Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvain solujen askites ovat merkittävä lähde taudin uusiutumisen munasarjasyöpä potilaille. Yritetään tunnistaa ja profiloida väestön askites saadut solut munasarjasyöpä potilaille, uusi menetelmä on kehitetty erillinen kiinni (AD) ja ei-adherentit (NAD) viljelmässä. Kaksikymmentäviisi potilasta rekrytoitiin tämän tutkimuksen; 11 chemonaive (CN) ja 14 solunsalpaajaresistentti (CR). AD solut molemmista CN ja CR potilailla esiintyi mesenkymaalisten morfologia antigeenin profiilin mesenkymaalisten kantasolujen ja fibroblastit. Sitä vastoin NAD solut oli epiteelin morfologia lisääntynyt ilmentyminen syövän antigeenin 125 (CA125), epiteelin adheesiomolekyyli (EpCAM) ja sytokeratiinia 7. NAD solujen kehitetty soluttautua kasvaimia ja askites sisällä 12-14 viikko kuluttua vatsaonteloon (ip) injektioita nude hiiret, kun taas AD-solut pysyivät ei-kasvaimia aiheuttava jopa 20 viikon ajan. Myöhemmät vertailu valikoiva epiteelin mesenkymaaliset ja syövän kantasolujen (CSC) merkkiaineiden välillä AD ja NAD populaatioiden CN ja CR potilailla osoitti parannettu trendi mRNA ilmentyminen E-kadheriinin, EpCAM, STST3 ja Oct4 NAD väestöstä CR potilailla. Samanlainen suuntaus tehostetun mRNA ilmentymisen CD44, MMP-9 ja Oct4 havaittiin AD väestöstä CR potilailla. Näin ollen, käyttämällä uutta puhdistusmenetelmää osoitamme ensimmäistä kertaa selvä erottaminen askites solujen epiteelin tuumorigeenisiä ja mesenkymaaliset ei-tuumorigeenisiä populaatioissa. Osoitamme myös, että solut askites CR potilaat ovat pääasiassa epiteelin ja näyttää lisääntymässä mRNA geenien ilmentymistä, jotka liittyvät CSCS, verrattuna soluihin, eristetty askites CN potilailla. Koska kasvainsoluihin askitekseen munasarjasyövän potilailla on hallitseva rooli taudin uusiutumisen, perusteellinen käsitys biologiaan askites microenvironment CR ja CN potilaita on olennaista tehokkaan hoitotoimenpiteiden.

Citation: Latifi A, Luwor RB, Bilandzic M, Nazaretian S, Stenvers K, Pyman J, et al. (2012) eristäminen ja karakterisointi kasvainsolujen päässä Askitesta munasarjasyöpä Potilaat: Molecular fenotyyppi solunsalpaajaresistentti munasarjakasvainten. PLoS ONE 7 (10): e46858. doi: 10,1371 /journal.pone.0046858

Toimittaja: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 heinäkuu 2012; Hyväksytty 10 syyskuuta 2012 mennessä; Julkaistu: 08 lokakuu 2012

Copyright: © Latifi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä oli tukee Naisten Cancer Foundation, National Health ja Medical Research Council of Australia (JKF, RegKey # 441101), National Breast Cancer Foundation (EWT; empatia Breast Cancer Network, Australia) ja Victorian hallituksen Operational Infrastructure Support Program (Australia). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksessa desugn, tietojen keruun ja analysoinnin, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vuonna 2009 American Association for Cancer Research raportoitu munasarjasyövän kuin gynekologinen maligniteetti korkein asia-to-kuolleisuuden suhteen [1]. Tämä korkea kuolleisuus johtuu diagnoosin myöhäisessä vaiheessa, kun syöpä on levinnyt vatsaonteloon ja metastasized elintärkeitä elimiä. Munasarjasyöpä etäpesäke tapahtuu joko suoraan aivokuoren sisällyttämisestä kystat munasarjat tai Fimbriaproteiinia päähän munanjohtimen [2], ja leviää suoraan laajennuksen vierekkäisten elinten (esim extraovarian sisäsynnyttimet paksusuolen, virtsarakon, maksa, jne) tai kiinnitys kuorinnan munasarjasyöpäsoluja joka selviytymään soluaggregaateiksi tai pallosia. Steroideja kuljettaa vatsakalvon kasvain neste (askites) ympäröiviin elimet vatsaonteloon. Laaja kylvö näistä pallosia kohtuun, sigmasuolessa ja omentum usein kohdataan myöhäisvaiheen ja uusiutuva sairaus [3].

