Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Oct4 ja Surviviinispesifisiä ovat tärkeitä tekijöitä syöpäsolujen lisääntymistä , uusiminen ja erilaistamattomuuden, ja korreloi vastustuskykyä sädehoidon ja kemoterapian useimmissa ihmisen syövissä, mutta niiden sääntelymekanismeille tunnetaan huonosti.

Menetelmät /Principal havainnot

tässä tutkimuksessa 50 potilasta, joilla ruokatorven okasolusyöpä (ESCC) on takautuvasti analysoitiin. Oct4 ilmentyi 13 tapauksessa (26%), ja surviviini positiivisesti ilmaistuna 31 tapauksessa (62%), tutkittiin immunokemian. Oct4 todettiin olevan itsenäinen ennustava tekijä Keskimääräinen elinaika, ja potilaita alaryhmä, jolla on suuri ilmaus Oct4 ja surviviinin oli huonoin ennuste tutkittiin log-rank-testi. Tutkimaan edelleen molekyyli- sääntelymekanismi välillä Oct4 ja surviviinia rakensimme erityiset

pieni

hiusneula-RNA (shRNA) ilmentävä vektoreita kohdistaminen Oct4 tai /ja Surviviinispesifisiä ja manipuloivat ilmaus Oct4 ja surviviinin. Western blottauksella ja RT-PCR, huomasimme, että Oct4 voi säätää ylös surviviinia ilmentymistä ruokatorven syöpä solulinjoja Eca109 ja TE1. Samalla pudotus on Oct4 ja surviviinin ilmentyminen indusoi apoptoosia ja G2-vaiheen lasku solukierron virtaussytometrialla, ja lopulta aiheutti parannettu anti-leviämisen aktiivisuusedellytykset Eca109 ja TE1 solulinjoissa MTT: llä.

Johtopäätökset

Tämä tutkimus osoittaa, että Oct4 ja Surviviinispesifisiä ilmentyminen korreloi huonon selviytymisen potilailla, joilla ESCC. Oct4 ja Surviviinivasteita voidaan pitää tavoitteet ESCC biotherapy.

Citation: Li C, Yan Y, Ji W, Bao L, Qian H, Chen L, et al. (2012) Oct4 säätelee positiivisesti Surviviinispesifisiä Expression edistää Cancer Cell Proliferation ja johtaa huonon ennusteen Ruokatorven Okasolusyöpä. PLoS ONE 7 (11): e49693. doi: 10,1371 /journal.pone.0049693

Editor: Wayne A. Phillips, Peter MacCallum Cancer Centre, Australia

vastaanotettu: 11 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 11 lokakuu 2012; Julkaistu: 21 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Tiedesäätiö of China (30801106, 81172308, 30973469). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ruokatorven levyepiteelisyöpä (ESCC) on yksi kaikkein pahanlaatuisten kasvainten korkea kuolleisuus [1], [2]. Vaikka joitakin uusia molekyylikohteista on löydetty ja käytetty ESCC biotherapy, molekyylimekanismeja ESCC toistuminen ja etäpesäke vielä ole ymmärretty. Yhä useammat todisteet ehdotti, että vain pieni osa syövän aloittamista solujen on kyky itse uudistaa sekä, ajaa taudin alkamisen ja etenemisen syövän, ja esitettiin voimakkaasti vastustuskykyä kemoterapiaa ja sädehoitoa [3], [4] , joka antaa meille paremman käsityksen molekyyliperustan ESCC.

oktameerin sitova transkriptiotekijä 4 (Oct4) on yksi varren liittyvien transkriptiotekijöiden, säätelevät kasvainten lisääntymistä ja itseuudistumisen. Huonosti eriytetty tai erilaistumaton syöpäsolut ovat tunnusomaisia ​​monet fenotyyppisen ominaisuuden samanlainen eriytymättömiä alkion kantasoluja, viittaa siihen, että Oct4 voidaan ilmaista kiinteiden kasvainten syövän aloittamista solun biomarkkereiden [5]. Oct4 kuuluu perheeseen POU-domeeni transkriptiotekijöiden, mukaan lukien homeodomeenin, joka on tärkeä alkion kehitykseen [6], [7]. On osoitettu, että Oct4 yliekspressoituvan paljon somaattisen syöpien, kuten rintasyövän, eturauhassyövän, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, virtsarakon syöpä, suun okasolusyöpä, mahalaukun, ruokatorven syöpä [8] – [14]. Oct4 ilmentyminen on keskeinen linkki kasvainten synnyssä ja ylläpidosta syöpäsoluja.

