Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

lisääntymistä indusoivan ligandin (huhtikuu) kuuluu kasvain (TNF) Super perhe. Se sitoutuu sen reseptoreihin ja on mukana useita prosesseja aikana kasvaimen kehittymisen ja kasvainsolujen lisääntymistä. Korkea APRIL ilmentymisen läheisesti korreloi kasvun, metastaasin, ja 5-FU lääkeresistenssin paksusuolen syöpä. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää tietyn huhtikuu sitojapeptidi (BP) voi estää huhtikuu toimintaa, jota voitaisiin käyttää mahdollisena hoito ja peräsuolen syövän.

Methods

faagiesittelykirjaston käytettiin tunnistamaan peptidejä, jotka sitovat selektiivisesti liukeneva yhdistelmä-ihmisen huhtikuu (sAPRIL). Peptidit, joilla on korkein sitoutumisaffiniteetti sAPRIL tunnistettiin käyttäen ELISA. Vaikutukset sAPRIL-BP soluproliferaatioon ja solusyklin /apoptoosin

in vitro

arvioitiin käyttäen CCK-8 määritys ja virtaussytometria, vastaavasti.

in vivo

hiirimallissa paksusuolisyövän käytettiin määrittämään antituumoritehoon on sAPRIL-BP.

Tulokset

kolme ehdokasta peptidejä karakterisoitiin kahdeksasta faagin kloonit, joilla on korkea sitoutumisaffiniteetti sAPRIL. Peptidi, jolla on korkein affiniteetti valittiin lisäkarakterisointia. Tunnistettu sAPRIL-BP tukahdutetaan kasvainsolujen proliferaatiota ja solusyklin etenemisen LOVO-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla.

In vivo

in hiiren peräsuolen haaste mallissa sAPRIL-BP vähensi kasvainsolujen kasvua nude-hiirissä estämällä proliferaatiota ja aiheuttamaan apoptoosin kasvaimen. Lisäksi käytettäessä

in vivo

etäpesäkkeitä malli, sAPRIL-BP maksan etäpesäke paksusuolisyövän soluja.

Johtopäätökset

sAPRIL-BP merkittävästi tukahdutti kasvaimen kasvua

vuonna vitro

ja

in vivo

ja saattaisi olla ehdokkaana hoitoon peräsuolen syöpiä, jotka ilmentävät korkeita APRIL.

Citation: Hän Xq, Guan J, Liu F, Li J, hän Mr (2015) tunnistetiedot sAPRIL sitojapeptidi ja sen kasvunestomenetelmää vaikutukset peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 10 (3): e0120564. doi: 10,1371 /journal.pone.0120564

Academic Editor: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan

vastaanotettu: 01 elokuu 2014; Hyväksytty: 05 helmikuu 2015; Julkaistu: 31 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 He et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat aihe Guangzhou Science and Technology Suunnitellut projektit (2012J4300091).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

peräsuolen syöpä on yksi yleisimmistä ruoansulatuskanavan syöpien maailmanlaajuisesti ja potilaat kuolevat usein syöpäsolumetastaasi [1]. Perinteinen kemoterapia on haittapuolia kuten, eriasteisia solusytotoksisuuden ja armottoman vaikutuksia, jotka voivat vahingoittaa terveiden kudosten, nämä haittavaikutukset on haitallinen vaikutus potilaan elämänlaatuun. On ratkaisevan tärkeää kehittää kohdennettuja syövän hoito, joka on alhainen sytotoksisuus ja on erittäin selektiivinen parantaa ennustetta ja eloonjäämisaste peräsuolen syöpäpotilailla.

Leviämisen indusoiva ligandia (APRIL) on ligandin tuumorinekroosi (TNF) superperheen, joka toimii liukoisena tekijä [2]. Huhtikuu ensisijaisesti ilmaistaan ​​hematopoieettisten solujen ja on biologisia rooleja B-solujen eloonjäämistä ja T-solujen aktivaation [3-5]. Normaalit kudokset ilmentävät hyvin alhainen huhtikuu kuitenkin syöpäsolun linjat ja kasvaimet kuten ruoansulatuskanavan syöpä, hematologiseen pahanlaatuisuuteen, ja uroteelisyöpä, ilmentävät korkeita APRIL [6-9]. Huhtikuu on mukana useita liittyvä prosessi kasvaimien syntyyn kuten edistämään kasvainsoluproliferaation ja selviytymistä eri syöpätyyppien [10-14]. Kolorektaalisyövässä, korkea ilmentyminen APRIL korreloi kasvaimen kasvua, etäpesäkkeitä, ja 5-fluoriuridiinin (5-FU) vastus [12, 13, 15].

