Krooninen sairaus

tiivistelmä

Parannetut menetelmät tarkan tunnistamisen sekä läsnäolo ja vakavuus CIN-muutos (CIN) ja laajuus leviämisen invasiivisia karsinoomia kohdunkaulassa (IC) tarvitaan. Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria (DSC) on äskettäin osoitettu spesifisten muutosten terminen käyttäytyminen veren plasman proteiineihin useissa sairauksissa. Näitä menetelmiä tutkitaan antaa täydentävä lähestymistapa seulonnassa kohdunkaulan sairaus. Tässä tutkimuksessa arvioitiin hyödyllisyys DSC erotella terveillä verrokeilla, vakavuusasteen kasvaessa CIN ja varhaisen ja kehittynyt IC. Merkittävät syrjintä oli ilmeinen suhteessa sairastumisen määrä ilman selkeää vaikutusta demografiset tekijät, kuten ikä, etnisyys, tupakointi ja pariteetti. Useimpien kliinistä merkitystä, oli voimakas eriyttäminen CIN terveiden valvontaa ja IC, ja joukossa potilaita, joilla IC välillä FIGO vaiheen I ja edennyt syöpä. Havaittu taudin erityisiä muutoksia DSC-profiileja (termogrammit) oletettiin heijastaa ero ilmentymisen sairauden biomarkkerit, jotka tämän jälkeen sitoutunut ja vaikuttaa termisen käyttäytymisen runsain plasman proteiineihin. Vaikutus vuorovaikutuksessa biomarkkereiden voidaan päätellä modulaatio termo- mutta sitä ei voida suoraan tunnistaa DSC. Tutkia aiotun vuorovaikutusten, massaspektrometrialla (MS) analyysit käytettiin. Määrällinen arviointi alhaisen molekyylipainon proteiinin fragmentteja plasma- ja virtsanäytteitä paljasti pieni lista peptidien, joiden runsaus korreloi laajuus kohdunkaulan sairaus, jossa silmiinpistävin plasma peptidomin tiedot tukevat interactome teorian peptidin annostelu on runsaasti plasman proteiineihin. Yhdistetty DSC ja MS lähestymistapa tässä tutkimuksessa oli onnistunut tunnistamaan ainutlaatuinen biomarkkerina allekirjoitukset kohdunkaulan syövän ja osoitti hyödyllisyyttä DSC plasmaprofiileja täydentävänä diagnostinen väline arvioida kohdunkaulan syövän terveys.

Citation: Garbett NC, Merchant ML, Helm CW, Jenson AB, Klein JB, Chaires JB (2014) havaitseminen Kohdunkaulan syöpä biomarkkereiden Patterns veriplasmassa ja Virtsa differentiaalipyyhkäisykalorimetrialla ja massaspektrometria. PLoS ONE 9 (1): e84710. doi: 10,1371 /journal.pone.0084710

Toimittaja: Jose M. Sanchez-Ruiz, Universidad de Granada, Espanja

vastaanotettu: 31 elokuu 2013; Hyväksytty: 18 marraskuu 2013; Julkaistu: 8. tammikuuta 2014

Copyright: © 2014 Garbett et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä aine perustuu työhön tukee toimiston tutkimuksen ja kehityksen, Medical Research Service, veteraaniviraston, Department of Energy Office of Science rahoitustukiohjelmalla (DE-FG02-05ER6406 MLM ja JBK), ja NIEHS avustuksen P30ES014443 ( MLM ja JBK). Tätä työtä tukivat myös alihankintasopimuksen myönnetty JBC National Cancer Institute apurahan R44 CA103437 ja avustuksen JBC päässä Elsa. U. Pardee Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: NCG, ABJ ja JBC ovat yhdessä keksijöiden patenttihakemukset kuvaavat DSC plasma termogrammi teknologialle Louisville Bioscience, Inc. (LBI) omistaa yksinoikeudella lisenssillä University of Louisville. JBC ja ABJ ovat perustajat ja osakkeenomistajat LBI; NCG on perustaja, osakas ja työntekijä LBI. Tämä ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Invasiivinen karsinooma kohdunkaulan (IC) on kolmanneksi yleisin syöpä vaikuttaa naisten arviolta 529000 diagnosoitu maailmanlaajuisesti vuonna 2008 ja 274000 kuolemantapausta [1]. Viime vuosikymmeninä seulontakäytäntö on auttanut vähentämään merkittävästi sekä ilmaantuvuutta ja kuolemantapauksia IC Yhdysvalloissa, mutta kuitenkin arviolta 12340 uutta tapausta diagnosoidaan 4030 kuolemantapausta 2013 [2]. Invasiivisen kohdunkaulan syövän edeltää verisyövän esiaste, CIN-muutos (CIN), jossa epänormaali solujen kasvua tapahtuu epiteelisolujen kohdunkaula. CIN jaetaan laadut (1 = lievä, 2 = kohtalainen, 3 = vakava), joka perustuu histologisia piirteitä kuten ydin- muutokset ja laajuus osallistumisen epiteelin. Riski etenemisen CIN IC ajan nousee luokalla on suurin CIN 3 [3], [4]. CIN voidaan käsitellä huomattavasti vähentää mahdollisuutta IC kehittämiseen. Osittain auttaa hoidon suunnittelussa, CIN 2 ja CIN 3 yleisesti ryhmitelty korkealaatuisesta levyepiteelikarsinooma intraepiteliaalisia leesio (HSIL), joka hoitaa ja CIN 1 ja HPV kondylooma kuin heikompilaatuisen levyepiteelikarsinooma intraepiteliaalisia leesio (LSIL), joka olisi käsittelemätöntä . Kun IC havaitaan pääasiallinen tarve on määrittää, onko alkuvaiheessa tauti (FIGO vaihe I), joka rajoittuu kohdunkaula tai jos on kehittyneempi etäpesäkkeitä. Vain tauti rajoittuu kohdunkaula ja riittävän pieni koko pidetään hoidettavissa leikkaus.

