Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

lukukehysmutaatioita mikrosatelliitti epävakaus korkea (MSI-High) ja peräsuolen syövät ovat potentiaalinen kohdistettavista neo-antigeenejä. Monet nonsense selostukset voivat nopeasta hajoamisesta johtuen hölynpölyä välittämää hajoaminen (NMD), mutta hölynpölyä selostukset kanssa CMS viimeisen eksonin tai lähellä viimeistä eksoni-eksoni risteyksessä on luontainen vastustuskyky hölynpölyä välittämää hajoaminen (NMD). NMD-resistenttejä transkriptien ovat siten todennäköisesti lähde ilmaistaan ​​mutantti proteiinien MSI-korkea kasvaimet.

Methods

Käyttämällä vasta-aineita konservoituneen N-päät ennustettujen mutanttiproteiinien, analysoimme MSI-High peräsuolen syöpä solulinjoja esimerkkejä luonnollisesti ilmaistu mutanttiproteiinien johtuvat lukukehysmutaatioita koodauksessa mikrosatelliitteihin (CMS) immunosaostuksella ja Western Blot kokeiluja. Havaitut mutantti proteiini bändejä NMD-resistenttejä transkriptit vielä vahvistanut geenispesifiseen lyhyen häiritsevä RNA (siRNA) knockdown. Genomi laajuinen Haku suoritettiin tunnistamiseksi CMS sisältäviä geenejä, jotka todennäköisesti tuottavat NMD kestävä transkriptien joka voisi koodata antigeenisiä ilmaistuna mutantti proteiinien MSI-korkea paksusuolen syöpiä. Nämä geenit seulottiin CMS mutaatioita MSI-High koolonsyöpäsolulinjoissa.

Tulokset

Mutanttiproteiini bändejä odotettu molekyylipaino havaittiin mutatoitu MSI-High solulinjojen NMD-resistenttejä selostukset (CREBBP, EP300, TTK), mutta ei NMD-herkkä transkriptien (BAX, CASP5, MSH3). Expression of mutantti CREBBP ja EP300 proteiinien varmistettiin siRNA knockdown. Viisi CMS-laakeri geenejä tunnistaa genomin laajuinen haku ja ilman nykyisiä mutaatio data (SFRS12IP1, MED8, ASXL1, FBXL3 ja RGS12) havaittiin mutatoitunut vähintään 5 11 (45%) MSI-High solulinjoja testattu.

Johtopäätös

NMD vastustuskykyisten transkriptien voi aiheuttaa ilmaistu mutantti proteiinien MSI-High koolonsyöpäsoluihin. Jos yleisesti ilmaistu ensisijainen MSI-High paksusuolensyövät, MSI-johdettu mutantti proteiinit voivat olla käyttökelpoisia syövän erityisiä immunologisia tavoitteita rokotteen kohdistaminen MSI-korkea paksusuolen kasvaimia.

Citation: Williams DS, Bird MJ, Jorissen RN Yu YL, Walker F, Zhang HH, et al. (2010) Nonsense välittämä lahonkestävän Mutaatiot ovat lähde ilmaistuna Mutant proteiinit Colon Cancer Cell Lines Mikrosatelliittimarkkerien Epävakaus. PLoS ONE 5 (12): e16012. doi: 10,1371 /journal.pone.0016012

Editor: Ben C. B. Ko, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 24 elokuu 2010; Hyväksytty: 3. joulukuuta 2010 Julkaistu: 31 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Williams et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke osittain rahoittama NHMRC Program Grant numero 487922. rahoitus tukea tätä työtä myös aikaansaadaan CASS (Edistetään Australian Scholarship Science) Foundation Science and Medicine Grant (DSW, AWB, ECN), Cancer neuvosto Victoria (EN) ja Royal College of patologi Australasia Kitamura /Kanematsu Memorial Award ja teknisen apuraha (DSW). Tätä työtä tuki myös varoja Operational Infrastructure Support Program tarjoamia Victorian osavaltion, Australia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Noin 15% peräsuolen, maha- ja kohdun limakalvon syöpiä ovat viallisia DNA mismatch korjaus ja korkean tason mikrosatelliittien epävakaus (MSI-high) [1], [2]. Useimmat MSI-korkea kasvaimet johtua satunnaista hypermetylaatiota MLH1 geenin promoottori [3], mutta mutaatio DNA mismatch korjaus entsyymi on taustalla vika tapauksissa perinnöllinen ei-polypoosin peräsuolen syöpä (HNPCC) [4]. Kasvaimet MSI on eräänlaista geneettinen epävakaus, joka ilmentyy lukukehysmutaatioita toistuvia microsatellite sekvenssit DNA [1]. Lukukehysmutaatioita koodauksessa mikrosatelliitteihin (CMS) muuttaa geneettistä lukukehyksen ja useimmissa tapauksissa koodaavat typistettyjä proteiineja ainutlaatuinen C-terminaalista proteiinisekvenssien.