APRIL saa aikaan biologisia toimintoja olemalla vuorovaikutuksessa useiden reseptoreihin. Tunnetut huhtikuu reseptorit sisältää B-solun kypsymisen antigeeni (BCMA), transmembraani- aktivaattori ja syklofiliinistä ligandin Interactor (TACI), ja hepariinisulfaattiproteoglykaanien (HSPGs) [7, 16]. BCMA ensisijaisesti ilmentyy kypsissä B-lymfosyyteissä [17], mutta on myös ilmentyy voimakkaasti useiden myeloomasoluja [18]. TACI ilmentyy ensisijaisesti kypsien B-solujen ja plasmasolujen infiltraatio [19], ja HSPGs ovat laajasti ilmaistuna pinnalla monien nisäkässolujen [20]. Sitoutumisessa näihin reseptoreihin, huhtikuu tehostaa lisääntymistä tai tukahduttaa apoptoosin edistämiseksi kasvaimen etenemistä läpi useita molekyylitason mekanismeja. Vuonna krooninen lymfaattinen leukemia (B-CLL), liukeneva huhtikuu stimuloi NF μB aktivointia, ja suojaa B-CLL-solujen spontaanin tai lääkkeen aiheuttama apoptoosin [21]. Non-Hodgkin-lymfooman (NHL) B-solujen, rekombinantti huhtikuu aktivoi NF μB, ylössäätelee anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja Bcl-x L, ja downregulates pro-apototic proteiinin Bax inhiboimaan apoptoosin [14]. Vuonna glioomasolut, ektooppinen ilmentyminen APRIL antaa suojan kuolemasta ligandi /reseptori-välitteisen apoptoosin mahdollisesti säätelemällä antiapoptoottista proteiinia X-linked estäjä apoptoosin proteiinia (XIAP) [22]. Vuonna multippelimyeloomaa huhtikuu edistää solusyklin etenemistä lisäämällä S-vaiheeseen ja G

2-M vaihe [23]. Ihmisen peräsuolen syöpäsoluja, kaatamalla huhtikuu käyttäen RNA-interferenssi lohkoja transformoiva kasvutekijä (TGF) -μ1 signalointi ja aktivoitumista ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasien (ERK) aiheuttaa solukierron pysähtymisen ja apoptoosin [24].

kohdistaminen huhtikuu tukahduttaa kasvaimen kasvua, lisääntymistä, ja selviytyminen voisi olla toteuttamiskelpoinen strategia hoitoon peräsuolen syöpä. Toiset ovat osoittaneet, että hiljentäminen huhtikuu vähentää kasvainsoluproliferaation ja etäpesäkkeiden kolorektaalisyövässä [25-27]. Olemme aiemmin osoittaneet, että downregulation APRIL vähentää leviämisen, lisää apoptoosia ja parantaa herkkyyttä 5-FU kemoterapiaa peräsuolen solulinjassa LOVO, joka ilmentää suuria määriä huhtikuu [28]. Gao

et al

. on menestyksekkäästi kehittänyt anti-huhtikuu monoklonaalinen vasta-aine ja osoitti antiproliferatiivinen vaikutus

in vitro

ja

in vivo

[29]. Muut ryhmät ovat käyttäneet rekombinantti sAPRIL reseptorien tai mutantti-sAPRIL kilpailla endogeenisen sAPRIL sitoutumisesta sen reseptoreihin [30, 31]. Verrattuna muihin strategioita, huhtikuu, kuten siRNA tai anti-huhtikuu vasta, polypeptidit omaavat useita etuja, kuten alhainen immunogeenisyys, korkea turvallisuus, synteesin helppous ja puhdistuksen, kyky tunkeutua kudoksia ja elimiä, ja vähemmän myrkyllisiä. Tunnistaminen ja syntetisointi anti-kasvain polypeptidejä on tullut suosittu strategia kehittämällä kohdennettuja syöpälääkkeiden [32, 33]. Ei kuitenkaan huhtikuu spesifisiä polypeptidejä on raportoitu tähän mennessä. Siksi Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa sAPRIL erityisten sitovien peptidien avulla faagiesittelykirjaston, ja arvioida sen

in vitro

ja

in vivo

syöpälääkkeen vaikutuksia tarjota terapeuttista ehdokas käytettäväksi vastaan ​​ja peräsuolen syöpiä, jotka ilmentävät korkeita APRIL.

