Krooninen sairaus

tiivistelmä

TCTP on ollut mukana lukuisia tärkeitä solun prosesseja, jotka liittyvät solun kasvuun, solusyklin etenemistä, pahanlaatuisiin ja apoptoosin. Näiden lisäksi solunsisäisen toimintoja, TCTP on solunulkoinen toimintoja ja sillä on tärkeä rooli immuunijärjestelmän soluissa. TCTP ekspressio on aiemmin osoitettu olevan vapautettiin eturauhassyöpä, mutta sen toiminta eturauhassyöpäsoluissa on suurelta osin tuntematon. Tässä osoitamme, että TCTP ilmentymistä säätelee androgeenien LNCaP eturauhassyövän solut

in vitro

sekä ihmisen eturauhassyöpäksenografteista

in vivo

. Knockdovvn

TCTP

pienentää pesäkkeiden muodostumista ja nousi apoptoosin LNCaP, syytetään sitä tärkeänä tekijänä eturauhasen syöpäsolun kasvua. Global geeniekspressioprofilointi in TCTP pudotus LNCaP solut osoittivat, että useat interferoni geenien säädellään TCTP, mikä viittaa siihen, että se voi olla rooli säätelyssä immuunitoimintojen eturauhassyövässä. Lisäksi, yhdistelmä-DNA-TCTP hoito lisäsi pesäkkeenmuodostusta LNCaP-soluissa viittaa siihen, että eritetyn TCTP voi toimia proliferatiivinen tekijä eturauhasen syöpä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että TCTP voi olla rooli eturauhassyövän kehitykseen.

Citation: Kaarbø M, Storm ML, Qu S, Wæhre H, Risberg B, Danielsen HE, et al. (2013) TCTP Onko androgeenisäädellyn Gene Sekaantunut eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (7): e69398. doi: 10,1371 /journal.pone.0069398

Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 02 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 10 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 22 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Kaarbø et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on tukenut avustuksin Norja Research Council (Grant # 193337 /V50, www.forskningsradet.no) ja Norja Cancer Society (Grant # 71395 – PR-2006-0335). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on useimmin diagnosoitu ei-kutaaninen maligniteetti ja kolmanneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien miehillä läntisissä teollisuusmaissa [1]. Tärkeys androgeenien kehittämistä ja etenemisen eturauhassyöpä osoitettiin varhain 20

vuosisadalta. Tämä johti panostus androgeenien ja reseptori, johon ne sitoutuvat, androgeenireseptorin (AR) [2], ja androgeeniablaatio hoito tuli pääradan hoidon. Vaikka AR ja androgeenitoiminnan ovat kriittisen tärkeitä näkökohtia eturauhassyöpä, on käynyt selväksi, että muut signaalinvälitysreittien, samoin kuin ei-genomista ja genomisia muutoksia, ovat mukana kehittymistä ja etenemistä eturauhassyövän (tarkistetaan [3]) .

translaation ohjattu tuumoriproteiinia (TCTP) on monipuolinen tekijä, joka on erittäin konservoitunut useissa lajeja. Se oli alun perin löydettiin hiiren sarkooma solulinja proteiinia säädellään translaation tasolla [4]. TCTP on sittemmin liitetty useita tärkeitä solun prosesseja, kuten solun kasvua, pahanlaatuisiin ja estämällä apoptoosin. TCTP ei löydy ainoastaan ​​kasvainsoluissa, mutta on laajalle levinnyt ekspressio profiilin, jota ei ole rajoitettu tiettyyn kudokseen tai solutyyppiin. Kuitenkin TCTP ilmaisu on yleensä suurempi kasvaimissa verrattuna vastaavassa normaalissa kudoksessa (katsaus [5]).

TCTP on anti-apoptoottisen roolin monissa solulinjoissa (katsaus [6]). TCTP hiirten ovat embryonically tappavia alentunut solujen lukumäärä ja korkeampi esiintyvyys apoptoosin alkioiden, korostaen sen merkitystä varhaisessa kehitysvaiheessa [7], [8]. Lisäksi, TCTP on osoitettu sitovan kalsiumin [9] – [12]; tämä ominaisuus voidaan yhdistää sen anti-apoptoottista aktiivisuutta, kun konsentraatio vapaan solunsisäisen kalsiumin tiedetään lisäävän apoptoosin aikana, liipaisu tapahtumaketju, joka johtaa solukuolemaan [13]. TCTP on mukana useita proteiini-proteiini-vuorovaikutusten ja sitoutuu tubuliinin PLK-1, p53 ja guaniininukleotidiä vaihto tekijä Rheb, muun muassa [14]. Lisäksi,

TCTP

mRNA on erittäin strukturoitu ja aktivoi PKR, proteiinikinaasi osallistuu tulehdusvasteeseen [15]. Vaikka nämä tutkimukset tarjoavat uskottavia selityksiä monista raportoitu vaikutuksia TCTP tarkka mekanismeja, joilla TCTP toiminnot pysyvät olla rajattu.