Surviviini on jäsen estäjiä apoptoottisen geenin perhe, ja sillä on tärkeä rooli syövän etenemistä estämällä apoptoosin, sääntely solunjakautumisen ja angiogeneesin induktio [15]. Surviviinin yli-ilmentyminen ehdotettiin erilaisia ​​syöpiä, kuten ESCC [16], [17], mutta harvoin esiintyy normaalin aikuisen kudoksissa. Surviviinin ilmentyminen verenkierrossa syöpäsoluja perifeerisessä veressä sairastavien potilaiden ESCC löydettiin ja saatiin arvokasta tietoa ennustaminen syövän uusiutumiseen ja huonon ennusteen [18], [19]. Lisäksi surviviinin yli-ilmentyminen on ESCC esitetty vastustuskyky kemoterapia ja lyhyempi selviytymisen [20], ja siinä oli samankaltaisia ​​tuloksia muissa syövissä [21].

Edellinen tutkimus osoitti, että pudotus surviviinin ilmentymisen useissa ihmisen syövän solulinjat, kuten A549, HeLa ja MCF-7-solut, johti merkittävään vähentämiseen solujen elinkelpoisuuden, ja yhdistelmä Surviviinispesifiset suunnatun hiljentäminen strategia kemoterapeuttisten aineiden muodosti arvokas lähestymistapa syövän hoito tehostetun antituumorivaikutuksen tehosta [21], [22]. Kuitenkin syövän uudelleen kasvu on luultavasti tärkein ominaisuus, koska syöpä aloittamista solujen vastustaa tavanomaisten syövän hoitomuotoja ja todennäköisesti tärkeä rooli syövän uusiutumisen [23]. Siksi kohdistaminen syöpä aloittamista solujen on mahdollista merkittävästi parantaa tuloksia syöpäpotilaille. Oct4 on mestari geeni, joka on keskeinen rooli itseuudistumisen ja pluripotenttisuuden kantasolujen. Selektiivisesti ilmaistaan ​​tuumorikudoksissa, näyttö viittasi siihen, että Oct4 voi olla lupaava kohde kehittämiseen syöpälääkkeiden strategioiden poistamaan syövän aloittamista soluihin [24].

Äskettäin on raportoitu, että surviviinin ilmentyminen dramaattisesti vähentynyt Oct4 pudotus hiiren alkion kantasoluja [25], mikä viittaa siihen, että on olemassa suhde Oct4 ja surviviinin. Mutta molekyylitason sääntelymekanismeja välillä Oct4 ja Surviviinispesifisiä eivät ole vielä selvillä syövissä. Nykyisessä tutkimuksessa tutkimme Oct4 ja Surviviinispesifisiä ilmaisun ja analysoi ennustetekijöiden merkitystä näiden kahden geenien kanssa ESCC yksilöitä. Samaan aikaan sääntelyn mekanismi Oct4 ja surviviinin ilmaisun ja niiden toiminta solujen apoptoosin, solujen lisääntymisen tai solusyklin tutkittiin ESCC solulinjoissa.

Tulokset

Oct4 ja Surviviinispesifisiä oli yli-ilmentynyt ESCC

ilmentyminen Oct4 ja surviviinin havaittiin immunohistokemia yksilöiden ESCC ja viereisten normaali ruokatorven kudoksia. Oct4 on ilmaistu 13 (26%) ESCC mutta vain 2 (4%) normaaliin ruokatorven kudoksia. Surviviinin ilmaistuna 31 (62%) ESCC mutta vain 11 (22%) normaalin ruokatorven kudoksia. Oli eroja ESCC ja normaalin ruokatorven ryhmät (

p

= 0,0051 varten Oct4;

p

= 0,0001 Surviviinia). Oct4-positiivinen immunoreaktiivisuus jakautunut pääasiassa ESCC solujen tumaan ja Surviviinispesifisiä oli jakautunut pääasiassa ESCC sytoplasmassa. OCT4- ja Surviviinispesifiset positiiviset solut sijaitsevat pääasiassa pohjapinta osissa epiteelin (Fig. 1). Surviviinin ilmentyminen ei liittyvät Oct4 ilmentymistä näissä ESCC näytteistä (R = 0,276,

p

= 0,052; taulukko 1).