Luotettavia menetelmiä tarkasti havaita CIN ja IC ovat kriittisiä. Nykyinen seulonta ei pysty erottamaan heikompilaatuisen ylemmiltä CIN, CIN IC, varhain myöhemmissä vaiheissa IC, tai määrätä muita sairauden tilan ilmaisimet, kuten läsnäolo solmukohtien osallistuminen. Useiden vuosien ajan alkuperäisestä seulontamenetelmä CIN on ollut Papa testi, joka mahdollistaa cytologic poikkeavuuksia voidaan havaita kaavituista kohdunkaula. Naiset, joilla papa-kokeilla viittaa squamous intraepiteliaalisten vaurioita sitten arvioida, mukaan lukien kliininen tutkimus ja kolposkopia ja koepala, määrittää luokan ja laajuudesta CIN läsnä ja jättää (tai diagnosoida) läsnäolo IC. Papa-seulonta on nyt integroitu testaus suuririskisille genotyypin ihmisen papilloomavirus (HPV HR), joka voidaan havaita samalla cytologic Papa näytteestä nestepohjaiseen Hybrid Capture II tekniikka [5]. Kaikki laadut CIN liittyy hyvin todennäköisesti läsnäolo HPV HR. Naisilla välillä 30 ja 65 vuotta HPV HR testaus parantaa havaitsemismäärä CIN 3 tai suurempi 17-31% ensimmäisellä kierroksella seulonta ja alentanut IC toisella kierroksella seulonnan [6], [7], [8], [9]. HPV HR testaus on nyt myös integroitu seuranta naisia, jotka ovat aiemmin osoitettu olevan HPV HR-infektio tai CIN, koska pysyviä HPV HR-infektio liittyy suurentunut kehittämiseen toistuva CIN ja IC [6] , [10]. Vaikka testaus HPV HR voi parantaa havaitsemista CIN se ei voi erotella CIN vaurioita, joilla on suurempi todennäköisyys etenee niistä, jotka eivät. Biomarkkerit on tutkittu tässä suhteessa, mutta eivät ole vielä osoittautuneet käyttökelpoisiksi [11], [12], [13], [14]. Työstämisen ja hoito naisille epänormaali papa-kokeilla on traumaattinen fyysisesti, henkisesti ja taloudellisesti ja valitettavasti, kyvyttömyydestä erottaa CIN vaurioita, joilla on suurempi todennäköisyys eteneminen IC monet naiset silti yli käsitelty.