TCTP on myös erittyvä proteiini solunulkoisen toimintoihin [16]. Erittyvän muodon TCTP tunnistettiin alun perin sen kyky edistää histamiinin vapautumista basofiileistä alaryhmässä allergisten luovuttajien ja siten nimetty Histamiini vapauttava tekijä (HRF) [17]. Lisäksi, TCTP stimuloi B-solujen lisääntymistä, indusoi IL-1, IL-6, ja immunoglobuliinin tuotanto sopusoinnussa rooli B-solujen kasvutekijä [16]. TCTP ei sisällä N-terminaalista signaalisekvenssiä tyypillisiä eritettyjä proteiineja ja erittyy läpi ei-klassisen reitin, johon eksosomeiksi [18]. Mielenkiintoista, nanovesicles erittyy apoptoottiselta endoteelisolujen, jotka toimivat parakriinisellä tavalla sisältävät TCTP, edelleen laajennetaan modaliteetista sen solunulkoisen toimintaa [19].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat tunnistaneet TCTP ilmentymistä ihmisen eturauhasen. TCTP havaittiin ilmentyvän eturauhasen kudoksissa saavilla miehillä kirurgisen adenomectomy eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) ja solulinjoissa, jotka ovat peräisin normaalin eturauhasen, kuten solulinja PWR-1E, ja eturauhassyövän [12]. TCTP ilmentyminen havaittiin myös olla suurempi kuin muut kalsiumia sitovia proteiineja (perusperiaatteet) ihmisen eturauhasen. Lisäksi, immunohistokemiallisissa määrityksissä normaalin eturauhasen osoitti, että TCTP pääasiassa ilmaistaan ​​onteloerityssolut ja pienemmässä määrin tyvisolut. TCTP tunnistettiin myös eturauhasen nesteitä, mikä viittaa siihen, että sillä voi olla solunulkoinen rooli eturauhassyövän [12]. Lisäksi, TCTP voi vaikuttaa proliferaatioon ja elinkykyyn eturauhassyöpäsoluissa [20]. LNCaP-soluja käsiteltiin siRNA kohdistaminen TCTP osoitti, että pudotus on TCTP lisää apoptoosia kaspaasi 3 ja kaspaasin 8 ja vähentää solujen lisääntymistä LNCaP-solujen [20]. Lisäksi tulokset tuoreessa tutkimuksessa osoittavat, että lämpöshokkiproteiini 27 (Hsp27) vuorovaikutuksessa TCTP eturauhasen syöpäsolujen ja suojaa sitä hajoamiselta [21]. Lisäksi, TCTP ilmentymistasot korreloivat sairauden etenemistä, kun se on yliaktiivista kastraatio resistenttejä eturauhassyöpä (CRPC) [21]. Nämä tutkimukset sotkea TCTP eturauhassyövässä; on kuitenkin vain vähän tietoa sen sääntely ja toiminta eturauhasen syöpäsoluja.

Tässä osoitamme, että TCTP säätelee androgeenien, tärkeä selviytymisen tekijöitä syöpäsolujen sekä normaalin eturauhasen. Kohdunulkoinen ilmaus TCTP ja sen knockdown sekä kokeiluja yhdistelmä-TCTP, osoittaa, että se edistää solujen kasvua ja lisääntymistä, syytetään sen tärkeä tekijä eturauhassyövän.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

tutkimus hyväksyttiin alueellinen eettinen komitea, REK Sør-Øst (S-07443a), ja materiaalia yhä elossa potilaista oli mukana, kun kirjallisen suostumuksensa. Käytä materiaalia kuolleista potilaista sallittiin eettinen komitea. Eläinkokeet hyväksynyt Case Western Reserve University IACUC ohjeita. Kaikki toimet eläinten hyvinvoinnin ja minimoida kärsimystä oli mukaisesti IACUC ohjeiden ja on aiemmin kuvattu [22], [23].

