Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvain mikroverenkiertoa on ominaista epänormaali verisuonten verkosto ja laajentuneet, monimutkainen ja saccular aluksia. Siksi kuvantaminen kasvaimen verisuoniston ja määrittämällä sen morfometrista ominaisuudet edustavat kriittistä tavoite optimointiin syövän hoidossa, joka kohdistuu verisuonia (eli angiogeneesiä torjuvina terapia). Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida uusien verisuonten morfometrisiin parametrit peräsuolen syövän, vaikea saavuttaa tavanomaisin Immunohistokemian käyttämällä konfokaali laser endomicroscopy menetelmällä. Tuoreet koepalat kasvain ja normaali kudos kerättiin aikana kolonoskopia viidestä potilaalla on T3 kolorektaalisyöpää ilman etäpesäkkeitä ja merkittiin fluoresoivasti leimattua anti-CD31-vasta-aineita. Sarja optisten viipaleita ulottuen 250 um sisällä kudosta otettiin heti talteen jokaisesta näytteestä käyttäen konfokaali laser endomicroscope. Kaikki mittaukset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe. Keskimääräinen halkaisija kasvaimen alusten oli merkittävästi suurempi kuin normaali alusta (9,46 ± 0,4 um vs. 7,60 ± 0,3 um, p = 0,0166). Alus tiheys oli myös merkitsevästi suurempi syövän vs. normaali kudosnäytteistä (5541,05 ± 262,81 vs. 3755,79 ± 194,96 alusten /mm

3, p = 0,0006). Nämä tulokset vahvistettiin immunohistokemiallisesti. Lisäksi mutkittelevuus indeksi ja aluksen pituuden eivät olleet merkittävästi erilaisia ​​(1,05 ± 0,016 ja 28,30 ± 3,27 um normaalissa kudoksessa, vs. 1,07 ± 0,008 ja 26,49 ± 3,18 um kasvainkudoksessa vastaavasti, p = 0,5357 ja p = 0,7033). Tytär /äidin suhde (suhde neliöiden summa on tytär aluksen säteiden kulmikkaan äidin aluksen säde) oli 1,15 ± 0,09 normaalissa kudoksessa, ja 1,21 ± 0,08 kasvainkudoksessa (p = 0,6531). Konfokaalinen laser endomicroscopy on toteutettavissa mittaamiseen lisää verisuonten parametrit tuoreista kasvainbiopsioissa kuin perinteiset immunohistokemiallisesti yksin. Edellyttäen uudet varjoaineet on kliinisesti saatavilla, tulevaisuus

in vivo

käytössä CLE voisi johtaa tunnistamiseen uusien biomarkkereiden perustuu morfometrisiin ominaisuuksista kasvaimen verisuoniston.

Citation: Ciocalteu A, Săftoiu , Cârţână T, Gruionu LG, Pirici D, Georgescu CC, et al. (2014) Evaluation of New morfometrinen parametrit neoangiogeneesiin Human peräsuolen syövän konfokaali Laser Endomicroscopy (CLE) ja Kohdennettu Panendothelial Merkit. PLoS ONE 9 (3): e91084. doi: 10,1371 /journal.pone.0091084

Editor: Domenico Ribatti, University of Bari Medical School, Italia

vastaanotettu 13 marraskuuta 2013 Hyväksytty: 07 helmikuu 2014; Julkaistu: 10 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Ciocalteu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat kahdesta tutkimusmäärärahat rahoittaa National Research Council (CNCS), Romania, otsikolla ”Clinical ja Biomathematical mallintaminen verisuonten muutokset jälkeen antiangiogeenisestä Therapy in Advanced kolorektaalikarsinoomasta” sopimuksen numero PN-II-ID-PCE-2011- 3-0664, ja ”reaaliaikainen arviointi Hoidon Effects in Advanced kolorektaalikarsinoomasta” sopimuksen numero PN-II-CT-ERC-2012-1. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epätasapaino pro- ja anti-angiogeeninen signalointi kasvaimiin luo epänormaali verisuonten verkosto, joka on ominaista laajentuneet, monimutkainen, ja hyperpermeable alukset [1], [2]. Siksi kasvain vascularization ja erityisesti uusien verisuonten kasvu (angiogeneesi) on herättänyt enemmän huomiota kahden viime vuosikymmenen aikana mahdollisia sovelluksia diagnoosi, ennuste kerrostuminen ja kohdennettu hoito [1].

