Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvaimen vastetta arvioidaan ensisijaisesti klinikalla seurannan vähennykset kasvaimen koon. Tämä lähestymistapa puuttuu herkkyys, koska monissa tapauksissa useita viikkoja voi kulua ennen kuin on näyttöä kasvaimen kutistuminen. Siksi on olemassa tarve kehittää ei-invasiivisia kuvantamismenetelmiä seurantaa kasvaimen hoitovasteen klinikalla. Täällä me arvioineet ennalta kliininen hyöty

18F-ICMT-11 positroniemissiotomografia – menetelmää ilmaista kaspaasi 3/7 aktivointi – ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC).

18F-ICMT-11 otto verrattiin molekyyli- biokemiallisten toimenpiteiden solukuoleman PC9 ja A549 NSCLC-solujen käsittelyn jälkeen karboplatiinin

in vitro

ja

in vivo

. Karboplatiini aiheuttama apoptoosin ERCC1 matalan /mutantti

EGFR

PC9 solujen leimasi aikaa ja annosriippuvainen kasvoi kaspaasi 3/7 aktivointi, poly-ADP-riboosi-polymeraasi pilkkominen ja anneksiini V värjäystä.

18F-ICMT-11 sisäänotto siis nousevat jopa 14-kertaisesti 200 pM karboplatiinin verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin soluihin (

P

0,01). Sen sijaan, nekroosi oli vallitseva syöttämällä mekanismi ERCC1 korkea /paino

EGFR

A549-soluja, ja ei muutosta

18F-ICMT-11 oton havaittiin.

In vivo

, histologinen analyysi PC9 tuumoriksenograftien osoitti korkea pre-terapia kuolion. 4,6-kertainen lohkaistaan ​​kaspaasi 3/7 mitattiin kuin nekroottinen alueilla PC9 kasvaimia 48 h karboplatiinihoidon. Keskimääräinen PET-johdettu kasvaimen

18F-ICMT-11 otto oli herkkä muutoksille apoptoosin, kun läsnä on merkittävä ennestään kuolion. PET-pohjainen vokselifantomeita intensiteetin lajittelu kuitenkin tunnistettu sisäinen kasvaimia alueilla korkea

18F-ICMT-11 oton, joka mahdollistaa tarkan arvioinnin apoptoosin ja siksi hoidon vasteen. A549 kasvaimia, joista puuttui korkea pre-terapia nekroosi, karboplatiini indusoi kasvun esto, joka oli vain vähän liittyy apoptoosiin ja siten ole havaittavissa

18F-ICMT-11 PET.

Citation: Witney TH, Fortt RR , Aboagye EO (2014) Prekliiniset arviointi karboplatiinihoitoa Teho Lung Cancer by

18F-ICMT-11-positroniemissiotomografia. PLoS ONE 9 (3): e91694. doi: 10,1371 /journal.pone.0091694

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 20 joulukuu 2013; Hyväksytty: 12 helmikuu 2014; Julkaistu: 11 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Witney et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus näihin tuloksiin johtanut on saanut tukea Innovatiiviset lääkkeet -aloitetta (www.imi.europa.eu) avustussopimuksen numero 115151, resurssit jotka koostuvat rahoitustukea Euroopan unionin seitsemännen puiteohjelman (FP7 /2007-2013 ) ja EFPIA yritysten luontoissuorituksina osuuden. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on korkein syöpään liittyvää kuolleisuutta [1]. Adaptive satunnaistamisesta potilaiden eri hoitomuotoja perusteella koepala perillä kasvain profilointi korostaa mahdollinen hyöty biomarkkereita ennustamisessa hoitovasteen (BATTLE tutkimus [2]). Olemassaolo monipuolinen resistenssimekanismeja NSCLC lukien vetämänä

EGFR

,

ELM-ALK

, ja

AXL

(mutantti) geenituotteita kuitenkin tarkoittaa sitä, että etukäteen potilas ositus sillä hoito on ongelmallista [3]. Hoito voi johtaa nopeaan sukupuuttoon herkkien kloonien mutta yhtä aggressiivinen jatkokloonin laajentuminen johtaa ohimeneviä peruuttamista ja toistumisen [4]. Tässä yhteydessä useat resistenssimekanismeja joihin liittyy hallitsematonta apoptoosin kulkureittiä on tunnistettu [3]. Jossa on rajoitettu määrä ”elämää pidentää” hoitojen ja täysin ymmärretty lääkeresistenssimekanismien, on mahdollista, että varhainen arviointi tehosta voidaan sallia nopeammin kytkin vaihtoehtoisia hoitoja. On kuitenkin niukasti varhaisen tehon biomarkkereita. Mitä kuvantaminen teho biomarkkerit, tarkastelu Zhao ja työtoverit korostettu hyödyllisyyttä molekyylikuvantaminen kuten positroniemissiotomografia (PET) yhdistettynä anatomisia kuvantaminen, keinona arvioida tehoa solunäytteillä saavuttamattomissa vaurioita [5], ja ylivoimainen kliiniseen arvioinnin perusteella Response arviointiperusteet Solid Kasvaimet (RECIST) yksinään [6].