Cell Culture

LNCaP-solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC) ja niitä viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS), 2 mM L-glutamiinia, 50 U /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä (Lonza). Ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen BEAS-2B solulinja transformoidaan SV40 oli antelias lahja Sten Mollerup (Department of Toxicology, National Institute of Occupational Health, Oslo, Norja) [24]. BEAS-2B-soluja ylläpidettiin LHC-9, jota oli täydennetty 1,8 mg /ml naudan seerumin albumiinia (BSA) levyillä päällystettiin 0,01 mg /ml fibronektiiniä, ja 0,03 mg /ml naudan kollageenia liuotettiin PBS: ään.

sekä solulinjat elatusaineet vaihdettiin joka toinen tai kolme päivää, ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2, 95% ilmaa inkubaattorissa. Androgen induktio kokeissa, LNCaP-solut ilman ravintoa 48 tuntia RPMI 1640, joka sisälsi 2% hiilellä käsitelty (CT) -FCS, jota seuraa vielä 24 h RPMI 1640, joka sisälsi 0,5% CT-FCS ennen käsittelyä 10

– 8 M R1881 (synteettinen androgeeni). R1881 saatiin NEN.

vierassiirrekokeissa

Transplantation, kasvua, ja sato kasvainten hiirillä, joilla CWR22 ksenograftien olivat kuten aiemmin on kuvattu [22], [23]. CWR22 -ksenografteja on kasvatettu nude-hiirissä, kun läsnä on pitkävaikutteisten testosteroni pelletti. Sen jälkeen, kun kasvaimen kasvua, hiiret kastroitiin, testosteroni pelletit poistettiin ja taantuu kasvaimet kerättiin 1, 2, tai 4 viikkoa kastraation jälkeen. Eläimiä pidettiin ja käsiteltiin mukaan IACUC suuntaviivoja.

Kvantitatiivinen PCR (qPCR) B

Kun sato, kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen Trizol® reagenssia (Invitrogen) valmistajan suositusten mukaisesti. 1-5 ug RNA: ta käytettiin ensimmäisen juosteen cDNA-synteesin kanssa SuperScript II -järjestelmää (Invitrogen) ja oligo-dT-alukkeita. qPCR analyysit suoritettiin LightCycler® 480 instrumentti (Roche) kanssa LightCycier 480 SYBR Green I Master mix (Roche). Standardikäyrä valmistetaan sarjalaimennoksia cDNA tehtiin laskea suhteellinen määrä kohde ja viite-geeni jokaisesta näytteestä. Nämä arvot normalisoidaan sitten sen suhteellinen määrä viite-geenin. Alukkeet ovat saatavilla pyynnöstä. Erot ryhmien arvioitiin käyttämällä kaksisuuntaista, pariksi Opiskelijan

t-

testi, jossa

P

0,05 sitä pidetä merkittävänä.

Protein Extraction ja Western Analyysit

Koko solu-uutteet valmistettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [25], SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Bio-Rad). Blotatun membraani blokattiin 10% rasvatonta kuivamaitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), joka sisälsi 0,1% Tween (TBS-Tween) 1 h, mitä seurasi inkubointi primaarisessa vasta-ainetta TBS-Tween, joka sisälsi 5% naudan seerumin albumiinia (BSA) 14-16 tuntia 4 ° C: ssa. Vasta-aineet joko TCTP (1:1000) [12], tai GAPDH (1:500) (Santa Cruz) käytettiin. Parannettu kemiluminesenssi Western blotting tunnistus reagenssit (Amersham Biosciences) ja analysointijärjestelmä käytettiin havaitsemiseen HRP leimattujen proteiinien. Kvantifiointiin, western blotit olivat digitalisoitu skannerilla kone (Epson Perfection V700 Photo) ja optinen tiheys mitattiin ohjelmiston ImageQuant TL (Amersham Biosciences). Ihmisen TCTP hiiren monoklonaalinen vasta-aine oli antelias lahja ryhmästä del Vecchio [12].

RNA Häiriöitä

Synteettiset siRNA kohdistaminen TCTP (kohdesekvenssi 5’AACCATCACCTGCAGGAAACA-3 ’) saatiin alkaen Dharmacon, kun taas siRNA lusiferaasin (kohdesekvenssin: 5’-AACTTACGCTGAGTACTTCGA-3 ’), oli Qiagen. LNCaP-soluja ympättiin kokonaan väliaineessa 24 h ennen transfektiota. Väliaine vaihdettiin RPMI 1640 ilman FCS: ää ja antibiootteja ennen transfektiota, ja solut transfektoitiin 100 nM siRNA kuoppaa kohti käyttämällä Oligofectamine (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollan.