joukossa menetelmiä arvioida kasvain verisuonten muodostumista, määrittämiseen mikroverisuonitiheys (MVD) peräisin immunohistokemia (IHC) näytettä käytetään yleisesti prekliinisissä ja kliinisissä tutkimuksissa. MVD edustaa keskimääräinen lukumäärä alusta kohti mm

2 sisällä kudosnäytteiden mutta tämä toimenpide ei yksinään riitä valvontaan verisuonimuutoksiin yli hoitojakson aikana [3]. Muut toiminnalliset ja morfologisia parametrit, kuten veren tilavuutta, läpäisevyys, mikroverisuonitiheys, suonen halkaisijan, haarautuvia kuvioita, muita toimenpiteitä aluksen muoto ja kasvaimen aineenvaihdunta voi liittyä kasvaimen angiogeneesiin.

mekanismit tehostettu antituumorivaikutukset yhdistetyn hoidot voivat vaihdella kesken antiangiogeeniset aineet, ja ei ole määritetty lopullisesti. Antiangiogeeniset aineet, jotka haittaavat endoteelikasvutekijä polku on osoitettu normalisoida kasvaimen verisuonistoon. Jotkut kirjoittajat katsovat, että normalisoitu verisuoniverkostoja on ominaista pienempi alus mutkittelevuus ja alemman suonitiheys. [4], [5], [6].

kliinistä seurantaa vaikutusten antiangiogeenisten hoito edellyttää kuvantamismodaliteetin joka havaitsee morfologisiin ominaisuuksiin kasvaimen aluksia suuri herkkyys ja spesifisyys. Lisäksi, koska antiangiogeeninen terapia vaatii toistuvia hoitoja, ei-invasiivinen tekniikka on erittäin toivottavaa, [7]. Tavanomaiset kuvantamismodaliteetit kuten tietokonetomografia, magneettikuvaus tai ultraääni eivät anna yksityiskohtaista kuvaa kasvaimen alusten, jolloin vähän käyttöä

in vivo

syövän arviointi [7]. Noninvasiiviset luonnehdinta tuumoriverisuoniin johtaa parempi käsitys hoidon vaikutuksia ja auttaa optimoimaan ja muokata hoitotoimenpiteiden. [8].

konfokaali laser endomicroscopy (CLE) mahdollistaa

in vivo

mikroskooppinen analyysi suoliston limakalvon ja sen microvascularization aikana tähystys käyttämällä paikallisesti tai systeemisesti varjoaineiden [7], [9 ]. Kohdistaminen markkereita angiogeneesin, yhdessä molekyylien CLE tutkimukset (immunoendoscopy), lisää toiminnallinen analyysi morfologisen näkökohdan neoplastisen prosessin [7]. Näin ollen, toisin kuin perinteiset menetelmät verisuonten arvioinnin, CLE tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden selektiivisesti lisätä eri hiussuonistossa.

Aikaisemmassa tutkimuksessa osoitimme, että CLE menetelmä on toteutettavissa kuvaamiseksi eri näkökohtia kasvaimen verisuoniston tuoreesta koepalanäytteistä samanlainen nykyisin hyväksytty histopatologia tekniikat [9]. Tässä tutkimuksessa arvioimme uusia verisuoniverkosto parametrien vaikeaa arvioida tavanomaisilla immunohistokemia potilaalla on kliinisesti järjestetään T3 ensisijainen kolorektaalikarsinooma ilman metastaaseja käyttämällä CLE yhdistettynä fluoresoivasti leimattua anti-CD31-vasta-aineiden merkintöjä sekä normaalin ja kasvaimen verisuonten .

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tämä tutkimus suoritettiin mukaisesti ja Helsingin julistuksen ja hyväksynyt eettinen komitea yliopiston lääketieteen ja farmasian Craiova . Kirjallinen suostumus annettiin kullekin potilaalle ennen tutkimukseen osallistumista.