Nykyinen hoitostrategioiden myöhäisvaiheen munasarjasyöpää sairastavilla potilailla johtaa alkuperäisen remission jopa 80%: lla potilaista [4]. Kuitenkin, kun lyhyen remissiovaihe (yleensä 6-22 kuukautta) toistuminen esiintyy lähes kaikilla potilailla [4]. Tämä johtuu suurelta osin kyky syöpäsolujen kiertää solunsalpaajahoitoon liittynyt sytotoksisuuden kautta hankittu chemoresistance. Viime aikoina chemoresistance on myös liitetty hankintaan epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) syöpäsoluissa [5] – [6]. Klassisen, EMT mahdollistaa paikallaan epiteelisolujen tulla liikkuvien ja levittäytyä levittämiseksi ja recolonize ympäröiviin kudoksiin [7]. Nämä piirteet EMT on osoitettu korreloivan CSC kaltainen fenotyyppi [8] – [9], vahvistivat äskettäin kliinisissä tapauksissa mesenkymaaliset ja ”kasvain aloittamista” fenotyypit jäljellä kasvainsolujen syöpäpotilaista elossa tavanomainen hoito [ ,,,0],10]. Fenotyyppi CSC on osoitettu dynaamisesti säätelevät kasvaimen microenvironment [11], ja keskeinen piirre vaaditaan mikro- ja makrotason metastasoitunut kolonisaatio ei koske ainoastaan ​​EMT vaan myös mesenkymaalisten ja epiteelin siirtymistä (MET) [12] – [13 ]. Jatkumoa EMT ja MET on kuvattu epiteelin mesenkymaaliset plastisuus (EMP) [11]. Tällaiset metastaattinen siirtokuntien määrittelee kykyä EMP transformoitujen levittää kasvainsoluja itse uudistaa ja erottaa, määrittäviä solujen piirteet CSCS [14].

Vaikka läsnäolo askites on yhteydessä huonoon ennusteeseen, alkuperä ja fenotyypin syöpäsolut askites, ja sen yhdessä chemoresistance ja toistumisen ymmärretään huonosti. Mikroskooppinen tarkastus askites on aikaisemmin paljastanut monimutkainen heterogeeninen kuva, joka koostuu yksittäisistä soluista ja pallosia [15]. Ei-syöpäsolujen sisällä askites sisältää tulehdussolujen, syöpään liittyvä fibroblastit, epäkypsät myelooisten solujen ja aktivoitujen mesoteelisolujen, jotka kaikki vaikuttavat tuumorisolun käyttäytymisen ja vastaus kemoterapia [16]. Myös edistää heterogeenisuus askites on populaatio CSCS jotka kestävät kemoterapiaa ja aiheuttaa hierarkian lisääntyvien kasvainsolujen progressive erottaa potentiaalia [17], [18]. Nämä CSCS, kun puhdistettiin lajittelu ja ksenosiirrettyjä nude-hiiriin, on osoitettu tuottaa huomattavasti enemmän tuumorimassa verrattuna lajittelemattomien kasvainsoluihin [19], mikä viittaa suuremman Tuumorigeenisuustutkimuksissa CSCS.

(A) NAD sferoidia ja (B) AD-solut ympättiin pienellä kiinnityslevyt välittömästi keräämisen jälkeen. Morfologiset ominaisuudet (C) NAD sferoidiviljelmiä ja (D) AD solujen kudosviljelymuoviin 24 tunnin jälkeen seuraava kylvö. Kuvat arvioitiin faasikontrastimikroskopiassa. Suurennus oli 100 ×, asteikko bar = 50 pm. Kuvat edustavat (n = 25) näytettä. (E) [

3H] -tymidiinin otto AD soluissa ja soluissa hajoavat pallosia suoritettiin kuvatulla Menetelmät ja materiaalit. Käyrä on esitys yhdestä askitesta näyte tehdään kolme kertaa. (F) sisplatiinin vaikutusta proliferaatioon {[

3H] -tymidiinin sisäänotto} NAD ja AD saadut solut askites munasarjasyöpä potilaille. Käyrä on esitys kolmen erillisen kokeen, suoritetaan kolme riippumatonta NAD ja AD näytteitä kolmena kappaleena. Merkitsevää eroa AD vs. NAD soluja, ** p 0,01.