Colony muodostumisen määritys

LNCaP-solut transfektoitiin siRNA: lla, kuten on kuvattu edellä, ja maljattiin 10 cm: n maljoilla tiheydellä-100000 solua /kuoppa. Pesäkkeitä kasvatettiin kolme viikkoa. LNCaP-solut, joita käsiteltiin yhdistelmä-TCTP ympättiin tiheydellä 2500 solua kuoppaa kohti kuuden kuoppalevyllä RPMI, jota oli täydennetty 10% FCS: ää. Rekombinantti TCTP, GST tai ajoneuvon hallinnan lisättiin joka toinen kolme päivää. Pesäkkeenmuodostus arvioitiin kahden viikon kuluttua kasvun. Solut kiinnitettiin metanolissa lämpötilassa -20 ° C: ssa 30 minuutin ajan, värjättiin 0,1% kristallivioletilla 20 minuutin ajan ja pestiin sitten MQ vedellä. Kattama alue pesäkkeiden kvantifioitiin käyttämällä GeneTools ohjelmiston SynGene.

TUNEL Pitoisuus

LNCaP-solut ympättiin kansi-luistaa, nälässä ja transfektoitu siRNA edellä kuvatulla tavalla. Sillä thapsigargin (TG) induktion jälkeen solut joko vehikkeliä tai 100 nM TG viimeisen 36 h 72 h transfektion aikana. Apoptoosin havaitsemiseen, joka on TUNEL

In situ

Cell Death Detection Kit (Roche) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Fluoresenssi havaittiin käyttäen Axioplan2 kuvantamisen mikroskoopilla (Zeiss) ja kuvat on otettu, jossa AxioCam HRC kameran (Zeiss). Määrä TUNEL-positiivisia soluja ilmaistiin prosentteina solujen lukumäärä.

geeniekspressioprofilointi

Kokonais-RNA: lla käsiteltyjen solujen siRNA eristettiin käyttäen TRIzol® mukainen reagenssi valmistajan ohjeita ja analyysit tehtiin Norja Microarray Consortium (NMC), Oslon yliopistollisessa sairaalassa, Oslo, Norja. RNA: ta monistettiin käyttäen Illumina® TotalPrep RNA Amplification Kit (Illumina). 500 ng kokonais-RNA: ta käytettiin monistuksessa ja leimausreaktioon. Laatu cRNA arvioitiin käyttäen Bioanalyser. Biotiinileimattua cRNA (1,5 ug) käytettiin sitten hybridisoitumaan päälle Illumina Human-6 v3 Expression beadchips käyttäen kaikkiaan-genomin geenin ekspressio suora Hybridisaatio assay Illumina. Skannauksen jälkeen tulokset tuotiin Illumina BeadStudio, jossa laatu kunkin matriisin ja skannauksen testattiin.

tuottaminen ja hoito rekombinantti TCTP

avoin lukukehys (ORF) hTCTP kloonattiin pET-28a rekombinantti TCTP. 0,1 mM IPTG: tä käytettiin ilmentymisen indusoimiseksi, ja seuraavaa satoa pelletti suspendoitiin uudelleen sitomispuskuriin (20 mM NaH

2PO

4, 500 mM NaCl, 20 mM imidatsoli, pH 7,4). Proteaasi-inhibiittoreita lisättiin ja solususpensiota sonikoitiin 4 ° C: ssa. His-merkitty hTCTP puhdistettiin natiiveissa olosuhteissa käyttäen HiTrap ™ Chelating HP sarake (GE Healthcare) ladattiin Ni

2 + -ioneja mukaan valmistajan ohjeiden. Näyte steriilisuodatettiin ja laimennettiin sitomispuskurilla ennen käyttöä pylvääseen. Pylväs pestiin sitoutumispuskurilla kunnes absorbanssi (280 nm) vakiintunut. Sitoutuneet proteiinit eluoitiin sitten eluointipuskuria (20 mM NaH

