Krooninen sairaus

tiivistelmä

Neuroblastooma on yleisin ylimääräinen kallon kiinteä syöpä lapsuuden. Huolimatta kiihtyminen hoitoyhdistelmien, merkittävä vähemmistö potilaista kuolee heidän sairautensa. Disialoganglioside (GD2) on toistuvasti ilmaissut korkeilla-tasoilla neuroblastoomakasvainten, jotka on kohdistettu jonkin verran menestystä käyttämällä terapeuttisia monoklonaalisia vasta-aineita. GD2 on myös ilmaistu monia muita syövän mutta lukuun ottamatta joitakin ääreishermojen ei juuri esiinny ei-transformoitujen kudosten. Kimeeriset antigeenireseptoreita (CAR) ovat keinotekoisia tyypin I proteiineja, jotka ympätä spesifisyyden monoklonaalinen vasta-aine päälle T-solu. Kliiniset tiedot aikaisin automuotoilulla kohdistuvista GD2 ovat osoittaneet joitakin lupaus Neuroblastooma. Tässä kuvaamme GD2 kohdistamisen CAR retroviruksen kasetti, joka on optimoitu CAR T-solujen pysyvyys, teho ja turvallisuus.

Citation: Thomas S, Straathof K, Himoudi N, Anderson J, Pule M ( 2016) optimoidun GD2-kohdistaminen Retrovirusperäinen Kasetti voimakkaampi ja Safer Cellular Therapy of Neuroblastooma ja muiden syöpien. PLoS ONE 11 (3): e0152196. doi: 10,1371 /journal.pone.0152196

Editor: Sophia N. Karagiannis, Kings College London, Yhdistynyt kuningaskunta

vastaanotettu: 27 tammikuu 2016; Hyväksytty: 10 maaliskuu 2016; Julkaistu: 31 maaliskuu 2016

Copyright: © 2016 Thomas et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: tutkimuksen rahoittivat neuroblastooma Society nyt uudelleen merkitty ”neuroblastooma UK”. Tämä pieni hyväntekeväisyys edellyttäen apurahan £ 133000 vuonna 2005 projektin nimeltä ”Genetic Engineering of T-solujen Adoptive immunoterapiaa Neuroblastooma”. Martin Pule tukee Britannian NIHR Biomedical Research Centre ja Wellcome Trust. John Anderson tukee Great Ormond Street, Biomedical Research Centre ja Great Ormond Street Lasten Charity. Karin Straathof tukee Great Ormond Street, Biomedical Research Centre ja Wellcome Trust. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: MP on saanut sopimuksen tutkimusrahoitusta Cellectis. Hän omistaa varastosta ja vastaanottaa palkkaa panos Autolus Oy Hän on keksijä patenteista arkistoi UCLB ja on saanut ja voi saada rojalteja siitä. Hän on saanut palkkiot Rochen ja Amgen puhumiseen. JA ja ST omistaa kannan Autolos Ltd Ne ovat keksijöiden patenteista mukaan UCLB ja voi saada rojalteja siitä. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Neuroblastooma osuus on noin 15% syöpäkuolemista lapsilla [1]. Huolimatta merkittävä tehostaminen hoito, alle 40% korkean riskin potilaita ovat pitkäaikaisia ​​perhe, jossa kemoterapiaa ja sädehoitoa kestävyys ja myöhäinen pahenemisvaiheita on tunnusmerkki hoidon epäonnistumisen [2]. Disialoganglioside (GD2), pinta glykolipidi-antigeeni, joka on läsnä ja runsaina neuroblastoomasoluja, sekä ottaa syövän ekspressio useissa aikuisten ja lasten maligniteettien [3], on ihanteellinen kohde immunoterapialle [4]. Todellakin, anti-GD2 monoklonaalisia vasta kuuluu tällä hetkellä tavanomaista hoitoa korkean riskin neuroblastooma, ja niiden tehoa ja toksisuusprofiili on vakiintunut [3,5].

hallinto kasvain-spesifisten T-solujen (otto- immunoterapia) on osoittautunut tehokkaaksi syövän hoito Epstein Barrin virus-odotuksiin lymfoomat [6] ja melanooma [7] kanssa vastauksia vieviä resistenttejä. Kuitenkin, se ei ole ollut mahdollista tuottaa neuroblastooma-spesifisiä T-soluja käyttäen perinteisiä menetelmiä valinnan ja laajentamiseen. Kimeeriset Antigen reseptorit (CAR), voidaan rakentaa liittämällä yhden ketjun vaihtelevan alueen (scFv) peräisin monoklonaalisella vasta-aineella solunsisäisen signaloinnin verkkotunnuksia. GD2-kohdistaminen CAR näin ollen anna meille vaihtoehtoinen tapa tuottaa neuroblastooma spesifisten T-solujen geenitekniikan. GD2 CAR hoito voi johtaa parempaan vasteet mAb hoidon takia sitkeässä ja dynaaminen hylkääminen GD2 ilmentävä kasvain.

