Krooninen sairaus

tiivistelmä

Androgeenien vajaushoidon on tullut nyrkki hoitona metastasoituneen eturauhassyövän; kuitenkin eteneminen kastroida vastustuskyky tautia esiintyy suurimmalla osalla potilaista. Näin ollen on olemassa kiireellinen tarve parannuksiin terapiassa kastraatio kestävä eturauhassyöpä. Tavoitteet tässä tutkimuksessa olivat tehon määrittämiseksi somatostatiinianalogilla oktreotidi (MMA) yhdistettynä edulliseen dosetakseliannos (DTX) käyttäen kastraatio resistenttien syöpäsolujen ja tutkimaan mukana molekyylitason mekanismeja in vitro. Anti-proliferatiivista ja synergia mahdolliset vaikutukset määritettiin MTT-määrityksellä. Apoptoosin induktio analysoitiin käyttämällä ja liittävät V ja propidiumjodidivärjäys ja virtaussytometria. VEGFA, CASP9, CASP3 ja ABCB1 geenin ilmentyminen arvioitiin RT-PCR: llä ja Q-RT-PCR-analyysillä. Lokakuu yhdistettynä DTX hoitoja DU145 solujen vaeltamiseen arvioitiin myös. Tutkimus osoitti, että yhdistetty anto DTX ja lokakuu oli merkittävä, synergistisesti suurempi sytotoksisuus kuin DTX tai MMA: hoito yksinään. Yhdistelmä kahta lääkettä aiheutti selvemmin apoptoosin lisääntyminen ja aiheutti enemmän tukahduttaminen invasiivisia potentiaali kuin yksikään yksittäisistä agentti. Oli selvää kasvua kaspaasi 3 ilmentymisen MMA yksin ja kahden lääkkeen yhdistetty hoitoryhmissä kuitenkin VEGFA ilmentyminen oli merkittävästi vaimentaa niitä. Nämä tulokset tukevat päätelmää, että somatostatiinianalogit yhdistettynä doketakseli saattaa parantaa kemoterapia tehokkuusvertai- läpi useita mekanismeja kastraatio kestävä PCa solulinjassa. Tämä työ tarjoaa prekliinisissä perustelut hoitostrategioita parantaa hoidon kastraatiotasolle vastustuskyky tautia.

Citation: Zhu S, Oremo JA, Li S, Zhen M, Tang Y, Du Y (2014) Synergistinen antituumoriaktiivisuuksia Docetaxel ja oktreotidin Associated kanssa Apoptotic-säätelyyn ylöspäin kastraatio hylkivät Eturauhassyöpä. PLoS ONE 9 (3): e91817. doi: 10,1371 /journal.pone.0091817

Editor: Allen Gao, UC Davis Kattava Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 joulukuu 2013; Hyväksytty: 13 helmikuu 2014; Julkaistu: 14 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat osina avustusta National Natural Science Foundation of China (81041102) ja tieteellisen tutkimuksen Preferred säätiö Palautetut Overseas Kiinan Scholars, valtion Opetusministeriö. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin syöpä, joka edustaa suuri uhka miesten terveyteen. Androgeenien puute hoitoa (ADT) liittyy kirurgiseen tai kemiallinen kastraatio on tavallinen hoito potilailla, joilla on pitkälle edennyt PCa [1]. Kuitenkin useimmat potilaat tulevat immuuniksi androgeenideprivaatio ja lopulta edetä kastraatio vastustuskykyisten tautien [2], yleensä 12-24 kuukauden aloittamisesta hormonihoito [3]. Syntyminen aggressiivinen kastraation-resistenttien kloonien aikana ADT on perusteet taksaanin-pohjainen terapia, joka on ainoa kemoterapiaa luokkaa näyttämään eloonjäämishyötyä metastaattisessa kastraatio resistenttien eturauhassyöpä (CRPC) [4], [5].