Potilastiedot

biopsianäytteissä saatiin viideltä potilaalta palvelukseen tutkimuskeskuksen gastroenterologian ja Hepatology Craiova, Romania ennen leikkausta mitään hoitoa (taulukko S1). Potilaat olivat aiemmin diagnosoitu primääri peräsuolen adenokarsinooma (G1-G2 histologinen) rutiinikäytössä kolonoskopia menettelyjä. Potilas 1 kävi hoidon bortetsomibia annetaan yhdessä kemoterapian ja säteily sen jälkeen leikkauksen. Potilas 2 oli historian leikkauksen jälkeen kemoterapiaa pahanlaatuinen kasvain rectosigmoid risteyksessä neljä vuotta ennen ja oli diagnosoitu paikallisen uusiutumisen seurannassa. Häntä hoidettiin leikkauksen ja adjuvanttihoitoa 5-fluorourasiilin (5-FU). Potilaat 3 ja 5 tehtiin kirurginen resektio jälkeen kemoterapiaa, jossa neoadjuvant säteilyn yksi peräsuolen syöpä. Potilas 4 oli historian läppävika, krooninen hepatiitti C-infektio ja alhainen verihiutaleiden määrä ja alun perin käsiteltiin FUFOL kuuri, mutta kieltäytyi edelleen hoitoa, kuten resektio. Tuolloin Tämän analyysin kaikki viisi potilasta oli elossa yli vuoden kuluttua ensimmäisen arvioinnin.

Immunohistokemiallinen arviointi suoritettiin kirurgisia näytteitä neljästä potilaista, kun taas endoskooppinen koepaloja kerättiin ennen aloittamista kemoterapian käytettiin potilaalle, jotka kieltäytyivät toimintaa.

potilaat valmistellaan kolonoskopia syömällä yleisesti määrätty suullinen elektrolyytti huuhtelu ratkaisu. Parilliset koepaloja kerättiin käyttämällä kolonoskopia (CFQ160ZL, Olympus, Tokio, Japani) normaalista limakalvon otettu noin 10 cm: n kasvain ja jokaisesta makroskooppisesti näkyvä vaurio ja välittömästi upotettiin fysiologiseen suolaliuokseen. Tuoretta koepalanäytteistä inkuboitiin pimeässä Alexa-Fluor 488-leimattua anti-CD31 (PECAM) vasta-aine (hiiren anti-ihmisen IgG1, laimennettuna 1:10 PBS 1% BSA, Exbio, Praha, Tsekin tasavalta) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Inkubointiaika ja laimennussuhde optimoitiin antamaan korkeimman tunkeutuminen sisälle kudokseen ja voimakkain fluoresenssi signaali tuoreiden biopsianäytteissä edellä kuvatulla tavalla [9]. Välittömästi inkuboinnin jälkeen, biopsia näytteet sijoitettiin objektilaseille kuvattavan kanssa CLE menetelmällä.

konfokaali Laser Endomicroscopy

Kuvaus suoritettiin käyttämällä dedikoitua endomicroscopy järjestelmä (Pentax EY-3870 CIFK, Tokio, Japani), jossa heräte aallonpituudella 488 nm ja joiden suurin laserin teho on ≤1 mW pinnalla kudoksen käyttäjä ohjaa tutkimuksen aikana optimaalisen kuvantamisen kontrastin. CLE menettely suoritettiin seuraavasti: distaalinen kärki endoskoopin sijoitettiin vastaavaan limakalvon alue histologia lasilevyille, jonka jälkeen kokoelma sarja konfokaali kuvia (7 um, 0,7 um sivusuunnassa resoluutio ja näkökenttä 475 pm x 475 pm) enintään syvyys 250 pm painamalla jalka kytkin pedaali.