faasin I kliinisessä tutkimuksessa anti-GD2 CAR transdusoidut T-solujen uusiutunut suuri riski neuroblastoomapotilaista raportoitu jonkin verran tehoa [8]. Mahdollinen rajoitus, että tutkimus oli käytössä ensimmäisen sukupolven CAR, joka tarjoaa vain CD3ζ ITAM signaaleja, jotka voivat ovat johtaneet köyhien pysyvyys ja laajentamiseen. Yhä useammat kliiniset tiedot CD19 CAR B-solujen maligniteetteja sekä kaksinkertainen merkintä tutkimus [9] viittaavat siihen, että autot on muita kostimulatorisia signaaleja johtaa parempaan pysyvyys ja tehokkuus. Tässä kuvaamme pyrkimyksemme rakentaa tehokkaampi, mutta turvallinen GD2 kohdistamisen kasetin käytettäväksi vastaan ​​neuroblastooma, jossa käytetään aikaisemmin kuvatun kolmannen sukupolven endodomain [10]. Painopiste tässä työssä on optimointi jäljellä CAR arkkitehtuuria ja ilmentämiskasetin maksimaalisen tehon ja turvallisuuden.

CAR tutkittiin tutkimuksessa raportoineet Pule ym käytetään scFv johdettu 14-18 mAb joka kimeeriseen muodossa on parhaillaan säännöllinen kliinisessä käytössä. Siksi olemme käyttäneet kohdistaminen domain eri anti-GD2 mAb perheen välttää anti-idiotyyppisiä hylkäämistä /aktivaatio CAR T-soluja. Voit vähentää mahdollisuuksia hylkäämisestä, humanisoitu versio CAR testattiin, ja iteratiivinen optimointi CAR arkkitehtuurin suoritettiin. Anti-GD2 mAb hoito liittyy ääreishermostotoksisuus. Vaikka alkuperäisen GD2 CAR tutkimus ei ilmoita tästä [8], huoli viipyy kuin yhä voimakkaampi CAR tuodaan klinikalla. Tätä odotellessa mahdollisuus, teemme yhteistyötä ilmaisi CAR kanssa iCasp9 itsemurhan geeni [11] ja optimoitu bi-sistronista retroviruksen kasetti pitää koekspressoimalla ja johdonmukainen siirtogeenin ulostulo. Lopullinen rakenne on testattu in vivo. Olemme tuottaneet GD2 CAR kohdistaminen retrovirus- kasetti optimoitu tehokkuuden ja turvallisuuden.

Tulokset

CAR kanssa humanisoitu scFv antaa vastaava ilmaisu ja lisääntynyt sytokiinien vapautumista ja T-solujen laajentamiseen

KM8138 on täysin humanisoidun anti-GD2 monoklonaalinen vasta-aine muodostettiin oksastamalla epitooppia sitovat komplementaarisuuden määräävät alueet (CDR: t) hiiren anti-GD2-vasta-ainetta KM666 päälle yhteensopiva ihmisen V

H ja V

L runkoalueita [12]. Tuloksena ihmisen scFv sekvenssi eroaa hiiren 31 jäämiä puitteissa ulkopuolella olevien alueiden CDR. Hiiren vasta-aineen 14.18 johdettu scFv käytetty aikaisemmin kuvatulla GD2 CAR voi olla kohde immuunihyljinnästä johtuen joko anti-idiotyyppiset (koska terapeuttista mAb nykyisessä kliinisessä käytössä ovat peräisin samasta kloonista), tai anti-hiiri-vasta-aineita. Siksi on johdettu CAR, joka perustuu humanisoidun KM8138 vasta-aine [12]. Määrittääkseen seurauksista käyttämällä humanisoidun scFv, myös syntyy CAR johdettu vanhempien hiiren vasta-aineen näin me syntyy parin anti-GD2 CAR identtisiä lukuun ottamatta niiden scFv: itä, jotka olivat peräisin hiiren anti-GD2-mAb KM666, tai sen humanisoitu vastine KM8138 [12]. Autojen oli ihmisen IgG1 sarana-Fc välilevyt, CD28 transmembraanidomeeni ja CD28-OX40-Zeta endodomain (kuvio 1A). Aluksi me vertasi ilmentymistä ja toimintaa tämän humanisoidun CAR (HuK666) sen vastinetta hiiressä (MuK666). Normaali luovuttaja ihmisen T-solut transdusoitiin yhtä tiitterit retrovirusvektorisuperna- koodaus kunkin reseptorin. Ilmentymiseen pinnassa kunkin CAR määritettiin virtaussytometrialla polyklonaalisella anti-Fc oli samanlainen (kuvio 1B). Mean fluoresenssin intensiteetti (MFI) transdusoitujen T-solut eivät eroa humanisoidut ja hiiren CAR. Transdusoidut T-solut olivat 4 tunnin krominvapautusmäärityksestä CD56-köyhdytettyä T-soluja, jotka ilmentävät joko CAR osoittivat samantapaiset tappaminen GD2 kantavien Lan-1 neuroblastoomasolulinjasta ja vastaava puuttuminen tehoaa A204 luusarkoomasolulinjassa josta puuttuu lauseke of GD2. Kumpikaan ei-transdusoituja T-solujen (NT) tai T-solut transdusoitiin irrelevantilla CAR suunnattu CD19 näytetään mitään sytotoksisuutta joko solulinja (kuvio 1 C) Molemmat reseptorit kykenivät stimuloimaan transdusoidut T-solujen kuoppiin eritystä IL2 ja IFN-g vastauksena LAN1 muttei A204 (kuvio 1 D). Ei ollut merkitsevää eroa huK666 ja muK666 autojen lisääntymistä (kuvio 1 D), interferoni γ julkaisu (kuvio 1 E), tai interleukiini 2 (IL-2) vapautumista (kuvio 1 F), vaikka oli merkityksetön suuntaus kaikki kolme kohti tehostettua funktio huK666 CAR.