Materiaalit ja menetelmät

In vitro huuhtomaan

Ihmisen yhdistelmä-sAPRIL (R streptomysiinillä 37 ° C: ssa 5% CO

2.

In vivo -mallissa

Kaikki eläinkokeet tehtiin vakiintuneiden ohjeiden mukaisesti, ja hyväksytty eläinten hoidon ja käytön komitean Nanfang sairaalassa. BALB /c-nude-hiiriin (4-6 viikon ikäiset) hankittiin Guangdongin Medical Laboratory Animal Center ja ylläpidetään gnotobioottisissa olosuhteissa kasvatetusta olosuhteissa. LOVO-solut (2 x 10

6 solua 100 ui PBS) injektoitiin subkutaanisti (100 ul /injektio; yhteen injektiokohtaan /kasvain) ja tuumorin koko mitattiin joka 3 päivä. 3 viikon kuluttua, ihonalaista kyhmy pidettiin kasvain, jolloin se oli 100-200 mm

3. Hiiret jaettiin kolmeen ryhmään, ja injektoitiin kasvaimen PBS: llä (kontrolli), 20 mg /kg sAPRIL-BP (pieni annos), tai 40 mg /kg sAPRIL-BP (suuri annos) joka toinen päivä kahden viikon ajan. Kasvaimen tilavuus (V) laskettiin käyttäen kaavaa: V = AB

2/2, jossa A on suurin halkaisija, ja B on halkaisija kohtisuorassa A.

peräsuolen syövän maksan etäpesäkkeiden malli, LOVO-solut (2×10

6 solua /100 ui) ruiskutettiin pernaan sen jälkeen, kun laparotomy. Kolme viikkoa injektion jälkeen, hiiret satunnaistettiin 3 ryhmään (N = 5) ja intraperitoneaalisesti PBS: ää (200 ui) kontrollina, alhaisen annoksen sAPRIL-BP (20 mg /kg), tai korkean annoksen sAPRIL- BP (40 mg /kg) päivinä 22, 24, 26, 30, 32, ja 34 jälkeinen kasvaimen injektion. Hiiret lopetettiin 35. päivänä maksa kerättiin ja lukumäärä ja koko metastasized kyhmyt määritettiin.

RT-PCR (RT-PCR) B

RNA peräsuolen syöpäsolun linjat uutettiin Trizol (Invitrogen, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA: ta kustakin näytteestä käytettiin cDNA-synteesi käyttäen RevertAID kit (Fermentas, Kanada). PCR suoritettiin käyttäen PCR-esiseos (SBS Genetech, Kiina). Alukesekvenssejä APRIL olivat: eteenpäin 5′-AGAAGAAGCAGCACTCTGTC-3 ’ja reverse 5′- CCATGTGGAGAGAGGTTAAG-3′ (tuote 394 bp). GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. GAPDH-alukkeet olivat: eteenpäin 5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3 ’ja reverse 5′-AGGGTCTACATGGCAACTG-3’ (tuote 240 bp). PCR-reaktio-olosuhteet olivat: 95 ° C 3 min, 94 ° C: ssa 50 s, 58 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C 1 min, 32 sykliä, mitä seurasi pidennys 72 ° C: ssa 7 min. PCR-tuotteet erotettiin käyttäen agaroosigeelielektroforeesilla ja visualisoitiin UV-säteilyllä.

Western-blottaus

Western blottaus suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti. Käytetyt vasta-aineet olivat vastaan ​​APRIL sykliini D1, sykliini A, sykliini E, sykliini B1, CDK4, CDK6, p53, p27, ja p16 (1: 1000, Abcam, USA) ja kanin anti-GAPDH (1: 2000, ZSGB- BIO, Kiina).

