja 3 alassäädetty) havaittiin (kuvio 1 B), kuten

HSA-miR-21-5p

,

HSA-miR-148a-5p

,

HSA-miR-181a-5p

,

HSA-miR-323-3p

, ja

HSA-miR-487b-3p

, kuten erittäin ilmaistu, ja

HSA-miR-19a-5p

ja

HSA-miR-25-5p

, kun alassäädetty DEmiRs.

(A). Ilmaisu arvot 380 DEmiRs mitattiin ja hierarkkinen klusterointi suoritettiin. Ilmaisu profiilia HepG2 ja Hep293TT ryhmittyivät kanssa Daoy. RD-ES ja MG-63 on ryhmitetty SH-SY5Y. Ilmentyvät differentiaalisesti miRNA (B). Kaksikymmentäkuusi miRNA ainakin 2-kertainen muutos 4 tai enemmän solulinjoja valittiin. Kaksikymmentä kolme miRNA olivat ylös säännelty ja 3 säädeltiin.

miRNA Target Prediction

tunnistamiseksi oletetun kohdegeenien DEmiRs, kohdegeenin ennustusalgoritmi, BCmicrO [21 ], joka on kuvattu Materiaalit ja menetelmät jaksossa, levitettiin DEmiRs. Kaikkiaan 865 otaksuttu microRNA kohdegeenien (630 ylös säänneltyä ja 235 sääteli) havaittiin (kuva S2 File S1). Meidän analyysi jokaisen Demir keskimäärin oli 38 ennusti kohdegeenien, lukuun ottamatta

HSA-miR-138-2-3p

,

HSA-miR-655

, ja

HSA -miR-101-3p

, joista jokaisella on yli 100 ennustettu kohdegeenien. Lisäksi olemme myös havainneet, että kaksi DEmiRs,

HSA-miR-487b-3p

ja

HSA-miR-517c-3p

, oli 7 ja 25 kohde- geenejä, tässä järjestyksessä, ennustivat TargetScan algoritmi. Nämä DEmiRs ei läpäissyt valintaperuste on BCmicrO (katso materiaalit ja menetelmät -osiossa).

Enrichment analyysit miRNA säädelty Pathways

ennustaa, sellaisia ​​keinoja meidän 26 CSCS DEmiRs voidaan säännellä me käytti miRNA-mRNA parien saatu kuten edellä on kuvattu reitin ja toiminta rikastamiseen analyysejä. Geeni settejä Kegg, BioCarta polkuja ja Gene ontologia (GO) mitattuna biologisen prosessin käytettiin. Löysimme 8, 12, ja 34 kohteita tilastollista merkittävyyttä Kegg koulutusjakson, BioCarta polku ja Gene ontologia, vastaavasti (taulukot 1, 2, 3). Kuusi ulos 8 rikastettu kohteet Kegg koulutusjakson kuuluivat eri syöpätyyppejä: pienisoluinen keuhkosyöpä, eturauhassyöpä, krooninen myelooinen leukemia, gliooma, melanooma, ja haimasyöpä. Niistä geeni sarjaa, monet solusyklin ja solujen lisääntymistä liittyviä geenejä, kuten

CDKN1A

,

CDKN1B

,

E2F1

,

PTEN

ja

RB1

säädeltiin differentiaalisesti ilmaisi miRNA (taulukko S1 File S1), joka ilmaisee solujen lisääntymistä olevan tärkeä funktio sääntelee CSC liittyvien DEmiRs. P53-reitin myös rikastunut sillä 15% geenien tämän reitin (

P

0,001,

ES

= 2.18) olivat tavoitteet meidän DEmiRs (taulukko 1). Meidän menetelmä ennusti joukko 10 geenien osallinen p53-reitin mahdollisina kohteina

HSA-miR-21-5p

,

HSA-miR-29b

,

HSA-asennuspalveli- 135b-5p

,

HSA-miR-494

, ja

HSA-miR-655

(kuvio 2A). Tiettyjä toimintoja p53-reitin, joka saattaa kärsiä näistä DEmiRs olivat solukierron pysähtymisen, apoptoosin, angiogeneesin estäminen ja etäpesäkkeiden, DNA: n korjaukseen ja vahinkojen ehkäisy, esto TGF-1 /mTOR-reitin, ja p53 negatiivinen palaute (kuvio 2A, esitettynä boxed out in red).