(a) vertailu aminohapposekvenssien huK666 ja muK666 scFv: tä verrataan. Komplementaarisuuden määräävät alueet näkyvät punaisella. Kytkijäsekvenssi näkyy vihreällä. Oikeassa, arkkitehtuurit autoista tuotettu alkuperäisen vertailun huK666 kanssa muK666. Molemmat eroavat vain scFv: t käytetty on joko alkuperäinen hiiren muK666 sekvenssit, tai humanisoitu (CDR oksastettu) huK666. Muuten CAR käsittävät ihmisen IgG1 sarana-CH2-CH3 spacer, TM verkkotunnuksen johdettu CD28 ja yhdisteestä endodomain koostuu välisiä fuusioita endodomains CD28, OX40 ja CD3-Zeta. (B) vakaus muK666 vs huK666 CAR. T-soluja 5 luovuttajista transdusoitiin yhtä tiitterit retrovirussupernatanttia koodaavan muK666 tai huK666 CAR. CAR ekspressio havaittiin anti-ihmisen-Fc-polyklonaalisia vasta-aineita. MFI oli sama molemmissa konstruktioita. Edustava esimerkki näytetään NT (vihreä), muK666 (sininen) ja huK666 (punainen) histogrammit päällekkäin. Nämä CAR T-solut altistettiin LAN-1 (a neuroblastoomasolulinjasta ilmentävien GD2) ja A204 (rabdomyosarkoomasta solulinja, joka on GD2: negatiivinen). Sytotoksisuus on esitetty (c), proliferaation päivänä 7 on esitetty (d), IFN-γ in (e) ja IL-2 vapautumista (f). Tiedot osoitetaan keskiarvoina +/- SEM 6 itsenäinen kokeiluja eri luovuttajilta.

Spacer käsittää IgG1 Fc domain tuloksia optimaalisen tappaminen ja sytokiinien vapautumista

CAR-toiminto voidaan vaikuttaa spacer verkkotunnuksen valinta [13-15]. Lisäksi huK666-pohjainen CAR edellä on kuvattu, joka sisältää ihmisen IgG1: n sarana-, CH2-CH3-domeeni, kuten välike, me syntyy ylimääräisiä huK666 CAR variantit, joissa välialueen koostui saranan yksin, sarana on kiinnitetty varsi CD8a tai CD8a varsi yksinään (kuvio 2A). Valinta näiden välilevyjen perustui koon huomioon, jossa IgG1 sarana-alone ollessa lyhyt välike, CD8 varsi väli- ja IgG1 Fc ollessa pitkä välike. Olemme myös oletettu, että CD8 varsi ei saa riittävästi niveltää scFv ja siten me syntyy ylimääräinen variantti IgG1 sarana liitetty CD8 varsi. Jotta helppo havaita CAR, me tagged huK666 kanssa aminoterminaalisen HA-tag, väliin signaali-peptidin ja VH. Edelleen, valvoa vaihteluiden vektori ilmaisua, me kloonattu että jalka-ja sorkkatauti 2A järjestyksessä TAV (2ATaV) lukukehyksessä karboksyylipäätä CAR, joka puolestaan ​​kloonattiin lukukehykseen katkaistu CD34 (dCD34ngg). Voisimme siis havaita CAR ilmaisun suhteessa vektorin ilmentymisen värjäämällä HA ja anti-CD34.