2PO

4, 500 mM NaCl, 500 mM imidatsoli, pH 7,4). Puhdistus menettely suoritettiin 4 ° C: ssa, jotta proteiinien hajoaminen. Eluaatti dialysoitiin PBS käyttäen Slide-A-Lyzer® 10K dialyysi kasetteja, joiden cut-off-arvo on 10 kDa. Saadakseen rekombinantti GST, pGEX-4T kasvatettiin BL21-soluissa, indusoitiin 0,1 mM IPTG ja puhdistetaan inkuboimalla 50% Glutathione Sepharose 4B lietettä. Helmet pestiin PBS: llä ennen eluointia (50 mM Tris-HCI, 10 mM pelkistettyä glutationia, pH 8,0). Puhdistetut proteiinit ajettiin rinnalla Precision Plus Kaksiväriset Protein Standard, Esivärjätyt Protein Markers, Broad Range (7-175 kDa) ja värjäämätön Protein Markers, Broad Range (2-212 kDa) (Biorad) arvioida proteiinin määrää.

BEAS-2B-soluja käsiteltiin rekombinanttisella TCTP /GST yhden tunnin ajan ennen sadonkorjuuta.

immunohistokemia

kudossiruina (TMA) valmistettiin eturauhasen yksilöt potilaista operoidaan norja Radium Hospital vuosien 1988 ja 1996 seurattu leikkauksen jälkeen. Prostataspesifinen antigeeni (PSA) mittaukset suoritettiin ennen ja jälkeen toiminta ja jokaisen myöhemmän kliinisen tutkimuksen. Seuranta jaksoja vaihteli 2-176 kuukautta (keskiarvo 73,3 kuukautta). Potilaiden katsottiin olevan kliinisesti todettu taudin uusiutumisesta, jos jokin olivat läsnä seuraavat: (

) todiste paikallisen uusiutumisen (vahvistettu histologinen koepaloja tai ultraääntä) tai (

b

) todisteet kaukainen etäpesäke (havaitsee luuston gammakuvaus ja /tai magneettikuvaus). Jos potilas, joka kärsi uusiutuminen oli leikkauksen jälkeisen seerumin PSA 4 ng /ml ennen joko paikallisen uusiutumisen tai etäpesäke, jona kohonnut PSA asetettiin uusiutumisen päivämäärä. H 0,05 sitä pidetä merkittävänä.

Tilastot

Lukuun ottamatta microarray analyyseja, tilastoja suoritettiin käyttäen Studentin t-testiä, jossa p-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä.

tilastollinen analyysi geenien ilmentyminen tietojen.

tilastollinen analyysi suoritettiin perustuen yhteenveto ilmaisun arvot kullekin koetin ja normalisoidaan quantile normalisointi joka johtaa pelimerkit, joilla on identtiset voimakkuusjakauma. Aineisto analysoitiin J-Express v2.7 ohjelmisto (https://www.molmine.com). Tilastollinen analyysi mikrosirujen (SAM) ja Feature Alijoukko Selection (FSS) käytettiin tilastollisiin analyyseihin.

Tulokset

TCTP Expression aiheutetaan Androgeenit

Ensin tutkitaan mahdollisia säätely TCTP ilmentymisen androgeenien androgeeniresponsiivisen eturauhassyövän LNCaP ajassa kurssin kokeen. Kuten on esitetty

kuvioissa 1A

ja 1B, siellä oli androgeenin indusoima lisääntyminen sekä TCTP mRNA: ta ja proteiinien kertymistä ajan, joka oli noin neljä kertaa korkeampi verrattuna käsittelemättömiin soluihin 48 tuntia. Sen määrittämiseksi, TCTP lauseke säädellään myös androgeenien

in vivo

, käytimme ihmisen androgeeniriippuvaisen eturauhassyöpäksenograftista malli CWR22 joka selvästi taantuu jälkeen kastraation [22], [23]. Western-analyysi CWR22 kasvainten kerätään hiiristä eri aikapisteissä kastraation jälkeen osoitti, että TCTP ilmaisua merkittävästi väheni ajasta riippuva tavalla ja oli lähes kadonnut neljän viikon (

Kuva 1C

). Nämä tulokset osoittavat, että TCTP ilmentymistä säätelee androgeenien eturauhassyövän soluissa sekä

in vitro

ja

in vivo

.

. LNCaP-solut jätettiin joko hoitamatta tai käsitelty synteettisen androgeenin R1881 (10

-8 M) varten osoitettu kertaa. Kokonais-RNA eristettiin ja qPCR analyysit suoritettiin.