(A). P53-reitin, joka sisältää 8 signalointi komponenttien määrittelemien Kegg oli voimakkaasti säänneltyä CSC liittyvät DEmiRs. Viisi 26 DEmiRs olivat sekaantuneet tämän reitin,

HSA-miR-21-5p, HSA-miR-135b, HSA-miR-29, HSA-miR-655, HSA-miR-494

. TGF-beeta-reitti on Kegg (B). TGF-beeta-reitin myös sääntelee CSC liittyvät DEmiRs. Reseptorin

TGFBR1

säädeltiin

HSA-miR-101-3p

,

ja

reseptorin

TGFBR2

säädeltiin

HSA-asennuspalveli- 21-5p

, ja

HSA-miR-519A-3p

. Reseptori

BMPR2

säädeltiin

HSA-miR-101-3p, HSA-miR-21-5p, HSA-miR-181C-5p, ja HSA-miR-494

. Solmukohtien tyypin II reseptorin kinaasi ja reseptorin

ACVR2B

myös säädellä

HSA-miR-101-3p

.

toinen tärkeä polku solusyklin sääntelyn, TGF-beeta /BMP-reitin, myös rikastunut (

P =

0,001,

ES

= 2,28; taulukko 1). Yhdeksän geenejä, mukaan lukien 4-reseptoreita,

TGFBR1

,

TGFBR2

,

ACVR2B

ja

BMPR2

ja yksi ligandi, TGF- beeta, säädeltiin 8 (

HSA-miR-181C-5p

,

HSA-miR-21-5p, HSA-miR-101-3p

,

HSA-miR-494, HSA-miR-655 HSA-mi-519A-3p, HSA-miR-29b-3p, HSA-miR-132-3p) B-26: CSC liittyvien DEmiRs, kuten on esitetty kuviossa 2B. Kuten ehdotettiin kuvassa 2B, muutos TGF-beeta- ja BMP-reseptorit saattavat häiritä Smad riippuvaisen signaloinnin CSCS, ehkä tuloksena häirityn kasvua pidätys, apoptoottiset ja erilaistumista ohjelmia. Siten menetys TGF-beeta herkkyyden aiheuttavat sääntelyn Sykliinien, CDK ja CDK-inhibiittorit, pahentaa säätelyhäiriötä p53 polkuja tukivat ennustus, että nämä CSC liittyvä DEmiRs voisi olla rooli säätelyssä solusyklin ja solujen lisääntymistä. Rikastamista analyysi BioCarta polkuja, tukee lisäksi tuloksia on saatu Kegg väyliä (taulukko 1). Neljä selityksin BioCarta kulkuväylillä Solusykli, G1, P53, ja RACCYCD, olivat myös liittyy solusyklin (taulukko 2,

P

0,001 kaikissa 4 polkuja). Väylät kuvat yhdessä CSC liittyvien DEmiRs kohdegeenien on esitetty kuviossa S3 A-D File S1. TGF-beeta /BMP-reitin myös osoitti rikastumista in BioCarta-analyysi (taulukko 2,

P

= 0,001), mikä vahvistaa, meidän Kegg reitin ennustus. Muita reittejä saatu BioCarta rikastamiseen analyysi olivat CTCF, TOB1, ALK ja PTEN väyliä (taulukko 2,

P

arvo pienempi tai yhtä suuri 0,001). Joitakin tunnettuja geenejä näissä reitit ovat

TGFBR1

,

TGFBR2

, ja

TGFb

,

Smad

perheen ja

PTEN

, edelleen osallistumisen tukeminen meidän CSC liittyy DEmiRs soluproliferaatioon ja solusyklin. Biologisia prosesseja in Gene ontologia sovellettiin myös meidän rikastamiseen analyysiin. Kolmekymmentäneljä GO termejä rikastettiin (