Doketakseli (DTX) on ensilinjan kemoterapeuttisen vaihtoehto oireenmukaiseen CRPC potilaille, jotka ovat ehdolla kemoterapiaa [6], mikä parantaa yleistä vastaus, kliininen remissio eturauhasen syöpäpotilaiden [7]. DTX hoito lisää Bcl-2 fosforylaation, down-regulation Bcl-XL-proteiini tasoilla, indusoi p53 ja johtaa siten apoptoosin [8], [9]. Lisäksi DTX on raportoitu aiheuttavan antiangiogeeniset vaikutukset [10]. Se muistuttaa meitä alussa näyttöä siitä, että TAXOTERE inhiboimaan ihmisen napalaskimon endoteelisolujen proliferaatiota läpi VEGF erityksen [11]. Siksi tutkimme VEGFA eritystä ennen ja jälkeen hoidon eri aineilla. Kuitenkin cytotoxicities erityisesti ääreishermostotoksisuus ja hematopoieettisten sivuvaikutukset ovat merkittäviä ja väistämättömiä etenemisen ilmenee sen jälkeen DTX hoidon [12], [13]. Resistance voi kehittyä läpi erilaisia ​​mekanismeja sisältävät apoptoosin ja aktivointi ekstrasellulaarisen signaalin liittyvä PI3 kinaasi /Akt eloonjäämisreittejä kehittämisen kanssa etäpesäkkeiden [14]. Vastustuksen vuoksi, se ei usein parantaa Potilaan kannalta on tärkeää tunnistaa paremmin tai vaihtoehtoisia hoitostrategioita että käänteinen kemoterapiaa kestävyys ja parantaa herkkyyttä doketakselia perustuvaa kemoterapiaa huumeita.

somatostatiini (SST) keksittiin estäjä kasvuhormonia, joka eristettiin ensin hypotalamuksen lampaita. Se jaetaan monissa ihmisen elinten ja kasvaimet erilaisia ​​toimintoja, kuten soluproliferaation inhibointi, sääntely fosfotyrosiinifosfataasi toimintaa estävän PI3-kinaasia ja MAP-kinaasin toimintaa [15]. Monet synteettiset somatostatiinianalogit (oktreotidi, lanreotidi, vapreotidi, ja depreotidi) kehitettiin ja viisi erilaista alatyyppiä somatostatiinireseptoreja voidaan sitoa niitä [16]. Somatostatiinireseptoreita on läsnä solukalvon kastraation vastustuskykyisten PCa solulinjoissa, mutta niiden dynaaminen ilmaisu voi vaihdella fenotyyppinen ominaisuus kustakin solulinjasta [17]. Synteettinen somatostatiinianalogin oktreotidi (MMA) on tutkittu laajasti yhtenä SST analogeja ja kertyvät todisteet tukevat sen antituumorivaikutus syövän hoidossa [18], [19]. Lokakuu on hyväksytty FDA käytettäväksi standardin mukainen ja sairaanhoidon eri syöpiä. Se on hyvin parantunut stabiilius verrattuna luonnollisen somatostatiinin, joka mahdollistaa pitkäaikaisen hoidon [20].

kampaus eri syöpälääkkeiden kanssa on järkevä strategia, jolla voidaan saada voimakas sytotoksinen vaikutus syöpäsoluja. Tutkimuksessamme määritimme vaikutus yhdistetyn hoidon DTX ja MMA profiilia geenien ilmentymisen liittyy apoptoosiin, angiogeneesiin ja huumeiden toleranssi DU-145-soluja. Tässä esitetyt tulokset osoittivat, että yhdistys DTX sekä MMA saatiin yli lisäaine apoptoottisen vasteen. Tämä uusi lääke yhdistelmä oli tehokkaampi aiheuttamaan apoptoosin ja vähentää muuttoliikettä kuin kumpikaan lääke yksinään. Nämä tulokset antavat kokonaiskäsityksen kliinisen strategioita eturauhassyövän ja lääkeresistenssi kääntyminen.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja soluviljelmä

DU145 syöpäsolujen ja PC3-solut tarjottiin ystävällisesti lahjana professori Peter Nelson (Fred Hutchinson Cancer Research Center). Ne ostetaan American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Soluja viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, USA), joka oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Hyclone) ja 1% penisilliini /streptomysiinillä, 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO2. Maljan solut siirrostettiin trypsiini-EDTA: a (0,05% trypsiiniä ja 0,53 mM tetranatrium-EDTA) ja ne kerättiin valmistamiseksi mRNA: ta on kuvattu alla.

hoito ja solunelinkykyisyysmääritys

DU145 eturauhassyövän solut ympättiin 96-kuoppalevyille viitenä Dulbeccon ruselatusaineeseen plus 10% naudan sikiön seerumia, ja pidettiin viljelmässä 24 h. Soluja käsiteltiin DTX (5, 10, 20, 50 tai 100 nM) sekä MMA (10, 10