Yksi hyvin kuvatun reitin biomarkkerit sidoksissa sekä synnynnäisen ja hankitun resistenssin NSCLC on apoptoosireittiä [3]. Apoptoosi tai ohjelmoitu solukuolema, on olennainen prosessi tarvitaan kudoksen homeostaasiin, alkion kehitykseen poistamista vahingollisia solujen kehossa. Aikana tuumorigeneesiä mekanismeja, jotka säätelevät normaalia solun apoptoosin tulla vapautettu. Jotkut yleisimmin mutatoitunut geenien todettu syöpä, p53 ja Bcl-2, sanella jos /kun solut elävät tai kuolevat [7], [8]. Voittaa luontaisen kasvaimen kestävyys tavanomaisissa kuoleman ärsykkeiden, perinteisiä sytotoksisia, sädehoidon ja mekanismi hoidoissa on suunniteltu indusoimaan kasvainspesifisen apoptoottista solukuolemaa lukuisissa erilaisia ​​mekanismeja. Nämä erilaiset mekanismit lähentyvät aktivointi efektori kaspaasi, kaspaasi-3, suorituksen aikana vaiheen apoptoottisen solukuoleman, myöhempien sitoutuminen DNA hajoaminen, jakautuminen solun tukirangan, kalvo kupliminen, muodostumista apoptoottisten kappaleiden ja pariston poistamisesta immuunijärjestelmä [9].

Veri biomarkkerit solukuoleman on tutkittu keuhkosyövän kautta mittaus liukoisen kaspaasin lohkaista sytokeratiini 18 tuotetta M30 [10], vaikka tätä menetelmää ei saa tietoa heterogeeninen vaurioidenvastemäärät eikä se pystyy erottamaan kasvaimen vasteen ja normaalin kudoksen myrkyllisyys. Koska lähes yleisesti esiintyminen kaspaasi 3/7 aktivaation ohjelmoidun solukuoleman, sen havaitsemisen kuvantamisen voisi olla lupaava biomarkkereiden hoidon tehoa. Olemme viime aikoina kehittänyt kaspaasi-3/7-spesifinen koetin,

18F – (

S

) -1 – ((1- (2-fluorietyyli) -1 H- [1], [2] [3] triatsol-4-yyli) metyyli) -5- (2 (2,4-difluorophenoxymethyl) pyrrolidiini-1-sulfonyyli) isatiinia (

18F-ICMT-11), että

in vivo

kuvantaminen hoidon aiheuttaman kasvaimen apoptoosin.

18F-ICMT-11 on osoitettu meille ja muita olemaan herkkä mitta sekä perinteisiä sytotoksisen aiheuttamaa solukuolemaa [11] – [13], ja kasvaimen apoptoosin hoidon jälkeen pienimolekyylinen kaspaasi aktivaattori [11] . Automatisoitu, helppo radioleimaamiseksi

18F-ICMT-11 GMP standardien on kuvattu [14], jossa on ensimmäinen-in-man tutkimuksen perusteella suotuisa dosimetriasta profile [15]. NSCLC voi esittää niin monimutkainen vaurio kuten esi-terapia nekroottista komponentit; yksityiskohtainen arviointi spesifisyyden

18F-ICMT-11 kohti apoptoottista solukuolemaa verrattuna hoidon aiheuttama nekroosi ei ole aikaisemmin raportoitu. Tässä artikkelissa esittelemme uusi strategia havaitsemiseksi hoidon tehon kanssa

18F-ICMT-11 PET prekliinisissä malleissa NSCLC vaihtelevalla vastauksia karboplatiinin, jotka liittyvät ainutlaatuinen geneettinen ennalta tekijöihin vasteen.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

PC9 ja A549-solut olivat LGC Standards (Teddington, Middlesex, UK). PC9 soluja pidettiin RPMI 1640-alustassa, jossa A549s kasvatettiin DMEM: ssä. Molemmat väliaineet täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, 100 U.mL-1 penisilliinillä ja 100 μg.mL-1 streptomysiiniä (Invitrogen, Paisley, Refrewshire, UK), ja soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Solukuolema indusoitiin lisäämällä karboplatiinin (Accord Healthcare Ltd, Middlesex, Iso-Britannia, 0-200 uM).