Tässä me kuvaamme soveltaminen käyttäen yhdistettyä lähestymistapaa differentiaalisella pyyhkäisykalorimetrialla (DSC) ja massaspektrometrian (MS) luonnehdinta kohdunkaulan sairaus. DSC on yleisesti käytetään mittaamaan denaturointi profiilit biomolekyylien, tunnettu termogrammit, tarkkailemalla suoraan lämmön muutoksia, jotka liittyvät molekyylitason tapahtumia lämpötilan funktiona. Tietyissä liuos olosuhteissa, termogrammi tarjoaa ainutlaatuisen allekirjoituksen tietyn proteiinin heijastaa tiettyjä rakenteellisia motiiveja ja molekyylien voimia. Se on äskettäin osoitettu, että DSC voidaan soveltaa analyysin veriplasman antaa osoitus yksilön kliinisen tilan [15], [16], [17], [18], [19], [20], [ ,,,0],21], [22], [23], [24]. Lämpökäyrässä plasman terveistä yksilöistä heijastuu painotettu summa denaturoitumisen profiilit runsain plasman proteiineihin; kuitenkin, termogrammit yksilöistä eri tiloja tai sairauksia ovat muuttuneet merkittävästi [15], [16], [17], [18]. Termogrammi muutokset näyttivät olevan herkkiä tietyn sairauden tila ja osoitti, että plasman DSC voisi olla käyttöä kliinisessä diagnostisen seulontamenetelmä. Mekanismeja tautikohtaiset muutokset lämpökäyrillä tutkii parhaillaan laboratoriossamme mutta oletamme, että ne heijastavat taudin esiintyminen biomarkkereita, jotka muuttavat tai vuorovaikutuksessa plasman proteiineihin siten vaikuttaa niiden denaturaatio ominaisuuksiin. Tällainen biomarkkereiden yhteisvaikutuksia tukea ”interactome” käsite, joka ehdottaa, että alhaisen molekyylipainon peptidejä on läsnä plasmassa proteomin kompleksoidaan runsaammin plasman proteiineihin verkoston luomiseksi proteiini-proteiini ja peptidi-proteiini-vuorovaikutusten [25]. Vaikka läsnäolo oletetun alhaisen molekyylipainon biomarkkerit voidaan päätellä muutosten kautta termogrammi ei ole suoraa tunnistamista voidaan valmistaa tällä menetelmällä. Olemme hakeneet MS peptidomic lähestymistapa tutkia luonnetta plasman termogrammi liittyviä profiileja kohdunkaulan sairaus.

MS on käytetty välineenä ymmärtämisen aut- taudin synnyssä ja sukupolven ehdokas biomarkkereita taudin [ ,,,0],26], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. Yksi soveltaminen MS on ollut määrällinen ja laadullinen analyysi pienimolekyylipainoisen proteiinifragmenteista löytyy plasmasta ja /tai virtsa, kutsutaan peptidomic lähestymistapa [33], jonka tavoitteena korreloivan runsauden kanssa havaitsemista tai ennusteeseen taudin. Peptidit Näissä tutkimuksissa todettujen ovat heijastavat metabolisen liikevaihdon emoproteiinien kanssa runsaasti muutoksia välillä tapauksessa (sairaus) ja valvontaolosuhteet liittyvä muutos (s) proteiinin normaalin catabolic tai anabolisten metabolinen puoliintumisaika. Nämä peptidomic tutkimuksissa on joissakin tapauksissa menestyksekkäästi osoittanut korrelaatioita määriä tai kuvioita useiden peptidien sairauden tai taudin etenemistä. Suhteen kohdunkaulan sairaus, metastaattista potentiaalia CIN on korreloitu ilmentymisen kolmen proteiinin, kuten matriisin metalloproteinaasi-2: n (MMP-2), MMP-9, ja urokinaasi plasminogeeniaktivaattori [14]. Koska ensisijainen osallistumisen peptidin tuottavan metalloproteinaasien taudin etenemistä, tämä korrelaatio CIN voitaisiin laajentaa koskemaan peptidomic fenotyypin. Sellaisenaan, kun läsnä on ainutlaatuinen plasman ja /tai virtsan peptidi profiili (t) voitaisiin vahvistaa MS lähestymistapoja ja korreloida termogrammi profiilit heijastaa läsnä ja missä määrin kohdunkaulan sairaus. Kuvaamme tulokset osoittavat herkkyyden DSC lämpökäyrillä kliinisen tilan ja todisteita yhdistyksen termogrammi profiilien vuorovaikutuksessa peptidin biomarkkerit tunnistaa MS.

Materiaalit ja menetelmät

Näytteenotto

tutkimussuunnitelman ja potilaan suostumus menettelyjä hyväksymiä University of Louisville Institutional Review Board (IRB # 08,0108, 608,03). Naiset osallistuvat klinikoilla Division Gynecologic Oncology kanssa biopsialla kohdunkaulan intraepiteelisiin neoplasian ja invasiivisen kohdunkaulan karsinooman olivat hyväksyttäviä ja antoivat tietoon suostumuksensa veressä ja kudoksissa, otetaan kudokseen arkistoon (IRB # 608,03) ja hyödynnetään tutkimustarkoituksiin. IRB nimenomaisesti hyväksytty käyttö kudosten kudoksesta arkistosta käytettäväksi tässä tutkimuksessa ilman tarvetta suostumuksen (IRB # 08,0108). Naiset tiedetään olevan HIV-positiivisia oli tukikelpoisia. Veri ja paikka virtsa kerättiin otettiin potilaita aikana alkuperäisen klinikan vierailu arvioinnin aikana ja ennen kuin saa hoitoa. Virtsanäytteet jaettiin eriin ja varastoitiin välittömästi -80 ° C: ssa analyysiin asti. Verta otettiin 5 ml: violetti alkuun (plasma; K