CLE kuvankäsittely ja analyysi

sijainnilla, jossa parhaat verisuonten kattavuutta koko syvyys biopsia näyte valittiin morfometrisiin mittauksiin. Kunkin potilaan 80-100 sarja kuvia kunkin biopsianäytteestä, kasvain vs. normaali kudos yhdistettiin kuvapinot. Z projektio kunkin kuvan pinon saatiin käyttämällä ImageJ NIH ohjelmisto (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, SUA) analysoida koko verisuoniverkoston jää kudosnäytteessä (Fig. 1 A ja B). Kaikki kuvat on kalibroitu ja väri overlay käytettiin eroteltava selvemmin verisuoniston. Tilille paikkatietojen heterogeenisyys kussakin näytteessä, kaksi 50 x 475 um suorakulmainen kiinnostavat alueet (ROI) keskellä sen jokaisen kuvan vaaka- ja pystysuunnassa oli merkitty kuva (kuva 1 C ja D). 50 um leveys ROI valittiin tarkastuksen kaikista näytteistä sallimaan useita haarautumiksi ja koko alustyypeissä kussakin näytteessä. Morfometrisiin parametrit mitattiin kussakin ROI ja sitten keskiarvo saada yksi arvo kunkin näytteen.

Z projektio kuvan pinon normaalin (A) ja kasvaimen (B) mikrovaskulaarisessa, ilmeisesti enemmän monimutkainen haaroittunut aluksia. Aluksen pituus mitattiin käyttäen segmentoituja verkkovälineessä ja raportoitu mikrometriä. Mutkittelevuus indeksi laskettiin suhteena segmentoidun ja suoraviivaisesti pituudet sekä normaali (C) ja pahanlaatuinen (D) ihmisen paksusuolen ja peräsuolen kudokseen. * Mittakaavapalkki on 50 pm.

Vascular parametri Mittaukset

Alus halkaisijat, suonitiheys, aluksen pituus, mutkittelevuus indeksin ja tytär /äiti-suhde mitattiin jokaisen aluksen ROI. Arvot kaksi ROI potilasta kohden laskettiin keskiarvo saamiseksi keskimääräinen arvo potilasta kohden. Lopuksi arvot Kunkin potilaan keskiarvona kaikkien potilaiden ja tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe (taulukko 1). Alus tiheys laskettiin keskimääräinen lukumäärä alusten kohden ROI jaettuna skannattu tilavuuden (ROI alue kerrottuna syvyydellä 250 um Z-suunnassa) ja sitten normalisoidaan 1 mm

3 volyymi.

Käyttämällä ImageJ n suora viiva toiminto, halkaisija kunkin verisuonten segmentin, joka putosi kokonaan tai osittain ROI mitattiin kahden vierekkäisen haarakohtiin.

alus pituus sekä normaali ja peräsuolen syövän kasvain näytteiden mitattiin jäljittämällä keskilinjan kunkin aluksen segmentin käyttämällä segmentoitua viivatyökalulla. Mutkittelevuus indeksi kunkin aluksen segmentin laskettiin suhteena segmentoidun ja suoraviivaisesti pituudet. Tytär /äiti-suhde (DMR) laskettiin suhteena summa neliöiden tytär aluksen säteiden kulmikkaan äidin aluksen säde, ottaen huomioon äidin suurimpana astiaan aluevaltaus kohtaan. Tämä mittaus on osoitus poikkeamat puurakenne topologia jolloin DMR on noin yksi.

Histopatologisten Assessment

histopatologiset arviointi suoritettiin kirurgisista näytteistä (eikä tuoretta koepala käytetyt näytteet CLE), yhtä poikkeusta lukuun ottamatta, kun endoskooppinen biopsia käytettiin potilaalta, joka kieltäytyi kirurgisia toimenpiteitä. Näytteet kiinnitettiin 4% neutraaleja puskuroituun formaliiniin ja prosessoitiin rutiini parafiiniupotusta ja leikkuun kuin 4 pm paksu osissa. (Tukeminen Information S1).