P

0,01, taulukko 3). Biologiset prosessit liittyvät lisääntyminen kuten positiivinen asetus mesenkyymisolun Proliferation (

P

0,007,

ES

= 2,66), Negative asetuksen epiteelisolujen proliferaatio (

P

0,001,

ES

= 2,44), G1 vaiheen Mitoottista Cell Cycle (

P

0,001,

ES

= 2,29), positiivinen asetus Fibroblast Proliferation (

P

0,001,

ES

= 2,04), positiivinen asetus B-solujen lisääntymisen (

P

= 0,001,

ES

= 1,70) , positiivinen asetus sileälihassolujen lisääntymistä (

P

0,001,

ES

= 1,61) ja solujen kasvun (

P

= 0,004,

ES

= 1,53) rikastuneet meidän CSC liittyvien DEmiRs. Biologisia prosesseja korreloi syövän biologian, vaskulogeneesi, soluvastetta hypoksia, haavan paranemista, ja vaste säteilylle, rikastettiin sekä (taulukko 3). BMP signalointi ja TGF-beeta näkynyt myös rikastettua reittejä GO analyysin samanlainen Kegg ja BioCarta polku analyysejä. Signalointireittien, kuten positiivinen säätely proteiinikinaasi B signalointikaskadissa, proteiinikinaasi C: n aktiivisuuden G-proteiini-kytketyn reseptorin proteiinin signalointireitin, osoitti myös merkittävää rikastumista GO-analyysi (taulukko 3).

Toiminnallinen arviointi HSA-miR-21-5p, HSA-miR-181C-5p ja HSA-miR-135b-5p in vitro

tutkiva mahdollinen funktionaalinen merkitystä ”stemness” on

HSA-miR -21-5p

,

HSA-miR-181C-5p

ja

HSA-miR-135b-5p

, suoritimme knockdown kokeita Daoy ja SK-N-BE (2 ) solut. Lukittu Nucleic Acid (LNA ™) anti-sense knockdovvn

HSA-miR-21-5p

vähensi osa ALDH

BR soluja (korvike CSC merkki) 50% vuonna Daoy (kuvio 3A). Testasimme vaikutukset

HSA-miR-181C-5p

ja

HSA-miR-135b-5p

esto kykyyn kasvaa neuropallojen vuonna Daoy ja SK-N-BE (2 ), vastaavasti. Molemmissa tapauksissa, kyky muodostaa palloja (lue-out itseuudistumiseen) oli heikentynyt. Tulokset

HSA-miR-135b

knockdovvn SK-N-BE (2) on esitetty kuviossa 3B. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot viittaavat siihen mahdolliseen rooliin

HSA-miR-21-5p

,

HSA-miR-181C-5p

ja

HSA-miR-135b-5p

säätelyssä itseuudistumiseen in Daoy ja SK-N-BE (2) CSCS.

(A). Noin kaksinkertainen vähentäminen osa rikastettu kantasolujen kaltaisia ​​soluja havaittiin

HSA-miR-21-5p

knockdown. Näytetyt tiedot edustavat kolmea riippumatonta koetta.

HSA-miR-135b-5p

estoa kyky muodostaa neuropallojen SK-N-NE (2) (B). Arvonalentuminen pallo muodostumisen nähtiin SK-N-BE (2)

HSA-miR-135b-5p

vakaa knockdown.