Growth Inhibition Assay

Drug pitoisuudet, jotka estivät 50% solujen kasvun ( GC

50) määritettiin käyttäen Sulphordamine B (SRB) -tekniikkaa, kuten on kuvattu muualla [16]. Kaikkia solulinjoja käsiteltiin 72 h, 24 h ymppäämisestä, ellei toisin mainita.

Virtaussytometrinen mittaukset Cell Death

Solut trypsinoitiin (0,25% trypsiiniä, 1 mM EDTA) ja korjattu sentrifugoimalla (1300 g, 3 min). Irrotettuja soluja läsnä tiedotusvälineissä ennen trypsinointi säilytettiin ja yhdistettiin kanssa trypsinoitiin soluihin. Solupelletit (1 x 10

6 solua) pestiin jääkylmässä HEPES-puskuroidulla suolaliuoksella (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl

2, pH 7,4) ja suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan samaa puskuri. Anneksiini V, Alexa Fluor 488 (Invitrogen), lisättiin (5 ul /100 ui solususpensiota) yhdessä 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, 20 μg.mL

1; Invitrogen), ennen inkuboimalla 10 min 20 ° C: ssa. Tuloksena saatu seos pestiin kerran, pidetään lyhyesti jäällä, ja analysoidaan sitten LSRII Cytometer (BD Biosciences, Rockville, MD), jossa 20000-solujen laskettiin tapahtumaa kohti. Jäljellä solu roskat, jonka tunnuksena on eteenpäin (FS) ja puoli valonsironta (SS) profiilit, jätettiin pois analyysin selektiivisellä gating.

Western blotit

polyADP-riboosi-polymeraasi (PARP) ja kaspaasi-3 lohkaisu arvioitiin tavallisella western blotting protokolla [17]. Kalvot tutkittiin koettimella käyttämällä polyklonaalista kanin anti-PARP1 vasta-ainetta (Abcam, Cambridge, Cambridgeshire, UK; 1:1000), kanin monoklonaalista ERCC1 vasta-ainetta (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA, 1:1000) ja polyklonaalisella kanin anti-lohkaista kaspaasi-3-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology, 1:1000). Kanin anti-aktiini-vasta-aineen (Sigma-Aldrich Co., Ltd; 1:2000) käytettiin latauskontrollina. Blotit skannattu (Bio-Rad GS-800 Calibrated densitometri, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja signaali kvantifiointi suoritettiin densitometrialla käyttämällä skannaus analyysin ohjelmisto (Määrä Yksi; Bio-Rad).

18F-ICMT-11 Radiosynthesis

18F-ICMT-11 synteesi ja radioleimaamista suoritettiin aiemmin kuvattu menetelmiä [14]. Radiokemiallinen puhtaus oli 98% lopussa synteesi, jonka spesifinen aktiivisuus on 35,1 ± 7,9 GBq /umol (

n

= 8).

In vitro

18F-ICMT-11 Cell otto

Solut (1 x 10

5) maljattiin 6-kuoppaisille levyille yön ennen käsittelyä (ajoneuvo /karboplatiini). Päivänä kokeen, tuoretta kasvualustaa, joka sisälsi 0,74 MBq

18F-ICMT-11 lisättiin yksittäisiin kaivoihin. Sisäänoton soluun mitattiin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 60 min. Seuraavaksi soluja käsiteltiin trypsiinillä (0,25% trypsiiniä, 1 mM EDTA) ja kerättiin sentrifugoimalla (1300 g, 3 min). Irrotettuja soluja läsnä tiedotusvälineissä ennen trypsinointi säilytettiin ja yhdistettiin kanssa trypsinoitiin soluihin. Solut pestiin 3 kertaa jääkylmällä PBS: llä (1 ml, 1300 g, 3 min), 20 ui myöhemmin ottanut kaspaasi-3/7 aktiivisuuden arviointi (katso alla), ennen pelletöintiä jäljellä solujen ja lyysi RIPA puskuri (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA; 1 ml, 10 min). Solulysaatti siirrettiin laskenta putkiin ja rappeutuminen korjattu radioaktiivisuus määritettiin gammalaskurilla (Cobra II Auto-Gamma laskuri, Packard Biosciences Co, Pangbourne, UK). Alikvootit snap-jäädytetty ja joita käytetään proteiinin määrittämiseen seuraavista radioaktiivinen hajoaminen käyttäen BCA 96-kuoppaisen levyn määritystä (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA). Data ilmaistiin prosenttia koko radioaktiivisuuden per mg proteiinia, kalibroitu käyttäen 10 ui standardeja 0,74 MBq /ml,