parafiiniin upotetut leikkeet altistettiin immunohistokemiallista tutkimusta ensisijaisen hiiren anti-ihmisen Oct4 ja kanin anti-ihmisen surviviini vasta työskentelytasolla pitoisuutena 1:100 ja diaminobentsidiini (DAB) käytettiin värjäämään positiivisen reaktion. Fosfaatti puskuroitua suolaliuosta (PBS), sen sijaan, että ensisijainen vasta-aineita, käytettiin negatiivisena kontrollina. Prosenttiosuudet positiiviset solut laskettiin 5 suuritehoisia kenttiä, alkuperäinen suurennos x 200.

Statistical korrelaatio Oct4 tai Surviviinispesifisiä ilmaisun ja ESCC kliinispatologiset ominaisuudet (sukupuoli, ikä, solujen erilaistumiseen, kasvain invaasio syvyys, imusolmuke etäpesäke) analysoitiin ja paljastanut mitään merkittäviä eroja OCT4- tai Surviviinispesifiset positiivisia ja OCT4- tai Surviviinispesifiset negatiivisia tapauksia ESCC (taulukko 2).

Oct4 ja surviviinia Correlated Poor ennuste ESCC potilaat

Follow-up tiedot 50 potilasta analysoitiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmä arvioida eloonjäämiskäyrien. Mediaani OS oli 34,5 kuukautta. Mediaanielossaolosta ESCC potilaalla on Oct4 positiivinen ilme oli merkittävästi pienempi kuin potilailla, joilla Oct4 negatiivinen ilmaus (

p

0,001). Samanlainen tulos osoitti välillä Surviviinispesifiset = Intention ESCC tapauksissa (

p

= 0,009). Niistä kolme alaryhmää (Oct4-positiiviset /Surviviinispesifiset positiivinen, Oct4-negatiivinen /Surviviinispesifiset positiivinen, Oct4-negatiivinen /Surviviinispesifiset negatiivinen), potilailla, joilla on Oct4-positiivisten /Surviviinispesifiset positiivinen ESCC oli merkitsevästi köyhimmät ennusteen (

p

0,001), ja pisin OS dokumentoitiin Oct4-negatiivinen /Surviviinispesifiset negatiivinen alaryhmä (Fig. 2A). Tarkempi analyysi suoritettiin tahansa kahden alaryhmiä log-rank testi, ja tulokset osoittivat, että Oct4 ja Surviviinispesifisiä ilmaisun olivat yhteydessä huonoon ennusteeseen of ESCC potilaista (Fig. 2B).

(A) Viisikymmentä sairastavilla potilailla ESCC otettiin tutkimukseen, ja OS määriteltiin ajanjakso toiminnasta päivämäärä kuolinpäivästä tai päättymispäivän seurannan. Survival käyrät laskettiin Kaplan-Meier menetelmällä, ja merkittävä ero testattiin log-rank-testi. (B) Joka toinen alaryhmää verrattiin log-rank-testi.

Tietojen analysointi kanssa yhden muuttujan Coxin suhteellista riskin malliin paljasti, että Oct4 ja Surviviinispesifisiä olivat merkittäviä ennustavia tekijöitä ESCC potilaista. Kuitenkin monimuuttuja-analyysi osoitti, että Oct4 oli itsenäinen prognostista arvoa ESCC potilailla, mutta surviviinia ei ollut (

p

= 0,168, taulukko 3).

inhiboiva vaikutus shRNA Vektorit kohdistaminen Oct4 ja surviviinia ESCC Cell Lines

indentify onko tietty

pieni

hiusneula-RNA (shRNA) kohdistaminen Oct4

(Oct4-shRNA),

Surviviinispesifisiä

( sur-shRNA) B, tai kahden shRNAs (Dual-shRNA) kohdistettu sekä Oct4 ja surviviinia vaikutti ruokatorven syöpä solujen lisääntymisen, MTT-määritys suoritettiin havaitsemaan solujen elinkykyä. Solujen elinkelpoisuus ilmeisesti väheni Eca109 ja TE1 transfektoitujen solujen Oct4-shRNA ja Sur-shRNA verrattuna vanhempien tai Ctr-shRNA transfektoiduissa soluissa. Dual-shRNA aiheutti parannettu estävä vaikutus solujen elävyyden verrattuna shRNA vektorin kohdistaminen yksittäinen tekijä. Kuitenkin, ei ollut eroa solujen elinkelpoisuuden välillä Oct4-shRNA ja Sur-shRNA ryhmien (Fig. 3A).