Soluproliferaatiomääritys

LOVO ja SW620-solut ympättiin 96-kuoppaviljelylevyillä (2 x 10

3 solua /kuoppa) 200 ui tilavuus yössä . Viisi annosta rekombinantti sAPRIL sitovaa peptidiä (5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, ja 80 uM) lisättiin 24 h, 48 h ja 72 h. Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen CCK-8 kit (Beyotime Biotekniikan instituutti, Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

solu- syklin ja apoptoosin analyysi

LOVO-solut ympättiin 6-kuoppaisille kulttuuri levyt (1 x 10

5 solua /kuoppa /ml). 24 tunnin kuluttua, sAPRIL sitovaa peptidiä (20 uM tai 40 uM) lisättiin vielä 48 tunnin ajan. Solusyklin analyysi virtaussytometrialla (BD LSR-virtaussytometriin, BD Biosciences, USA), solut otettiin talteen ja kiinnitettiin 7% etanolia 24 tunnin ajan 4 ° C: ssa. PBS-pesun jälkeen solut värjättiin propidiumjodidilla (PI) liuosta (50 ug /ml PI, 100 ug /ml RNAasi-A, 0,2% Triton X-100) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Aineisto analysoitiin käyttämällä Modfit LT ohjelmisto. Apoptoosin analyysi virtaussytometrialla, korjatun solut värjättiin apoptoosin havaitsemiseen kit (Beyotime, Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut värjättiin 500 ul: aan sitoutumispuskuria, 5 ui anneksiini V-FITC, ja 5 ui PI 5-15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä.

immunohistokemia värjäys

Kaikki ksenograftikasvaimissa kiinnitettiin 10% formaliinilla ja parafinoidut leikkaamista varten. Antigeenin haku, kudosleikkeet asetettiin 0,01 M sitraattipuskurissa pH: ssa 6,0, ja sitten kuumennettiin 98 ° C: sta 100: ssa 15 minuutin ajan mikroaaltouunissa. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin inkuboimalla kohdissa 3% vetyperoksidia (tuoreen metanolissa) 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten kudosleikkeet värjättiin primaaristen vasta-aineiden, jotka ovat spesifisiä Ki-67 (1: 100, Abcam, USA) ja pilkottiin kaspaasi-3 (1: 200, CST, USA). Konjugoitua kanin anti-hiiri-IgG sekundääristä vasta-ainetta (1: 200, Abcam, USA) käytettiin. Positiivinen värjäys visualisoitiin DAB. Kuvat otettiin käyttäen Olympus BX41 valomikroskoopilla. Prosenttiosuus Ki67-positiivisia kasvainsoluja (proliferatiivinen indeksi) ja prosenttiosuus pilkkoa kaspaasi-3-positiivisia kasvainsoluja (apoptoosin indeksi) määritettiin kolme erillistä kentät sisältävät vähintään 1000 viereisten solujen kunkin kuvan.

tilastot

Kaikki tulokset analysoitiin SPSS version 17.0 ohjelma. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta (SD), ellei toisin mainita. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA tai kaksisuuntaisia ​​t-testiä. Ero ryhmien katsottiin merkitseväksi kun

p

0,05.

Tulokset

tunnistaminen erityisiä sAPRIL-sitoutuvan peptidin

faagikirjastoa käytettiin tunnistamiseksi 20 yhden ilmentävien kloonien potentiaali sAPRIL sitovia peptidejä. Kloonit valittiin satunnaisesti neljän seulontakierroksen. Kahdeksan yksittäinen kloonit tunnistettiin ”positiivinen”, joka osoittaa korkeaa sitoutumisaffiniteettia (määritellään OD ≥6-kertainen OD positiivisen kontrollin) varten sAPRIL ELISA (kuvio 1A). Kahdeksan kloonia, jota edustaa kolme DNA-sekvenssit, jotka vastaavat seuraavaa sitovia polypeptidejä (BP): AAAPLAQPHMWA, SSTTTSDKYLSA, ja SNLHDNNTEKNV (taulukko 1). Affiniteetti sAPRIL mitattiin kunkin polypeptidin ELISA: lla ja verrattiin liity polypeptidi (HWDPFSLSAYFP) negatiivisena kontrollina. Kolmen peptidin tunnistettiin käyttäen faagikirjastoa oli sAPRIL sitoutumisaffiniteetit, jotka olivat 13,7, 10,8 ja 9,3-kertaa suurempi kuin kontrolli-peptidiä, vastaavasti (kuvio 1 B). Sitoutumisaffiniteetti on sAPRIL-BP testattiin myös toisen TNF-superperheen ligandi BAFF (B-solun aktivoitumista tekijä TNF-perheen). Sitoutumisaffiniteetit kunkin sAPRIL-BP olivat 1,2, 1,1, ja 0,9, vastaavasti (kuvio 1 B). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että sAPRIL-BP sitoutuu spesifisesti huhtikuu eivätkä ristireagoi BAFF. sAPRIL-BP1 (AAAPLAQPHMWA) oli korkein sitoutumisaffiniteetti ja käytettiin myöhemmin

in vitro

arvioida, se kykeni inhiboimaan sAPRIL sitoutuminen kiinteän paksu- ja peräsuolisyövän solulinjaa LOVO soluja (kuvio 1 C). sAPRIL-BP1 osoitti annoksesta riippuvaa estävä vaikutus sAPRIL sitoutumisen LOVO-solut. Näin ollen, sAPRIL-BP1 (jäljempänä sAPRIL-BP) valittiin edelleen toiminnallisen kuvauksen.