HSA-miR-135b-5p

KD1, Kd2 ja KD3 olivat samasta kloonista. Data edustaa kolmen erillisen kokeen, esitetään keskiarvona ± SEM.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tunnistettiin yhteinen allekirjoitus de-säänneltyjen miRNA liittyy CSCS ja ennustetun jotkut ehdokas polkuja vaikuttaa CSCS lapsitutkimuksissa kasvaimia. CSC: n jae sisällä kuuden solulinjoissa kerättiin eri korvike määrityksiä. Kaksikymmentäkuusi ilmentyvät eri miRNA (DEmiRs) tunnistettiin CSC osa 4 ulos 6 solulinjoissa. Tämä mukana miRNA, joiden tiedetään rooli CSCS toiminto (esimerkiksi

HSA-miR21-5p

) mutta myös uusia miRNA (esimerkiksi

HSA-miR-487b

ja

HSA-asennuspalveli- 323-3p

). Se oli silmiinpistävää nähdä, että 6 CSC liittyvän DEmiRs on raportoitu muiden ryhmien kuten miRNA osallisina CSC-toiminto (t) säätämällä ydin kehityshäiriöitä reittejä [22] – [28]. Perehtyä uskottavaa roolia 26 CSC liittyvien DEmiRs, me pudotti 3. CSC liittyvien DEmiRs joilla tiedetään toimintoja CSCS. Olemme osoittaneet, että

HSA

–

miR-21-5p, HSA-miR-181C-5p

ja

HSA-miR-135b-5p

vaikuttanut CSC osa mitataan ALDH

BR ja neuropallo muodostus sijaismarkkereiden. Tuloksemme olivat samanlaisia ​​tutkimuksia muiden ryhmien osoittanut edistää näiden DEmiRs CSC väyliä [22] – [28]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että tarvitaan lisätutkimuksia luonnehtia näitä CSC liittyvien DEmiRs lapsipotilaiden syövissä.

esitteli myös systeemibiologian menetelmä ennustaa reittejä ja toimintoja näiden CSC liittyvien DEmiRs. Bayes lähestymistapa BCmicrO [21], [29] käytettiin integraattorina useiden kohde ennustaminen algoritmeja. Suppea matemaattinen malli (Eq. 2) esitettiin kartoittaa miRNA polkuun sääntelyä tai muita funktionaalisia ryhmiä. Rikastamiseen analyysi ilmentyvät eri geenien sovellettiin onnistuneesti yhdessä Fisherin testiä määrittää merkittäviä aktiivisia reittejä tutkimuksessamme. Meidän menetelmä tarjosi ainutlaatuisen rikastamiseen analyysi, jossa yhdistyivät ero ilmentymiä DEmiRs ja kohde ennuste voimaa ymmärtää sääntelyn reittiä tai toiminnallisella tasolla keskittymällä ennustetun DEmiRs kohdegeeneissä. Käyttämällä ero ilmentymistason DEmiRs, odotimme tarkempi käsitys DEmiRs ”sääntelyn ja niiden toiminnot kautta menetelmällä.

Vaikka toiminnallinen vaikutus useimpien miRNA on vielä tuntematon, käytimme miRNA kohdistetun geenit ennustettu

in silico

löytää toimintoja Demir n asetus ja mahdollinen puuttuminen. Meidän menetelmä tarjoaa siis sillan DEmiRs polkuun ja toiminta sääntelyä. Laskennallinen analyysi Näiden 26 CSC liittyvien DEmiRs paljasti, että nämä DEmiRs saattaa säännellä vain neljä selityksin reittejä: solujen proliferaatiota ja sykli, p53: n ja TGF-beeta /BMP (taulukot 1 ja 2). On tunnettua, että Notch, Wnt, Hedgehog ja PTEN /Akt ovat keskeisiä kehitys- signalointireittejä että orkestroida solujen lisääntymistä, solusyklin ja solu- kohtalo

in vivo

. De-sääntely näissä neljästä signalointireitteihin on laajasti osoitettu CSCS. Meidän CSC liittyy DEmiRs ovat mukana näissä ydin kehityshäiriöitä signalointireittejä, kuten edellä. Kuusi 26 CSC liittyy DEmiRs:

HSA

–

miR-19a-5p

[22],

HSA

–

miR-25-5p

[23], [24],

HSA-miR-181C-5p

[25],

HSA-miR-21-5p

tarkistetaan [26],

HSA

–

miR-135b-5p

[27] ja

HSA-miR-148a-5p

[28] ovat tunnettuja toiminto (s) in CSCS. Tältä osin biologisesti validoitu tavoitteet