(A) Vanhempien ja shRNA transfektoitiin Eca109 ja TE1 soluja viljeltiin 96-kuoppalevyillä tiheyteen 8 x 10

3 solua /kuoppa 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin methylthiazoletetrazolium (MTT), jonka aallonpituus on 490 nm,

#

p

0,01; Dual-shRNA: vektori, joka sisältää kaksinkertaisen shRNAs kohdistettu sekä Oct4 ja surviviinin. (B) Kun Eca109 solut transfektoitiin shRNA vektoreilla, 5 x 10

6 solua /ml kerättiin ja värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja PI, ja analysoitiin virtaussytometrialla. Prosenttiosuudet varhaisen apoptoosin näytettiin histogrammien tiedot olivat edustajat kolmen erillisen kokeen, ja määrälliset histogrammit yhdistettiin tiedot, virhe palkit ovat keskihajonnan (SD), *

p

0,05;

#

p

0,01. (C) Cell cycle mitattiin virtaussytometrialla. Tiedot solukierron näytettiin histogrammien *

p

0,05.

apoptoosi ESCC solulinjojen mitattiin FCM kanssa Anexin V-FITC- ja PI-värjäys. Hoidon jälkeen shRNA vektoreilla 48 tuntia, prosenttiosuudet varhaisen apoptoosin korotettiin Oct4-shRNA (13,4 ± 2,76%), Sur-shRNA (10,89 ± 2,21%) ja Dual-shRNA (17,79 ± 3,89%) ryhmiin verrattuna kanssa, että vanhempien soluissa (1,20 ± 1,01%) ja Ctr-shRNA (0,87 ± 0,64%) ryhmässä, erityisesti suurempi Dual-shRNA ryhmä (Fig. 3B). Verrattuna vanhempien ja Ctr-shRNA ryhmien prosenttiosuudet G2-vaiheen solut merkitsevästi pienempi Oct4-shRNA, Sur-shRNA ja Dual-shRNA transfektoitujen ryhmiä, mutta ei ollut merkittävästi eroja G1 ja S-vaiheessa olevien solujen ( kuva 3C).

Surviviinispesifisiä Expression liittyi Oct4 vuonna ESCC Solut

vuorovaikutuksen tutkimiseksi ja sääntelyn välillä Oct4 ja surviviinia Oct4-shRNA, Sur-shRNA ja Dual-shRNA vektorit suunniteltiin manipuloida kohdegeenin ilmentymistä ESCC solulinjoissa. Western blot ja RT-PCR-analyysi, Oct4 ja Surviviinispesifisiä positiivisesti ilmaistuna vanhempien Eca109 ja TE1 soluja. Oct4-shRNA ja Sur-shRNA vektorit voivat estää tietyn kohdegeenin ilmentymistä, ja Dual-shRNA vektori voi estää ilmentymisen sekä Oct4 ja surviviinin geenejä. Oct4-shRNA voisi myös alas-säädellä surviviinin ilmentymistä Eca109 ja TE1 soluja (Fig. 4A), mutta Sur-shRNA ei vaikuttanut Oct4 lauseke (Fig. 4B).