(A) sitoutumisaffiniteetti faagikloonia No.1-20 varten sAPRIL määritettiin ELISA: lla. Klooni 21 käytettiin positiivisena kontrollina. Kannen muutos optinen tiheys normalisoidaan positiivisen kontrollin. Klooneja, jotka oli vähintään 6 kertaa suurempi affiniteetti kuin positiivinen kontrolli katsottiin ”positiivinen” varten sAPRIL sitova. (B) kolme sitovat peptidit syntetisoitiin ja niiden sitoutumisaffiniteetti kanssa sAPRIL (mustat palkit) määritettiin ja verrattiin negatiivisen kontrollin (NC) käyttäen ELISA. Ristireaktiivisuutta arvioitiin mittaamalla sitoutumisaffiniteetti BAFF (harmaat pylväät). (C) Clone BP1 (sAPRIL-BP) sekoitettiin sAPRIL eri annoksina kilpailla sitoutumisesta kiinteitä LOVO-solut.

Anti-proliferatiivinen vaikutus sAPRIL sitovien peptidien LOVO-solut

arvioimiseksi roolin huhtikuu kolorektaalisyövässä, huhtikuu ilmentyminen tutkittiin viidessä paksu- ja solulinjoissa RT-PCR (kuvio 2A ja 2B) ja western-blottauksella (kuvio 2C ja 2D). HCT116 ja LOVO solulinjoissa oli merkitsevästi korkeampi huhtikuu mRNA (

p

0,05) ja proteiini (

p

0,05) kuin SW480, SW620 ja HT29 solulinjat. Siksi vaikutus sAPRIL-BP arvioitiin LOVO ja HCT116 (huhtikuu

korkea) soluja, ja SW620 ja HT-29 (huhtikuu

matala) soluja. Sen määrittämiseksi oliko annoksen vaikutuksia soluproliferaatiota mitattiin eri pitoisuuksia sAPRIL-BP. Nopeus leviämisen inhiboitui merkittävästi (

p

0,05) käsittelemällä sAPRIL-BP LoVo ja HCT116-soluissa (kuvio 3A) on ajasta ja annoksesta riippuvaisella tavalla. Tämä oli kuitenkin ei tapahtunut SW620 ja HT-29-soluissa (kuvio 3B). Siellä tulokset viittaavat siihen, että antiproliferatiivisia vaikutuksia sAPRIL-BP ovat spesifisiä huhtikuu

korkea soluja.

huhtikuu ilmentyminen arvioitiin viidessä paksu- solulinjoista (merkitty) käyttäen RT-PCR (A) ja Western-blottaus (C). Edustavia geeli kuvia näytetään. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Optinen tiheydet APRIL mRNA (B) ja proteiini (D) nauhat analysoitiin ja normalisoitiin sisäisen valvonnan. *

P

0,05 verrattuna SW620, HT-29, tai SW480.

(A) huhtikuu

korkea LOVO ja HCT116-solut ja (B) huhtikuu

alhainen SW620 ja HT-29-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella sAPRIL sitovat peptidit 24, 48, ja 72 h, ja proliferaatio määritettiin käyttäen CCK-8 kit. Nopeus leviämisen estäminen laskettiin: (%) = [(keskiarvo OD

control-keskiarvo OD

kokeellinen) /keskiarvo OD

control] x 100%.

vaikutukset sAPRIL sitovien peptidien solusyklin ja apoptoosin LOVO-solut

Koska syöpäsolujen lisääntymistä säädellään ensisijaisesti solusyklin, seuraavan kerran määritetty, jossa vaihe solusyklin vaikutti sAPRIL hoitoon. Perustuen leviämisen tuloksia (kuvio 3A), päätimme testata 20 uM ja 40 uM sAPRIL-BP LoVo soluissa määrittää, miten estämällä sAPRIL muuttanut solusyklin ja apoptoosin. Virtaussytometrillä, sAPRIL-BP lisäsi merkittävästi solujen prosenttiosuus G