2-EDTA antikoagulantti) vacutainers. Putkia sekoitetaan varovasti käännellen 8-10 kertaa heti verinäytteen jakautuu tasaisesti antikoagulantti lisäaine seurasi sentrifugointi 3200 rpm 10 minuuttia (BD-Clay Adams Compact II sentrifugi). Erotettu plasma huolellisesti pois, jotta vältetään hemolyysin tai kontaminaation erotettu veren vaiheet, jaettiin osiin ja välittömästi varastoitiin -80 ° C: ssa analyysiin asti. Ohjaus verta ja virtsanäytteitä koottiin samoissa tutkimuksessa menettelyjä terveiltä vapaaehtoisilta, joilla ei ollut epänormaalia papa-kokeilla tai syöpä. Kuten edellä, tutkimussuunnitelman ja suostumuksen menettelyjä hyväksymiä University of Louisville Institutional Review Board (IRB # 08,0108, 608,03). Kaikki vapaaehtoiset antoi kirjallisen, tietoon perustuva suostumus niiden verta ja kudoksia, jotka merkitään kudokseen arkistoon (IRB # 608,03) ja hyödyntää tutkimustarkoituksiin. IRB nimenomaisesti hyväksytty käyttö kudosten kudoksesta arkistosta (IRB # 608,03) käytettäväksi tässä tutkimuksessa ilman tarvetta suostumuksen (IRB # 08,0108). Näytteen sulatettiin analysoitavaksi ja loput heitetään pois. Kaikki käsittely näytteet ja näytteiden jätteet oli mukaisesti OSHA veriperäisten taudinaiheuttaja menettelyjä. Kaikki näytteet kerätään tutkimusta varten deidentified ja tallennetaan Gynecologic Oncology Tissue Bank on James Graham Brown Cancer Center. Associated demografiset ja kliiniset tiedot kerättiin kliinisen tutkimuksen henkilöstö ja tallennettu turvallisesti tutkimuksesta tietokoneella. Kudospankin hyväksyttiin University of Louisville Institutional Review Board (IRB # 608,03) ja oli täysin HIPAA yhteensopiva. Näytteet tarjotaan perustiedot tieteestä tutkimushenkilökunnalle (NCG, MLM, ABJ, JBK, JBC) DSC ja MS tutkimuksia koodattu kudospankille kokoelma numero. Tässä muodossa näytteet deidentified ja sokaissut sekä demografiset ja patologinen sairaus tila puolueeton tiedonkeruuta. Demografiset ja tautitilanne myöhemmin säädetty tietojen lajittelu ja tulkinta.

DSC Studies

Näytteiden valmistus DSC tutkimuksiin.

plasmanäytteet (100 ui) dialysoitiin standardi fosfaattipuskuri (1,7 mM KH

2PO

4, 8,3 mM K

2HPO

4, 150 mM NaCl, 15 mM natriumsitraatti, pH 7,5) 24 tuntia 4 ° C: ssa, jotta saavutettaisiin normalisointi puskuria olosuhteissa kaikilla näytteillä. Jäädytetyt plasmanäytteet sulatettiin yön yli 4 ° C: ssa päivää ennen dialyysiä. Aamulla dialyysin, näytteet ladattiin Slide-A-lyzer mini dialyysihoitoyksiköt (MWCO 3500; Pierce, Rockford, IL), joka oli tasapainotettu vastaan ​​dialyysipuskurista yössä. Perustuen kustannukset ja luotettavuus me rutiininomaisesti kootaan uudelleen pesty dialyysihoitoyksiköt korvaa alkuperäisen dialyysikalvojen kanssa cut-to-size Snakeskin Laskostettu dialyysiputkea (Pierce, Rockford, IL). Näytteet dialysoitiin 1 litraan fosfaattipuskuria puskurilla muutoksia kolmen tunnin dialyysin jälkeen ja sitten kaksi neljän tunnin jakson ajan lopullisen yön dialyysin aikana. Näytteet otettiin talteen dialyysi ja suodatettiin hiukkasten poistamiseksi käyttäen Spin-X: n sentrifugiputkeen suodattimen (0,45 um selluloosa-asetaatti, Corning Incorporated, Corning, NY). Lopullinen dialyysipuskurista myös suodatetaan (0,2 um: polyeetterisulfoni, Pall Corporation, Ann Arbor, MI) ja sitä käytetään kaikkiin näytelaimennossarjaa ja referenssinä ratkaisu DSC tutkimuksiin.

DSC-analyysi.