18F-ICMT-11-kantaliuosta.

kaspaasi-3/7 Activity Assay

kaspaasi-3/7 aktiivisuus määritettiin käyttäen Promega: n kaspaasi-3/7 mukainen määritys valmistajan ohjeiden (Promega, Madison, WI, USA). Soluja inkuboitiin 1 tunnin ajan kaspaasi-Glo-reagenssia, ja entsymaattinen aktiivisuus kaspaasi 3/7 mitattiin käyttämällä TopCount NXT mikrolevyn luminesenssilaskuria (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) ja normalisoitiin proteiinipitoisuuden (BCA). Tiedot ilmaistiin taitettava kasvu kaspaasi-3: n aktiivisuuden päälle ajoneuvon hallinnan soluja.

In vivo

Kasvainten mallit

Kaikki eläinkokeet suoritettiin lisensoitu tutkijat mukaisesti Yhdistyneen kuningaskunnan Home Office ohjeita toiminta Animal (Scientific Procedures) Act 1986 nojalla projekti lisenssin 70/7177, ja sisällä julkaistujen ohjeiden hyvinvoinnin ja eläinten käyttöä syöpätutkimuksessa [18]. Syöpäsolut (2 x 10

6 ja 5 x 10

6 PC9 ja A549, vastaavasti) injektoitiin subkutaanisesti takana BALB /c-nude-hiiriin (iältään 6-8 viikkoa, Charles River), jossa eläinten vehikkeliä tai karboplatiini kun ksenografteista saavutti -100 mm

3 (katso alla hoitoaikataulun). Kasvaimen mitat mitattiin määräajoin käyttämällä tulkki ja kasvainten tilavuudet laskettiin kaavalla: tilavuus = (π /6) x a × b x c, missä a, b ja c esittävät kolmea kohtisuoraa akselia kasvain.

PET kuvantamistutkimukset

Dynaaminen

18F-ICMT-11 kuvantamisen skannaukset suoritettiin omistettu pieni eläin PET-kamera (Siemens Inveon PET moduuli, Siemens Medical Solutions USA, Inc.) jälkeen bolus

iv

injektio ~3.7 MBq merkkiaine kasvainta kantavissa hiirissä [19]. Dynaaminen skannaa hankittiin luettelotilassa formaatissa yli 60 min. Hankitut tiedot sen jälkeen lajiteltiin 0,5 mm Sinogrammi roskakorit ja 19 aikataulut kuvan muodostamiseen (4 x 15 s, 4 x 60 s, ja 11 x 300 s), joka tehtiin iteratiivinen jälleenrakennus (2D-OSEM). Siemens Inveon Research työpaikka ohjelmistoa käytettiin visualisoinnin radiomerkkiaineen sisäänottoa kasvain; 30-60 min kumulatiivinen kuvia dynaamista tietoa käytettiin määrittämään 3-ulotteinen (3D) kiinnostavat alueet (ROI). Laskenta tiheydet laskettiin keskiarvo kaikille ROI kunakin ajankohtana, jotta saadaan aikaan verrattuna radioaktiivisuuden käyrän (TAC). Kasvaimen TAC normalisoitiin pistetään annos, mitattuna VDC-304 annoskalibraattorilla (Veenstra Instruments), ja ilmaistaan ​​prosentteina injektoidusta annoksesta per ml kudosta käyttäen kalibrointikerroin määritetty Inveon PET-kamera. Sillä kuva visualisointi, 3D-OSEM jälleenrakennus tehtiin ja esitettiin tiivistää 30-60 min kehyksiä.

In vivo

Carboplatin hoidon ajankohdat

hoito-vasteen tutkimuksissa hiirillä jossa koko haun noin 100 mm

3 ksenograftikasvaimissa käsiteltiin ip joko vehikkelillä (suolaliuos; 0,012 ml /g kehon painoa) tai karboplatiini (Accord Healthcare Ltd .; 120 mg /kg; 0,012 ml /g kehon paino). 24 h injektion jälkeen, karboplatiinia saaneilla ja ajoneuvon hallinnan hiiriä kuvantaa

18F-ICMT-11 PET. Toinen ryhmä hiiriä sai kaksi annosta joko ajoneuvon tai karboplatiini, toisen injektion annettuna 24 tunnin kuluttua ensimmäisestä annoksesta. Nämä hiiret myöhemmin kuvantaa

18F-ICMT-11 PET 48 h kuluttua ensimmäisestä annoksesta.