Hypoteesimme että uusiutumisen munasarjasyöpää sairastavilla potilailla pitkälti sanelee, missä määrin kasvain ja liittyy strooman solujen vatsaontelossa hengissä kemoterapiaa, ja että vertailevan mRNA tutkimus solujen eristettyjen askites CN versus CR munasarjasyöpä potilaat voivat antaa tärkeän puuttuva linkki ymmärtämistä uusiutuva sairaus. Yleisenä tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää ero mRNA profiilia askites solujen CN ja CR potilaiden tunnistamiseksi geeni tuotteita, jotka voivat edistää selviytymistä ja levittää jäljellä syöpäsolujen kemoterapian jälkeen. Tavoitteena oli myös ymmärtää metastaasien taipuvaisia ​​kasvainsolujen askites munasarjasyöpä potilaille. Tämän saavuttamiseksi, olemme kehittäneet uuden puhdistusmenetelmä eristämään erillisiä solujen populaatiot askitesnesteestä munasarjasyöpä potilaille. Käyttämällä tätä yksinkertainen tekniikka askites solut erotettiin kahteen erilliseen populaatioissa solujen hyvin määritellyt epiteelin ja mesenkymaaliset fenotyyppejä, vastaavasti. Eristetyt solut CR askites oli enemmän epiteelin fenotyyppi, ja se osoitti suuntaus parantaa liittyvien geenien ilmentymistä CSC: n kanssa verrattuna soluihin, joita on eristetty askites CN potilailla. Nämä tulokset viittaavat siihen, että askites kasvain microenvironment voivat erota potilailla ennen ja jälkeen kemoterapiaa ja lisäksi voi olla rooli uusiutumisen munasarjasyöpä potilaiden solunsalpaajahoidon jälkeen.

Puhdistettu soluja askites CN (n = 11 ) ja CR (n = 14), munasarjasyöpä potilasta inkuboitiin joko kontrolli-IgG tai asiaan ensisijainen vasta-aineita vastaavia antigeenejä seurasi sekundaarisen fykoerytriinikonjugoitua vasta-ainetta. Tulokset edustavat (n = 25) riippumattomia näytteitä. Täytetty histogrammi kussakin kuvassa edustaa kontrolli-lgG, mustat viivat osoittavat proteiinin ilmentymistä vastaaviin soluihin.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit

Monoklonaalisia ja polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​CA125, fibroblastien pinnan proteiini (FSP) ja CD44 saatiin Merck Millipore (MA, USA). Monoklonaalisia vasta-aineita sytokeratiini 7 (cyt 7) ja N-kadheriinin saatiin Zymed Laboratories (San Francisco, USA). Polyklonaalisia vasta-aineita vastaan, E-kadheriinin, vimentiinistä ja EpCAM saatiin Cell Signalling Technology (Beverly, MA, USA). Polyklonaalisia vasta-aineita vastaan, CD73, CD105, CD90, ja CD34 saatiin Sapphire Bioscience (NSW, Australia).

Puhdistettu NAD ja AD-solut arvioitiin immunofluoresenssilla käyttäen hiiren monoklonaalista vasta-ainetta (vihreä), kuten on kuvattu menetelmät ja materiaalit. Cellular värjäys visualisoitiin käyttäen toissijaisena Alexa 488 (vihreä) fluoresoiva leimattu vasta, ja tumat havaittiin DAPI (sininen) värjäys. Kuvat edustavat kolme riippumatonta näytettä. Suurennus on 200 x; asteikko bar = 50 pm.

Immunofluoresenssikoe tutkimus suoritettiin puhdistettiin NAD ja AD soluja kuten on kuvattu kuviossa 3. Kuvat edustavat kolmea riippumatonta näytettä. Suurennus on 200 x; asteikko bar = 50 pm.

Potilaat

Human etiikka selvitys.

Askites kerättiin potilailta diagnosoitu myöhäisvaiheen vakavien munasarjasyövän saatuaan kirjallisen tiedon, suostumusta protokollien hyväksymien Tutkijavoimavarojen ja eettisen komitean (HREC # 09/09) The Royal Naisten Hospital, Melbourne, Australia.

histopatologinen diagnoosi, kuten kasvain laadut ja vaihe määritettiin riippumattomien henkilöstö patologia kuin osa kliinisen diagnoosin (taulukko 1). Askites saatiin leikkauksen aikana primaarista karsinoomaa (CN potilasta). Muissa tapauksissa, askites kerättiin ryhmä potilaita aikaan toistumisen (CR potilasta). Nämä potilaat olivat kehittäneet uusiutuva sairaus kuluessa 6-20 kuukautta ensimmäisen rivin kemoterapiaa. Potilaat tässä ryhmässä eivät kaikki käsitellään samalla tavalla kuin ne olivat aiemmin saaneet yhdistelmiä kemoterapiaa koostuvat paklitakselin, karboplatiini ja muut lääkkeet, kuten doksorubisiini, gemsitabiini, doketakseli, syklofosfamidi ja topotekaani jokaisen toistuvan jakson (taulukko 1). Näytteitä kerättiin potilailta aikana hoito kuten taulukossa 1.