Kiehtova patologinen piirre MSI-korkea kolorektaalisyövissä on taipumus olla lisääntynyt määrä kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) suhteessa MSI-Low ja microsatellite vakaa (MSS) kasvaimia [5]. TIL in MSI-korkea kasvaimet aktivoituvat CD8 + sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) [6], sopii tunnistamaan solunsisäisten peptidien kuten MSI-johdettu neo-antigeenejä, HLA-luokan I molekyylejä. MSI-High fenotyyppi ja lisääntynyt TIL on peräsuolen syövän merkitä paremmin vaiheessa toisiaan ennusteen suhteessa MSI-Low tai MSS kasvaimia [7], [8]. Tämä selviytymisen etu saattaa heijastaa suojaava hyötyä immuunivasteen infiltraatiota [9].

Synteettiset peptidit, jotka vastaavat mutantti- proteiineja ennustetaan syntyvät MSI liittyvää lukukehysmutaatioita on osoitettu olevan immunogeeninen. Kuluneen vuosikymmenen aikana, sytotoksisia T-lymfosyytti (CTL) vasteita on kuvattu HLA-A2 sitovat peptidit johtuvat lukukehysmutaatioita vuonna A10 CMS on TGFBR2 [10], [11], A10 CMS on CASP5 [12], T10 CMS on OGT [13] ja äskettäin T15 CMS of U79260 (FTO) [14]. CTL-vasteet mutanttien proteiinit on havaittu potilailla, joilla on MSI liittyy paksusuolen syöpiin ja terveillä HNPCC-mutaation kantajia, nostamalla mahdollisuutta suojaavan immuunitutkimusohjelmasta jälkimmäisessä väestöstä [15].

On julkaistu mutaatio tietoja saatavilla vähintään 1522 mononukleotidi koodaus mikrosatelliitteihin 460 geenejä MSI-High kolorektaalisyövissä [16]. Korrelaatio välillä CMS pituuden ja mutaatioaste. Geenit CMS mutaatiot ovat mahdollisia lähteitä kohdistettavista proteiinien immuuniterapiassa strategioita. Koska lukukehysmutaatioita vaikuttaa CMS toistoja ennustettavalla tavalla, mutantti proteiinit tuotetaan todennäköisesti säilytetty potilaspopulaatiossa MSI-korkea koolonsyöpien [17], [18]. Vaikka kukaan mutantti transkripti on yhteinen kaikille MSI-High kasvaimia, rokote, joka kohdistuu joukko yhteisesti mutatoitujen proteiinien voi olla tehokas hoito MSI-High paksusuolen syöpiä. On olemassa tarve uusille hoidoille vastaan ​​MSI-High paksusuolen syöpiä, koska useita tutkimukset ovat osoittaneet näiden kasvainten olevan vastustuskykyisiä standardin kemoterapeuttisia, kuten 5-fluorourasiilin [19], [20], [21].

olemassaolo MSI-johdettu mutantti proteiinit on päätellyt immunologisiin tutkimuksiin, mutta ei ole olemassa julkaistuja tietoja, jotka koskevat suoraa havaitsemista ennustetun MSI-johdettu mutantti proteiineja. Western blot analyysit on julkaistu jossa potentiaalinen mutantti Proteiinivyöhykkeet havaittiin varten CREBBP, EP300 [22] ja MBD4 geenit [23], mutta ei ollut validointi näillä taajuuksilla. Vahvistaminen ilmentymistä mutantti proteiinien MSI-korkea kasvaimet on tärkeää, jos nämä ovat onnistuu terapeuttisia kohteita rokote. Stabiili ilmentyminen mutanttiproteiinien joka helpottaa rajat esitys kasvainantigeenien antigeeniä esittelevien solujen ja stimuloi auttaja-T-vasteen, on omiaan antamaan parempia anti-kasvain immuniteetin [18]. Kuitenkin useimmat mutantti selostukset tuottamat MSI on suunnattu nopeaan hajoamista nonsense-välitteisen hajoaminen (NMD) [24], [25] ja ilman väliintuloa, vähän mitään kohdistettavaksi mutantti proteiini muodostetaan näistä poikkeavasta selostukset [24 ].

tässä tutkimuksessa olemme havainneet kolme MSI-johdettu mutantti proteiineja, jotka kaikki johtuvat NMD-resistenttejä transkriptien. Jälkeen genominlaajuisten hakea lisää NMD-resistenttejä transkriptien, CMS sisältäviä geenejä seulottiin mutaatioiden paneelin 11 MSI-korkea koolonsyöpäsolulinjaa. Geenit valittiin mutaation analyysi perusteella todennäköisesti korkean Mutaatiofrekvenssi (perustuu CMS pituus), todennäköisesti immunogeenisyys (perustuu mutantti C-pään aminohappo pituus) ja todennäköisesti ilmentymistä paksusuolensyöpä (perustuen geenin ja proteiinin ilmentymistä tiedot, jos saatavissa ). Yleisesti mutatoitunut NMD-resistenttejä transkriptien arvioitiin todennäköistä HLA-A * 0201 CTL-epitooppeja käyttämällä

in silico

ennakoivaa ohjelmisto, SYFPEITHI [26], ja niitä verrataan MSI johdettujen epitooppien jo osoitettu olevan immunogeeninen

vuonna vitro

.