PET-pohjainen Voxel Intensity lajittelu pylväskaavioista

intensiteetit kaikista voxels sisällä kasvain ROI laskettiin ja lajitellaan kohti niiden intensiteetti taajuuden antaa PET-pohjainen vokselifantomeita intensiteetin lajittelu (PVIS) histogrammien [11]. Kunkin ROI, kaikki vokseleiden, 30-60 minuutin kuluttua radiomerkkiaineen lisäksi ja niihin liittyvän intensiteetin poimittiin (-300 vokseleiden per ROI). Vokselifantomeita intensiteetit jakaumat käsitellään edelleen tilastollinen analyysi (Prism v5.0 ohjelmisto, GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Sisällä kapea apoptoosin nähneet, me mielivaltainen valittu 95

persentiilin cut-off biologisesti kuvaamaan 5% korkein intensiteetti voxels-todennäköisesti sisältää apoptoottisia soluja – kuin esimerkiksi perusteella vastaanotin toimii ominaisuuden analyysi.

aktiivinen kaspaasi-3 ja TUNEL immunohistokemia Pitoisuus

jälkeen PET kuvantamistutkimukset, kasvaimen kudokset leikattiin irti, kiinnitettiin formaliiniin, upotettiin parafiiniin, leikattiin (5 um viipaletta) ja käsitellään aktiivisen kaspaasi-3: n ja DNA hajoaminen terminaalin deoksinukleotidyylitransferaasin dUTP nick end merkinnät (TUNEL) loisteputki detektiomäärityksiä käyttäen halkaistut kaspaasi-3 (Asp 175) monoklonaalinen vasta-aine (Cell Signaling Technology) yhdistettynä Alexa Fluor 594 vuohen anti-kani (Invitrogen) ja In situ Cell Death Detection Kit (Roche), tässä järjestyksessä. Pidentää Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää liuosta (Invitrogen), joka sisälsi 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) lisättiin kudosleikkeiden ennen asennusta peitinlasit. TUNEL-määritys suoritettiin valmistajan ohjeiden, kaspaasi-3-värjäys suoritettiin [11], [13]. Alternate leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Online Resource 1) ja on paino

EGFR

. Solukuolema indusoitiin

in vitro

in PC9 ja A549 ihmisen NSCLC-solujen seuraavat karboplatiinihoitoa (0-200 uM). Annoksesta riippuvaa kasvun estämistä arvioitiin 72 tuntia jälkikäsittely sulforodamiini B määritys (SRB) osoitti puolet maksimaalisesta kasvun estäminen (GC

50) 71,6 ± 9,5 uM ja 136 ± 31,6 uM PC9 ja A549 vastaavasti (

n

= 3, Fig. 1A). Apoptoottista solukuolemaa arvioitiin western blottauksella. Tasot katkaistun kaspaasi-3 ja pilkkominen sen alavirtaan alustan, PARP, osoitti annokseen liittyvää in PC9 soluissa, kun taas mitään muutoksia ei havaittu A549 (Fig. 1 B). Virtaussytometriset mittaukset vahvistivat apoptoottisen mekanismi solukuoleman PC9s (Fig. 1 C), jossa kuolion ensisijainen mekanismi kuoleman A549s (Fig. 1 D).

Karboplatiini aiheuttama kasvun inhibitio PC9 ja A549 solut käyttäen sulforodamiini B määritys 72 tunnin kuluttua hoidon. B: Western blot analyysi tasojen lohkaisemattoman PARP, halkaistut PARP ja halkaistut (aktiivinen) kaspaasi 3 72 tunnin kuluttua karboplatiinihoitoa (0-200 uM) in PC9 ja A549-soluja. Aktiini käytettiin latauskontrollina. C, D: Virtaussytometrinen analyysi PC9 (C) ja A549-soluja (D), joita hoidettiin karboplatiinin (100 uM) tai vehikkeliä. Apoptoottisia soluja tunnistettiin anneksiini V-Alexafluor488 (λ Ex /Em = 495/519 nm) ja nekroottinen soluissa 7-AAD (λ Ex /Em = 546/647 nm). Väestön Q4 edustaa eläviä soluja, kun taas väestö Q3 edustaa apoptoottisia soluja, jotka on alhainen 7-AAD fluoresenssi ja tahra anneksiini V väestön Q2 edustaa toissijaisen apoptoottisten /nekroottisia soluja.