2, 10

3, 10

4, 10

5 nM), käytetty yksinään tai samanaikaisesti yhdistelmät 24 h, 48 h ja 72 h, vastaavasti. Lopussa inkubointien, solujen elatusaine poistettiin ja 100 ul /kuoppa MTT-liuosta (0,5 mg /ml PBS: ssä) lisättiin. Sitten levyjä inkuboitiin 3 h (37 ° C: ssa valolta suojattuna). Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa, 5% CO 2: ssa 4 tuntia, supernatantit poistettiin varovasti, ja 150 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Sitten soluja shokkikäsiteltiin 10 min pimeässä. Absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä Microplate Reader (Bio-Rad 680). Analyysi saadut tulokset tehtiin käyttäen GraphPad Prism 4 tietokoneohjelma arvioida solujen lisääntymisen korko ja sytostaatit korko. Käsittelemättömiä soluja käytettiin kontrolleina.

RNA: n ja DNA: n eristämiseksi

Yhteensä RNA: ita viljellyistä soluista uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Takara, Dalian, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden ja niiden pitoisuudet määritettiin spektrofotometrillä (NanoDrop, Nyxor Biotech). Perimän DNA viljellyistä soluista uutettiin käyttäen DNeasy Veri Tissue Kit (Qiagen) ja niiden pitoisuudet mitataan NanoDrop Spektrofotometri. Kaikki prosessit suoritettiin valmistajien ohjeiden.

RT-PCR ja Q-RT-PCR

Quantitative real-time PCR suoritettiin QPK-201 SYBR Green master mix (Toyobo, Osaka, Japani) ja ABI 7300 järjestelmä Applied Biosystems. Käytetyt alukkeet tutkimuksessa saatiin Invitrogen (Peking, Kiina) ja esitetään taulukossa 1. Lämpövuorottelu parametrit sisälsi RT vaihe 50 ° C: ssa 20 minuutin ajan, minkä jälkeen DNA-polymeraasin aktivoinnin vaiheessa 95 ° C: ssa 2 minuutin ajan ja 50 PCR-sykliä (95 ° C: ssa 20 s, 60 ° C 30 s). Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Kertamuutoksen erilaiseen ekspressioon kunkin geenin laskettiin käyttämällä vertailevan C

Tmethod (tunnetaan myös nimellä 2

-ΔΔCTmethod), kuten ovat kuvanneet Lu et ai [21].

virtaussytometrinen arviointi anneksiini V-FITC /PI-värjättyjen solujen

Cancer soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä 24 tunnin ajan, käsiteltiin DTX (20 nM) ja (MMA 10

3 nM) yksinään tai samanaikaisesti yhdistettynä ylimääräisiä 48 tuntia. Havaitsemiseksi apoptoottisia tapahtumia, solut pestiin kahdesti PBS: llä, ja pelletti suspendoitiin uudelleen 1 x anneksiini sitovaa puskuria, jonka pitoisuus on 10

6cells /ml. Sitten 100 ui solususpensiota siirrettiin 5 ml: n viljelmä putkeen. Seuraava, 5 ui anneksiini V-FITC: llä ja 5 ui propidiumjodidia lisättiin kuhunkin kokeeseen, ja näytteitä inkuboitiin 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Tämän ajan jälkeen 400 ui 1 x anneksiini sitovaa puskuria lisättiin jokaiseen putkeen ja solut analysoitiin käyttämällä BD FacsCanto -virtaussytometriä (BD Biosciences). Kukin koe sisälsi kontrollinäytteitä solut värjättiin anneksiini V-FITC (ei PI) ja solut värjättiin PI (no anneksiini V-FITC). Elävät solut olivat anneksiini V-FITC- ja PI-negatiivisia, solut alussa apoptoosin oli anneksiini V-FITC-positiivisia ja PI-negatiivisia ja solujen myöhään apoptoosin tai kuolleet olivat positiivisia sekä anneksiini-FITC: ja PI. Tulokset olivat edustettuina kertaiseksi muutoksia suhteellisen keskimääräisen suhdelukua solujen käsittelemättömät verrattuna eri hoitomuotojen. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena.