Kustakin lohkon dia värjättiin hematoxylin- eosiinilla patologista diagnoosin, ja seuraava sarja leikkeitä käytetään immunohistokemia visualisoida CD31-antigeenin. Lyhyesti, sen jälkeen, kun microwaving sitraattipuskurissa (pH = 6), antigeeninä hakumenetelmä, osioista, jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja inkuboitiin 30 minuuttia 1% vetyperoksidia tavoitteena sammuttaa endogeeninen peroksidaasi. Jotta estää epäspesifisen antigeenisten kohtien, näytteet blokattiin 30 minuuttia 2% kuorittua maitoa (Bio-rad, München, Saksa) ja ensimmäinen vasta-ainetta inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa (anti-CD31, hiiren anti -ihmisen, IgG1, kloonata JC70A, Dako, Glostrup, Tanska, laimennettuna 1:100 PBS 1% BSA). Seuraavana päivänä, objektilasit pestiin, signaali ensimmäisen vasta-monistettiin käyttäen peroksidaasi-konjugoitua polymeerikoostumus (EnVision Dako, Redox, Bukarest), ja sitten havaittiin 3,3′-diaminobentsidiiniä – DAB (Dako) . Kaikki pesuvaiheet suoritettiin 1 x PBS-puskuria. Jälkeen hematoksyliinillä värjäys, objektilasit coversliped ja arvioitiin käyttämällä Nikon Eclipse 55i mikroskooppi (Nikon, Tokio, Japani), joka on kytketty 5 Mp CCD-kamera (Nikon) ja kuva-analyysi asemalle (Image ProPlus AMS ohjelmisto, Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, USA).

Neljä kuvaa korkeimmasta verisuonten tiheyden alueita otettiin kiinni samoissa valaisuolosuhteita ja 40x tavoitteena tapauskohtaisesti, ja arkistoidaan pakattuna TIFF. Stylus-suunnittelu kynä käytettiin piirtää ääriviivat alusten (visualisoituina DAB värjäys) Image ProPlus ohjelmistopaketti. Kaikki nämä alueet kohteisiin (ROI) oli pseudo-värinen musta ja mitataan automaattisesti koko verisuonten alueet ja koko verisuonten lukumäärät 40x alue, jonka jälkeen tulokset normalisoitiin 1 mm

2 alueilla. Kaikki lopulliset mittaukset hyödynnetään keskiarvot kaikkien kuvien kaapattu tapauskohtaisesti ja histopatologisia profiilin.

Tilastollinen analyysi

morfometrisiin mittaukset saadut ImageJ viety data-analyysin Microsoft Office Excel (Microsoft , Redmond, Washington, USA). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe. Kaikki mitatut aluksen parametrit katsottiin olevan peräisin normaalijakaumasta kuin ennen [9], [10], ja sen vuoksi tilastollisia eroja normaalin ja kasvaimen verisuoniston laskettiin käyttäen Studentin t-testiä, ja p-arvot ≤0.05 katsottiin oltava tilastollisesti merkittävä.

tulokset

konfokaali Laser Endomicroscopy

CLE menettely oli yksityiskohtainen havainto vierekkäisten kasvain ja normaali limakalvo kohdat, joissa on näkyviä fluoresoiva signaali (Fig. 1). Sekä normaalin ja kasvaimen alukset näyttävät monimutkainen kokonaisuudessaan, mutta se ei ollut selvää visuaalista analyysin kuvien onko merkittävä ero normaalin ja kasvaimen alukset vai mutkittelevuus ylläpidetään tasolla yksittäisten verisuonten palasia.

keskimääräinen halkaisija alusten kasvainnäytteet (9,46 ± 0,4 um) oli merkittävästi suurempi kuin normaalissa näytteessä (7,60 ± 0,3 um, p = 0,0166) (taulukko 1). Vastaavasti, alus tiheys oli merkitsevästi suurempi paksusuolen syövän (5541,05 ± 262,81 alusten /mm

3) kuin normaali peräsuolen limakalvo (3755,79 ± 194,96 alusten /mm

3, p = 0,0006).