TCTP

mRNA ilmaisun normalisoitiin

GAPDH

. Kuvaaja esittää kokeen yhdestä edustavasta kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena virhejanat osoittavat ± SEM, ekspressiotasot ovat suhteessa soluissa, joita käsiteltiin ilman androgeenireseptorin (asetettu 1). Koe toistettiin yli kolme kertaa B. Western analyysit suoritettiin kokosoluekstraktien valmistettu käsiteltyjen solujen puuttuessa tai läsnä R1881 (10

-8 M) varten ilmoitettuina ajankohtina. Ilmentymistasojen normalisoitiin GAPDH. Esitetyt arvot ovat suhteessa hoitamattomiin näytteitä (asetettu 1). Kuvaaja havainnollistaa tietoja kahdesta kokeesta, jotka suoritettiin kolmena rinnakkaisena virhejanat havainnollistaa ± SEM. C. CWR22 -ksenografteja on kasvatettu nude-hiirissä, ja kasvaimen kerättiin joko ennen (t = 0) tai 1, 2 ja 4 viikkoa kastraation jälkeen. Yhteensä solu uutteet tehtiin ja käytettiin western blot-analyysit. Kuvassa on esitetty yksi edustava blottauksella TCTP ja GAPDH, jossa arvojen suhteen TCTP (t = 0 asetettu 1) normalisoitiin GAPDH. Erot ryhmien arvioitiin käyttämällä kaksisuuntaisia, pariksi Studentin t-testiä verrattuna ei-käsiteltyjen näytteiden, jossa P 0,05 niitä pidetään merkittävinä. Merkitys on merkitty tähdellä; yksi Tähti osoittaa P 0,05, kaksi Tähdet osoittavat P 0,01.

knockdovvn TCTP Vähennykset Colony muodostaminen LNCaP

n androgeenisäätely TCTP ilmaisun, kuten edellä on esitetty, ehdotti, että se voi olla rooli kasvun eturauhasen syöpäsoluja. Tämä voi olla joko indusoimalla leviämiseen tai apoptoosin estämiseen, tai molempien yhdistelmä. Tutkia mahdollista roolia TCTP solukasvun, sen ilmentyminen estyi LNCaP-soluissa siRNA käsittely ja pesäkkeiden muodostus arvioitiin verrattiin ohjaus siRNA käsiteltyihin soluihin. Kuten kuviossa 2A on esitetty, TCTP proteiinin ilmentyminen väheni 85% 72 tunnin kuluttua transfektion siRNA kohdistaminen TCTP. Colony muodostumista TCTP Knockdown solujen väheni 50% verrattuna säätökennoja (kuviot 2B ja 2C). Nämä tulokset osoittivat, että TCTP voi olla rooli LNCaP-solujen lisääntymisen ja /tai elinkelpoisuutta.

. siRNA välittämä knockdovvn

TCTP

LNCaP-soluissa. LNCaP-solut transfektoitiin siRNA (100 nM) kohdistaminen joko

Luciferase (Luc) B tai

TCTP

. Ilmoitettuina ajankohtina solut otettiin talteen, proteiini-uutteet valmistettiin ja analysoitiin western-analyysillä. Antiseerumit TCTP ja GAPDH käytettiin peräkkäin samassa blot. B. LNCaP-solut transfektoitiin 100 nM siRNA kohdistaminen

Luc

tai

TCTP

, siirrostettiin 10 cm: n maljoilla ja analysoitiin pesäkemuodostusta kyky kristalliviolettivärjäys- värjäyksen jälkeen kolmen viikon kasvun. Edustavia kuvia näytetään. C. kvantitointi pesäkkeen muodostumisen LNCaP jälkeen siRNA välittämää knockdovvn TCTP. Käyrä edustaa kahden kokeen kolmena kappaleena. Erot ryhmien arvioitiin käyttämällä kaksisuuntaisia, pariksi Studentin t-testiä verrattuna Luc-siRNA käsiteltyjen näytteiden, joissa *: P 0,05 osoittaa merkittävää eroa.