18F-ICMT- 11 Cell otto korreloi kaspaasi-3 aktivointi

in vitro

Annoksesta riippuvia muutoksia.

Carboplatin-solukuolema alun perin arvioitiin

18F-ICMT- 11

in vitro

(Fig. 2A). Karboplatiini hoito PC9 solujen johti annoksesta riippuvalla kaspaasi-3/7 aktiivisuus (kaspaasi-Glo määritys, Fig. 2B), jopa 87 ± 19-kertaisesti 200 pM (

P

= 0,001

n

= 3). Nämä tiedot tukee lisäksi saatujen tulosten western blot ja virtaussytometria (Fig. 1 B ja C). Muutokset kaspaasi-3/7-aktiivisuus ei ole havaittu A549 samanlaisilla lääkekonsentraatioilla (Fig. 2B).

V: kemiallinen rakenne

18F-ICMT-11. B: Annoksesta riippuvat muutokset kaspaasi 3/7 seuranneesta karboplatiinihoitoa. C: Annoksesta riippuvat muutokset

18F-ICMT-11 oton soluissa karboplatiinihoitoa. D välinen korrelaatio kaspaasi 3: n aktiivisuuden ja

18F-ICMT-11 oton PC9 soluissa.

lisäys 0,74 MBq (20 pCi)

18F-ICMT-11 soluihin 72 tuntia karboplatiinihoitoa (0-200 uM) johti havaittavissa ja kerääntyvä merkkiaine seuraavaa 1 h pulssi-Chase merkkiaine. Nostamalla soluunottokokeissa, verrannollinen karboplatiinin annosta mitattiin PC9 soluissa; saavuttaa tilastollista merkittävyyttä 100 uM, kasvoi 28,8% ± 6,7% radioaktiivisuudesta /mg proteiinia ajoneuvon käsiteltyjen säätimet 414,4% ± 20,1% radioaktiivisuudesta /mg proteiinia 200 uM (

n

= 3; P 0,01 ), joka on 14,4-kertainen (Fig. 2C). Oli erinomainen korrelaatio solun kaspaasi-3/7-aktiivisuus ja

18F-ICMT-11 oton tämän linjan (Fig. 2D; R

2 = 0,954). Mitään merkittävää muutosta

18F-ICMT-11 sisäänotto havaittiin A549 lisäyksen jälkeen karboplatiinin (Fig. 2C).

Aika aikana apoptoottisen solukuoleman.

Aika tietysti apoptoottisen solukuoleman arvioitiin edelleen 50 uM karboplatiini, annos lähellä GC

50 PC9 soluja (Fig. 1A). Puhkeamista apoptoosin PC9s oli havaittavissa 48 tuntia käsittelyn jälkeen, mitattiin 7,8 ± 4,6-kertainen kaspaasi-3/7 aktiivisuus (

P

= 0,03;

n

= 4 ; Fig. 3A), jossa kaspaasi-3 ja PARP pilkkominen myös selvää, western blot (Fig. 3B (ii)). Ajallinen lisääntyminen lohkaistaan ​​kaspaasi-3 havaittiin jopa 96 tunnin kuluttua hoidon PC9 soluissa oli kuitenkin väheneminen kaspaasi-3: n aktiivisuuden välillä 72 h ja 96 h, laski 19,1 ± 3,4-kertaisesti 11,1 ± 0,8-kertainen kasvaa yli lähtötason, vastaavasti (

n

= 4;

P

= 0,036). Suuruus apoptoottinen vaste oli 7,9-kertaa pienempi soluja käsiteltiin 50 uM 96 tuntia verrattuna pitoisuuteen 200 uM samana ajankohtana.

18F-ICMT-11 solunsisäisen kertymisen peilattu ajallinen lisäys katkaistun kaspaasi-3: tässä solulinjassa (Fig. 3B, C), nousee 15,8% ± 4,2% radioaktiivisuudesta /mg proteiinia 64% ± 8,1% radioaktiivisuudesta /mg proteiinia soluissa käsiteltiin 50 uM 96 tuntia verrattuna käsittelemättömän verrokin soluihin (

P

= 0,009). Huolimatta erinomainen korrelaatio solujen halkaistut kaspaasi-3 ja

18F-ICMT-11 oton tässä solulinjassa, korrelaatio

18F-ICMT-11 oton ja kaspaasi-3/7-aktiivisuus oli vähemmän hyvin määritelty (Fig. 3d R

2 = 0,3314). Vaikka havaitseminen heikkoa vyöhykettä, joka vastaa pilkotaan kaspaasi-3 ja PARP A549-soluja käsiteltiin joko 48 h tai 72 h (Fig. 3B (ii)), ei ollut kasvua havaittavissa kaspaasi-3/7 aktiivisuus (Fig. 3A) . Samanaikaisesti, ei ollut merkittävää muutosta

18F-ICMT-11 yli kokonaisuudessaan tämän ajan myötä (Kuva. 3C).