(EN) vanhempien ja shRNA transfektoitiin Eca109 ja TE1 soluja viljeltiin 96-kuoppalevyillä tiheydellä 8 x 10

3 solua /kuoppa 48 tuntia, ja ekspressio Oct4 ja surviviinin korjatun ESCC solut tutkittiin Western-blottauksella . Glyseraldehydi-3- phosphatedehydrogenase (GAPDH) käytettiin latauskontrollina. Suhteellinen bändi intensiteetti analysoitiin densitometrialla jälkeen normalisoitu GAPDH sisältö, *

p

0,05;

#

p

0,01. (B) Oct4 ja surviviinin mRNA: n ilmentymisen testattiin RT-PCR (RT-PCR). GAPDH: ta käytettiin sisäinen kontrolli. Suhteellinen bändi intensiteetti analysoitiin densitometrialla normalisoinnin jälkeen kanssa GAPDH sisältö, *

p

0,05;

#

p

0,01. Kaikki tiedot olivat edustajia 3 riippumattoman kokeen. Quantitative histogrammit yhdistettiin tiedot. Virhepylväät: keskihajonta (SD); Dual-shRNA: vektori, joka sisältää kaksinkertaisen shRNAs kohdistettu sekä Oct4 ja surviviinin.

Dynaaminen lokalisaatio Oct4 ja surviviinin ilmentäminen ESCC Solut

Tutkimme lisäksi dynaamista vaihtelua Oct4 ja surviviinin ilmaisun in ESCC soluissa konfokaali määrityksessä. 48 tunnin kuluttua transfektion Oct4-shRNA, Surviviinispesifisiä ilmentyminen erityisesti alassäädetty syövän solujen sytoplasmassa yhdessä lasku Oct4 ilmaisun solutumien. Kuitenkin, kun transfektion Sur-shRNA, The Oct4 ilmentymistaso ei muuttunut yhdessä lasku surviviinin ilmentymisen (Fig. 5).

vanhempien ja shRNA transfektoitiin Eca109 ja TE1 soluja viljeltiin 96- kuoppalevyille tiheydeksi 8 x 10

3 solua /kuoppa 48 tuntia, ja korjatut solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä, tutki Oct4 ja surviviinin ilmentyminen immuno fl loistelamppu konfokaali määrityksessä ja havaittiin alle laser-skannaus konfokaalimikroskoopilla .

keskustelu

Oct4, yhtenä tärkeimmistä transkriptiotekijät, on keskeinen rooli pluripotenttien kantasolujen [26]. Oct4 yhdessä Sox2 ja Nanog, ylläpitää kantasolujen pluripotenttisuus, itseuudistumiseen ja erilaistuminen [27]. Se on vähitellen tullut lupaava kasvain biomarkkereiden diagnosointiin itusolutuumorien [28]. Äskettäin on raportoitu, että Oct4 voitu havaita monissa somaattisten solujen syöpiä ruokatorvioireita, virtsarakon, keuhkojen ja maksan, ja sillä on suuri vaikutus potilaan ennusteeseen. Toiminta Oct4 voi moduloida sarja signaalin polkuja, kuten Wnt /β-kateniinin, TGF-β, JAK /STAT3-signaalien kulkureiteillä [29], [30], aktivoida tai rajoittaa alavirran kohdegeenejä. Lisäksi Oct4 ilmentyminen hiiren alkion kantasoluja on tarpeen suojaa apoptoosia ja tämä vaikutus voi liittyä STAT3 /surviviinin reitin [25].

surviviinia, äskettäin tunnistettu jäsen estäjien apoptoosin proteiinin (IAP: t ) perhe, säätelee olennaisen soluprosessia, kuten tukahduttaminen apoptoosin, solujen jakautumisen ohjaamiseen, ja angiogeneesin edistäminen [31]. Yhtenä merkittävimmistä syövän geenien, surviviini ilmentyy lähes kaikissa kasvaimissa, mutta ei havaita useimmissa normaaleissa aikuisen kudoksessa [32]. Surviviini pidettiin kohdegeenin syöpähoidon, ja alas-säätely surviviinin voisi tukahduttaa kasvaimen kasvua ja parantaa kasvainsolun herkkyyttä säteilylle ja kemoterapia edistämällä apoptoosia ja vähentää solujen elinkelpoisuuden. Drugs of LY2183108 [33] ja YM155 [34] kohdistaminen Surviviinispesifisiä oli otettu käyttöön kliinisissä kokeissa eri vaiheissa ja vaikutus oli lupaava. Vaikka kasvaimen kasvu nopeus hidastui vahvuus hiljentäminen surviviinia kasvaimia edelleen hallussaan kyky kehittämistä ja laajentamista ja riistää potilaiden elämää, mikä viittaa siihen, että Surviviinispesifisiä ei ollut yksittäinen tekijä ennustetta. Jäljelle jää tuntematon sääntelymekanismina välillä Oct4 ja surviviinin.