0 /G

1 vaihe pienen annoksen (20 uM sAPRIL-BP: 73,1 ± 0,6%;

p

0,001) ja suuren annoksen (40 uM sAPRIL-BP: 76,2 ± 0,1%;

p

0,001) verrattuna Vehicle ohjaus (65,2 ± 0,8%). sAPRIL-BP myös vähensi merkittävästi solujen prosenttiosuus G

2 /M vaiheessa verrattuna Vehicle ohjaus (24,3 ± 0,8%) on pienellä annoksella (20 uM sAPRIL-BP: 15,1 ± 0,5%;

p

0,05) ja suuren annoksen (40 uM sAPRIL-BP: 13,7 ± 0,5%;

p

0,001; Kuva 4A ja 4B). Tämä viittaa siihen, että antiproliferatiivisia vaikutuksia sAPRIL-BP LoVo soluissa johtuvat kertyminen solujen G

0 /G

1 vaihe, joka estää solusyklin etenemisen. Mitä apoptoottinen vaikutuksia sAPRIL-BP, virtaussytometria analyysi osoitti, että sAPRIL-BP oli annoksesta riippuvaa vaikutuksia prosenttiosuus Lövön solujen alussa apoptoosin (PI

– anneksiini V

+ solut). Verrattuna Vehicle ohjaus (1,76 ± 0,12%) alhaisen annoksen (20 uM sAPRIL-BP: 2,49 ± 0,23%;

p

0,05) ja suuren annoksen (40 uM sAPRIL-BP: 3,82 ± 0,36 %;

p

0,05) lisäsi merkittävästi varhain apoptoottisia soluja (kuvio 4C ja 4D). Tutkimme lisäksi mahdollisia molekyylimekanismin taustalla vaikutusta sAPRIL-BP solusyklin etenemisen. Hoito sAPRIL-BP ei ollut vaikutusta sykliini A, B, E1, CDK6, p53, P27, ja p16 ilmaisu (kuvio 5A). Mutta ilmaus G1 /S-spesifisen proteiinin sykliini D1 (kuvio 5A ja 5B) ja solunjakautumisen kinaasi sykliinistä riippuvaisen kinaasin 4 (CDK4) (kuvio 5A ja 5C) on vaimentua annoksesta riippuvaisella tavalla käsittelemällä sAPRIL- BP.

LOVO-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella sAPRIL-BP: ssa 48 tuntia. Solut värjättiin PI solusyklin analyysi (A ja B) ja PI + anneksiini V apoptoosin analyysi (C ja D) virtaussytometrialla. *

p

0,05 verrattuna Ajoneuvojen valvonta; #

p

0,05 verrattuna alhaisen annoksen ryhmässä.

LOVO-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella sAPRIL-BP: ssa 48 tuntia. (A) ilmentyminen tasolla osoitetun solusyklin proteiineja arvioitiin Western-blottaus-analyysi. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Proteiini koko sykliini D1 on 34 kDa, sykliini 49 kDa, sykliini E 50 kDa, sykliini B1 55 kDa, CDK4 34 kDa, CDK6 37 kDa, p53 53 kDa, P27 27 kDa, p16 40 kDa, ja GAPDH 36 kDa. Optinen tiheydet sykliini D1 (B) ja CDK4 (C) Proteiinivyöhykkeet analysoitiin ja normalisoitiin sisäisen valvonnan kertainen muutos. *

P

0,05 verrattuna Ajoneuvo ryhmään; #

P

0,05 verrattuna 10pM ryhmään, †

P

0,05 verrattuna 20 uM ryhmään.

vaikutus sAPRIL-BP on -ksenografti kasvaimen kasvua

Tämän jälkeen

in vivo

vaikutus sAPRIL-BP arvioitiin peräsuolen syövän ksenograftimallissa. LOVO-solut injektoitiin ihonalaisesti nude-hiiriin, jota seuraa ohjattu, alhainen (20 mg /kg) tai korkea (40 mg /kg) annos sAPRIL-BP injektoitiin kasvaimen, kun kasvain on perustettu. Hiiret tapettiin 14. päivänä, edustaja kuvia hiirillä ja kasvaimia, on esitetty kuviossa 6A. Hoidon sAPRIL-BP vähensi annosriippuvaisesti kasvaimen tilavuus (kuvio 6A) ja kasvaimen paino (kuvio 6B) hiirimallissa. Päivästä 8 sAPRIL-BP injektio, kasvaimen koko pienen ja suuren annoksen ryhmissä merkitsevästi

(p

0,05) pienempi kuin kontrolliryhmässä (kuvio 6C).