qPCR suoritettiin puhdistetulla NAD ja AD väestön kuvatulla tavalla menetelmät ja materiaalit. Saannot muutettiin femtograms perustuu standardikäyrä kutakin PCR-tuotetta, ja tuloksena mRNA-tasot normalisoitiin 18S mRNA-tasolla näytettä kohti. Tiedot laskettiin tuloksista kahdeksan itsenäistä näytteet arvioitiin kolmena kappaleena. Merkittävästi erilaiset AD versus NAD soluihin * (p 0,05) ja ** (p 0,01).

valmistaminen Solut Askites munasarjasyövän Potilaat

volyymi askitesta vaihteli potilailla. CN potilailla oli pienempi askites tilavuudet (100 ml-2L) verrattuna CR potilailla (100 ml-17 L). Jotta yhtenäistää koesuunnitelmalla vain 500 ml Askites koottiin soluja. Kontaminoivat punasoluja solujen pelletti Askites poistettiin hypotoninen lyysi steriileissä MilliQ H

2O. Suurin osa askites-soluja ympättiin pienellä kiinnityslevyt (Corning Incorporated, NY) MCDB: DMEM (50:50) kasvualustaa, jota oli täydennetty naudan sikiön seerumilla (10%), glutamiinia (2 mM) ja penisilliini /streptomysiiniä (2 mM ) (Life Technologies, CA, USA). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5% CO

2. Näissä olosuhteissa NAD kellui kuin rakeita keskipitkällä taas AD kiinnittyneiden solujen alhainen kiinnityslevyjä. Jälkeen 2-3 päivää, kelluva NAD pallosia (hajallaan pipetoimalla) ja AD-solut seulottiin CA125, EpCAM, cyt 7 ja FSP virtaussytometrialla. AD-soluja pidettiin muovisissa kudosviljelykolveissa kun NAD pallosia pidettiin matalan kiinnityslevyjä. Solut siirrostettiin viikoittain ja kokeet suoritettiin 1-2 kohtia.

(A) vaihekontrastimikroskoopilla kuva NAD solujen kiinni muovi ennen valmistella solususpension i.p. injektio; (B) H ja E värjäys agaroosia sulautettujen potilaan näytteestä ennen injektiota; (C) kuvan kiinteän kasvaimen saatu hiiren neljätoista viikkoa i.p. injektio NAD soluja (5 x 10

6); (D) H ja E-värjäys hiiren askites NAD solujen upotettu agaroosi; (E) virtaussytometrinen vertailu ilmentymisen CA125, EpCAM ja CD44 välillä potilaan ja hiiren askites-soluja. Tulokset edustavat kahden riippumattoman näytettä. Täytetty histogrammi kussakin kuvassa edustaa kontrolli-lgG, mustat viivat osoittavat proteiinin ilmentymistä ihmissoluissa, katkoviivat osoittavat proteiinin ilmentymistä hiiren askites soluissa.

solumäärät ja proliferaatiomääritystä

AD-solujen ja NAD pallosia kerättiin 1 ml askites annettiin tarttua on kudosviljelylevyillä 24 tunnin ajan, minkä jälkeen solut trypsinoitiin ja laskettiin trypaanisiniekskluusiolla menetelmällä. Määrän AD-solujen ja solujen NAD sferoidit laskettiin ja elävien solujen prosenttimäärän AD ja NAD pallomainen väestön arvioitiin laskemalla solujen kokonaismäärässä läsnä sekä AD ja NAD populaatioita 1 ml Askites kunkin potilas.

histologinen kuvia (A) kasvain, (B) maksassa, (C) maha-suolikanavan ja (D) haima hiirestä injektoitiin ip NAD soluja (5 x 10

6). Nuolet kasvain (A) osoittavat taskut syöpäsoluja ympäröimänä sidekudosta. (B-D) nuolet osoittavat tuumorisolut tunkeutuvat vastaaviin elimiin. H ja E-värjäys (E) munuais- ja (F) munasarja hiirestä injektoitiin NAD-soluja (5 x 10

6). Nuolet osoittavat tuumorisoluja ympäröivään elimiä ilman hyökkäystä. Suurennus on 200 × kaikille, paitsi munasarja joka oli suurennus 100 x, asteikko bar = 50 pm.