Useita huK666 CAR kloonattiin identtisellä muotoon, jolloin scFv koodattu HA-tag, ja auto oli co -expressed katkaistun FMD-2A sekvenssin typistetyn CD34. Ilmentämiskasetin esitetään (a) ja sarjakuvia näistä muodoista on esitetty (b). Co-ilmentyminen CAR (HA) ja CD34 markkerigeeni myös eri kasetteja. Neljä sarana alueita verrattiin kannalta sytotoksisuuden (c) (LAN1 = GD2 kohdemelanoomasoluille ja A204 = GD2 negatiivinen kohde), IFN-γ eritystä (d), IL-2 (e) ja kohde-erityisiä lisääntymistä (f). Data esitetään keskiarvoina +/- SEM 4 itsenäisestä kokeesta, joissa eri luovuttajilta.

Ensisijainen ihmisen T-solut transdusoitiin yhtä tiitteri supernatantti Näiden rakenteiden ja värjättiin anti-HA ja anti-CD34. Edustava virta-sytometrinen analyysi tämän värjäytymistä on esitetty kuviossa 2B. Sarana-CH2-CH3, sarana-vivun ja Varsi spacer CAR ilme olivat samanlaisia, kun taas sarana-alone spacer CAR johti pienentyneeseen HA värjäytymistä (kuvio 2B). Tämä saattaa johtua vähentyneestä vakautta tai vähentää pääsy HA-tag tässä muodossa. Funktionaaliset kokeet suoritettiin seuraavaksi, ja oli selviä eroja kyvyt välike varianttien välittäjäksi sytotoksisuus, sytokiinin vapautumista ja jakautumista vasteena Lan-1-soluissa. PBMC transdusoitu tahansa välikkeen variantin CAR näkyy sytotoksisuutta kohti Lan-1-solut; kuitenkin oli merkittäviä eroja tehoa riippuen välike. CAR ilmentävät CH2-CH3 spacer olivat merkitsevästi tehokkaampia kuin sarana /varsi (P = 0,009) ja saranan (p = 0,0003) vaikka suuntaus tehostetusti tappaminen verrattuna varsi oli ei-merkitsevä. Mikään välikappale variantti CAR välittämää mitään tappamisen GD2 negatiivisten A204-soluissa (kuvio 2C). Eroja havaittiin myös kyky muiden välike variantit stimuloivat IFN-γ tai IL-2 seuraava kulttuuri LAN1 soluihin. CH2CH3 spacer aiheutti johdonmukaisesti molemmat sytokiinien, ja oli huomattavasti parempi kuin sarana IFN-γ tuotantoon (p 0,003, kuvio 2D), ja huomattavasti parempi kuin sarana /varsi (p 0,03) ja sarana (p 0,006) IL -2 tuotanto (kuvio 2E). Lukuun ottamatta saranan variantin kaikki reseptorit näytti suhteen verrattavissa niiden kykyä stimuloida solujen jakautumista vasteena GD2-laakeri LAN1 huolimatta merkittävää vaihtelua rahoittajien (kuvio 2F). T-solut, jotka ilmentävät sarana-muunnos osoitti vähän havaittavaa lisääntymistä, mikä on sopusoinnussa heikentynyt tämän reseptorin välittää IL-2 release. Kaiken IgG Fc-alueen näytti olevan optimaalinen välilevy GD2 CAR ja käytimme tämän reseptorin muotoa myöhemmissä optimointeja.

Parannettu CAR toimintoa muuttaminen Spacer

normaalia toimintaa CH2 -CH3 alueen immunoglobuliinien Fc-alueen on sitoutumisen Fc-reseptoreihin on immuunijärjestelmän efektorisolujen. Ihmisen IgG1 CH2-CH3 spacer käytetty GD2 CAR on luonnollinen ligandi suuri affiniteetti FcyRI (CD64) ilmentyy synnynnäinen efektoreja kuten makrofagit ja monosyytit. Siksi on olemassa teoreettinen riski sitoutumisen CAR ilmentävien T-solujen kanssa ydinsoluissa sitomalla CD64 johtaa sekä armottoman myrkyllisyys myeloidisoluissa ja kulkeutuminen CAR T-solujen aiotun efektoritoiminto. Todellakin tämä ilmiö CAR sisältävien IgG1 CH2-CH3 välilevyt on aiemmin kuvattu [16,17]. Kriittinen aminohappoja IgG1 tunnustamista asuvat CH2 domain (PELLGG ja ISR motiiveja [18]), ja Hombachin ym ovat osoittaneet, että korvaaminen näiden keskeisten aminohappojen vastaavia aminohappoja IgG2 puitteissa CAR suunnittelu ei estävä vaikutus in vitro on CD30 kohdistaminen CAR, mutta estää armottoman lyysin CD64-ilmentävien THP1 soluihin [16]. Siksi mutatoitiin PELLGG ja ISR tähteet kohti lähestymistapaa Hombach et al (kuvio 3A) ja vastaavaksi osoitettu ilmaisun T-solut CAR mutatoidun (lyhennetty muotoon pvää) CAR (kuvio 3B). Pvää-mutatoitunut CAR säilyttänyt antigeenispesifisen efektoritoiminto vastaan ​​SupT1 solujen muokattu ilmentämään GD2 kirkkaita tasoilla (kuvio 3C). Vaikka pvää sisältävä CAR hajotettiin GD2 ilmentävien LAN1 soluja vastaavia tehokkuus villin tyypistä, pvää CAR oli alentanut merkittävästi armottoman sytolyysistä vastaan ​​CD64 ilmentäviä THP1 solujen (p = 0,0005 Kuva 3D). Samoin vaikka co-kulttuurin WT-CAR T-solujen THP1 solujen johti keskimääräisen havaittavissa IL1B supernatanttiin 886pg /ml, tämä laskettiin arvoihin, jotka eivät yllä tausta pvää sisältävien CAR (kuvio 3E). Näin ollen sisällyttämistä mutaatio estää sitoutumisen suuren affiniteetin FcyR vältetään armottoman myrkyllisyyttä GD2-CAR.