Haavan paranemista määritys

tyhjästä määritys suoritettiin arvioimaan vaikutuksen DTX ja MMA eturauhassyövän soluliikkuvuus yksinään ja yhdistelmänä. DU145-solut ympättiin korkean tiheyden 6-kuoppalevyille ja kasvatettiin 24 tuntia. Väliaine poistettiin ja korvattiin väliaineella, joka sisälsi DTX ja /tai MMA: vielä 24 tuntia. Yksikerroksiset Solut fyysisesti haavoittunut raaputtamalla pintaa pipetin kärjen (1000 ui) yhdenmukaisesti ja suora kuin mahdollista. Kuvat Solujen valtaavat naarmu vangittiin merkityillä ajankohtina (0, 4, 6, 8 ja 24 tuntia) käyttäen faasikontrastimikroskopiaa (IX 70 Olympus Optical Co., Saksa). Kuvat arvioitiin mittaamalla ero alueen haavat Leica kuva-analyysi-järjestelmän (Leica, Mannheim, Saksa) ja maahanmuuttoluku ilmaistaan ​​prosenttiosuutena tyhjästä sulkeminen laskettiin seuraavasti:% tyhjästä sulkeminen = a-b /a, jossa (a) on etäisyys reunojen haavan, ja (b) on etäisyys, joka jäi cell-free aikana solumigraation sulkea haavan. Kokeet toistettiin kolmena rinnakkaisena vähintään kaksi kertaa.

Tilastollinen analyysi

tiedot kokeista analysoitiin SPSS 18.0 ohjelmiston ja ilmaistaan ​​muodossa keskiarvo ± SD. Kaksipuolinen Studentin t-testiä käytettiin analysoimaan eri kokeissa. P-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä taas p-arvo 0,01 tai 0,001 kuin erittäin merkittävä.

Tulokset

apoptoottinen ominaisuuksien DU145 solujen käsitelty DTX yksin, lokakuu yksinään ja niiden yhdistäminen 48 tuntia

alkuperäisessä tutkimuksessa, kasvua estävää vaikutusta DTX, MMA: iden ja niiden yhdistelmää eturauhasen syöpäsolujen DU145 tutkittiin. Näiden aineiden käsittelyä, osat solut alkavat pieneni, solujen välisen etäisyyden tuli suurempi ja sytoplasminen lastujen havaittiin DTX sekä MMA käsiteltyjen solujen. Tämä vaikutus oli paljon voimakkaampi yhdistelmä hoitoryhmässä kuin yksittäisissä hoitoryhmissä. Oli enemmän kelluva ja vaahtoamista solujen morfologisia piirteitä apoptoosin yhdistelmän hoitoryhmässä ja kasvun hoidossa pitoisuus tehostetun apoptoottisen esiintymisiä. Kuva. Kuvio 1 esittää solujen morfologia eri pitoisuuksia DTX ja /tai MMA: hoito 48 tuntia. Lisäksi, kun käsittelyaikaa edetessä solujen kasvua tuli hitaasti ja oli lisääntynyt määrä kelluvat solut voidaan havaita väliaineessa.

. Käsittelemättömät solut; B. 1 nM DTX; C. 100 nM lokakuu; D. 10 nM DTX; E. Kahden lääkkeen yhdistelmä 10 nM DTX ja 100 nM lokakuu; F. 100 nM DTX.

Kasvun estäminen mukaan DTX sekä MMA yksin vastaavasti

kasvua estävä vaikutus DTX sekä MMA tutkittiin vastaavasti. On selvää, että molempien aineiden näytetään anti-leviämisen vaikutus DU145-soluissa (kuvio. 2A ja 2B). Sekä DTX ja lokakuu laski proliferaatiota in aikaa ja annosriippuvaisesti. Kuten on esitetty kuviossa. 2C, verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin, oli 14%, 31% ja 43% inhibitio leviämisen DU145-solujen altistettiin 10 nM DTX 24 h, 48 h ja 72 h. Kuten MMA (Fig. 2D), verrattuna valvontaan, oli 10%, 18% ja 29% inhibitio leviämisen DU145-solujen altistettiin 100 nM lääkkeen 24 tunnin, 48 tunnin ja 72 tunnin . Tiedot osoittivat, että suurin sytotoksisuus oli 72 tuntia ja IC

50-arvot DTX (Fig. 2A) ja (MMA Fig. 2B), laskettiin solujen lisääntymistä koealojen vastaavasti. DTX näytteillä vahvempi cytotoxity alemman IC

50, jonka arvo on 10,784 ± 3,122 nM kuin MMA osoitti heikompaa esto vaikutus IC

50 ollessa 2,342 ± 0,262 uM.