LOVO soluja ihon alle nude-hiiriin ja annettiin kasvaa 3 viikkoa. Kun kasvain oli laatii, hiiret jaettiin 3 ryhmään (N = 5) ja käsiteltiin PBS: llä (kontrolli), alhainen (20 mg /kg), tai korkea (40 mg /kg) annos sAPRIL-BP joka toinen päivä . (A) Edustavia esimerkkejä kasvaimista kunkin ryhmän on esitetty. Ylälevy: Mittakaava, 8 mm. Pohjalevy: Mittakaava, 7 mm. (B) Hiiret tapettiin kahden viikon kuluttua hoidon sAPRIL-BP: n ja kasvaimen painot kirjattiin. *

p

0,05 verrattuna kontrolliin. #

p

0,05 verrattuna alhaisen annoksen ryhmässä. (C) Kasvaimen tilavuus kirjattiin kahden päivän välein hoidon aikana. *

p

0,05 verrattuna kontrolliin.

vaikutus sAPRIL-BP soluproliferaatioon ja apoptoosin ksenograftissa kasvain

Jotta voitaisiin edelleen tutkia mekanismi joka sAPRIL-BP estää ksenografti kasvaimen kasvua, teimme H 0,05 verrattuna kontrolliin. #

p

0,05 verrattuna 20 mg /kg ryhmässä.

vaikutus sAPRIL-BP on ksenograftissa tuumorietäpesäke

Jotta voitaisiin edelleen tutkia, sAPRIL- BP hoito estävät etäpesäkkeiden perustimme maksan etäpesäke mallin ruiskuttamalla LOVO solujen perna. Edustavia kuvia metastaattisen maksan kasvain oli kuviossa 8A. Hoito sAPRIL-BP vähensi etäpesäkenystyröiden annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 8B;

p

0,05). Jakauma Kyhmyn kokoja oli samanlainen molemmissa ryhmissä (kuvio 8C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, sAPRIL-BP hoitoa ei ainoastaan ​​vähentää kasvaimen kasvua, mutta myös vähentynyt maksan etäpesäkkeiden hiirimallissa paksusuolisyövän.

LOVO-solut ruiskutetaan perna nude-hiirten tarkkailla kokeellista maksan etäpesäke. Kolme viikkoa injektion jälkeen, hiiret jaettiin 3 ryhmään (N = 5) ja käsiteltiin PBS: llä (kontrolli), alhainen (20 mg /kg), tai korkea (40 mg /kg) annoksina sAPRIL-BP joka toinen päivä. Hiiret tapettiin kahden viikon kuluttua hoidon sAPRIL-BP. (A) edustaja kuvia metastasoituneen maksakasvaimien kustakin ryhmästä näkyvät. (B) numerot etäpesäkenystyröiden hiirtä kohti kirjattiin. *

P

0,05 verrattuna kontrolliin. #

P

0,05 verrattuna alhaisen annoksen ryhmässä. (C) numerot etäpesäkenystyröiden kanssa tarvittavan kokoista kirjattiin. Kokonaismäärät etäpesäkenystyröiden: n = 197 (Con), n = 130 (20 mg /kg), ja n = 84 (40 mg /kg).

Keskustelu

tässä tutkimuksessa olemme määritelleet ja karakterisoivat sAPRIL-BP, joka voisi olla potentiaalinen terapeuttinen peräsuolen syövän.

In vitro

tutkimuksissa osoitettu sekä antiproliferatiivisia ja proapoptoottisiin vaikutukset sAPRIL-BP. Johdonmukaisesti, sAPRIL-BP alennetaan

in vivo

kasvaimen kasvua vähentämällä kasvaimensisäisenä solujen lisääntymisen ja lisäämällä kasvaimensisäisenä solujen apoptoosin. Lisäksi sAPRIL-BP vähensi maksan etäpesäkkeiden peräsuolen syövän soluja hiirimallissa. Vaikutukset sAPRIL-BP tunnistettu tässä tutkimuksessa täytyy testata edelleen kliinisissä kokeissa. Anti-syöpä polypeptidejä on useita etuja, kuten helppo synteesi ja puhdistus, alhainen immunogeenisyys ja korkea levinneisyysaste. Tämä sAPRIL-BP voisi olla toteuttamiskelpoinen strategia hoitoon huhtikuu

korkea syöpiä [34-38].