tulokset vahvistavat, että NMD-resistenttejä selostukset aiheuta ilmaisi mutantti proteiineja ja osoittavat myös, että yleisesti esiintyviä lukukehysmutaatioita jotka tuottavat NMD kestävät transkriptien ovat lupaava lähde kohdistettavista kasvaimen antigeenejä MSI- korkea paksusuolen syöpiä. Joukko yleensä ilmaistaan ​​mutanttiproteiinien on potentiaalia muodostaa perustan moniarvoinen rokote tai immunoterapeuttinen kohdistaminen MSI-korkea kasvaimet.

Tulokset

MSI-korkea koolonsyöpäsolulinjaa satama lukukehysmutaatioita vuonna useiden CMS

seulonta koolonkarsinoomasoluissa linjat poikkeavalle ilmaisun DNA mismatch korjaus proteiineja paljasti epänormaali fenotyyppi vastaa MSI 11 17 solulinjojen (taulukko 1). Solulinjat arvioitiin lukukehysmutaatioita vuonna valikoima geenejä CMS aiemmin raportoitu kehittää mutaatioita MSI-korkea paksusuolen syöpiä. Lukuisat mutaatiot sopusoinnussa MSI-High fenotyyppi havaittiin kussakin solulinjassa poikkeava DNA mismatch korjaus ilmaisun immunohistokemiallisesti, mutta harvat mutaatioita, jos jokin havaittu jäljellä solulinjoissa (taulukko 2, Taulukko S1). Poistetaan 1 DNA emäsparin oli yleisin mutaatio, jonka osuus 82% (214/262) mutaatioista tässä tutkimuksessa havaitut (todennäköinen kaksialleelisten mutaatiot lasketaan 2 mutaatioita). Useimmat lukukehysmutaatioita koodaavat typistettyjä proteiineja pienempi molekyylipaino, jossa on mutatoitu C-päähän (taulukko 3).

jäljitettävä MSI-johdettuja mutanttiproteiinit ilmaistaan ​​NMD-resistenttejä transkriptien

havaitsemiseksi ilmaistuna mutanttiproteiinit, ostimme vasta-aineita konservoitunut N-terminaalinen osa on valittu proteiineista. Olemme alun perin tutkittu valikoima yleisesti mutatoituja geenejä, on raportoitu olevan mahdollinen ”kohdegeenien” [1]. Western blot kokeita kokosolulysaattien ja immunosaostumat n genotyyppi solulinjojen tunnistaa proteiinin vyöhykettä, jotka vastasivat odotettua molekyylipainoa normaalin BAX (kuvio 1), MSH3 ja CASP5 proteiinit (julkaisematon data) solulinjoissa, ei-mutatoituja alleeleja, näiden geenien . Ei kuitenkaan mutantti proteiini vyöhykkeet havaittiin mille tahansa näistä geeneistä. Kun kyseessä on BAX me syntyy polyklonaalisia kanin vasta-aineita synteettinen peptidi, joka vastaa mutatoituneen C-päähän. Nämä vasta-aineet osoittivat spesifistä sitoutumista synteettisiin mutantti peptidi Biacore, ELISA ja Western blot määritykset, mutta ei tunnista mutantti BAX proteiini bändi kokosolulysaateista tai immunopresipi BAX mutatoitunut solulinjojen (julkaisematon data). Mutaatiot BAX, MSH3 ja CASP5 kaikki koodaavat NMD-herkän (NMD-S) mutantti selostukset; mutantti BAX ja MSH3 tiedetään olevan alttiita hajoamiseen [27]. NMD-herkkyys voisi selittää meidän kyvyttömyys havaita kaikki mutanttiproteiinit johtuvat näistä kolmesta geeneistä, vaikka epänormaali proteiini taitto menetys vasta epitoopit saattavat myös olla tekijä.

(A) Normaali BAX proteiinia (21 kDa , nuoli), mutta ei mutantti BAX-proteiinia (ennustettu 6,4 kDa) havaittiin Western blot-analyysit kokosolulysaateista koolonsyöpäsolulinjoissa. Solulinjat kanssa BAX G8 CMS mutaatiostatus: 1. LoVo (-1, +1), 2. SW480 (painosta), 3. HCA7 (-1, paino), 4. LS174T (-1), 5. HCT116 (- 1, paino), 6. HeLa (wt), 7. LIM1215 (-1). (B) Homozygous -1 pohja mutaatio G8 CMS in LS174T solulinjassa (ylhäällä) verrattuna ei-mutatoitu solulinja, SW1222 (alhaalla) (reverse DNA sekvensointi). (C) Normaali BAX-proteiinin (nuoli), mutta ei mutantti BAX-proteiinia havaittiin immunosaostuksella: 1. HeLa (wt), 2. LS174T (-1). IgG-kevytketjun 25 kDa.