Yli-ilmentyminen Oct4 tai surviviinia ESCC vakiintuneen liitetty taudin etenemiseen, metastasoitunut levittäminen, kestävyys hoito [14], [18]. Siksi olemme havainneet sekä Oct4 ja surviviinia ilmaisun ESCC kasvain yksilöitä, ja totesi, että Oct4 ja Surviviinispesifisiä läheisesti liittyvät kirurgisen tuloksen ESCC potilaista. Potilaat, joilla Oct4-positiivisia tai Surviviinispesifiset kasvain esitetään paljon huonompi ennuste kuin ne, joilla Oct4-negatiivinen tai Surviviinispesifiset syöpäkasvain. Niistä alaryhmien, potilailla, joilla on Oct4-positiivisten /Surviviinispesifiset kasvain osoitti lyhyessä yleistä elinaika. Monimuuttuja ja univariate analyysejä, sekä Oct4 ja Surviviinispesifisiä liittyvät potilaiden ennusteeseen, ja Oct4 pidetään itsenäisenä tekijänä forcasting potilaiden yleistä elinaika. Vuodesta Tutkimuksessamme olemme tulleet siihen tulokseen, että Oct4 ja Surviviinispesifisiä olivat yhdessä liittyvät huonoon ennusteeseen on ESCC potilaista, mutta sääntely välisiä Oct4 ja surviviinia ESCC eivät ole vielä selvillä.

Inhiboivaa ilmaus Oct4 tai surviviinia ESCC solulinjat kanssa Oct4-shRNA tai Sur-shRNA vektorit vähensi G2-vaiheen soluissa ja lisäys solujen apoptoosin, ja co-tukahduttaminen Oct4 ja surviviinin jonka Dual-shRNA vektori johti parannettu vaikutus. Jotkut tutkimukset osoittivat, että esto surviviinin aiheuttaman solukierron pysähtymisen G2-M-vaiheessa [35], [36], mutta meidän tutkimuksessa havaittiin useissa G2-vaiheessa olevien solujen aleni valtavasti jälkeen tukahduttamalla surviviinin ilme. G1-S-vaiheessa, sekä G2-M vaihe, oli tärkeä tarkistuspiste solusyklin, joka ohjaa ja ylläpitää solujen prosessi tarkkuutta. Kerrottiin, että yli-ilmentyminen surviviini voi auttaa syöpäsoluja välittää G2-M tarkastuspiste [37], [38]. Samalla, Surviviinispesifisiä hallussaan kyky upregulate ilmaus sykliini D1 ja varmistaa syöpäsolujen siirtää G1-S tarkistuspiste sujuvasti ja saada kyky pysyviä lisääntymistä [38], [39].

Early apoptoosin nostettiin kanssa downregulation surviviinin monissa raporteissa. Tutkia tarkemmin molekyylitason mekanismi Oct4-mukana apoptoosia ja solukierron pysähtymisen Eca109 ja TE1 soluja, huomasimme, että ESCC solut ilmensivät alhaisempi Oct4 ja Surviviiniproteiini jälkeen transfektoitu Oct4-shRNA, mutta Sur-shRNA vain alaspäin säännelty Surviviinivasteita ilmaisun ja ei ollut muutosta Oct4 ilmaisun tasolla. Siksi, päättelimme, että Oct4 voi säädellä apoptoosia ja solunjakautumisen kautta surviviinin toiminto. Oct4 voi aktivoida useita signalointireittien hallita surviviinia ilmaisua, kuten STAT3, myc ja NFKB reittejä [30], [40] – [42], joka on kriittinen syöpäsolu selviytymisen ja antiapoptosis.