Toisin kuin visuaalisen arvioinnin mutkittelevuus indeksi ja aluksen pituus ei tilastollista eroa normaalin (mutkittelevuus indeksi oli 1,05 ± 0,016 ja aluksen pituus oli 28,30 ± 3,27 um) ja kasvainkudoksen (mutkittelevuus indeksi oli 1,07 ± 0,008 ja aluksen pituus 26.49 ± 3,18 um) (taulukko 1). Keskimääräinen tytär /äiti-suhde oli 1,15 ± 0,09 normaalissa näytteessä ja 1,21 ± 0,08 kasvain näytteissä (p = 0,6531). Tiedot kunkin potilaan on esitetty taulukossa 2. Vaikka pieni otoskoko, ei ole suuria vaihteluita potilaiden välillä. Mahdollisena poikkeuksetta potilas 2 arvot tytär /äiti suhteet olivat suurempia kuin 1 sekä kasvain ja normaali näytteitä ja (1,53 ja 1,46 vastaavasti), jotka saattaisivat vaikuttaa erityisen vascularized ja heterogeeninen verisuoniston mutta keskimäärin kaikilla potilailla, arvot olivat lähes 1.

immunohistokemia

jotta onko CLE alus signaalit korreloivat histologinen data, aluksen halkaisija ja suonitiheys havaita CLE olivat laadullisesti verrattuna CD31-värjätään alusten histologinen osassa samasta potilaasta. Verisuonten alue oli 8,19 ± 1,35% kolorektaalisyövässä, huomattavasti korkeampi kuin normaalissa limakalvo, 3,17 ± 0,48% (p = 0,0084). MVD varten peräsuolen normaalin limakalvon ja kasvainkudoksen myös merkittävästi erilaiset (185,73 ± 33,21 /mm

2 ja 309,28 ± 32,26 /mm

2, p = 0,0280, taulukko 3).

Keskustelut ja päätelmät

Tyypillisesti kasvaimen verisuonten tutkimuksissa hiussuonisto kuvataan vain astiasta halkaisijan ja tiheyden näkökulmista, koska nämä ominaisuudet voidaan mitata histologisia viipaleiksi. Olemme myös suorittaa immunohistokemiallinen tutkimus meidän näytteitä, ja saatu samanlaisia ​​tuloksia kuin kirjallisuudessa (suuremman MVD ja verisuonten alueen kasvaimissa vs. normaali kudos) [9], [11], [12], [13]. Lisäksi arvioimme enemmän parametreja vaskula- peräisin tilavuudeltaan näytteiden, kuten aluksen pituus, indeksi mutkittelevuutta ja tytär /äiti-suhde, joka voidaan helposti määrällisesti CLE johtuen sen suuremmasta tunkeutumissyvyys kudokseen (jopa 250 um). Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti tyttären /äiti suhteet ja mutkittelevuus indeksi kolorektaalisyövässä verisuonistossa.

anatomisesti, kasvain pienten verisuonten ovat yleensä laajentuneet, monimutkainen, ja saccular epäsäännöllisiä kuvioita yhteenliittämisen ja haarautuvia [ ,,,0],14]. Yli-ilmentyminen joitakin pro-angiogeenisten tekijöiden, kuten VEGF, johtaa muodostetaan uusi verisuoniston, joka on rakenteellisesti epänormaali klo makroskooppiset ja mikroskooppiset tasoilla ja se on yleisesti katsotaan, että nämä poikkeavuudet pahenevat, kun kasvain kehittyy [15]. Näin ollen mikroverisuonitiheys kasvaa asteittain huonolaatuisesta korkea-asteen neoplasia syöpään [16]. Samoin esillä olevassa tutkimuksessa olemme löytäneet huomattavasti korkeampi suonitiheys ja halkaisija tuumoriverisuoniin.