Siksi pyrittiin tunnistamaan mutanttiproteiinit johtuvat NMD-resistenttejä (NMD-R) selostukset. Aiemmin julkaistut Western blot tiedot osoittivat potentiaalia mutantti proteiini bändejä CREBBP ja EP300 geenit, kukin johtuvat heterotsygoottinen (-1, villi tyyppi) lukukehyksen of 5 mer CMS toistaa viimeisen eksonin, havaittiin LoVo (CREBBP) ja HCT116 (EP300) solulinjat vastaavasti [22]. Varmistimme Näiden mutaatioiden läsnäolo LoVo ja HCT116 solulinjat PCR: llä ja DNA-sekvensoinnilla. Nämä CMS ei mutatoitu mitään muita MSI-High tai MSS solulinjoja. Vyöhykettä, jotka vastasivat odotettua molekyylipainot normaalin CREBBP ja EP300 proteiinia johdonmukaisesti havaittiin Western blot -analyysit ei-mutatoidun solulinjoissa. Olemme havainneet epänormaalia proteiinia vyöhykettä, jotka vastasivat odotettua molekyylipainoja mutantin CREBBP ja mutantti EP300 että LoVo ja HCT116 solulinjoissa vastaavasti Western blotit kokonaisista solulysaateista (kuvio 2) ja immunosaostumien (kuvio S1). Meidän blot Hyväksytty aiemmin julkaistu tiedot EP300 [22]. Tunnetun CREBBP data Hyväksytty alue epäspesifisen bändejä meidän blot, mutta proteiinirintamat asianmukaisten molekyylipaino oli myös läsnä meidän blotteja. CREBBP vyöhykkeet havaittiin myös kokeissa, joissa yhden vasta-ainetta käytettiin im- ja vasta-aineen eri CREBBP epitooppia käytettiin havaitsemiseen.

Normaali proteiinit (valkoinen nuoli) ja mutanttiproteiinit (musta nuoli) havaittiin Länsi-blot-analyysit kokosolulysaateista varten (A) CREBBP ja (B) EP300. (A) CREBBP C5 CMS: 1. SW480 (wt), 2. LoVo (-1, wt), 3. HCT116 (wt), 4. LIM1215 (wt), 5. LS174T (painosta). MW (kDa): paino 265, mut 209. (B) EP300 A5 CMS: 1. LoVo (wt), 2. HCT116 (-1, wt), 3. HCA7 (wt), 4. LIM1215 (wt), 5 . LS174T (paino). MW (kDa): paino 223, mut 187.

validointi mutanttiproteiineista

Vahvista henkilöllisyys epänormaalin proteiinin bändit ja todistaa, että nämä edustavat aitoa esimerkkejä odotettavissa mutanttiproteiinit, olemme alun perin suorittaa tandem-massaspektrometrialla immunosaostumissa solulinjoista. Tämä tekniikka vahvisti identiteettiä normaalin CREBBP ja EP300 proteiiniryhmänä (kuva S1), jolloin validoida vasta-aineiden spesifisyys käytetty. Mutanttiproteiineilla ei havaittu tällä menetelmällä, johtuen mahdollisesti samanaikainen immunosaostus ja runsaampaa proteiineja vastaavia molekyylipaino, kuten MYH9 (julkaisematon data). Spesifisyyden mutantin proteiinin juovien asemesta vahvistettiin käyttämällä pientä häiritsevä RNA (siRNA) suorittaa geenin tiettyjä knockdowns mutantti CREBBP ja EP300 proteiineja. Vähentynyt ilmentyminen mutantti CREBBP proteiini suhteessa transfektoimattomiin ja ei-kohdennetulla valvonnalla korreloi merkittävä lasku kohdennettua mRNA, vahvistettiin qRT-PCR (kuva 3). Knockdovvn mutantti EP300 proteiinia samalla tavoin osoitettu immunosaostumissa (kuvio 4). Nämä tulokset vahvistavat, että epänormaali proteiini bändit havaittiin ovat mutatoitunut variantteja CREBBP ja EP300 proteiineja. Tämä havainto viittaa siihen, että tietyt MSI johdettuja mutanttiproteiinit luonnollisesti ilmenny.

erityisyys mutanttiproteiinin kaistan vahvistettiin geenispesifisiä pudotus in transfektantteja siRNA kohdistaminen CREBBP. (A) havaitseminen mutantti proteiinin band (musta nuoli) in kokosolulysaateista LoVo solulinjan, mutta normaali proteiini vain (valkoinen nuoli) ei-mutatoitunut SW480 solulinjassa. (B) Western Blot Lövön kokosolulysaateista alkaen siRNA SMARTpool transfektanteista osoittavat vähentynyttä ilmentymistä normaalien (valkoinen nuoli) ja mutantti (musta nuoli) CREBBP proteiini bändi CREBBP kohdistetun lysaatit (kaista 1). Beta-kateniini lastaus ohjaus (harmaa nuoli) 92 kDa. (C) Suhteellinen intensiteetti normaali (sininen), ja mutantti (punainen) CREBBP proteiinivyöhykkeet verrattuna transfektoimattomiin soluihin (PBS). (D) Vähentynyt CREBBP mRNA: n ekspression CREBBP siRNA-transfektanteissa (vasen kaista) suhteessa transfektoimattomiin soluihin (oikealla kaistalla).