Solun elinkelpoisuus oli määritettiin MTT-määrityksellä ja ilmaistiin prosentteina kontrolli-arvo (keskiarvo ± SEM kolmesta kokeesta tehdään kolmena kappaleena); virhepalkkeja = SEM (n = 6).

DTX yhdessä lokakuu tuottaa synergistisen kasvun esto ihmisen DU145 soluissa

Arvioida mahdollisia synergiavaikutuksen DTX-lokakuu yhdistyivät kasvua syöpäsolut, DU145 solut altistettiin eri pitoisuuksia DXT sekä MMA yhdistettiin 72 h (Fig. 3B). Synergistisen vaikutuksen DTX ja MMA: DU145 solujen lisääntymistä ei havaittu. Prosenttiosuudet solukasvuneston indusoiman DTX yhdessä lokakuu olivat suurempia kuin kunkin yksittäisen aineen yksinään. Pitoisuudella 10

3 nM, OCT vähensi merkitsevästi IC50-arvo (P 0,05) ja edistänyt apoptoosin (P 0,05) DU145 solujen vastauksena DTX. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, 10 nM DXT ja 10

2 nM lokakuu tuloksen 39% ja 14%: n esto in proliferaation DU145 soluissa, vastaavasti kun molemmat yhdistetty samaan annoksilla aiheutti 68%: n lasku solujen lisääntymisen verrattuna käsittelemättömään kontrolliin, joka osoitti vahvaa synergiaa.

tulokset ovat prosentteina kontrollista saadun arvon kanssa käsittelemättömien solujen (keskiarvo ± SEM kolmesta kokeesta tehdään kolmena kappaleena). (**) Lisääntyminen laski merkittävästi (

p

0,001); virhepalkkeja = SEM.

VEGFA, CASP3, CASP9 ja ABCB1 mRNA ilmaisun DU145 soluissa

tutkia mahdollisuuksia mekanismi, jonka DTX plus lokakuu indusoi apoptoottisen solukuoleman, ilmaus liittyvien geenien apoptoottisen signaalin solun resistentiksi DTX ja angiogeneesin arvioitiin RT-PCR: llä ja qRT-PCR seuraavat 48 h (Fig. S3) ja 72 h hoidon jälkeen. Kontrolliin verrattuna, 10 nM DTX ja 100 nM MMA kahden aineen yhdistelmä ryhmän merkittävästi vähentynyt VEGFA mRNA: n ilmentymisen (Fig. 4A) (P 0,01). Kuten CASP9 ja CASP3, pohjapinta mRNA taso CASP9 ja CASP3 olivat alhaiset, mutta havaittavissa ja mRNA ekspressio lisääntyi merkitsevästi kuten on osoitettu kuvassa. 4B ja kuva. 4C (P 0,01). Proteiinin ekspressiotaso kahden kaspaasin geenejä tutkittiin myös ja yhdenmukainen tulos qRT-PCR: llä (Fig. S4). Lisäksi, ekspressio ABCB1, joka on tunnustettu liittyvän geenin lääkeresistenssin [22], ei ollut vaikutusta hoitoryhmissä (Fig. 4D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että kasvaimen vastainen vaikutus DTX yhdessä MMA: iden saattaa liittyä apoptoosin edistämiseksi liittyy korkea ekspressio kaspaasi 9 ja kaspaasi 3.

M: Marker, The ekspressiotasot objektiivisten geenejä tutkittiin RT-PCR: llä (A, B, C ja D) ja kvantitatiivisen tosiaikaisen -PCR (B, D, F ja H), vastaavasti, käyttämällä soluja, käsiteltiin koelääkkeiden 72 tuntia. Ilmentymisen taso kunkin mRNA normalisoida tasolle β-aktiini-mRNA: n. Arvot ovat keskiarvoja ± SD kolminkertaisten analyysien (*

p

0,05, **

p

0,01).

Effects of DTX, lokakuu yksin ja kahden lääkkeen yhdistelmä hoidon DU145 solujen apoptoosiin

mukaan qRT-PCR-tuloksiin, kokeet jaettiin neljään hoitoryhmään, mukaan lukien valvonta, DTX (10 nM), lokakuu (100 nM) ja kahden lääkeaineen yhdistelmiä, (Fig. 5). Käsittelyn 48 tuntia, apoptoosin testi suoritettiin virtaussytometrialla ohjeiden annetaan anneksiini V-FITC /PI -värjäyspakkausta (Kuva. 5A). Toisin kuin kontrolliryhmän apoptoosia indusoitiin sekä DTX ja MMA (P 0,05). Yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen osuus apoptoottisten solujen lisääntyi merkittävästi soveltamalla DTX plus lokakuu verrattuna DTX tai lokakuu hoito yksinään (kuvio. 5B). Nämä tulokset osoittavat, että yhdistelmähoito parantaa apoptoottisen solukuoleman DU145-soluissa.