Useimmat kirjallisuudessa antaa vain laadullinen analyysi aluksen pituus ja mutkittelevuus kolorektaalisyövässä. Yuan et al. (1996), joka on aikaisin näyttöä siitä, että neutralointi kasvaimeen-soluista peräisin VEGF voisi kääntää joitakin poikkeavuuksia kasvaimen mikroverisuoniston kuten verisuonten läpimitan ja mutkittelevuutta [17]. Kun otetaan huomioon, että yksi strategia onnistuneen hoidon antiangiogeeniset aineet on vähentää mutkaisuus epänormaali alusten [18], määrällinen arviointi on tarpeen. Yleensä, verisuonten tortuosity arvioitiin 2D-kuvia [19]. Aiempi tutkimus on määritelty erityyppisiä aluksia mutkittelevuus riippuen aluksen pituus ja osoittivat, että alus mutkittelevuus ja pituus ovat vaihtelevia kasvaimissa [20]. Meidän confocal optiset osat, pahanlaatuinen verisuonten esiintyi enemmän laajentuneet ja tuskallisempi verrattuna normaaliin näytteitä. Mielenkiintoista on, huolimatta silmämääräinen tarkastus, saimme tilastollisesti merkitseviä, kun laskimme heidän indeksi mutkittelevuus. Tämä saattaa johtua siitä, että mutkaisella ulkonäkö saattaa antama mekaaninen muodonmuutos kuin koko kasvainkudoksen kasvaa pikemminkin yksittäisen aluksen palasia mutkikkaita. Yksi viimeaikainen kolmiulotteinen kvantifiointiin tutkimuksessa ei eroja koskien mutkittelevuus ja aluksen pituus välillä kapillaarien terveillä ja syöpäkudokset [21], kun taas kvantitatiivinen tutkimukset kolmiulotteisessa kasvaimia myöhemmissä vaiheissa kasvun väheni aluksen pituus [20], [ ,,,0],22], [23].

ei ollut merkittävää eroa tytär /äiti suhde normaalin ja kasvaimen haarautuvia verkon ja arvot ovat lähellä 1 (1,15 ± 0,09 vs. 1,21 ± 0,08). Tämä parametri on johdettu Murrayn laki liittää suuria aluksia pieniin aluksiin sovelletaan peräsuolen syövän angiogeneesiä. Murrayn laki, käytettävissä epäsymmetrinen sekä symmetrinen aluevaltaus järjestelmiä, todetaan, että kuutio säteen vanhemman aluksen on yhtä suuri kuin summa kuutiot säteiden tyttäristä ja viittaa optimointia verisuonen halkaisija ja veren tilavuuden mukaan aineenvaihdunnan vaatimuksiin [24]. Yksi rajoitus Tutkimuksemme on, että suunta veren virtaus ei ole tiedossa, joten tarkka kuvaus äidin aluksen ei voida määrittää. Tämä puute voidaan ratkaista kanssa

in vivo

havainnointi verenkiertoa kasvaimia, käyttäen kliinisesti hyväksytty varjoaineita.

käytön hyödyllisyyttä morfometrisen parametrien biomarkkereina voi riippua siitä, missä vaiheessa kasvaimen kehitystä . Laskimme morfometrisiin parametrit, jotka mittaavat eri puolia peräsuolen kasvain Mikrovaskulaarinen huomioon otetaan ainoastaan ​​T3 järjestetään, hyvin kohtuullisesti erilaistunut karsinooma (G1-G2 grade), ilman etäpesäke. Vuonna 1997 Robert D. Cardiff et al. lasketaan indeksi mutkittelevuus tutkimuksessa perustuu hiiren nisätuumorimallissa järjestelmän avulla histologia yhdistettynä tietokoneavusteista Elintensisäistä mikroskopia ja hiiret injektoitiin FITC [25]. Hän piti tätä parametrille ennustetekijä ja osoitti, että oli tilastollisesti merkitsevä, kun korreloi korkeamman metastaattinen nopeudella. Samoin edelleen pitkäaikaisia ​​tutkimuksia suurempia potilasryhmissä ovat tarpeen nähdä, jos kaikki morfometrisiin parametrit vahvaa yhdessä peräsuolen adenokarsinooma luokittelua ja jos ne saattavat korreloivat hoitotulokseen ja ennusteen.

Muut menetelmää voidaan soveltaa tutkimukset, joissa seurataan vaikutusta anti-angiogeneesin hoidossa (esim bevasitsumabi) verisuonten haarautuvia, mutkittelevuus ja astian tilavuuden kasvaimissa [8], [26].

tehoa kemoterapia riippuu läsnä on riittävä kasvain verenkierto varmistaa lääkeannostelun, ”normalisointi” kasvaimen verisuonten verkosto on toivottavaa. Siten arvioimalla eroja aluksen pituus, mutkittelevuus ja haarautuvia kuvioita CLE kuvantamisen ja raikas koepalan värjäytymisen voisi olla hyödyllistä tunnistaa cathegory potilaiden, jotka voisivat hyötyä neoadjuvant angiogeneettisiä hoitoa. [27].