(a) aminohapposekvenssi villityypin (ylhäällä) ja mutatoidun (pvää) CH2 vastaavat alueet for FcyR sitova. (B) virtauksen värjäämällä anti-Fc-vasta-aine näyttää vertailukelpoista ilmentymisen taso reseptorin kanssa tai ilman pvää mutaatio. Samanlaista autoa kanssa ja ilman pvää verrattiin vierekkäin suhteen sytotoksisuutta GD2 suunniteltu SupT1 ja GD2 negatiivisia villityypin SipT1 soluja (c), sytotoksisuutta GD2 positiivisia LAN1 soluja ja FcRy positiivinen THP-1-solut (d), ja IL 1β julkistus kulttuuri THP-1-solut (e). Tiedot osoitetaan keskiarvoina +/- SEM 4 itsenäinen kokeiluja eri luovuttajilta.

optimointi koeskspressio itsemurhageenille

Vaikka tarjoaa tehokkaan potentiaali hoitoa syöpään, auto- T-solut on kyky toimia välittäjänä mahdollisesti kuolemaan johtavia haittavaikutuksia. GD2 kohdistaminen voi johtaa on-kohde off-kasvain myrkyllisyyden aiheuttamia keskus- ja ääreishermoston GD2 ilme. Keino valikoivasti poistaa CAR T-solujen edessä hyväksyttävää myrkyllisyyden on toivottavaa. Tämän saavuttamiseksi teemme yhteistyötä ilmaisi indusoituva kaspaasi 9 (iCasp9) itsemurhageenille [11]. Co-ilmentymä CAR ja iCasp9 käytti itselohkaisevan FMD-2A kaltainen sekvenssi TAV

13. Tämä saa aikaan ehdottoman 1: 1 koekspressoimalla CAR kanssa itsemurhan geenin. Koska retrovirus- ilmaisu johtaa normaalijakaumaa ilmaisun intensiteetin, yksi näkökohta on paeta matalan tason iCasp9 ilmentävät CAR T-soluja. Lisäksi korkea iCasp9 voi olla basaalisesti myrkyllisiä. Solut, jotka ilmentävät matalan tason iCasp9 selviävät itsemurha geeniaktivaatioon, joten pyrimme saavuttamaan homogeeninen kirkas ilmaus CAR ja iCasp9 huolimatta ylimääräisiä transkription taakka, että 1,5 kb iCasp lisää vektorin, ja osoittaa, että iCasp9 ollut basaalisesti myrkyttömiä saavutetaan ekspressiotasot. Muokkasimme vektorin ja avoimet lukukehykset seuraavasti: Vektori 3’LTR U3 muutettiin sisältämään kanan β-globiini chromatin eriste [19]. Teline kiinnitys alue ihmisen interferoni-β-geeni insertoitiin 3′-UTR [20] (kuvio 4A). Olemme myös luotu konstruktioita sekä muutoksin yhdessä mutta tiitterit olivat liian vähäistä ollakseen käyttökelpoista ja ei testattu vielä (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi koko avoin lukukehys oli kodonioptimoiduista. Lopuksi, sen varmistamiseksi, että iCasp9 ei aiheuttanut pohjapinta toksisuutta suurilla-ekspressiotasot olemme tuottaneet ei-toiminnallinen mutantti, jossa aktiivisen paikan kysteiini on mutatoitu seriiniksi (kuvio 4A). PBMC: t transdusoitiin yhtä tiitterit retrovirussupernatanttia kunkin reseptorin, ja ilmaisun seurattiin 72 tunnin transduktion jälkeen virtaussytometrialla. Keskimääräinen fluoresenssi-intensiteetti kunkin variantin fuusioituna ei-toiminnalliset iCasp9 on hieman suurempi kuin vastaava ei-optimoitu reseptori liittyy toiminnallinen iCasp9, mikä viittaa siihen, erittäin ilmentäviä soluja voidaan menettää johtuen sopimatonta, ei-spesifinen aktivointi iCasp9 (kuvio 4B ja 4C).