V: Aika kurssi muutosten kaspaasi 3/7 seuranneesta karboplatiinin hoitoon. B: Western blot -analyysi tasojen katkaisemattomasta PARP, pilkottiin PARP ja pilkotaan (aktiivinen) kaspaasi 3 post 50 uM karboplatiinihoitoa (0-96 h) PC9 (i) ja A549-solut (ii). C: Ajallinen muutokset

18F-ICMT-11 oton soluissa karboplatiinihoitoa. D välinen korrelaatio kaspaasi 3: n aktiivisuuden ja

18F-ICMT-11 oton PC9 soluissa.

18F-ICMT-11 voi erottaa apoptoottiset alkaen Necrotic Cell Death

in vivo

ajalliset muutokset hoitovastetta.

PC9 ja A549 kasvaimia kasvatettiin ksenografteja, jossa calliper mittaukset kasvaimen koon jälkeen mitattu ajoneuvo, 24 tunnin ja 48 tunnin karboplatiinihoitoa (120 mg /kg ip päivittäin) ja lähtötilanteeseen verrattuna. Sekä kasvaimet, karboplatiinihoitoa johti kasvun pysähtymisen. Sillä PC9 kasvaimia, merkittävä ero kasvaimen tilavuus mitattiin 48 tunnin kuluttua karboplatiinihoitoa verrattuna ajoneuvon hallintalaitteita, joka nousi 143 ± 18% lähtötasosta tilavuus, karboplatiinin saaneilla kasvaimia pysyi 96 ± 13% lähtötasosta volyymi (

P

= 0,013;

n

= 4; Fig. 4A). Merkittävä viivästyminen kasvaimen kasvua mitattiin sekä 24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua karboplatiinihoitoa A549 kasvaimissa verrattuna ajoneuvon hallintalaitteita (Kuva. 4B); myöhempinä ajankohtina ei mitattu.

A, B: Kasvaimen tilavuutta kirjannut calliper mittaukset PC9 (A) ja A549 kasvaimet (B) ennen ja jälkeen karboplatiinihoitoa kuten. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD% tilavuudesta verrattuna lähtötilanteeseen (

n

= 4). *,

P

0,05; **,

P

0,01. C, D: Havainnollinen aksiaalinen PET-CT-kuvia (30-60 min summataan aktiivisuus) varten PC9 (C) ja A549 (D) kasvaimia. Kasvain marginaalit merkitty CT kuva, on esitetty punaisella. Keskiarvo ± SD (

n

= 4-6 eläintä ryhmää kohti). E, F: kasvain TAC edustavat keskiarvo laskee dynaamisesta 60 minuutin skannata PC9 (E) ja A549 ksenograftit (F) seuraavat karboplatiinihoitoa (ajoneuvon, 24 h tai 48 h karboplatiini käsitelty;

n =

4-6 eläintä ryhmää kohti).

seuraava arvioitiin

18F-ICMT-11 on herkkä markkeri kasvainsolukuoleman

in vivo

. Kasvaimeen liittyneitä

18F-ICMT-11 radioaktiivisuus määritettiin dynaamisella 60 minuutin PET kuvantaminen. Edustaja aksiaalinen esittäviä kuvia kasvaimeen liittyvien

18F-ICMT-11 on esitetty kuvioissa 4C ja 4D PC9 ja A549 kasvaimia, vastaavasti. 3D kiinnostavat alueet määriteltiin sekä PC9 ja A549 kasvaimia, joissa keskimääräinen määrä käytetään, jotta saataisiin aikaan verrattuna radioaktiivisuus käyrän (ROI, Fig. 4E ja 4F vastaavasti). Sekä tuumorilinjoja, ei ollut merkitsevää eroa keskimäärin kasvaimeen liittyvien

18F-ICMT-11 radioaktiivisuus 24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua karboplatiinihoitoa verrattuna ajoneuvon hallintalaitteita määrittelemä ala TAC (30-60 min) tai normalisoidut oton arvot 60 min jälkeisen radiomerkkiaineen injektion (% ID /ml

60).

confounds kasvaimen epäyhtenäisyys.