Tällä hetkellä kolmiulotteisen konfokaali laser endomicroscopy rekonstruktio on haaste [28] – [30]. Käyttämällä CD 31-vasta-aineita fluoresoivasti leimattu fluorokromilla (Alexa Fluor 488) ja CLE tunnistamiseen alusten tuoreista biopsianäytteissä, voisimme arvioida niiden muodon, haarautuminen ominaisuuksia ja tiheys. Kaksi suurta Tämän menetelmän etuja ovat lyhyempi käsittelyaika (tunti vs. useita tunteja tai päiviä), eikä esineitä kudosten kiinnitys ja käsittely IHC. Tulevaisuuden samanlaiset tutkimukset voisi sisältyä täsmällisempiä merkkiaineita kasvaimen neoangiogeneesiin verrattuna panendothelial merkki käytetään nykyisessä tutkimuksessa.

suora vertailu morfometrisen parametrien välillä CLE ja IHC on vaikeaa ja vähäinen merkitys. Yksi olisi verrata tuloksia yhden parafinoidut kudosta osassa käytetään tavanomaisissa IHC kliiniseen diagnoosiin, jossa tiedot 3D pinon saatu yhdessä CLE skannaus, joka analysoitiin tässä tutkimuksessa. 2D viipale ei salli tarkan mittauksen aluksen pituus, mutkittelevuuteen tai äiti /tytär-suhteet. Toinen vaikeus on se, että CD31-vasta-aine ja kudos käsittelyvaiheet (tuore versus kiinteä ja parafinoidut) ovat erilaiset kahden värjäystekniikkaa ja todennäköisesti saadaan erilaisia ​​arvoja sama parametri erojen vuoksi käsittelymenetelmät.

Yhteenvetona nykyisessä käsikirjoituksen osoitimme, että konfokaali laser endomicroscopy on toteutettavissa mittaamiseen lisää verisuonten parametrit tuoreista kasvainbiopsioissa kuin perinteiset immunohistokemiallisesti yksin. Lisäksi olemme esittäneet kehys, joka kaappaa joitakin olennaisia ​​piirteitä kolorektaalisyövän microvascularization käyttäen toistettavissa ei-invasiivisia tekniikka ja kohdennettuja panendothelial markkereita tuoreen koepaloja. Tarkastus pitäisi tehdä tulevaisuudessa kokeita konfokaali laser endomicroscopy

in vivo

manipuloimalla kasvain morfologian kautta vaihtelut kasvaimen verisuonten muodostumista. Edellyttäen uudet varjoaineet on kliinisesti saatavilla, tulevaisuus

in vivo

käytössä CLE voisi johtaa tunnistamiseen uusien biomarkkereiden perustuu morfometrisiin ominaisuuksista kasvaimen verisuoniston.

Tulokset ovat hyödyllisiä edelleen ymmärtämisen ja peräsuolen syövän kehitystä ja potilaan valintakriteerit. Lisäksi, kuten on määritelty Ehling J et al (2013), ei-invasiivisia luonnehdinta tuumoriverisuoniin johtaa parempi käsitys hoidon vaikutuksista, auttaa optimoimaan ja muokata hoitotoimenpiteiden [8]. Tulokset laajentaa edellinen toteutettavuus havainnot arviointiin uusien verisuonten parametreja, jotka ovat tärkeitä hallinnassa syöpä, mutta joita on vaikea mitata immunohistokemiallisesta kohdat (alusten /mm

3, aluksen pituus, indeksi mutkittelevuutta ja äiti /tytär-suhde). Olemme osoittaneet menetelmän uusittavuuden vertaamalla kahden yhteisen käytetyn parametrit (alus halkaisija, suonitiheys) perinteistä immunohistokemiallisesti. Käyttäen CLE kuvantamismenetelmä analysoida 3D microvascular arkkitehtuuri kasvainten sopii sekä määrällisiä että laadullisia angiogeneesiä mittaukset in vivo ja yhdistettynä kohdennettua vasta-aineilla.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Potilaan ominaisuudet ja immunohistokemia tuloksia.

doi: 10,1371 /journal.pone.0091084.s001

(DOC) B