Down-regulation of TCTP Lisäykset apoptoosin LNCaP Solut

TCTP on aiemmin raportoitu estävän apoptoosia useissa solulinjoissa [20], [26] – [28]. Lisäksi RNAi-välitteinen knockdovvn TCTP LNCaP-soluissa aktivoituu kaspaasi 3 ja kaspaasin 8, osoittaa lisääntynyt apoptoosin [20], [21]. Meillä on siis tutkineet mahdollista roolia TCTP on apoptoosin LNCaP. Edellinen työ meidän laboratorio on vahvistanut, että Thapsigargin (TG) indusoi merkittäviä apoptoosia kuluttua 36 h hoidon LNCaP [25]. Meillä on siis selvitettävä, TCTP voi muuttaa TG indusoiman apoptoosin. LNCaP-solut transfektoitiin joko siRNA vastaan ​​TCTP tai ohjaus (Luciferase) siRNA, sitten se jätetään hoitamatta tai altistunut TG, jonka jälkeen laajuus apoptoosi määritettiin TUNEL-määritystä. Kuten on esitetty kuvioissa 3A ja 3B, ilman TG hoidon, oli noin kolme-kertainen apoptoosin TCTP pudotus soluissa verrattuna kontrollisoluihin. Kuten odotettua, TG huomattavasti apoptoosia sekä ohjaus- tai TCTP-siRNA käsitellyissä soluissa, mutta se oli noin 2,5-kertainen, kun TCTP pudotus. Pudotus on

TCTP

varmistettiin qPCR kaikissa kokeissa (tietoja ei ole esitetty). Nämä tiedot viittaavat siihen, että TCTP on mukana apoptoosin säätelyyn eturauhassyöpäsoluissa.

LNCaP-soluja viljeltiin peitinlaseilla ja transfektoitiin siRNA vastaan ​​

TCTP

tai

Luciferase (Luc)

72 h. Apoptoosi indusoitiin 100 nM TG 36 tunnin aikana siRNA hoidon. Hoidon jälkeen ja kiinnittäminen, apoptoottista solukuolemaa havaittiin käyttäen TUNEL määritystä, solujen tumat värjättiin DAPI ja soluja tarkasteltiin käyttämällä Axioplan kuvantamisen mikroskooppia. A. Edustavia kuvia LNCaP-soluja transfektoitiin joko

TCTP

– tai

Luc

-siRNA 72 h ja käsiteltiin dimetyylisulfoksidin tai TG 36 tuntia transfektion. TUNEL positiivisia soluja näkyvät punaisina täplinä. Nuolet osoittavat apoptoottisia soluja. B. kvantitointi apoptoosin esiintymistä. Tiedot osoittavat prosenttiosuuden käyttökelvottomaksi solujen kuluttua 36 h hoidon TG transfektoiduissa soluissa

TCTP

tai

Luc siRNA

. Pylväät edustavat keskiarvoa kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena ja pylväät edustavat ± SEM *: P 0,05 osoittaa merkittävää eroa.

Down-regulation of TCTP Tulokset lisääntymisen merkkejä Immuunivasteen Genes LNCaP Cells

jotta valaista polkuja TCTP voi vaikuttaa eturauhasen syöpäsoluja, teimme maailmanlaajuinen geeniekspressioprofilointi in TCTP pudotus soluissa verrattuna kontrolli LNCaP. Merkittävät TCTP Knockdown vahvistettiin sekä mRNA ja proteiini taso (tuloksia ei ole esitetty). Aineisto analysoitiin käyttämällä kahta menetelmää: tilastollinen analyysi mikrosirujen (SAM) ja Feature Alijoukko valinta (FSS) työkalut toteutettu J-Express [29]. Niistä 15 merkittävimmin geenien määräytyy kunkin analyysin yhdeksän todettiin olevan merkittävästi molempien menetelmien, kuten kuvattu Venn-kaavio kuviossa 4A. Kuvio 4B esittää ylös- tai alaspäin-sääntely joidenkin geenien, kun luettelo yli merkittävimmin geenien array, niiden ontologia, tunnetun funktion ja määritelmä on kuvattu kuviossa 4C. Suurin osa geeneistä ennustetaan merkittävästi säädellään TCTP pudotus ovat mukana interferoni signalointireitin ja /tai immuunijärjestelmän liittyviä vasteita. Ilmaisu kuusi näiden geenien (IFIT1, SLITRK3, IFI44L, IFIT3, OAS2 ja MX1) validoitiin qPCR (kuviot 5A-F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että TCTP muuttaa immuunivastetta eturauhassyöpäsoluissa.