erityisyys mutanttiproteiinin kaistan vahvistettu geenispesifisiä pudotus in transfektantteja siRNA kohdistaminen EP300. (A) qRT-PCR tietojen arvioimiseksi siRNA kohdistaminen EP300 (paras Knockdown käyttäen P300-1 ja P300-3). (B-C) Vähentynyt mutantti EP300 proteiini havaitaan Western blot-analyysit immunosaostumissa EP300 siRNA transfektanttien suhteessa transfektoimattomiin kontrolleihin (PBS).

Detection muita mahdollisia mutantti proteiinivyöhykkeet

edelleen Western Blot kokeet (kuvio 5), mutantti TTK proteiinin vyöhykkeet havaittiin useita mutatoidut solulinjoissa hieman suurempi molekyylipaino (101 kDa) kuin ei-mutatoidun TTK-proteiinia (97 kDa), mikä on yhdenmukaista ennustettujen koon (taulukko 3) . Yrityksiä siRNA knockdovvn mutantti TTK haittasivat vaikeuksia ratkaista mutantti ja normaalin proteiinin bändejä. AIM2 bändi havaittiin noin 46 kDa Western blot on immuunisaostuksia kokosolulysaateista, johdonmukainen koko havaittu aikaisemmissa tutkimuksissa käyttäen tätä vasta-ainetta [28]. AIM2-proteiinia ei havaittu useita ei-mutatoitua solulinjojen ja myös homotsygoottisia AIM2 mutantti LoVo-soluihin. Mutantti ja villityypin AIM2 proteiinit ovat samankaltaisia ​​ennustetun molekyylipainot (39 kDa ja 40 kDa). Koska NMD-resistenttejä transkriptien usein CMS viimeisen eksonin lähellä C-terminaalisen pään, mutanttiproteiineilla on usein samankokoisia normaalia proteiineja. Tämä tekee validoinnissa mutantti proteiiniryhmänä tekniikoilla käytetään vahvistamaan CREBBP ja EP300 bändejä vaikeampaa.

(A) Western blot analyysit kokosolulysaateista havainneet mahdollisuudet mutantti TTK proteiinia band (musta nuoli) useina mutatoitunut solulinjoja ja normaali TTK proteiinia (valkoinen nuoli) ainoastaan ​​ei-mutatoitunut linjat: 1. LIM1863 (paino), 2. HCA7 (painosta), 3. LIM1899 (-1, paino), 4. HCT116 (-1, p- ), 5. LoVo (-1, wt), 6. LIM2537 (-1, wt), 7. LIM2551 (-1, paino). TTK MW (kDa): paino 97, mut 101. (B) Western blot-analyysit immunosaostumissa kokosolulysaateista havainnut AIM2 proteiinin band (musta nuoli) kaikissa solulinjoissa, mukaan lukien homotsygoottinen mutantti LoVo solulinja: 1. SW480 ( painosta), 2. LoVo (-1), 3. HCT116 (-1, paino). 4, LS174T (wt). AIM2 MW (kDa): paino 39,0, mut 40,4.

Mutant Proteiinivyöhykkeet ei havaittu kaikkien NMD-resistenttejä selostukset arvioidaan. Kun kyseessä on ACVR2A, proteiinin vyöhykkeet havaittiin odotettuun molekyylipainot sekä normaali- että mutantti proteiini, mutta ei-spesifisellä tavalla, joka ei korreloinut mutaatio tietoja. Useita proteiinivyöhykkeet havaittiin blotit TCF7L2 geeni, jossa on lukuisia vaihtoehtoisesti liitettyjä transkriptien [29], mutta ei mutantti-proteiinit havaittiin, että korreloivat mutaatio tietoja.

Genome-haun koko NMD-resistenttejä transkriptien kuten lähde kohdistettavaksi proteiinien

Todettuaan, että NMD-vastustuskykyisiä transkriptien voi aiheuttaa ilmaistu MSI johdettuja mutantti proteiineja, pyrimme tunnistamaan uusia CMS sisältäviä geenejä, jotka todennäköisesti tuottavat ilmaistu mutantti proteiinien MSI-High paksusuolisyöpien jotka voivat toimia terapeuttisina kohteina. Käyttämällä bioinformatiikan strategia, teimme genominlaajuisten etsiä CMS sisältävien geenien perustein ennustetaan koodaavan varten NMD-merkityksetön mutantti transkriptien [24], jotka ovat luontaisesti NMD-resistenttejä (taulukko S2). Havaitsimme 1511 ei-tarpeeton mononukleotidi CMS toistuu ≥7 mer pituisia (mukaan lukien hypoteettinen geenit) ennustetaan tuottaa NMD kestäviä mutantti selostukset. Tämä on verrattavissa 17654 mononukleotidi CMS (≥6 mer) tunnistettiin (riippumatta NMD status) aiemmassa tutkimuksessa [17].