3 [H] -tymidiinia oton määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [20] . Lyhyesti, 1 x 10

5 NAD tai AD-soluja ympättiin kolmena rinnakkaisena 24-kuoppalevyillä. 2, 4 ja 6 päivää, 0,5 uCi [

3H] tymidiiniä lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 16 tuntia. Solut pestiin PBS: llä, kerättiin ja lyysattiin 1% Triton ja sisällyttämällä [

3H] tymidiinin mitattiin nestetuikelaskennalla (Hidex 300SL, LKB Instruments, Australia).

prosenttiosuus jakelu solujen kokonaismäärästä NAD ja AD populaatioita askites CN (n = 5) ja CR (n = 5) potilaat määritettiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. Tulokset ovat keskiarvo ± SEM viisi riippumatonta näytettä arvioitiin kolmena kappaleena. Merkittävästi erilaiset CR vs. CN näytteitä, ** (p 0,01).

määrittämiseen kasvua estävä pitoisuus (GI50), 1 x 10

5 NAD tai AD solujen annettiin noudattaa 24 kuoppalevyillä 24 tuntia kolmena kappaleena. Sekä NAD ja AD-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla sisplatiinin (0,5 ug /ml-10 ug /ml) 48 tuntia, ennen kuin lisättiin 0,5 uCi [

3H] tymidiinillä 16 tunnin ajan. Taso [

3H] tymidiinin määritettiin edellä kuvatulla tavalla.

qPCR oli suoritettu, kuten on kuvattu menetelmät ja materiaalit on puhdistettu NAD ja AD solujen populaatiot eristettiin askites CN (n = 4) ja CR (n = 4), askites näytteitä. Tulokset on esitetty kuviossa 5 kuvatun neljä riippumatonta näytettä arvioitiin kolmena kappaleena.

qPCR suoritettiin, kuten on kuvattu kuviossa 9 on puhdistettu NAD ja AD solujen populaatiot eristettiin CN ja CR askites näytteitä. Tulokset ilmaistaan, kuten on kuvattu kuviossa 9. Merkittävästi erilainen CR vs. CN näytteitä, * (p 0,05).

Immunofluoresenssianalyysi

Immunofluoresenssianalyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [21 ]. Kuvat otettiin käyttäen Leica TCS SP2 laser, ja katsellaan HP työasemaan Leica TCS SP2 ohjelmisto.

qPCR suoritettiin yksittäisiä NAD ja AD soluja kuten on kuvattu kuviossa 9. Tulokset ilmaistaan ​​kuvattu kuviossa 9. Merkittävästi erilaiset CR vs. CN näytteitä, * (p 0,05).

antigeenejä on pisteytetään korkean ilmentymisen (

+++), kohtalainen lauseke (

++), alhainen ilmentyminen (

+), eikä ekspressiota (

-).

virtaussytometria-analyysi

virtaussytometrialla menetelmää on kuvattu aiemmin [21]. Kaikki tiedot analysoitiin käyttäen Cell Quest -ohjelmistoa (Becton-Dickinson, Bedford, MA, USA). Tulokset ilmaistaan ​​fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti (MIF).

RNA uuttaminen ja määrälliset Real Time (q-PCR) B

RNA uuttoa, cDNA-synteesi ja kvantitatiivinen määritys mRNA-tasojen eri geenejä suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [21]. Sense ja antisense alukkeet suunniteltiin vastaan ​​julkaistiin ihmisen sekvenssit E-kadheriinin, N-kadheriinin, vimentiinistä, Oct4, MMP2, MMP9, EpCAM ja CD44. Gel Extraction PCR-tuotteita suoritettiin käyttäen Qiaex II Agaroosigeeli- (Qiagen Australia), kohti valmistajan protokollaa ja mittaamaan ND-1000 Nanodrop spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies Inc Wilmington, DE, USA). Sekvenssit ja tuotteet todennettiin edellä kuvatulla [22]. Käytetyt alukeparit sisältävät 5-3 ’: E kadheriinin (Entrez Gene ID 999, hyväksytty symboli CDH1) eteenpäin-GGCACAGATGGTGTGATTACAG; käännetyn GTCCCAGGCGTAGACCAAGAAA; N-kadheriinin (Entrez Gene ID 1000 hyväksytty symboli CADH2) tulevaisuuteen AAACAGCAAGCACGGGTTA; käännetyn CTTAGGATTGGGGGCAAAAT; vimentiinista (Entrez Gene ID 7431, hyväksytty symboli VIM) tulevaisuuteen CCTACAGGAAGCTGCTGGAA; käännetyn GGTCATCGTGATGCTGAGAA; MMP2 (Entrez Gene ID 4313, hyväksytty symboli MMP2) tulevaisuuteen AAGGGGATCCAGGAGCTCTA; käännetyn GCTTGTCACGTGGTGTCACT; MMP-9 (Entrez Gene ID 4318, hyväksytty symboli MMP9) tulevaisuuteen TTGACAGCGACAAGAAGTGG; käännetyn GCCATTCAC GTCGTCCTTAT; EpCAM (Entrez Gene ID 4072, hyväksytty symboli EpCAM) tulevaisuuteen CGTCAATGCCAGTGTACTTCAGTT; käännetyn TCCAGTAGGTTCTCACTCGCTCAG; CD44 (Entrez Gene ID 960, hyväksytty symboli CD44) tulevaisuuteen CCAATGCCTTTGATGGACCA; käännetyn TGTGAGTGTCCATCTGATTC; Oct4 Entrez Gene ID 5460, hyväksytty symboli POU5F1): kuormatraktoreiden CTCCTGGAGGGCCAGGAATC; käännetyn CCACATCGGCCTGTGTATAT; 18S (Entrez Gene ID 100008588, hyväksytty symboli RN18S1) eteenpäin-GTAACCCGTTGAACCCCATT; reverse-CCATCCAATCGGTAGTAGCG. MRNA: n ilmentyminen STAT3 määritettiin käyttäen STAT3 koetinta (Applied Biosystems, Victoria, Australia). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen Applied Biosystems ABI SYBR mix (Victoria, Australia) käyttämällä Applied Biosystemsin ABI 7900 HT Fast reaaliaikainen kone. Saannot muutettiin fg (femtograms), joka perustuu standardikäyrän kunkin tuotteen ja tuloksena mRNA-tasot olivat normalisoitu 18S mRNA-tasolla näytettä kohti. Kukin koe suoritettiin riippumatta vähintään kolme kertaa.