DSC kerättiin kanssa MicroCal VP-Capillary DSC väline integroitu autosampler (MicroCal, LLC, Northampton, MA, nyt osa GE Healthcare). Sähköinen kalibrointi ero tehon signaali ja lämpötila kalibroinnin hiilivety lämpötilanormeja tehtiin osana valmistajan vuosittaisen instrumenttihuolto. Valmistaja suoritustiedot lämpötilan standardit ovat ± 0,2 ° C. Väliaikainen väline suorituskyky arvioitiin käyttäen biologisia standardeja lysotsyymiä ja RNaasiA. Valmistaja suoritustiedot biologisen standardit ovat ± 0,5 ° C. Dialysoitua plasmanäytteet laimennettiin 25-kertaisesti antaakseen sopivan proteiinipitoisuus DSC-analyysi. Näytteet ja dialysaatin siirrettiin 96-kuoppalevyille ja sitten syötetään instrumenttiin autosampler termostoitu 5 ° C: ssa analyysiin asti. Näyte tilavuudet 400 ui vaadittiin riittävän volyymin lastaukseen instrumentin kapillaarisen ja asianmukaisen täytön 135 ui lämpötilavalvontajärjestelmä alueella. DSC skannauksia rekisteröitiin 20 ° C: sta 110 ° C: seen skannaus nopeudella 1 ° C /min ennalta scan termostaatti 15 minuuttia, puolivälissä palautteen tila ja suodatuksen aikana 2 sekuntia. Monista DSC skannaukset saatiin kultakin plasma näytteen. Kutakin koetta varten asetettu, me kerätään yhteen näytteitä varmistaa analyysi päätökseen seitsemän päivän ikkunan jälkeen alkuperäisen sulatuksen näytteitä. Kehittäessämme koemenettely Olemme huolellisesti arvioineet näyte ja puskuri skannaa funktiona juoksujakso, instrumentti kammio huuhtelu ja puhdistus protokollaa, ja aika vuodesta valmistelua. Olemme tutkineet puskuri skannaa kerätään alussa ja lopussa näyte set ja sen jälkeen yhden tai peräkkäisen näytteen skannaa ja määritetty hyväksyttävä toistettavuus ja tehokkaaseen puhdistukseen väline kammioiden. Olemme verranneet kaksoisnäyte skannaa kerätään jälkeen puskurin tai näyte skannata ja todennut sen on mahdollista kerätä peräkkäisen näytteen skannaa laajojen huuhtelun instrumentin kammioiden vaikuttamatta termogrammi profiilin. Me rutiininomaisesti verrattuna kaksoisnäyte skannaa kerätty eri ajaa sekvenssit ja eri ajankohtina varmistaa termogrammi profiilin oli toistettavissa.

DSC Aineisto analysoitiin Alkuperä 7 (OriginLab Corporation, Northampton, MA). Raaka DSC tiedot korjattiin instrumentaalinen lähtötilanteen vähentämällä sopivan puskurin viite scan. Korjattu skannaa normalisoitiin koko proteiinipitoisuus joka määritettiin kolorimetrisesti käyttämällä bikinkoniini- happo proteiini iinianalyysikitissä ja mikrolevyjen menettely Pierce (Pierce, Rockford, IL), vähäisin muutoksin valmistajan protokollaa. Absorbanssilukemia otettiin käyttäen Tecan Sunrise mikrolevyjen absorbanssia (TECAN US, Research Triangle Park, NC). Sen jälkeen normalisointi, plasma DSC skannaa korjattiin nollasta perusviivoista soveltamalla lineaarista perustason sovi. Sopivan näytteen lähtötilanteen korjaus mutkistaa läsnäolo rajoitetun alueen muutoksen jälkeiseen lähtötilanteen seurasi yhdistäminen ja sademäärä jälkeisistä tapahtumista lämpödenaturaatiota kirjekuoren. Olemme arvioineet kaikki käytettävissä lähtötilanteen korjaus vaihtoehtoja analyysin ohjelmisto ja löysi lineaarinen perusvaihtoehdossa antaa parhaiten yhteen tulokset testattaessa toistuvissa mittauksissa, eri näytteiden ja riippumattomat käyttäjän määrityksiä. Hyväksymme, että lähestymistapamme saattaa olla rajoituksia, mutta valinnut parhaiten yhteen lähtötilanteen korjauksen menetelmä, jota voidaan soveltaa koko tutkimuksemme. Lopulliset termogrammit esitettiin graafisesti ylimääräistä ominaislämpökapasiteetti (cal /° CG) versus lämpötila (° C).

Tilastollinen analyysi DSC tietoja.