Geenit valittiin CMS mutaation analyysi perustuu valintaperusteiden todennäköisesti tärkeitä käyttökelpoisia kohdistettavaksi proteiinia. Olemme rajoittaneet tutkimuksen 316 mononukleotidi CMS toistuu ≥8 mer pituisia, koska on olemassa korrelaatio microsatellite pituuden ja todennäköisesti mutaatio taajuus. Merkittäviä mutaationopeudet ( 40%), on raportoitu jonkin 8 mer toistoja [16]. Geenit lyhyen ennustettu neo-C-terminaali proteiinisekvenssien ( 10 aminohappoa) jätettiin pois, koska nämä eivät todennäköisesti hyötytyöntövoiman T-soluepitooppien joukolle yhteisiä HLA-tyyppejä, ratkaisemiseksi tarvitaan MHC rajoitus. Ilman hypoteettinen geenit (etuliite LOC tai KIAA), 179 CMS sisältäviä geenejä tyytyväisiä meidän valintaperusteet (taulukko S3). Näyttöä proteiinin ilmentymisen paksusuolen syöpää jatkoon geenien haettiin myös ylimääräisenä valintakriteerinä osoittaa todennäköisesti ilmentymistä mutantti-proteiineja. Human Protein Atlas [30] sisältää tiedot osoittaa proteiinin ilmentymistä peräsuolen syöpiä immunohistokemiallisesti. Tällainen tieto on käytettävissä monia geenejä, koska riippuvuus IHC kun sopivien vasta-aineita. Näin ollen geeni-ilmentymisen profilointi tietoja käytettiin myös tunnistamaan geenejä, joilla on korkein mRNA: n ekspressiotasot olevien tietojen perusteella kahden tutkimuksen [31], [32], MSI ja MSS paksusuolen syöpiä (kuva S2).

Valitut geenien (taulukko 4) seulottiin CMS mutaatioiden paneelia 5 MSI ja 1 MSS solulinjojen ja myöhemmin paneelia 6 MSI solulinjojen testattiin jos aloitusnäyttö ilmennyt mitään CMS mutaatioita. Kolme geeniä (SFRS12IP1, MED8 ja ASXL1) mutatoitiin 6/11 (55%) MSI-High solulinjojen ja kaksi geeniä (FBXL3 ja RGS12) mutatoitiin 5/11 (45%). Useita geenejä vähemmän mutaationopeudet havaittiin myös (taulukko S4).

In silico

epitoopin analyysi NMD-resistenttejä transkripti peräisin mutanttiproteiinit

Ollakseen hyödyllinen kuten terapeuttista rokotetta /immunoterapian tavoitteet, mutantti proteiinit tunnistettu tarve tuottaa CTL-epitooppien yhteisiä HLA tyyppejä.

In silico

analyysi käyttäen julkisesti saatavilla oleva ohjelmisto, kuten SYFPEITHI on aikaisemmin tunnistettu uusi CTL-epitooppeja, jotka myöhemmin validoitu funktionaalisia määrityksiä [26]. Mitkä MSI-johdettu mutantti proteiinit ovat todennäköisesti immunogeeninen, arvioimme mutanttiproteiineja, jotka johtuvat NMD-resistenttejä transkriptien mahdolliset HLA-A * 0201-epitooppeja. HLA-A * 0201 on yleisin HLA-tyyppi, joka on läsnä noin 50% väestöstä [33]. SYFPEITHI tulokset perustuvat sitovat motiivit yhteisiä tunnetuille luonnossa esiintyviä epitooppeja. Mukaan SYFPEITHI pisteytyksen ohjeet, luonnollisesti ilmaistu epitooppi olisi joukossa top 2% kaikista peptidin tulokset arvioitiin 80% tapauksista [26]. Arvioimme mutantti C-päät, jotka johtuvat yhteisen NMD-R mutaatioita (taulukko S5), ja yläosassa 2% HLA-A * 0201 SYFPEITHI sitova tulokset syntyvät mutanttiproteiinit määritettiin (taulukko 5). Kärkikastiin peptidit oli SYFPEITHI sitovia tulokset vaihtelevat 23-31. Nämä tulokset ovat verrattavissa sitoutumisen tulokset 135 tunnettua HLA-A * 0201 CTL syöpä epitoopit [26], mukaan lukien 4 julkaistut MSI johdettuja epitooppeja, joilla on mediaanipisteet 24 ja keskimäärin 23,4 (taulukko S6).