Tässä tutkimuksessa havaittiin, että yli-ilmentyminen Oct4 ja surviviinin ovat tärkeä ominaisuus ESCC etenemistä, ja Oct4 ilmentyminen korreloi surviviinipeptidillä ilmentymisen säätelyyn syöpäsolujen apoptoosin ja lisääntymistä. Kuitenkin molekyylien välisiä Oct4 ja Surviviinispesifisiä ovat hyvin monimutkaisia. Meidän pitäisi tehdä työtä selventää geneettinen piirteitä Oct4 ja surviviinia ja muotoilu tehokkaampi antitumor terapiaa ESCC.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

Viisikymmentä sairastavilla potilailla ESCC otettiin mukaan tutkimuksessa Changhai Hospital (Shanghai, Kiina) välillä 01/01-31/12, 2005. tutkimuksen hyväksyi Ethic komitean Toisen Military Medical University. Potilaat koostui 37 miestä ja 13 naista. Ikä vaihteli 47-72 vuotta vanhoja, ja mediaani-ikä oli 62 vuotta vanha. Kaikki potilaat, kunhan tietoisen kirjallisen suostumuksen. Resektoitua vauriot diagnosoitiin patologisesti kuin ESCC leikkauksen jälkeen. Seurannan potilaille aloitettiin toiminnasta päivämäärä elo 31, 2011. kokonaiselinaika (OS) määriteltiin ajanjakso alkamispäivä seurannan kuolinpäivästä tai päättymispäivän seurannan .

solulinjat ja Cell Culture

Ihmisen ESCC solulinjat, Eca109 ja TE1, ostettiin Cell Bank of Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina). Soluja ylläpidettiin yhtenä kerroksena RPMI-1640, jossa on 10% FBS: ää (naudan sikiön seerumia), 100 IU /ml penisilliini G: tä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa.

immunohistokemiallinen värjäys

tuoretta kasvaimet ja viereisten normaaleissa kudoksissa saatiin resektoitua näytteiden käytön aikana. Parafiini-sulautettujen peräkkäistä leikettä alistettiin immunohistokemiallinen tutkimista Oct4 ja surviviinin ilmentymisen käyttäen ensisijaisena vasta-aineita, mukaan lukien hiiren anti-humaani Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, USA) ja kanin anti-humaani-surviviini (RD Systems Inc, Minneapolis, MN, USA), ja ultraherkät streptavidiini Peroxidase Kit (Fuzhou Maixin biotekniikan kehittämisen Co, Fuzhou, Kiina). Niiden positiivisten solujen laskettiin 5 suuritehoisia kenttiä, ja arviointi Värjäysreaktio suoritettiin mukaisesti immunoreaktiivisia pisteet standardin ehdottamaa Friedrichs [43].

Rakentaminen ja transfektio shRNA Vektorit

shRNA sekvenssit ihmisen Oct4 (Oct4-shRNA: 5′-CCCTCACTTCACTGCACTG-3 ’) ja surviviinin (Sur-shRNA: 5′-GAAAGTGCGCCGTGCCATC-3′) syntetisoitiin ja kloonattiin, vastaavasti, tulee pGenesil vektoriin (Wuhan Genesil Biotekniikka Co, Ltd, Wuhan, Kiina), jossa koodaus sekvenssit ohjataan U6 promoottori. Dual-shRNA vektorin sisältävä kaksinkertainen shRNAs kohdistettu sekä Oct4 ja Surviviinispesifisiä ja mock ohjaus shRNA vektorin (Ctr-shRNA, 5’-GACTTCATAAGGCGCATGC-3 ’) on samanaikaisesti rakennettiin.

ESCC soluja log-vaiheen transfektoitiin shRNA vektorit pitoisuudella 4 ug /10

5 soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen Corporation Shanghai Representative Office, Shanghai, Kiina). Transfektoidut solut viljeltiin jatkuvasti 37 ° C: ssa CO

2-inkubaattorissa vielä 48 h, sitten talteen valmistamiseksi tutkia geenin ilmentymistä.

Western-blottaus-analyysi

Kerätyt solut lyysattiin fenyylimetaanisulfonyylifluoridia (PMSF) liuokseen, ja eristetty proteiini ajettiin elektroforeesilla natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja tutkittiin Western-blottauksella käyttäen anti-surviviinin ja anti-Oct4-vasta-aineita. Blotteja visualled että tehostettu kemiluminesenssi reagenssia (PerkinElmer Inc., Shanghai, Kiina).