Examination kaikista termogrammi data paljasti, että lämpötila-alue 45-90 ° C virittämä täydellinen denaturaatio profiilin kaikki näytteet ja skannausta typistetty tällä alueella kaikissa seuraavissa analyyseissä. Määrällinen vertailu lämpökäyrillä saavutettiin laskeminen useiden muoto ja ominaisuus mittareita. Parametrit otettiin huomioon piikin kokonaisalasta; huipun korkeus; piikin leveys piikin korkeuden puolivälissä; lämpötilan piikin maksimissa (T

max); lämpökapasiteetti ensisijaisen siirtymisen välillä 60-65 ° C [C

p

ex (Peak 1)]; lämpökapasiteetti toissijaisen siirtymisen klo 68-72 ° C [C

p

ex (Peak 2)]; suhde ensimmäisen ja toisen siirtymäkauden amplitudit [C

p

ex (Peak 1)] /[C

p

ex (Peak 2)]. Koska monimutkaisuuden termogrammi muotoja, ylimääräinen parametri on laskettu antamaan mitan jakelun alueella denaturaatio profiilin suhteen akselin kanssa. Ensimmäinen hetki lämpötila (T

FM) määritettiin yhtälön 1: (1) B

termogrammit ryhmiteltiin patologisen tautinsa viiteen ryhmään: terveillä verrokeilla, LSIL (CIN 1), HSIL (CIN 2, CIN 3), varhaisessa vaiheessa IC (vaihe I) ja kehittyneiden IC (vaihe II-IV). Mean termogrammit kanssa keskihajonnat määritettiin kullekin valmisteluryhmän.

erot termogrammia muoto ja ominaisuus mittareita arvioitiin ei-parametriset menetelmät. Ensinnäkin laatikko kaavioita käytettiin vertaamaan eroja jakaumia kunkin tutkimusryhmän. Laatikko kaavioita oli rakennettu seuraavalla tavalla: ylä- ja laatikon edusti 25

th ja 75

persentiili, vastaavasti, ja 50. prosenttipiste edusti bändi keskellä ruutuun. Pohja ja yläosa päät viikset merkitään 5

th ja 95

th prosenttipisteet, vastaavasti. Vaaka esitetyllä pienin ja suurin kaikista tiedoista ja ristit edusti 1

st ja 99

th persentiilit. Keskimääräinen oli merkitty avoin neliö. Erot termogrammi mittarit Jokaista kliinistä ryhmää testattiin merkitystä käyttämällä ei-parametrinen U-testi epätasainen medians [34].

MS Studies

Kokeellinen suunnittelu MS-tutkimuksilla.

järjestys näytteiden käsittely ja analysointi (näytteen määrä, jotta näytteen valmistusta kylmäkuivatus MALDI-TOF levy tiputtelua, ja TOF tiedonkeruu) oli satunnaistettu minimoimiseksi järjestelmällinen vaihtelu aikana tiedonkeruu. Näytteitä käsiteltiin eristämiseksi peptidejä (Fraktio 1 tai FX1), eristää peptidejä, jotka sidottiin yhteensä plasman proteiineihin (Fraktio 2 tai FX2), peptidien eristämiseksi aikana vapautuu immunodepletion albumiinin ja IgG plasmasta (Fraktio 3 tai FX3), ja peptidien eristämiseksi selektiivisesti sitoutuneen erittäin runsas proteiineja, albumiini ja IgG (Fraktio 4 tai FX4). Näytteet täplikäs kolmena kappaleena, MALDI-TOF MS-tiedot hankitaan ja signaali keskimäärin yli kolme sijaa. Analyysi keskimäärin tietojen erilaisesti runsas peptidien suoritettiin käyttäen pääkomponenttianalyysi (PCA) ja Studentin t-testiä, jonka jälkeen manuaalinen tarkastelu ionin intensiteetit valittuja peptidejä. Manuaalinen tarkastelu suoritettiin sen varmistamiseksi, että peptidejä ei ole jätetty seurauksena virheellisen lähtötilanteessa normalisoituminen tai perusviivan vähennystä.

Näytteenkäsittelymenetelmien.

Näytteet sulatettiin kerran eriin, osaksi 100 ui volyymit varastointia -80 ° C ja kerran näytteen valmistamiseen peptidin kvantifiointiin. Näytteet analysoitiin käyttäen kahta erillistä erään ja yksittäisiä eriä analysoitiin kolmena kappaleena. Plasmanäytteet köyhdytettyä albumiinin ja IgG käyttäen kaupallisesti saatavilla affiniteetti spin sarakkeet (Sartorius N. A. Inc, Edgewood, NY) mukaan valmistajan ohjeita. Peptidit eivät sitoudu plasman proteiineihin eristettiin käyttäen modifikaatiota saostuminen menetelmän Chertov et ai [35]. Peptidit sitoutuu albumiiniin ja IgG otettiin talteen albumiini /IgG-affiniteetti hartsia hapon puhdistamalla 10% etikkahappoa. Peptidit sitoutuu plasman proteiineihin otettiin talteen orgaanisen liuottimen-hyytyneet proteiinien suolan tai hapon ionisaatiota. Talteen otettu peptidi liuokset lyofilisoitiin ja suspendoitiin uudelleen 0,1% trifluorietikkahappoa (TFA) ennen MALDI-TOF-MS-analyysiä. Spot virtsanäytteitä sulatettiin -80 ° C jäällä. Virtsanäytteet sentrifugoitiin 1500 x g 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa pelletoimiseksi solujätteen ja hiukkasia. Virtsan peptidit eristettiin käyttäen Amicon Ultra-4 (10000 NMWCO) (Millipore, Billerica, MA) kuten aiemmin on kuvattu [26].