Perustuen saatavilla raportoitu CMS mutaatio hinnat EPHB2, TTK ja RGS12 (C8), rokotteen lukien näiden kolmen mutanttiproteiinit sisältää ainakin yksi todennäköinen HLA-A * 0201-epitooppi 69% potilaista ( 1- (1-41%) x (1-27%) x (1-28%)). Edelleen HLA-A * 0201 epitooppeja havaittiin useiden geenien (TMEM97, ASXL1, SFRS12IP1, RGS12 (A9), RTKN2) yhteisten mutaatiot tässä tutkimuksessa, mikä osoittaa, että myös kohdistaminen nämä geenit voitaisiin laajentaa HLA-A * 0201 kattavuus. Joissakin harvoissa mutaatioita (esim NTAN1, RAPH1) tuottavat myös immunogeenisiä epitooppeja, jotka eivät tarjoavat laajan väestöstä, mutta se voi myös olla syytä kohdistaminen valikoiduilla potilailla.

Keskustelu

mikrosatelliittien epävakaus aiheuttaa ennustettavissa lukukehysmutaatioita johon CMS monien geenien. Mutanttiproteiinit johtuvat nämä mutaatiot ovat looginen lähde kasvaimen antigeenejä, jotka voisivat selittää sekä läsnäolo lisäsi TIL ja parempi ennuste liittyy MSI-High fenotyypin. Tämä käsite tukee äskettäin toteamista korrelaatio immuuni soluttautua tiheyden ja määrän CMS lukukehysmutaatioita havaittu joukko MSI-korkea koolonsyöpien [34]. Olemme validoitu ainakin kaksi esimerkkiä (CREBBP ja EP300) luonnollisesti ilmaistuna mutanttiproteiineista MSI-High koolonsyöpäsolulinjoissa, sekä johtuvat NMD-resistenttejä transkriptien. Nämä havainnot vahvistavat, että NMD-vastustuskykyisiä transkriptien voi tuottaa luonnollisesti ilmaistu MSI johdetun mutantti proteiinit [34], [35]. CMS toistuu CREBBP ja EP300 ovat lyhyitä ja todennäköisesti mutatoitunut suuri osuus MSI-korkea kasvaimet. On kuitenkin todennäköistä, että joitakin yhteisiä NMD-resistenttejä mutaatioita kuten TTK myös tuottaa kohdistettavaksi mutantti proteiinien MSI-Korkea syöpiä. Meidän genomin laajuinen strategia tunnistaa immunogeenisten NMD-resistenttejä transkriptien on yksilöinyt viisi novel CMS mutaatiota (SFRS12IP1, MED8, ASXL1, FBXL3, RGS12) ainakin 45% yhdentoista MSI-korkea koolonsyöpäsolulinjaa testattu. Mutation analyysi suuremman sarjan ensisijaisen MSI-High paksusuolen syövät mahdollistavat mutaation taajuudet näistä mahdollisista terapeuttisten kohteiden voidaan määrittää tarkemmin.

In vitro

tutkimuksissa on todettu, CTL-vasteet synteettisille mutantti peptidejä, jotka johtuvat yhteisiä CMS mutaatioita käyttäen perifeerisen veren mononukleaarisia soluja potilailta MSI paksusuolen syöpiin [10], [11], [12], [13], [14], [36] ja kiehtovan, myös terveillä henkilöillä, joilla HNPCC [15]. Nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että kasvain-erityinen mutantti proteiinit voivat stimuloida

in vitro

T-solujen koskemattomuuden ja tukevat käsitystä Rokotusstrategian. Julkaistut HLA-A * 0201 CTL epitoopit TGFBR2 [10], [11], CASP5 [12], OGT [13] ja U79260 (FTO) [14] kaikki syntyvät NMD-mutantti selostukset. NMD-esto kokeet ovat osoittaneet, että mutantti TGFBR2 on yksi ilmen- tymisen lisääntymisen selostukset, jossa 10-kertainen mRNA-ekspressio yhdessä tutkimuksessa [27], [37]. T-solu vasteita ristiriidassa odotettua vaikutusta NMD kun mutantti proteiinin ilmentymisen. Transfektiosysteemi tutkimus osoitti, että mutantti TGFBR2 proteiini on havaittavissa transfektanteissa mutantti-cDNA (NMD-resistentti), mutta ei mutantti gDNA (NMD-herkkä) [35]. Emme havainneet mutantti proteiinien NMD-herkkien selostukset (BAX, CASP5 ja MSH3). Kuitenkin NMD on käännös riippuva prosessi [24] ja matalan tason mutantti proteiinin ilmentymisen alkuperäisestä kierroksen kääntäminen voi riittää stimuloimaan immuunivasteita. CTL voi näyttää hienoja herkkyyttä tietylle peptidi /HLA ligandin, liittyi vain 3 kohdepeptidiä /MHC-komplekseja riittää CTL-spesifinen solun tuhoutumisen

in vitro

[38]. Humoraalivasteiden mutanttiin TGFBR2 proteiini on tunnistettu ELISA, mutta vain vähemmistö (10%) MSI-korkea paksusuolen syöpäpotilaiden [39].