Tulokset ovat keskiarvo ± SEM kaksi erillistä koetta suoritettiin kolmena kappaleena. ***

p

0,000 vs. kontrolli.

Effect of DTX, OCT yksin ja kahden lääkkeen yhdistelmä muuttoa DU145 solujen

havaitsemaan vaikutuksen kahden lääkeyhdistelmä siirtyvien DU145 soluja, haavan paranemista analyysi suoritettiin seuraavien 24 tunnin hoidon. Tulokset haavan paranemista määritykset osoittivat, että joko lääkeaineen yksin on inhiboiva vaikutus solujen siirtoa. Mutta solut yhdistelmä ryhmän liikkui hitaammin kuin lääke yksin ja käsittelemätön kontrolli ryhmissä (Fig. 6A). Kontrolliin verrattuna, suhteellisen siirretyn etäisyyden solujen DTX, lokakuu ja DTX /MMA yhdistetään ryhmiä (Fig. 6B), tässä järjestyksessä olivat 76,5 ± 10,21, 53,2 ± 12,13, 79,4 ± 13,04 (P 0,05). Soluja inkuboitiin kontrolliryhmässä vaeltaneet alue, joka oli huomattavasti suurempi kuin solujen inkuboitiin lääkettä yhdistetty ryhmä, mikä osoittaa, että DTX yhdessä lokakuu esti muuttoa DU145 solujen.

( A) Haavojen parantumisen sen määrittämiseksi vaikutuksen ilmoitettu lääkkeiden DU145 soluissa muuttoliikettä. (B) lyhennelmä muuttoliike suhde (%), kun 72 tuntia hoidon mitataan haavan paranemista määrityksessä. Kukin pylväs edustaa keskiarvo ± SEM. **

p

0,01, vs. kontrolli.

Keskustelu

Microtubule kohdistamisen kemoterapian on yleisimmin käytetty menetelmä hoidettaessa eturauhassyöpää [23]. Kuitenkin pitkäaikainen hoito johtaa usein sivuvaikutuksia ja kemoterapian resistenssin, yleensä edistää muuttuja kliinisiä tuloksia potilailla, joilla on näennäisesti samankaltaisia ​​kasvaintyypeille. Yrittäessään voittaa lääkeresistenssi, päätimme tutkia tehokkaita sytotoksisia ja apoptoottista pitoisuudet mikrotubuleihin huumeita dosetakseli (DTX) ja somatostatiinianalogilla oktreotidi (MMA) ja niiden synergistinen vaikutus näiden kahden lääkkeiden kastraatio kestävä eturauhassyöpäsolulinja DU145.

tässä tutkimuksessa arvioimme yhdistetty vaikutus DTX sekä MMA eturauhassyöpää vastaan ​​DU145 ja PC3-soluissa (kuvio. S1). Yhdistelmä DTX kanssa lokakuu aiheutti suurempaa laskua solujen elinkelpoisuuden kuin kummallakaan aineella yksinään. Lokakuu vähensi IC

50-arvo DTX DU145 ja PC3-solujen annoksesta riippuvalla tavalla, esti PCa solujen lisääntymistä (kuvio. S2), lisääntynyt DTX herkkyys, solujen sytotoksinen ja apoptoosin. Vaikka olemme huomanneet, että PC3-solut osoittivat herkempiä DTX kuin DU145 soluja, jotka vastaavat tutkimuksen in vivo (Fig. S5). Nämä tulokset viittaavat siihen, että lokakuu synergisesti voimistaa mikrotubulia kohdentamisaineita PCA soluissa in vitro. Nämä sopusoinnussa tuore tutkimus Lattanzio et al. doketakselia yhdistettynä oktreotidi synergistisesti vaikutus yhdistetyn hoidon erityisen dosetakselia kestävä PC-3 solulinja [24]. Kuitenkin löysimme jompikumpi huumeiden yksin stimuloi proliferaatiota DU145 solujen alhaisempi pitoisuus DTX 1 nM tai MMA: 10 nM, joka ei havaittu niiden yhteenlaskettu ryhmässä.