(a) Yhdeksän erilaista ekspressiokasettia verrattiin: Kolme erilaista retrovirusvektorit kertyi-villityypin SFG, SFG kanssa rakennustelineet-kiinnitys alue (SAR) työnnetään 3’UTR ja SFG jossa CHS4 työnnetään 3’LTR U3-alue. (Retrovirusvektorit sekä SAR ja CHS4 syntyi vaan sitä tuotetaan hyvin alhainen vektori tiittereitä eikä niitä verrattiin edelleen); Näihin retrovirusvektorit villityypin iCasp9-2A-huK666 CAR konstruktit asetettu ja iCasp9 istutettiin 3 muodoissa; kodonioptimoiduista, villityypin, ja katalyyttiseen domeeniin mutatoitunut. (B) Histogrammes päivänä 3 transduktion jälkeen (siniset viivat). Päällekkäin T-soluja viljeltiin 20 nM CID näkyvät punaisella. Bargraphs rahalaitosten solujen puuttuessa CID päivänä 3 (c) ja (d) päivä 7. Tiedot osoitetaan keskiarvoina +/- SEM 5 itsenäinen kokeiluja eri luovuttajilta.

arvioimiseksi vaikutukset vektorin muutoksia useamman pitkiä aikoja, transdusoitu PBMC: itä viljeltiin sitten yhteensä 7 päivää. Keston tämän kulttuurin aikana totesimme ero alenemiset ilmaisun välillä 3 ryhmään: muunneltua (ei SAR /CHS) ja CHS reseptorit osoittivat huomattavaa laskua rahalaitoksen ylös vaihtelevat 22,4-49,5% verrattuna päivä 3 rahalaitos (kuvio 4D verrattuna kuvioon 4C). Tämä lasku ilmentyminen oli odotettu ja johtuu todennäköisesti reagointikykyä MoMLV LTR T-soluaktivaation tilan. Pitkien 7 päivää kulttuuri rahalaitoksen vektorien, jotka sisältävät SAR oli merkittävästi korkeampi kuin umodified. Tämä lasku ilmentyminen oli merkitsevästi vähäisempi SAR-sisältävien reseptoreiden (p 0,02 ei kodonioptimoidut; katso kuva 4D) viittaa siihen, että SAR toimii estääkseen alaspäin säätelyn GD2 CAR. Ilmiö alhaisempien rahalaitoksen päivänä 7 verrattuna Päivä 3 havaitaan tasapuolisesti vektorit, jotka sisältävät tai eivät sisällä C S mutaatio viittaa siihen, että epäspesifiset aktivointi itsemurha-geenin ei vastaa tätä hiljentäminen.

jälkeen inkubointi CID tasot CAR ilmentymisen elävien PBMC arvioitiin virtaussytometrialla (kuvio 4B). Kuten odotettua C-to-S mutantti reseptorit oli hoitoresistenttejä CID hoitoon. Kumpikaan kodoni-optimointi eikä sisällyttäminen SAR sekvenssin vaikuttanut CID vastausta, mutta CHS4 sekvenssi näytti johtaa suurempaan Transdusoitujen T-solujen pakenevat CID käsittely (kuvio 4B). Paeta itsemurhan geeniaktivaatioon näytti havaittiin etupäässä alhaisen CAR-ekspressoivat ja tämä oli sopusoinnussa alemman ilmaisee yleisesti havaittu CHS4 reseptoreihin. Vaikka hyvin pieni määrä jäljellä CAR-ilmentäviä T-solut olivat havaittavissa muunneltua ja SAR ryhmien seuraava CID hoitoa, on epäselvää, onko solut säilyttävät riittävän CAR ilmaisu näyttää aktiivisuutta.

Niinpä suhteen ilmaisun , vakautta ja vastaus CID, kodonioptimoidun SAR-sisältävä reseptori (iCasp-HuK) toimivat parhaiten ja tämän reseptorin verrattiin alkuperäiseen HuK666 CAR sen kykyä toimia välittäjänä sytotoksisuuden ja sytokiinien vapautumista vastauksena LAN1 soluihin (kuvio 5 ). Transdusoidut PBMC: itä inkuboitiin 72 tuntia poissa tai läsnä ollessa 10 nm CID, ja sitten viljeltiin yhdessä Lan-1 tai A204-solut. Esimerkki ilmentymisen näistä autoista läsnä ja poissa ollessa CID esitetään kuviossa 5A. Tasot HuK666-iCasp9 ilmentyminen eliminoi tehokkaasti induktiolla iCasp9 (kuvio 5A).

SAR kodonioptimoitu kasetti otettiin tarkemmin ja verrattuna alkuperäiseen kasetin ilman iCasp9. (A) ilmentyminen CAR pysyi muuttumattomana. Ehtyminen näkyy FACS lisäyksen jälkeen CID. Toiminto Kasettien kanssa ja ilman iCasp9 arvioitiin (b) Killing (c) IFN-γ vapautumisen ja (d) IL-2 release. Tiedot osoitetaan keskiarvoina +/- SEM 4 itsenäinen kokeiluja eri luovuttajilta.