Useimmat munasarjasyöpä potilaat diagnoosin (vaihe IIIc /IV) läsnä askites (CN), joka koostuu fibroblastin kaltaisen strooman solut ja hyvin vähän syöpäsoluja. Suurin osa näistä potilaista (-80%) leikkauksen jälkeen ja ensimmäinen rivi kemoterapian tuoton, joilla on uusiutuva syöpään liittyvä askites (CR). Aikana solunsalpaajahoidon ja myöhempien pahenemisvaiheita, prosenttiosuus strooman solujen askites on laskenut vähitellen ja potilaan kanssa toistuvia syöpä esittelee askites, joka koostuu enimmäkseen CA125

+++ /EpCAM

+++ /STAT3

+++ solunsalpaajaresistentti epiteelisolujen NAD syöpäsoluja. Nämä CA125

+++ /EpCAM

+++ /STST3

+++ rikas kasvainsoluja lopulta lähde extraovarian vatsakalvon kiinnikkeistä. Nämä kiinnikkeistä ovat viime kädessä syy potilaan kuolleisuutta.

Animal Studies

Eläinten etiikka selvitys.

Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas Care ja käyttö Laboratory Animals National Health ja Medical Research Council of Australia. Kokeellinen protokolla hyväksyttiin Ludwig /osasto Kirurgian, Royal Melbourne sairaala ja University of Melbournen Animal eettisen komitean (Project-006/11), ja jonka myös tutkimus- ja eettisen komitean Royal Naisten Hospital Melbourne, Australia. Balb /c nu /nu-hiiriä (ikä, 6-8 viikkoa) hankittiin Animal Resources Centre, Länsi-Australiassa. Eläimiä pidettiin vakiona patogeenittomassa ympäristön pääsy ruokaan ja veteen.

NAD ja AD-solut eristettiin askites kolmen CR potilailla (taulukko 2). 5 x 10

6 solua per ryhmä injektoitiin i.p. jossa on 26 gaugen neulaa kymmenen hiirtä (kuusi NAD ja neljä AD solut). Hiiret tarkastettiin viikoittain ja syövän etenemistä seurattiin perustuu yleiseen terveyteen ja kehon painoa, kunnes ennalta määritetty päätepiste saavutettiin. Endpoint kriteereinä olivat painonlaskua yli 20% alkuperäisestä ruumiinpainosta, ruokahaluttomuus, yleinen malleja vähentynyt hyvinvoinnin kuten alhaisemmat liike ja väsymys johtuvat kiinnostuksen puute päivittäisissä toiminnoissa. Hiiret lopetettiin ja elimet (kuten maksan, vatsan, keuhkot, ruoansulatuskanavassa, haima, kohtu, luurankolihasten, paksusuolen, munuaisten, vatsakalvon, munasarjat ja perna), kiinteät kasvaimet ja askitesneste kerättiin jatkotutkimuksiin. Metastaattinen kehitys dokumentoitiin Royal Naistenklinikka patologi mukaan histologinen tutkimus (H E värjäys. Myöhemmät luonnehdinta CA125, EpCAM ja CD44 ilmentymisen soluissa kerätään askites-hiirten suoritettiin kuten edellä on kuvattu.

Tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism (version 5; GraphPad Software Inc., San Diego, CA) ja Microsoft Excel. Jos näytteen poikki asetettu, keinot osoitettiin olevan vaihtelun p 0,05 F-testi sitten parametrisena t-testi suoritettiin unpaired epätasainen vaihtelut. Tiedot katsottiin merkittävästi erilainen, jos p 0,05.

Tulokset

morfologia Solut Kerätyt Vesivatsanesteestä syöpäpotilaiden

Askites peräisin olevia soluja sekä CN (n = 11) ja CR potilailla (n = 14) arvioitiin faasikontrastimikroskopiassa jälkeen kylvö pienellä kiinnityslevyt 24 tuntia. Kaksi erillistä solupopulaatiota havaittiin: (i) monisoluisista aggregaatit (palloset), jotka kellui kuin kolmiulotteisia rakenteita kasvualustaan ​​ilman työvälinettä (NAD) (kuvio 1A), ja (ii) kara-muotoinen fibroblastin kaltaisen yksittäisistä soluista, jotka kiinni alhainen kiinnityslevyt (AD) (kuvio 1 B).

Lisäksi morfologinen arviointi NAD väestöstä paljasti lukuisia kolmiulotteinen klustereita löyhästi tiivistettyä sferoidit keskiontelon (kuvio 1A). Oli huomattavaa vaihtelua morfologia ja koko pallosia eri potilaiden sekä sisällä askites saman potilaan. Joissakin tapauksissa, sferoidit olivat muodossa tiukka palloja, joilla on määrätty ulkokehälle, kun taas toiset näytetään löysä aggregaatteja pienisoluisen klustereita (kuvio 1A). 24 tunnin kuluttua viljelmä kudosviljelymuoviin, useimmat pallosia kiinni ja selkeä muodonmuutoksen kolmiulotteisen rakenteen litistetty solun klustereita, jotka sisältävät useita kerroksia tarttuvien solujen kasvaa toistensa päälle havaittiin (kuvio 1C). Kehän pallosia näytteillä pitkänomainen soluja siirtymässä pois pallosia, kun taas solut kohti keskustaa olivat pyöristetty rakenne. Kun solut siirretään pois keskeinen ydin, solu-solu-kontakti on alennettu, mikä erittelemään pallojen (kuvio 1C). Vaihtoehtoisesti, AD kiinnittyneiden solujen muovin pitkänomainen karan kaltaisia ​​soluja ja esittää fibroblastin kaltaisen morfologia (kuvio 1 D).

Kasvu AD ja sferoidi johdettuja NAD solut, kuten yksikerroksinen Cultures

kasvu kuvio sekä AD ja NAD solut määritettiin kiinnittynyt yksikerrosviljelmissä by

3 [H] -tymidiinin oton määritystä. NAD sferoidit dispergoitiin pipetoimalla ja kasvumalli verrattiin AD soluihin. AD solut oli lähes 2-kertainen kasvu vaste verrattuna soluihin hajallaan NAD väestöstä (kuvio 1 E).

Sisplatiini herkkyys NAD ja AD Cells

Solut NAD sferoidit hajoitettiin pipetoimalla ja GI50-arvon vasteena sisplatiinin verrattuna AD-solut eristettiin askites munasarjasyöpä potilaiden (n = 3) (kuvio 1 F). Solujen NAD sferoidit olivat lähes 4 kertaa enemmän resistenttejä sisplatiinin (n = 3, GI50 = 8,8 ± 0,72 ug /ml) verrattuna AD-soluja (n = 3, GI50 = 2,4 ± 0,28 ug /ml) (kuvio 1 F ).

arvio solunpintamarkkereiden virtaussytometrialla

ilmentyminen solun pinnalla FSP, EpCAM, CA125, CD44 ja cyt 7 määritettiin AD ja NAD soluja (hajallaan trypsinaatiolla) mukaan flow cytometry. Korkeatasoinen ilmentymisen EpCAM, CA125 ja cyt 7 havaittiin soluissa hajoavat NAD väestöstä, kun taas vähäinen /ei ilmentymistä FSP havaittiin, ja suhteellisen alhainen ilmentymisen CD44 näkyi NAD pallosia (kuvio 2 ). Toisaalta, AD solut olivat positiivisia FSP ja CD44, joilla on alhainen /ilman havaittavaa ekspressiota CA125 ja sytokeratiini 7 (kuvio 2). Alhainen of EpCAM ilmentymisen havaittiin AD soluissa. Tämä kuvio solunpintamarkkeria ilmaisu oli yhdenmukainen kaikissa askites näytteistä (n = 25). Ei ilmentymä CD34, CD31 ja CD45 havaittiin joko NAD tai AD populaatiot virtaussytometrialla.