MS-analyysi eristetty plasman ja virtsan peptidejä.

Kaikki näytteet poistettiin suola ja konsentroitiin MALDI-TOF-MS-analyysillä käyttäen C18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA). Peptidit eluoitiin C18-hartsista käyttäen näytteen matriisi, 5 mg /ml 4-hydroksi-α-cyanocinnamic happo (α-CN), ja sitä laikullinen kolmena kappaleena päälle MALDI levy. Positiivinen ioni MALDI-TOF-massaspektrit hankittiin kuvatulla [36]. Peptidit jatkotutkimuksiin valittiin analysoitiin käyttäen AB4700 in TOF /TOF tila ja tulkinnasta pirstoutuminen dataa Mascot (Matrix Science, Boston, MA) ver1.9 kuten aiemmin on kuvattu [26].

Tilastollinen analyysi MS data.

data-tiedostot (.t2d) vietiin AB4700 proteomiikka Analyzer ja tuodaan MarkerView ohjelmisto. Tämä ohjelmisto voi löytää spektrin piikit käyttäjän määritelty massa toleranssirajojen tai bin spektrien kautta käyttäjän määrittämä alusta kokoja. Lisäksi käyttäjä voi määrittää minimi ja maksimi signaali vastauksia, joka auttaa käsittelemään korkea-ulotteinen massaspektritiedot sarjaa. Aineisto analysoitiin tiedot binning, joka mahdollisti perusviivan vähennystä. Peptidi ekspressiotietojen tarkasteltiin ensin käyttämällä PCA. Seuraavat tiedot tuonti, tiedot olivat esikäsitellyt käyttämällä ei-painotusta ja joko keskiarvokeskitettiin tai Pareto tietoja skaalaus ennen PCA. PCA on menetelmä valmistelevan tietojen analysointi, joka vähentää monimutkaisuutta tietoja, säilyttäen niiden vaihtelevuus, muuttamalla data uuteen muuttujien ryhmä, kutsutaan pääkomponentteina. PCA saamiseksi käytettiin puolueeton arvio onko MALDI-TOF MS peptidi ekspressiotietojen itse lajitellaan ryhmiin vastaa potilaiden kanssa CIN, kohdunkaulan syövän ja terveillä verrokeilla ilman CIN /kohdunkaulan syöpä. Differential peptidin ja proteiinin ilmentymistä verrattiin parittomalla, kaksisuuntaisella Studentin t-testiä käyttäen linjassa MALDI spektrit ja keskimäärin piikkiryhmän alueen yksittäisten peptidien. P-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä. Ilmentyvät eri peptidejä valittiin tandem MS-analyysiä käyttäen AB4700 proteomiikka Analyzer.

Tulokset

Plasma yksilöt 67 naiset osallistuvat Division Gynecologic Oncology klinikan ja 4 tervettä vapaaehtoista kerättiin DSC-analyysi. Jakautui näytteen numeroita oli seuraava: kontrolli = 4, CIN 1 = 3, CIN 2 = 4, CIN 2-3 = 3; CIN 3 = 22, IC = 35 (FIGO vaihe I = 14, II = 10, IIIb = 7, IV = 4); ikäjakauma = 18-69 vuotta (keskiarvo 38,7 vuotta) (taulukko S1). Täydellinen demografiset ja kliiniset tiedot, kuten biopsialla CIN ja IC asema, koottiin kaikkien yksilöiden jäsenet kliinisen tutkimuksen joukkue. Näytteitä perus tiede study joukkue oli deidentified ja vailla kaikki demografiset ja kliiniset tiedot. DSC-analyysi plasmanäytteet saatiin normalisoitua, lähtötilanteessa korjattu kahtena lämpökäyrillä jokaisesta näytteestä. Tässä vaiheessa kliiniset ja demografiset tiedot toimitettiin perustiedot tieteestä joukkue myöhempää analyysejä.