LNCaP-solut transfektoitiin siRNA: lla vastaan ​​

TCTP

tai

Luciferase

72 tuntia, RNA eristettiin ja käytettiin globaalissa geeniekspressioprofilointi, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. A. Venn kaavio geenien merkittävästi säätelee geeniekspressioprofilointi. B. Heatmap edustus geenien ylä- tai alassäädetty vastauksena

TCTP

knockdown. Punainen ja vihreä ovat ylä- ja vaimentua geenejä, tässä järjestyksessä. C. Luettelo kymmenestä merkittävästi geenien liittymisen myötä numeroita, määrittely ja ontologian prosessi, johon ne on liitetty. Kansi muutos suhteessa

Luciferase

siRNA käsitellyt solut osoitetaan.

A-F. qPCR käytettiin arvioida geenien ilmentymisen ennustetaan ekspressoitua eri soluissa transfektoiduissa Luc-siRNA versus TCTP-siRNA. MRNA: n ilmentyminen oli normalisoitiin

GAPDH

ja laskettiin suhteessa Luc-siRNA näytteet (asetettu 1). Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Kaikki virhe palkit kuvaavat ± SEM. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin käyttäen kaksisuuntaisia, pariksi Studentin t-testi *: P 0,05 ja **: P 0,01 sitä pidetä merkittävänä.

Yhdistelmä TCTP indusoi Eturauhassyöpä Cell Growth

erittynyt muoto TCTP on aiemmin osoitettu indusoivan ilmentymisen useita välittäjäaineita, käynnistää erillistä signalointia tapahtumia ja johtaa kasvuun solujen immuunisolujen lisääntymistä [30] – [32]. Koska TCTP on läsnä eturauhasen nesteissä [12], se voi olla solunulkoinen toiminto eturauhassyöpäsoluissa. Arvioimaan tätä mahdollisuutta, teimme rekombinantti TCTP (rTCTP) in

E. coli

ja määräytyy sen biologista aktiivisuutta BEAS-2B soluissa verrattuna yhdistelmä-glutationi-S-transferaasin (rGST) kontrollina [33]. BEAS-2B-soluja käsiteltiin rTCTP tai rGST lopullisessa konsentraatiossa 1,0 ug /ml, 1 tunnin ja

IL-8

mRNA tuotanto määritettiin qPCR.

IL-8

mRNA: n ekspressio on merkittävästi lisääntynyt käsitellyissä soluissa rTCTP verrattuna soluihin, käsiteltiin rGST (kuvio 6A), mikä osoittaa, että rTCTP on biologisesti aktiivinen. LNCaP-soluja käsiteltiin sitten 1,0 ug /ml rTCTP tai rGST ja pesäkkeiden muodostumisen määritys suoritettiin. Kahden viikon viljelmässä jatkuva altistuminen rekombinanttiproteiineja, solut kiinnitettiin ja värjättiin visualisoida pesäkkeitä. Kuten kuvioissa 6B ja 6C, oli merkittävästi suurempi määrä muodostuneiden pesäkkeiden solut käsiteltiin rTCTP verrattuna rGST käsiteltyjä soluja. Nämä tiedot osoittavat, että rTCTP on proliferatiivinen /pro-eloonjäämisen vaikutus LNCaP-solujen ja ehdottaa rooli eritetyn TCTP eturauhasen syöpäsolujen kasvua.

. BEAS-2B-soluja käsiteltiin yhdistelmä-TCTP tai GST (rTCTP ja rGST) lopulliseen konsentraatioon 1,0 ug /ml, kokonais-RNA uutettiin, cDNA syntetisoitiin ja qPCR suoritetaan. GAPDH: ta käytettiin viite-geenin ja arvot ovat suhteessa GST (asetettu 1). B. Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä LNCaP-soluissa käsitelty rTCTP tai rGST. Soluja viljeltiin, kun läsnä on rTCTP tai rGST lopullisessa konsentraatiossa 1,0 ug /ml kaksi viikkoa ja muodostuneiden pesäkkeiden visualisoitiin 0,1% kristalliviolettia. Kuuluvalla alueella kullakin maljalla Pesäkkeiden mitattiin ja edustettuina prosentteina kokonaispinta-alasta levyn. C. Kaksi edustavat kuvat näytetään. Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena kolme kertaa. Virhe palkit kuvaavat ± SEM. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin käyttäen kaksisuuntaisia, pariksi Studentin t-testiä. Merkitys on merkitty tähdellä, P 0,05.

TCTP Expression on yliaktiivista Eturauhassyöpä verrattuna normaalin eturauhasen

Koska TCTP ilmentyy normaalissa eturauhasessa sekä säädellään