Aksiaaliset kuvia 30-60 min tiivisti aktiivisuus paljastui heterogeeninen kuvio

18F-ICMT-11 jakelun PC9 kasvaimia (Fig. 4C), kun taas A549 radioaktiivisuus oli homogeeninen sen jakelun (Fig. 4D). Vaikka osittainen tilavuus vaikutus voi edistää tätä ilmeistä heterogeenisyys, vokselilta-viisasta analyysi PET tietojen PVIS (30-60 min) vahvisti epätasaisen jakautuminen

18F-ICMT-11 kasvain radioaktiivisuus (Fig. 5A ja 5B for PC9 ja A549 vastaavasti). Sillä PC9s, oli selvä muutos PVIS histogrammit yli 48 tunnin ajan kulku, jossa on 1,5-kertainen ryhmässä keskimääräinen lisäys lukumäärän voxels suurella intensiteetillä PC9 kasvain ROI karboplatiinin ruiskutetaan hiirten verrattuna ajoneuvon, kuten kuvata 95

persentiili (

P

= 0,01; Fig. 5C). Ei merkittävää eroa vokselifantomeita voimakkuudet tai jakeluun havaittu A549 kasvainten hoitojakson ajan myötä (Kuva. 5D).

intensiteetit kaikista voxels sisällä kasvain ROI laskettiin ja ilmaistiin histogrammit normalisoitu vokselin intensiteetti versus määrä voxels. A, B: Tyypillinen tietoja kolmesta edustavien eläinten (ajoneuvon, 24 h tai 48 h karboplatiini-käsitelty) ja PC9 (A) ja A549 (B) on esitetty. C, D: tilastollinen vertailu 95

persentiilin vokselifantomeita intensiteettiä PC9 (C) ja A549 (D) suoritettiin käyttäen Prism v5.0 ohjelmistoa (GraphPad). Keskiarvo ± SD (

n

= 4-6 eläintä ryhmää kohti). *,

P

0,05; **,

P

0,01.

H 3,5% ± 0,70% lohkaista kaspaasi-3 värjäys mitattiin 48 tunnin kuluttua hoidon, huomattavasti korkeampi kuin ajoneuvon hallintalaitteita (4,6-kertainen lisäys;

P

= 0,0003; Fig. 6B). Verrattuna apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään PC9 kasvaimia, TUNEL värjäys oli 3,5 kertaa suurempi 24 tunnin kuluttua hoidon, nousten 0,49% ± 0,17% värjäys 1,74% ± 0,17%, (

P

= 0,047; Kuva. 6C). Mitään merkittävää muutosta TUNEL värjäys mitattiin 48 tunnin kuluttua hoidon takia suuria vaihteluja satunnaisesti valitun FOVs. A549-kasvaimia, karboplatiini-hoito johti menetykseen soluihin, on määritelty H kasvoi 0,14% ± 0,05%: sta 0,87% ± 0,02% ajoneuvojen ja 24 h karboplatiinia saaneilla kasvaimia, vastaavasti (

P

= 0,0015; Fig. 6A 6C). Pieni nousu lohkaista kaspaasi-3 värjäys mitattiin 48 tunnin kuluttua karboplatiinihoitoa A549- kasvaimia, kasvoi 0,34% ± 0,07% ajoneuvojen saaneista kasvaimet 0,70 ± 0,13% (2-kertainen lisäys;

P

= 0.02; Fig. 6B).

Kasvainten kudokset poistettiin jälkeen PET kuvantamisen skannata, käsitellään histologista analyysiä ja värjättiin aktiivinen (pilkkoutuu) kaspaasi-3: n ja DNA pirstoutuminen (TUNEL määritys) tunnistus, yhdessä H 0,05; ***,

P

0,001.

n

= 3 tuumorisektioiden 5 random FOV per jakso. Valokuvat H V, elinkelpoinen.

Keskustelu

Platinum-pohjainen terapia on edelleen tehokkain hoito-pitkälle NSCLC kanssa hoitovasteen 15-30% vuonna valitsemattomat potilaista (mediaanielinajassa, 10- 12 kk) [23]. Useita mekanismeja on kuvattu korostaa synnynnäisen ja hankitun resistenssin platinapohjaisen hoidon, joihin liittyy muutoksia nukleotidin Leikkauskorjauksessa [21]. ERCC1 ilme on keskeinen rooli näissä DNA vaurioitunut välittämää korjaus reittejä [24]. Viime aikoina muita mekanismeja, joissa

EGFR

on kuvattu. Erityisesti, epistaattinen vuorovaikutukset FANCD2 ja mutantin

EGFR

solujen on osoitettu heikentävän homologisen rekombinaation korjaus ja herkistää solut platina-pohjainen terapia [20].