Olemme aiemmin osoittaneet, että termogrammi plasman saatu terveiden yksilöiden edustaa lämpödenaturaatio runsain plasman proteiineihin painotettu keskimääräinen normaaliin plasmassa [18]. Jotta nykyinen tutkimus, termo- plasman saatu terveiltä vapaaehtoisilta otettiin keskiarvo saamiseksi tutkimuksittain ”terveisiin” profiilin, joka selittää tietyn keräämistä ja käsittelyä protokollat ​​nykyisessä tutkimuksessa. Vertailun, aikaisemmin julkaistun keskiarvo termogrammi saatiin 15 terveiden yksilöiden: 9 urosta ja 6 narttua (11 Afrikkalainen Amerikan ja 4 valkoihoinen) joiden ikä 22-50 vuotta (keskiarvo 37,0 vuotta). Keskimääräinen termogrammin ala on 5,02 ± 0,23 cal /g ja ensimmäinen hetki lämpötila (T

FM) on 67,4 ± 0,8 ° C. Tutkimus-erityinen ”terveisiin” profiili saatu 4 valkoihoinen nainen, jolla on samanlainen ikäjakauma edellisessä tutkimuksessa (25-50 vuotta, keski 39,3 vuotta) hyvin vertailun samanlainen alue (4,94 ± 0,19 cal /g) ja T

FM (66,3 ± 0,3 ° C) arvot.

termogrammit otettiin keskiarvo viiden kliinisessä ryhmään: kontrolli, LSIL, HSIL, vaihe I ja vaihe II-IV. Keskimääräinen termogrammit ovat erillisiä toisistaan ​​ja osoittavat asteittainen muutos profiilin muoto (kuvio 1A). Tärkein siirtymä on alueella 60-65 ° C muuttuu vähitellen pienempi kasvu amplitudi toisen siirtymisen noin 70 ° C: ssa. Jokainen kliininen ryhmä tutkittiin vaikutusta potilaan demografiset tekijät, erityisesti ikä, etnisyys, tupakointi ja pariteetti ilman merkittävää vaikutusta löytyy keskiarvon termo-. Varianssi liittyvät kunkin ryhmän profiilin tutkittiin läpi laskemiseen keskihajonnat kussakin lämpötilassa ja rakentamisen tontin keskihajonta lämpökapasiteetin funktiona lämpötilan (kuvio 1 B). Terve kontrolliryhmä näkyy pienin varianssi koko lämpötila-alueella. Toinen kliininen ryhmät osoittavat suurempi varianssi liittyy ensisijaisesti suurten siirtyminen ~65 ° C samoin kuin toinen siirtyminen -70 ° C ja sen korkeamman lämpötilan olkapäät. Havaittu termogrammin varianssi on samanlainen kuin aiemmat havainnot [18] ja heijastaa sekä odotettavissa oleva kliininen vaihtelu plasman proteiineihin tasolla sekä sairauden liittyvän proteiinin muunnoksia.

Mean termogrammissa profiilit ylimääräistä ominaislämpökapasiteetti (C

p

ex) lämpötilan funktiona (paneeli A) ja keskihajonta (paneeli B) Jokaista kliinistä ryhmä: valvonta (musta); LSIL (punainen); HSIL (vihreä); varhaisessa vaiheessa IC [FIGO Vaihe I] (sininen); ja kehittynyt IC [FIGO Stage II-IV] (syaani). Termogrammit osoittavat asteittaista siirtymistä korkeampia dentauraatiolämpötiloille yhä taudeista. Ero käyrät kliinisen ryhmän lämpökäyrillä verrattuna kontrolliryhmään (paneeli C) osoittavat negatiivinen erotus huiput ~62 ° C ja lisäämällä siirtymä ja suuruus korkeamman lämpötilan positiivinen erotus piikit. Nämä arveltu heijastaa vuorovaikutuksen tautikohtaisten komponenttien runsaasti plasman proteiineihin, pääasiassa albumiiniin, jossa tuloksena lämpöstabiloimiseen ja muuttaminen plasman termogrammi profiileja.

Muutokset termogrammi liittyviä profiileja tautikuormituksesta tutkittiin kautta DSC ero tontteja jotka heijastavat muutoksia ryhmässä lämpökäyrillä suhteessa terveen kontrolliryhmän (kuvio 1 C). Kunkin CIN luokan tai IC vaiheessa oli negatiivinen ero piikki, ~62 ° C korkeamman lämpötilan positiivinen erotus piikit. Positiivinen ero huiput siirtynyt korkeampaan lämpötilaan ja lisääntynyt suuruudeltaan lisääntynyt taudeista. LSIL ryhmä ei noudata tätä suuntausta positiivinen erotus piikit; Tämä saattaa heijastaa huono määrittely Tässä kliinisessä jolle annettiin pieni näytemäärät (n = 3) käytettävissä arviointia. Vaikka nämä muutokset termogrammi profiili pysyvät tutkittavana laboratoriossamme he ehdottavat lämpöstabiloimiseen plasman proteiineihin (t), jonka denaturointi profiilin näkymisen ~62 ° C.