HSA-miR-21-5p

ja

HSA-miR-135b-5p

, kuten taulukossa 4, on kartoitettu PTEN /Akt, Notch ja /tai Wnt reitit ja ovat välttämättömiä CSC itseuudistumisen eri solujen yhteyksissä [26], [27]. Meidän laskennallisen analyysin kartoitettu ilmentyvät differentiaalisesti

miR-181C-5p

Notchiin signalointireitin (taulukko 4) ja luun morfogeneettinen proteiini (BMP) reittiin (kuvio 2B) toiseen CSC itseuudistumisen reitti, sekä tunnettuja ylikuulumisen Wnt (tarkistetaan [30]). Siksi voimme otaksua, että mallissamme järjestelmissä,

HSA-miR-21-5p

,

HSA-miR-135b-5p

ja

HSA-miR-181C-5p

voidaan säännellä solujen lisääntymistä ja solukierron todennäköisesti vaikuttamalla PTEN /Akt, Notch ja /tai Wnt signalointireittejä.

Yhteenvetona tutkituista 6 lasten syöpä solulinjoja CSC liittyy DEmiRs jotka saattavat säännellä CSC toimintoja. Käyttämällä tavoite- ennuste tulokset ja ero miRNA ”ilmaisun, ja uusi rikastamiseen algoritmi on suunniteltu erityisesti miRNA ekspressioprofiileja ennustimme polkuja, jotka olivat kohteena nämä DEmiRs CSC. Ottaen huomioon kehittävän reittejä kuten Notch ja Wnt, meidän havainnot esitetään tässä tutkimuksessa esitettiin lisätavoitteita ennustetekijöitä ja terapeuttisesta lapsipotilaiden syövissä.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines

Ihmisen lasten syöpä solulinjoja Daoy (medulloblastooma); SK-N-BE (2) ja SH-SY5Y (neuroblastooma), HepG2 (hepatoblastooma), RD-ES (Ewingin sarkooma), ja MG-63 (osteosarkooma) saatiin American Type Culture Collection (ATCC) ja ylläpidetään ATCC suositteli viljelyväliaineessa. Kaikki viljelyalustassa, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Atlanta® Biologicals) ja 1% antibiootti-antimykoottia, amfoterisiini B: n, penisilliiniä ja streptomysiiniä (Gibco®, Life Technologies ™). Hep 293TT (hepatoblastooma) on uusi ihmisen maksan tuumorisolulinja perustettu laboratoriossamme johdetaan primaarikasvaimen kudoksia 5 vuotta vanha nainen lapsi [31]. Hep293TT soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa, joka sisälsi L-glutamiinia ja 25 mM HEPES (Mediatech), ja jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Atlanta® Biologicals) ja 1% antibiootti-antimykoottia, amfoterisiini B: n, penisilliiniä ja streptomysiiniä (Gibco®, Life Technologies ™ ). Solulinjoja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% hiilidioksidia.

neuropallo muodostumisen määritys

in vitro

valikoiva viljelyjärjestelmästä kutsutaan neuropallon määritystä käytettiin rikastuttaa Daoy, SK-N-BE (2), SH-SY5Y, RD-ES ja MG-63 CSCS. Käyttäen hyvin määriteltyä protokollaa, ja kun läsnä on kasvutekijöiden, kuten perus- fibroblastikasvutekijän (bFGF) ja epidermaalinen kasvutekijä (EGF), on mahdollista tuottaa uusimista kantasolujen lähde-, kuten syöpäsolut, jotka voidaan laajentaa neuropalloja . Solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen 2 x 10

4 solua /ml sen jälkeen maljataan ultra low kiinnityslevyt (Corning) seerumivapaassa ylläpitoelatusaine ihmisalkion kantasoluja (mTeSR ™ 1, Stem Cell Technologies). Noin 2 päivää, ensisijainen palloja muodostettiin noin 100 solua alalla. Arvioidaan itseuudistumisen, yksittäisiä palloja kerättiin ja jaotellaan yksisoluiset suspensiot ja sarjoittain kuljetettiin kahden sukupolven ajan.