Antiproliferatiivistä vaikutus DTX sekä MMA voi johtua joko solu- kuolion tai solujen apoptoosin. Siksi tutkittiin apoptoottinen vaikutus DTX, OCT yksinään ja niiden yhdistelmän käyttöä DU145 soluissa. Tulokset osoittivat, että yhdistelmä DTX kanssa lokakuu vähentynyt solujen elinkelpoisuuden ja lisätä kaspaasi 9/3 aktiivisuutta suuremmassa määrin kuin kumpikaan yksittäinen aine yksin kerrallaan riippuvaisella tavalla (Kuva. S4). Kontrolliin verrattuna on ilmeinen lisääntyminen kaspaasi 3 ilmaisua erityisesti MMA yksin ja kahden lääkkeen yhdistetty hoitoryhmissä. Tämä on sopusoinnussa raportti osoitti, että lokakuu lisäsi kaspaasi 3 mRNA: n ilmentymisen ja indusoi solujen apoptoosia HepG2-soluissa [18]. Todettiin, että apoptoottisen solukuoleman ohjelman erotettiin aktivoimalla initiaattori kaspaasi-8, joka indusoi mitokondrion ulkokalvon läpäiseväksi (MOMP), mitokondrioiden pirstoutuminen, ja lopulta aktivointi alavirran proteaasien kaspaasi-9 ja -3. MOMP indusoi poistumista sytokromi c, muodostumista apoptosome ja lopulta kaspaasi-9 [25]. Esillä olevassa tutkimuksessa, kaspaasi 9 aktiivisuus lisääntyi merkittävästi, kun hoito DU145-solujen yhdistämisen jälkeen DTX sekä MMA hoito, syyllistämättä MOMP ja mitokondrioiden pirstoutuminen induktio, jolloin havaittiin aktivointi apoptoosin DU145 solulinjassa.

VEGF signalointi edistää angiogeneesiä stimuloimalla verisuonen endoteelisolujen proliferaatiota, migraatiota ja putken muodostumiseen ja lisää merkittävästi verisuonten läpäisevyyttä [26]. VEGF-perheen kuuluu viisi jäsentä, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D ja istukan kasvutekijä (PIGF) ja VEGF-A tunnetaan keskeinen tehtävä kasvaimeen liittyvien angiogeneesissä [27]. Siksi tutkimme vaikutus MMA DTX ja näiden kahden yhdistelmä huumeiden VEGFA ilmaisun DU145 soluissa. Tutkimus osoitti, että yhdistelmä DTX sekä MMA kohdistaa suuri estävä vaikutus VEGFA mRNA: n ilmentymisen mutta oli kohtalainen vaikutus DTX yksin hoitoa. Raportti osoitti, että VEGF ilmentyminen oli merkittävästi vaimentaa glioomasoluihin MMA annosvasteisesti. Kuitenkin lokakuu oli vain vähän vaikutusta mikroympäristössä hypoksian aiheuttaman VEGF tuotanto in vivo [28].

Tässä tutkimuksessa osoitimme pienenivät huomattavasti solujen vaeltamiseen in vitro altistumisen jälkeen kahden lääkkeen yhdistelmähoito . Tutkimus viittaa siihen, että DTX yhdessä lokakuu estää DU145 lisääntymistä tai maahanmuuton vapautumisen inhibition peptidin VEGFA ja johtaa myöhemmin estämällä solujen vaeltamiseen. Tutkimus kertoi, että lisäys VEGF /VEGFR vuorovaikutus parantaa kulkeutumista koolonkarsinoomasoluissa [29]. Kuitenkin jotkut epäjohdonmukaisia ​​Tutkimustulokset löydettiin. Esimerkiksi Maksan iskeeminen-reperfuusiovaurio malli, OCT osoitti estävä vaikutus hepatosellulaaristen apoptoosiin ja heikennettyjä maksasolujen aiheuttamia iskeemisen reperfuusion [30]. Lyhytaikaiset soveltaminen MMA voisi aiheuttaa lokakuu reseptorin SSTR2 siedätyshoito ja sisäistämisen, joka esti apoptoottinen vaikutus MMA maksasyövän soluissa [31]. Nämä päinvastoin tulokset voivat johtua eri solun ominaisuudet, solujen microenvironment, ilmaus reseptorit sekä MMA hoito keskittyminen.