HuK666 transduktoitu- PBMC näkyvissä vertailukelpoiset sytotoksisuuden ja sytokiinien vapautumista vastauksena LAN1 soluihin riippumatta ennen kulttuurin CID. Koska CID HuK666-iCasp9 konstrukti suoritetaan sekä reseptori puuttuu itsemurhageeniä. Kuitenkin 72 tunnin esikäsittely CID poisti sytokiinien mukaan (kuvio 5C ja 5D) sekä sytotoksisuus (kuvio 5B) ilmentävät T-solut HuK-iCasp9.

In vivo

toiminta iCasp9-CAR kasetti

Varmista, että teho ja spesifisyys koekspressoi optimoitu CAR ja itsemurhageenille todettu in vitro oli todennäköisesti merkitse kliinisen tehon arvioimme iCasp9-CAR kasetti käytettäessä immunokompetenteilla hiirimallissa. GD2 antigeeni on gangliosidin identtisiä kemiallisen rakenteen lajien välillä niin ScFv huK666 ScFv sitoutuu GD2 yhtä hiiren ja ihmisen soluja. Olemme hyödyntäneet heikosti immunogeenisten CT26 koolonisyöpäsolulinja, jotka jatkuvasti muodostaa kasvaimia ihon alle Balb /c-hiirissä. CT26-solut transdusoitu gammaretrovirus koodaavat GD2 ja GD3 disyntaasit, ja klooni (numero 7) kirkkaan GD2 ilme valittiin analyysiin GD2 kohdennusta GD2-CAR käytettäessä immunokompetenteilla malli (S1 Kuva). CT26-klooni 7 soluissa indusoi spesifejä vapautumisen IL-2 ja IFN-γ seuraavat rinnakkaisviljelemällä pernasolujen transdusoitiin GD2-CAR (S2 Kuva). In vivo, CT26-GD2-klooni 7-johdettu kasvaimia tehokkaasti eliminoitu CAR transdusoida splenosyytit toisin GD2 negatiivinen CT26-solut, jotka kasvoivat samalla nopeudella kuin hiirissä, käsiteltiin trandusoidun pernasolua (kuvio 6).

Balb-C hiiriä innocultaed kanssa 1×10

6 CT26 tai CT26-GD2 solu sekoittaa matrigeeliä. 10 päivää kasvaimen istuttamisen, hiiret olivat tappavasti säteilytettyyn (200 rad) ja kaksi viikkoa kasvaimen injektion jälkeen hiiret suonensisäisesti, joihin on siirretty yhteensä 1.5×10

6 transdusoitu pernasolujen tai ei transdusoitu valvontaa häntälaskimoinjektiona. Villityypin CT26 käytettiin antigeeni negatiiviset (a, c) kun taas CT26 -GD2 käsitellyt kasvaimet trandusoidun T-solujen (b) ei taantua taas CT26-GD2 kasvaimet altistettiin CAR T-solujen taantunut. Jokainen rivi edustaa yhtä hiirtä.

Keskustelu

Korkean riskin Neuroblastooma edustaa ratkaisematon kliininen ongelma. Neuroblastoomakasvainten ilmaista diasialoganglioside GD2 runsaasti ja kaikkialle. GD2 on yksi harvoista kiinteän kasvaimen antigeenejä suhteellisen vähän ilme muissa kudoksissa, erityisesti GD2-alhaisen ilme ääreishermojen, joten GD2 houkuttelevan kohteen CAR hoitoa. Varhainen GD2 CAR T-solujen tutkimus tehtiin, jossa vertailtiin EBV-CTL: iä ja ääreisverenkierron T-solujen transdusoitu CAR samalla potilaalla. Vastaukset olivat ohimeneviä ja vain matalan tason jatkuminen CAR-T-solujen havaittiin [8].

Yksi mahdollinen rajoitus, että tutkimus oli käytössä ensimmäisen sukupolven [21] reseptori, joka lähettää vain immunologinen signaali 1 upon ligaatio. Toisen sukupolven CAR on kuvattu, joka myös välittää kostimulatorisia signaaleja [22]. Kaksinkertainen merkintä vertailun ensimmäisen ja toisen sukupolven CAR ehdottaa paremmuuden jälkimmäisen [9]. Todellakin Yhä useammat kliiniset tiedot toisen sukupolven CAR kohdistaminen CD19 CAR T-soluterapia B-solusyöpiä on vahvistanut paremmuus toisen sukupolven CAR [23,24]. Täällä päätti lisätä endodomain joka lähettää kaksi kostimulatorista signaalia, yksi kutakin päässä Ig-superperheen koreseptoria perhe (CD28) ja TNF-koreseptoria perhe (OX40).