semikvantitatiivinen RT-PCR (RT-PCR) B

48 h jälkeen transfektion, kokonais-RNA uutetaan Trizol reagenssilla (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) sadosta Eca109 ja TE1 solulinjoissa, ja liuotetaan diethylpyrocarbonatetreated (DEPC) vettä. Ilmaus Oct4 ja surviviinin tutkittiin käyttäen Takara Reverse Transcription System Kit (Takara Biotechnology Co Ltd, Dalian, Kiina), jonka Oct4 alukkeita (sense: 5′-CAG TCGTCAGCGTCGTCGTTGTAAGCTGCGGCCC-3 ’, antisense: 5’-ACGCGTCG ACTCAGTTTGAATGCATGGGAG -3 ’, tuotteet 480 bp) ja surviviinin alukkeita (sense: 5′-CGGAATTCACCATGGGTGCCCCGACG-3′, antisense: 5’-GAAGATC TTCAATCCATGGCAGCCAG-3 ’, tuotteet 448 bp). Glyseraldehydi-3- phosphatedehydrogenase (GAPDH) käytettiin lastaus valvonta alukkeita (sense: 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ’, antisense: 5′-TCCACCACCCTGT TGCTTGTA-3’, tuotteet 120 bp). Bändit tuotteiden elektroforeesi etidiumbromidia (EB) -agarose geeli analysoitiin semikvantitatiivisesti by harmaasävy densitometrian analyysi.

analyysi Cell Cycle ja apoptoosi virtaussytometrialla (FCM) B

48 tunnin kuluttua ja transfektio, korjatut solut pestiin 0,1 M fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja suspendoitiin uudelleen solujen 0,1 M PBS: llä pitoisuuteen 10

6 solua /ml. Osa solut kiinnitettiin 1 ml esijäähdytetty 70% alkoholia yli yön 4 ° C: ssa, jota seuraa inkubointi propidiumjodidilla (PI) liuosta pitoisuutena 50 ug /ml ja RNaasi A: ta pitoisuudessa 20 ug /ml 30 min pimeässä. Solusykli analysoitiin FCM (FACS420, BD Biosciences, San Jose, CA). Toinen osa soluja inkuboitiin 5 ui anneksiini V-FITC in 195 ul sitomispuskurissa pimeässä 10 minuutin ajan. Soluja sentrifugoitiin 1000 g: ssä 5 min ja suspendoitiin uudelleen 190 ui sitomispuskuria ja 10 ui PI, minkä jälkeen fl uorescence analyysi.

Methylthiazoletetrazolium Pitoisuus

Eca109 ja TE1 solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 8000 solua /kuoppa ja transfektoitiin shRNA edellä kuvatulla vektorilla. 48 tunnin kuluttua, 3- (4, 5) -dimethylthiahiazo (z-y1) -3,5-diphenytetrazoliumromide (MTT) 5 mg /ml, lisättiin kuhunkin kuoppaan ja jatkuvasti inkuboitiin 4 tuntia. Sen jälkeen lisättiin 150 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO) kuhunkin kuoppaan, absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä.

Immuno fl loistelamppu konfokaali Pitoisuus

Cancer solut kerättiin ja kiinnitettiin 4% formaldehydiä 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa, sitten pestiin 0,1 M PBS: llä ja käsiteltiin 0,3% Triton X-100, jonka jälkeen inkuboitiin ilmoitetuilla Oct4 (1:100) ja surviviinin (1:100) primaaristen vasta-aineiden 4 ° C: ssa yön yli, ja toisen vasta-aineet, fl uorescein isotiosyanaatti (FITC) konjugoidulla anti-kani-IgG: tä tai syaniini-3 (Cy3) -leimattua vuohen anti-hiiri-IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), huoneenlämpötilassa 40 minuutin ajan pimeässä. Solut värjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) ja havaittiin alle laser-skannaus -konfokaalimikroskoopilla.

Tilastollinen analyysi

chi-neliö testi ja Spearmanin rho korrelaatio käytettiin suhteen analysoimiseksi ja korrelaatio suhteellisen geeniekspression ja kliinisten patologisten tietojen. OS arvioitiin Kaplan-Meier menetelmää ja merkittävä ero OS laskettiin log-rank-testi. Yhden ja usean analyysit suoritettiin käyttäen Coxin suhteellista riskin malliin. Kokeelliset tiedot edustivat kolmen erillisen kokeen, ja analysoitiin tilastollisesti kaksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) käyttäen PASW Statistics ohjelmistoversio 18,0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA). Erot katsottiin olevan merkittäviä varten

p

0,05.