Fluoresenssi solulajittelu- (FACS) ja ALDEFLUOR® Pitoisuus

Hep293TT ja HepG2 varsi-like fraktiot rikastetaan käyttämällä FACS solujen tunnistamiseksi, joilla on korkea entsyymiaktiivisuus aldehydidehydrogenaasi (ALDH) käyttäen ALDEFLUOR® Assay (Stem Cell Technologies) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tämä määritys rikastunut solun jae kanssa korkea ALDH aktiivisuus luku-out varren kaltainen väestöstä. Lyhyesti, BODIPY ™ aminoasetaldehydidietyyliasetaali (BAAA), substraatti ALDH, lisättiin, ja kun viritetään 488 nm: ssä, varsi kaltaisia ​​soluja, joilla on suuri ALDH aktiivisuus havaittiin ja porteilla niiden vihreä fluoresenssi 515-545 nm. Tämä puhdistus kantasolujen kaltaisten solujen varmistettiin käyttäen diethylaminobenzaldehyde (DEAB), spesifinen inhibiittori ALDH, negatiivisena kontrollina. Cell lajittelu suoritettiin FACS Aria (FACS Diva v 6.1.2 ohjelmistot; Becton Dickinson). Elävät solut Suojattu käyttäen propidiumjodidia (PI).

RNA uuttaminen ja Suurikapasiteettinen miRNA kvantifiointi

Solut kerättiin ja totaali-RNA eristäminen käyttäen Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion) mukaisesti valmistajan ohjeita. Eheystarkistuksia (mitattuna RNA Integrity Number, RIN) ja näyte kvantitointi suoritettiin käyttäen Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). miRNA profilointi suoritettiin käyttäen suuren läpimenon nopea kantasilmukan kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) määritys on suurikapasiteettisten 384 kuoppien muodossa (MicroRNA Micro Fluid Card Analyysit ”kemia; Applied Biosystems) mukaan valmistajan protokollan Kaikkiaan 768 kypsynyt miRNA ja valvonta löydetty ihmisen genomin, selityksineen vuonna miRBase Registry (https://microrna.sanger.ac.uk) on profiloitu. Ensimmäisessä vaiheessa, cDNA käänteiskopioitiin kokonais-RNA näytteistä (2 ng /ml laimennus) käyttämällä kahta allasta erityisten varsi-silmukka-RT-alukkeita. Transkriboidussa cDNA lastattu kaksi mikrofluidistiikkaan korttien (allas A ja B), kukin allas sisälsi kuivui ainutlaatuinen Taqman-alukkeita ja koettimia (375 miRNA ja 9 normalisointi ohjaus). qRT-PCR: ää käytettiin monistamaan cDNA käyttäen spesifisiä Esivahvistustaso alukkeita ja suoritettiin ABI Prism 7900HT reaaliaikainen PCR-järjestelmää 384 sekä muodossa; allas A ja B erikseen toimivaa. Tässä määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena kahdessa riippumattomassa kokeessa. qRT-PCR lämpökäsittelyyn olosuhteissa oli 50 ° C: ssa 2 minuutin ajan, 95 ° C: ssa 5 min, sitten 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia, 58 ° C 30 sekuntia, 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Tiedot varresta kaltainen fraktiolla ja niiden ei varsi kaltaisia ​​kollegansa analysoitiin käyttämällä vertailevan C

T kynnyssyklistä menetelmä (2

-ΔΔCT) menetelmä suhteellisen kvantifioinnin (ΔΔCt = ACt näyte-ACt kalibrointireagenssina; jossa ACt näyte = Ct kantasolujen kaltaisia ​​soluja-Ct kantasolujen kaltaisia ​​solu- normalisointi ohjaus, ja ACt kalibraattori = Ct ei kantasolujen kaltaisia ​​soluja-Ct ei kantasolujen kaltaisia ​​solu normalisointi ohjaus).