On todettu, että ABCB1 ilmaistaan ​​yli viisikymmentä prosenttia lääkeaineresistenttien syöpien ja tunnustettu tärkein mekanismi taustalla lääkeresistensseihin [32]. ABCB1 ilmentyminen säädelty kemoterapian jälkeen eri kasvaimissa yleisen stressin vastaus [33], [34]. Tutkimuksessamme ei havaittu merkittävää eroa todettiin eri ryhmien käsitelty yhdistetty DTX ja MMA kunkin yksittäisen aineen yksinään ja untreatment valvontaa. Korkea ilmentyminen ABCB1 geenin ennen ja jälkeen nämä lääkkeet hoidon osoittaa DTX ja /tai lokakuu lääkkeille vastustuskykyiset solulinjassa eturauhassyövän DU145 soluja, jotka on havaittu edellisessä tutkimuksessa hiiren ksenograftimallissa in vivo (tietoja ei julkaista).

Nämä tiedot viittaavat siihen, että yhdistetty hoito DTX ja MMA DU145 ja PC3-solujen aiheutti suuremman esto kasvainsoluproliferaation ja selvästi aiheuttaman apoptoosin, mikä saattaa liittyä säätely ylöspäin kaspaasi 9/3 aktiivisuus ja vähentynyt ilmentyminen VEGFA in vitro. Vaikka tulokset on laajennettava in vivo malleissa tulevissa tutkimuksissa, ne nostavat kiehtova mahdollisuus, että kohdistaminen mikrotubuleiksi taksaanin kanssa yhdisti somatostain analogi voi olla hyödyllinen lähestymistapa parantaa tuloksia eturauhassyövän.

tukeminen Information

Kuva S1.

vaikutus DTX yksin, synergistinen vaikutus DTX yhdessä 100 nM MMA PC3-solujen lisääntymistä seuraavat 48 h (A) ja 72 h (B) hoidon. Tulokset ovat prosentteina kontrollista saadun arvon kanssa käsittelemättömien solujen (keskiarvo ± SEM kolmesta kokeesta tehdään kolmena kappaleena). (**) Lisääntyminen laski merkittävästi (

p

0,001); virhepalkkeja = SEM.

doi: 10,1371 /journal.pone.0091817.s001

(TIF) B Kuva S2.

synergistinen vaikutus DTX yhdessä MMA DU145 solujen lisääntymistä seuraavien 48 tunnin hoidon jälkeen. Tulokset ovat prosentteina kontrollista saadun arvon kanssa käsittelemättömien solujen (keskiarvo ± SEM kolmesta kokeesta tehdään kolmena kappaleena). (**) Lisääntyminen laski merkittävästi (

p

0,001); virhepalkkeja = SEM.

doi: 10,1371 /journal.pone.0091817.s002

(TIF) B Kuva S3.

Vaikutukset DTX yksin, OCT yksinään ja yhdistelmä DTX /MMA ilmaisun VEGFA, kaspaasi 9, kaspaasi 3 ja ABCB1 in DU145 soluissa qRT-PCR vastaavasti käyttäen seuraavaa solujen 48 tunnin hoidon jälkeen. Ilmentymisen taso kunkin mRNA normalisoida tasolle β-aktiini. Arvot ovat keskiarvoja ± SD kolminkertaisten analyysien (*

p

0,05, **

p

0,01).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0091817.s003

(TIF) B Kuva S4.

havaitseminen kaspaasi 3, ja kaspaasi 9 ilmentymistä DU145 soluissa Western blot (A). Tulokset osoittavat, että lisääntynyt merkittävästi kaspaasi 3 ja kaspaasi 9 ekspressiotasot DTX yksin ja yhdessä lokakuu seuraavien 48 tunnin hoidon. (B) densitometrinen analyysi suoritettiin käyttäen Kodak yksiulotteinen kuva-analyysi-ohjelmisto. (P 0,01).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0091817.s004

(TIF) B Kuva S5.

kasvukäyrät eturauhassyöpäksenograftista PC3 (A) ja DU145 (B) verrokkihiirten kastroitu hiiriä ja hiiret hoidettiin dosetakselilla lukien kaksi ryhmää 10 mg /kg ja 20 mg /kg dosetakselihoidon. Kasvaimen mittaus alkaa lääkehoidon (p 0,015). (N = 5).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0091817.s005

(TIF) B