faagiesittelykirjasto sisältää suuren määrän erilaisia ​​polypeptidejä ilmaisi pinnalla faagien [39]. Tätä tekniikkaa käytetään laajalti seulontaa lääkekohteiden, reseptorin agonisti /antagonisti, antigeenin epitoopin analyysi, rokotteen suunnittelu ja analyysi proteiinien rakenteeseen [40-42]. Käytimme tätä menetelmää kehittää sAPRIL spesifisen sitoutumisen peptideihin. Koska yksi mekanismeista kasvaimien synnyn on häiriöitä tasapaino solujen lisääntymistä ja apoptoosia, syöpälääkkeen joiden piiriin kuuluvat proliferaation ja /tai aiheuttamaan apoptoosin syöpäsoluissa suositellaan [43, 44]. Oletimme, että sitovat peptidit, jotka kilpailevat endogeeninen huhtikuu reseptorien sitoa liukoista muotoa huhtikuu, olisi terapeuttista tehoa vastaan ​​huhtikuu

korkea syöpiä. Samanlaisia ​​strategioita kohdistaminen huhtikuu kuten käyttämällä liukoisia muotoja houkutuslintuna reseptorien kilpailla ligandin sitoutumista ja hiljentäminen huhtikuu, on osoitettu estävän kasvaimen kasvua joissakin syöpien. Esimerkiksi liukoisen muodon BCMA on osoitettu estävän proliferatiivista aktiivisuutta APRIL

in vitro

ja vähentää kasvainsolujen proliferaatiota in nude-hiirissä [45]. Downregulation huhtikuussa lentivirusta välittämä RNAi tehokkaasti estää niiden kasvun haimasyöpäsoluissa

in vitro

ja

in vivo

[46]. Wang

et al

. [15, 26] käytetään myös siRNA vaientaa APRIL nude hiiren peräsuolen syövän malli ja totesi, että huhtikuu Knockdown lisääntynyt syöpäsolun apoptoosin ja vähensi kasvainten kasvua ja etäpesäkkeiden. Samoin olemme aiemmin osoittaneet, että lentivirusta välittämää RNAi knockdovvn huhtikuu estää kasvuvauhti Lövön soluja ja lisää määrä solujen G0 /G1 vaiheeseen ja vähentää numero G2 /M vaiheessa [28]. Yhdenmukainen aiempien työtä, tämä tutkimus osoitti, että kohdistaminen huhtikuu käyttäen sAPRIL-BP on jonkin verran tehoa vastaan ​​kolorektaalisyövän linjat.

Aikaisemmassa tutkimuksessa [14, 21, 22, 24] ehdotti, että anti-apoptoottiset mekanismit sAPRIL -bp saattaa johtua estää NF-KB signalointi, ja asetus antiapoptoottisten proteiinit (Bcl-2, Bcl-x L, XIAP, ERK, ja TGF-β) tai pro-apoptoottisia proteiineja, kuten Bax. Kuitenkin yksityiskohtainen molekyylitason mekanismeja, joiden kautta sAPRIL-BP nousi apoptoosin LOVO soluista on tutkittava tarkemmin. Lisäksi sAPRIL-BP tunnistimme osoitti spesifinen sitoutumisaffiniteetti, jossa sAPRIL ja merkittävä kyky inhiboida kompetitiivisesti sAPRIL sitoutumisen APRIL reseptoreihin LOVO-solut. HSPG on ainoa huhtikuu reseptori löytyy LOVO-solut (tuloksia ei ole esitetty). Siksi onko sAPRIL-BP ja HSPG samaa sitovat epitoopit sAPRIL, ja rakenteellinen samankaltaisuus HSPG ja sAPRIL-BP vaatii lisää tutkimusta.

Huhti säädellään solujen lisääntymistä on ollut mukana monissa eri syövissä, mutta Tähän mennessä on vain vähän julkaistuja tutkimuksia, jotka osoittavat molekyylimekanismin taustalla huhtikuu välittämä solukierron säätelyssä. Wang

et al

. osoitti vähentäminen sykliini D1 ja CDK4, jotka ovat kriittisiä säätelijöitä G1 /S siirtymä, kun huhtikuu pudotettiin peräsuolen syöpäsoluja. Nämä havainnot ehdotti, että sykliini D1 ja CDK4 saattaa olla mukana huhtikuu-säätelyyn solujen lisääntymisen [24, 25, 47].