Analyysi CA125, EpCAM, CD44 ja mesenkymaalisten Solumerkkiaineet immunofluoresenssillä

Seuraava analysoineet ilmaisun ja lokalisointi CA125, EpCAM, CD44 ja mesenkymaalisten kantasolujen merkkiaineiden askites näytteissä immunofluoresenssilla. Yhdenmukainen virtaussytometrillä tulokset, CA125 on huomaamatta populaatiosta, kun taas solujen NAD sferoidit osoittanut voimakasta kolmiulotteinen diffuusi ilmentyminen CA125, joka oli näkyvästi reuna kalvoja eräiden solujen (kuvio 3). Hyvin harvat EpCAM-positiivisia soluja oli läsnä populaatiosta (kuvio 3). Sen sijaan tiheä reuna-kalvo värjäys EpCAM havaittiin lähes kaikissa NAD pallosia. Diffuusi sytoplasman värjäytymistä oli läsnä joissakin pallosia, mutta värjäytyminen oli paljon voimakkaampi epiteelisoluihin kehän pallosia (kuvio 3). Toisaalta, ilmentyminen CD44 rajoittui kehän NAD sferoidien ja havaittiin soluissa, jotka oli siirtymässä pois pallosia. Vahva värjäys CD44 näkyi kalvon lähes kaikkien AD-soluja (kuvio 3).

strooman fibroblastit ja mesenkymaaliset kantasolut (MSC) on osoitettu jakaa yhteisiä ominaisuuksia [23], arvioimme ilmaus yleisesti tunnettu MSC markkereita (CD90, CD73 ja CD105) sekä NAD ja AD populaatioiden askites näytteistä (kuvio 4). Hajallaan diffuusia värjäytymistä FSP näkyi AD-soluissa (kuvio 4). Harvat FSP-positiivisia soluja havaittiin NAD palloset, ja nämä olivat solujen siirtymässä pois palloset. Voimakas ilmentyminen CD105 ja CD90 oli läsnä AD soluissa. Ekspression näiden proteiinien havaittiin koko sytoplasmassa ja solukalvon solujen. Heikko ilmentymä CD73 oli läsnä AD soluissa. Toisaalta, matala /ei ilmentymistä CD90 ja CD73 havaittiin NAD pallosia. Kuitenkin CD105 värjäytyminen oli ilmeistä hyvin harvoilla soluja siirtymässä pois pallojen (kuva 4).

kvantitatiivinen arviointi Valikoiva edustajan Markers mRNA-tasolla

lisäarvioimiseksi määrälliset erot ilmaus epiteeli- ja mesenkymaalisten merkkiaineiden NAD ja AD populaatiot, vertasimme mRNA: n ilmentymisen tasoja joidenkin markkereiden q-PCR: llä. Solujen NAD pallosia, oli merkitsevästi korkeampi ekspressiotaso E-kadheriinin ja EpCAM verrattuna AD-soluja (p 0,01) (kuvio 5). Toisaalta, AD-solut osoittivat merkitsevästi korkean mRNA-ilmentymisen tasoa vimentiinista ja MMP-9 verrattuna solujen NAD pallosia (p 0,01, s 0,05) (kuvio 5). Keskimääräinen ilmentyminen N-kadheriinin, CD44 ja MMP2 esiintyi useammin 2,5, 7 ja 15-kertaiseksi AD väestö, mutta ei ole merkitystä havaittu (p 0,2, p 0,06, p 0,17). Ilmentyminen STAT3 ja Oct4 oli merkitsevästi korkeampi NAD verrattuna populaatiosta (p 0,05) (kuva 5).

Arvio Tuumorigeenisuustutkimuksissa NAD ja AD populaatiot in vivo hiirimallissa

-tuumoriksenografti suoritettiin kokeita sen määrittämiseksi Tuumorigeenisuustutkimuksissa NAD ja AD populaatiot eristettiin askites kolmen CR potilaiden ip rokotus 5 x 10

6 NAD tai AD solua hiirtä kohti. Viisi kuudesta hiiret injektoitiin NAD-soluja (kuten solujen suspensio) (kuvio 6A) on kehitetty askites joilla on kiinteitä kasvaimia ( 0,5 cm

3) (n = 3) (kuvio 6C) tai pieniä vaurioita (n = 2) vatsakalvon. Kasvain latenssiaika kaksitoista-neljätoistaviikko elinsiirron jälkeen havaittiin. Kasvaimet painavat 0,8 ± 0,2 g ja askites (-0,5 ml) havaittiin kaikissa viidessä hiirillä, kehittyi kasvaimet (kuvio 6C). Sitä vastoin ei havaittu kasvaimia hiirissä (n = 4), injektoitiin sama määrä AD solujen parinkymmenen viikkoa i.p.