etuna NMD vastustuskykyisten transkriptien lähteenä kohdistettavaksi mutanttiproteiinit on, että pysyvästi ilmensivät kasvaimen antigeenejä voi olla rajat esitetään immuunijärjestelmälle dendriittisolujen stimuloimaan CTL ja auttaja-T-soluvasteita [40]. Cross-esitys on todennäköisesti johtaa superior kasvaimen vastaisen immuniteetin ja NMD kestävä transkriptien lähteenä kohdistettavana mutantti proteiineja. Fuusio-geenin määritys raportoitu merkittävää korrelaatiota ilmentymisen transfektoiduissa MSI johdettujen mutanttien proteiinit ja rajat esittäminen koekspressoi ovalbumiini antigeeni [18]. Geenejä, joissa vähäinen havaittavaa proteiinia, kohtalaista voimakkaaseen CTL-vasteita havaittiin, mutta ilman rajat esitys [18]. Rajoitus on transfektioanalyysissä on, että mutantti-cDNA konstrukteja käytettiin ja siksi kokeissa ei arvioinut vaikutusta NMD kun mutantti proteiinin ilmentymisen. Lähestymistapamme voittaa tämän suoran havaitsemisen mutantti proteiinin ilmentymisen. Modifioitu transfektioanalyysissä vaativat luonnollinen silmukoinnin C-päätä voidaan myös tunnistaa biologisesti relevantteja rokotuksen tavoitteita.

NMD-eston kokeet ovat tunnistaneet ”NMD-escape” transkriptit joka osittain hajoavat johtuen NMD [27], . MBD4 ennustetaan tuottaa NMD-herkkä transkriptio, mutta heikko epänormaali proteiini bändi on raportoitu Western blot analyysit MBD4 mutatoidun solulinjoissa. Tämä voi edustaa mutantti MBD4 proteiinin ilmentymisen takia NMD-paeta [23]. NMD-paeta transkriptien voi olla hyödyllinen proteiinin lähde tavoitteet, mutta nämä eivät voi ennakoida ja lisätoimia tarvitaan, mitkä NMD-paeta transkriptien tuottamiseksi kohdistettavana mutantti proteiineja. Strategiat, jotka häiritsevät NMD estämättä proteiini käännöstä pitäisi aiheuttaa yleisen säätelyyn ylöspäin NMD-mutantti tekstitystiedostojen paljasten erilaisia ​​kasvaimen antigeenejä. Tämä lähestymistapa voisi täydentää rokotteen kohdistaminen MSI-korkea kasvaimet laajentamalla tarjolla olevaan immuuni tavoitteita pidemmälle NMD-resistenttejä selostukset. NMD-esto siRNA kohdentamista NMD sääntelyn geenien SMG1 tai UPF2 on äskettäin osoitettu kykenee indusoimaan suojaavan

in vivo

immuunivasteen kasvainsoluja transfektoitu NMD-herkkä kohdeantigeeniä [41].

vahvistuksen mutantti proteiinin ilmentymisen MSI-korkea kasvaimet voivat olla tärkeitä kliinisiä sovelluksia. Rokote kohdistaminen yleisesti ilmaistuna mutanttiproteiinit on ehdotettu lupaava strategia hoitoa varten MSI-korkea kasvaimet [15], [18], [34], [42]. Riittävällä tavoitteet, rokotus voi olla mahdollista edellyttäen, että mutantti proteiinit ilmentyvät, antigeeniset epitoopit luodaan ja antigeenin esittelyä on toimiva. Lisätyötä tarvitaan, mitkä mutantti proteiini immuunivaste voi antaa selviytymisen hyötyä potilaille, joilla MSI-korkea kasvaimet. Mutant proteiinit erittyvät seerumin voisivat olla hyödyllisiä biomarkkereita varhaiseen toteamiseen MSI-High kasvaimia, erityisesti HNPCC vaikutti väestöstä. Tällaiset biomarkkerit olisi hyödyllinen lisä colonoscopic seulontaan, koska MSI-High kolorektaalisyövissä on taipumus välein adenoomien ja kasvaimia kehittää välisenä aikana seulonta colonoscopies [43], [44]. Yhteinen, ennustettavissa ja kasvaimen erityisluonne MSI johdettujen mutanttien proteiinit tekee niistä ihanteellisia ehdokkaita terapeuttisina kohteina tai diagnostisia markkereita.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuuri

LIM kolorektaalisyöpä solulinjat perustetaan kasvainbiopsioissa Ludwig Institute for Cancer Research (LICR) Melbourne Branch kuten aikaisemmin on kuvattu: LIM1215 [45], LIM1899 [46], LIM1863 [47], LIM2463 [48] ja (LIM2099, LIM2405, LIM2408, LIM2537, LIM2550 ja LIM2551) [49]. LIM solulinjat perustettiin sekä Satunnaista ja perinnöllistä kolorektaalisyövissä [49] ja saa CellBank Australia (www.cellbankaustralia.com) tai LICR Melbourne Branch päätyttyä standardin akateemisen materiaaleja siirtosopimuksen. SW1222 peräsuolen syövän solut antamat Ludwig Institute for Cancer Research, New York Branch, (New York, NY) ja HCA7 peräsuolen syövän solut saatiin European Collection of Cell Cultures (Porton Down, UK). b. c. d.