Lisääntyvä kliininen kokemus on osoittanut, että autot sisältävät sitovat domeenit on johdettu rottaeläimen vasta-aineet voivat saada vakavia reaktioita potilaille, jotka voivat edistää tehostetun puhdistumaan transdusoitujen T-solujen ja CAR aktivaation huomattava myrkyllisyys [25,26]. Tämä mahdollisuus on pakottava Neuroblastooma: alkaen anti-GD2 mAb hoito on nyt vakio-of-care, monet potilaat ovat altistuneet kimeerisen 14-18 mAb. Erityisesti nämä terapeuttiset vasta-aineet ovat peräisin samasta kloonista kuin CAR käyttää Pule et al. CAR sisältäviä 14.18 perustuvaa scFv on osoitettu äskettäin johtavan tonic signalointi riittävä estämään toiminto [27]. Siksi yritimme käsitellä mahdollisuutta molempien muotoon puristetut ja CAR-indusoi anti-idiotyyppisiä ja anti-hiiri puitteet vastausta. Siksi käytetään erilaista sideaine perhe, joka oli humanisoitu.

reseptorin toiminta ja valinta oikea välike voi olla tärkeä kliininen teho [13,14,21,28]. Guest et al ovat tutkineet, miten sekvenssi välikkeen ja CAR-toiminto näyttää liittyvän etäisyyden reseptorin sitoutumiskohdan kohde-antigeeni kohde solukalvon [13]. Kirjoittajat huomattava, että tapauksessa, NCAM ja 5T4, antigeenejä, jossa CAR epitooppi sijaitsee lähellä kalvon, sukulaisamideillaan CAR vaaditaan, että läsnä on Fc spacer toimii optimaalisesti. Poistamalla tämä spacer johti vähenemiseen sytotoksisuuden ja IFN-γ: n eritys transdusoidut T-solujen vaste antigeenille-ilmentäviä tuumorisoluja. Päinvastainen ilmestyi asianlaita CD19 ja CEA, molemmat antigeenit jossa CAR-sitoutumiskohta on kauempana membraanista. CAR suunnattu nämä kaksi jälkimmäistä antigeenejä näytetä vähensi IFN-γ toiminnan, jos ne sisälsivät Fc välike, vaikka sytotoksisuus ei vaikuttanut. Hudecek et ai on ROR-1 ja CD19-mallit ovat ehdottaneet, että optimaalinen pituus ja joustavuus spacer riippuu myös sijainnin kohde-epitoopin suhteen solun pinnalla [14,28].

Havaitsimme että muuttaminen välikappale meidän GD2 CAR johti muutoksiin sytotoksisen potentiaalin ja sytokiinien erityksen transdusoitujen PBMC. Kaiken Fc välike mikäli optimaalinen vaste vaikka sekä reseptorin variantit, jotka sisältävät CD8 varsi ilmestyi optimaalinen kannalta sytotoksisuuden ja IL-2 release, vaikka varsi-variantti transduktoitu- PBMC johdonmukaisesti havaittu erittämään korkeampi IFN-γ upon stimulaation kuin PBMC transdusoitu Fc muunnos. Puute korrelaatio sytotoksisuus, proliferaation ja sytokiinien erityksen tiettyjen reseptorin konstruktioita on havaittu aiemmin [13] [29,30]. Transduktio tasot olivat johdonmukaisesti sama kaikille spacer variantit ja tämä ei näytä huomioon havaittu eroja toiminto lukuun ottamatta saranan variantti, joka on heikosti ilmentyy solun pinnalla transdusoidut solut, ja näytetään vain vähän tai ei lainkaan reaktiivisuutta vastaan ​​kasvaimen solut tahansa mitattujen parametrien. Tämä voi johtua rajoitetun pääsyn ilmaisulaitteen anti-HA-vasta-HA tag sarana-reseptorin tai vähentyneestä vakautta solun pinnalla, vaikka tämä reseptori kokoonpano on havaittu toimivaksi muissa järjestelmissä [13,21]. Sisältävät sarana-alue osaksi varsi variantti näytti negatiivisesti vaikuttaa reseptorin toiminta ja lievittää sytokiinien eritys verrattuna varsi yksin. On oletettu, että keskeinen piirre välialueen määrittää toiminto on joustavuus, jolloin sitova domeeni käyttää kohdeantigeeniä. Yksi mahdollisuus on, että sisällyttäminen sarana segmentti voi vähentää reseptorin joustavuutta ja että tämä voi voittaa mitään hyötyä johdettu kasvoi hieman reseptorin pituus.

Viime kädessä valitsimme Fc-spacer variantti olevan optimaalinen meidän käsissämme ja otti tämän eteenpäin lisätutkimuksia varten. Kuitenkin yksi asia, joka on ollut havaittavissa CAR sisältävien IgG Fc on sitova tämän alueen Fcy reseptoreihin (FcyR) on solujen luonnollinen immuniteetti johtaen sopimatonta off-tavoite aktivoitumisen Transdusoitujen T-solujen [16,17]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.