knockdown HSA-miR -135b-5p

miRZip-135b anti-miR-135b miRNA konstrukti ostettiin System Biosciences (SBI). Constructs saapui bakteerien raitoja. Yksittäinen pesäke poimittiin, ja sitä kasvatettiin LB-liemessä (Fisher Scientific) ja 50 ug /ml ampisilliinia (Gibco®, Life Technologies ™). Plasmidit inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa ja kerättiin seuraavana päivänä. Plasmidit puhdistettiin mukaisesti PureLink® Lyhyt Plasmid Miniprep Kit (Life Technologies ™) valmistajan protokollan. Puhdistettu plasmidi-DNA transfektoitiin SK-N-BE (2) soluja. Lyhyesti, SK-N-BE (2) solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle 8 x 10

5 solua /kuoppa. Soluja kasvatettiin antibioottivapaalle kasvualustaan ​​yhdessä yössä. Solut transfektoitiin 4 ug DNA: ta käyttäen Lipofectamine 2000 (Life Technologies ™) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, DNA ja Lipofectamine inkuboitiin erillisissä putkissa, jotka sisältävät 250 ui OptiMEM (Gibco®, Life Technologies ™). Plasmidi-DNA ja Lipofectamine yhdistettiin sitten ja niitä inkuboitiin 20 min. Solut pestiin OptiMEM ja tuoretta OptiMEM lisättiin kuhunkin kuoppaan. Plasmidi-DNA ja Lipofectamine-seosta lisättiin sitten kunkin nimetyn hyvin ja inkuboitiin 24 tuntia. Kun oli kulunut 24 tuntia, GFP: n ilmentymisen mitattiin määrittämiseksi transfektion tehokkuutta. Tuottaa stabiili solulinja, solut siirrostettiin ja kasvatettiin kasvatusliuoksessa, joka sisälsi 1 ug /ml puromysiiniä (Gibco®, Life Technologies ™).

pudotus on

HSA-miR-21-5p

ja

HSA-miR-181C-5p

Anti-sense LNA ™ Oligonukleotidit

Daoy solut eksponentiaalisen kasvuvaiheessa maljattiin 6-kuoppaisille levyille (TPP, Techno Plastic Products) 8 x 10

4 solua /kuoppa ja viljeltiin antibiootti vapaiden tiedotusvälineiden ~24hours, jonka jälkeen transfektoimalla miRCURY LNA ™ knockdown koettimia

HSA-miR21-5p

ja

HSA-miR181- 5pc

(Exiqon Inc.), käyttäen Oligofectamine ja OPTIMEM® seerumittomassa elatusaineessa (Life Technologies ™), mukaisesti valmistajan protokollaa. Noin 6 tuntia transfektion jälkeen, media seerumin, sitten lisättiin 24 tuntia transfektion jälkeen, media muutettiin säännöllisen kasvualustaan ​​(Minimum Essential Medium Eagles (Mediatech), 10% FBS: ää (Atlanta® Biologicals) ja 1% antibiootti-antimykoottia; amfoterisiini B, penisilliini ja streptomysiini (Gibco®, Life Technologies ™). Ei koetin (mock) käytettiin negatiivisena kontrollina.

Statistical Data Analysis miRNA Profilointi

MicroRNA ilmaisua laadunvalvonta.

MicroRNA ekspressiotietojen generoidaan mikrofluidinen korttien määritykset tutkitaan ensin sirontakuvaajiin vertaamalla kaikki näytteet (Kuva S1 File S1), jossa miRNA ekspressiotasot (ACt) varren kaltainen fraktiolla ja niiden ei varsi kaltaisia ​​kollegansa olivat piirretään. tulokset tulisi osoittaa jonkin verran vastaavuustaulukkoa (päätämme korrelaatiokerroin on suurempi kuin 0,75), muuten replikaation kutsutaan vahvistamaan tuloksen tai vaihda epäonnistunut määrityksessä.

ilmentyvät eri miRNA (DEmiRs [33].