Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Toll-like-reseptorien (TLR) ovat avaintekijöitä luonnollinen immuniteetti ja aloittaa tulehdusreaktion ulkomaisia ​​taudinaiheuttajia kuten bakteereja, sieniä ja viruksia. Mikroympäristössä kasvaimen, TLR: ien voi edistää tulehdusta ja solujen eloonjäämistä. Toll-like-reseptori 2/6 (TLR2 /6) signalointi tuumorisoluissa pidetään yhtenä mekanismien krooninen tulehdus, mutta se voi myös välittää kasvainsolujen immuuni paeta ja syövän etenemiseen. Ilmaisulla TLR2 ja sen biologisen funktion on kehittymistä ja etenemistä maksasyöpä ei ole tutkittu. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää ilmaus TLR 1-10 vakiintunutta ihmisen maksasyövän solulinjaa BLE-7402, tutkia biologinen vaikutus TLR2 solujen kasvua ja selviytymistä.

Methods

TLR ilmentyminen BLE-7402-soluissa määritettiin RT-PCR, reaaliaikainen PCR ja virtaussytometria (FCM). Jotta voitaisiin edelleen tutkia toiminto TLR2: n maksasyöpä kasvua, BLE-7402-solut transfektoitiin rekombinantti-ilmentävien plasmidien yksi kolmesta TLR2: n siRNA (sh-TLR2 RNAi (A, B ja C)). TLR2 Knockdown varmistettiin käyttämällä RT-PCR, reaaliaikainen PCR ja fluoresenssimikroskopiaan. Kasvainsolujen proliferaatiota seurattiin MTT-määrityksellä ja erittävät sytokiineja supernatantissa transfektoitujen solujen mitattiin helmi-pohjainen FCM, toiminta TLR2 siRNA tutkittiin myös in vivo.

Tulokset

BLE-7402 solulinja ilmaisi TLR 2-10 sekä mRNA ja proteiini tasoilla. TLR2 oli pisimmälle ilmaisi TLR. Vaikka kaikki kolme siRNA: t estivät TLR2 mRNA ja proteiinin ilmentyminen, sh-TLR2 RNAi (B) oli vahvin knockdown vaikutus. TLR2 Knockdown sh-TLR2 RNAi (B) vähensi solujen lisääntymisen. Lisäksi eritystä IL-6 ja IL-8 oli myös vähentää. Tulos osoitti jyrkkä aleneminen kasvaimen tilavuuden hoidettujen hiirien sh-TLR2 RNAi (B).

Keskustelu

Nämä tulokset viittaavat siihen, että TLR2 pudotus estävät leviämisen viljellyistä maksasyöpä soluja ja vähentää eritystä sytokiinien. On ehdotettu, että TLR2 hiljentäminen voi kannattaa lisätutkimuksia varten siRNA perustuu geeniterapiaan hoidossa maksasyöpä.

Citation: Huang Y, Cai B, Xu M, Qiu Z, Tao Y, Zhang Y, et al. (2012) Gene vaiennettu Toll-kaltainen reseptori 2 Estää leviämisen ihmisen maksan syöpäsoluja ja eritys tulehdussytokiinien. PLoS ONE 7 (7): e38890. doi: 10,1371 /journal.pone.0038890

Editor: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

vastaanotettu: 04 tammikuu 2012; Hyväksytty: 14 toukokuu 2012; Julkaistu: 16 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Jiangsun maakunnan Natural Science Foundation (BK2011175). YZH tukee Jiangsun maakunnan Natural Science Foundation (BK2011164), terveys -tutkimusohjelma Jiangsun maakunnassa (X200736, X201110). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasyövän tai maksasyövän pidetään ensisijaisena syöpä peräisin maksasoluja; se on yksi kaikkein tuhoisia syöpä muodossa, erityisesti Kiinassa. Tällä hetkellä puuttuu tehokkaan hoidon johtoa etsitään uusia hoitostrategia, kuten geeniterapiaa. Lyhyt häiritseviä RNA, siRNA voidaan tarjota uudentyyppinen hoito kerran hyvä kohde löytyy. Se ehdotti äskettäin TLR ilmentyvät monissa ihmisen kasvaimissa [1],

Toll-like-reseptorien (TLR) ovat erittäin konservoitunut perheen tyypin I trans- reseptorit, jotka tunnistavat tiettyjä taudinaiheuttajista liittyvien molekyylitason kuviot (PAMPs), esim lipopolysakkaridi, lipotechoic happoa ja muita bakteerin seinämän osia [1], [2], ja se voi myös välittää kasvainsolujen immuuni paeta ja syövän etenemiseen. Ihmisen TLR: t on sytoplasminen domeeni, joka on homologinen sytoplasminen domeeni ihmisen interleukiini (IL) -1-reseptori [3]. Tähän mennessä 11 nisäkkäiden TLR on tunnistettu ja kuvattu.

Viime aikoina uusi tutkimus on paljastanut, että TLR ilmaistaan ​​monien ihmisten kasvaimissa [2], [3], [4], [5], [6 ], mukaan lukien eturauhassyöpä, keuhkosyöpä, rintasyöpä ja hepatosellulaarinen karsinooma. Vaikka TLR on eri toimintoja eri tuumorisoluissa, jotkut tulokset ovat osoittaneet, että TLR signalointi voi olla rooli kasvaimen kasvua ja etenemistä. Esimerkiksi TLR2 signalointi voi edistää keuhkosyövän solujen kasvua ja kestävyys apoptoosin [7], [8]; TLR3 riippuva signalointi voi suoraan johtaa apoptoosin ihmisen rintasyövän [6]; kautta toimia metalloproteaasit ja integriinit, TLR2 ja TLR9 voi johtaa lisääntyneeseen invasiivisuus ja etäpesäkkeiden [8], [9]; TLR4 voi välittää etäpesäke, joka aktiivisesti edistää kasvainsolujen invaasio, proliferaatio, ja selviytyminen eturauhassyöpäsolujen [10].

Toll-kaltainen reseptori 2/6 (TLR2 /6) signalointi syöpäsoluihin on erityisen kiinnostava, koska sitä pidetään yhtenä mekanismien krooninen tulehdus, mutta se voi myös välittää kasvainsolujen immuuni paeta ja syövän etenemiseen. Lisäksi TLR2 toimii mahdollisena antiviraalista mekanismi hepatiitti B-tartunnan maksasoluviljelmissä solulinjoissa [11].

TLR ilmentyvät monenlaisia ​​kasvainsolujen ja epäillään tärkeitä rooleja aloittamista ja etenemistä syöpä, mutta ilmaus TLR mukaan maksasyöpä soluja ei ole tutkittu systemaattisesti ja vähän tietoa TLR vuorovaikutus sairauden etenemiseen. Tässä tutkimuksessa pyrittiin määrittämään ilmentymisen TLR 1-10 vakiintunutta ihmisen maksasyövän solulinjaa BLE-7402. Olemme lisäksi tavoitteena oli tutkia biologinen vaikutus TLR2 solujen kasvuun ja eloonjääminen, sekä arvioida sen mahdollisuuksia alalla syöpähoidon.

Materiaalit ja menetelmät

Kaikki kokeet noudattaneet nykyisen lainsäädännön Kiinassa.

Cell line

ihmisen maksasyövän solulinjaa BEL-7402 ostettiin solusta pankin Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). BEL-7402 kasvatettiin ilman antibiootteja, 5% CO

2 37 ° C: ssa RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA), joka sisälsi 10% FBS.

rakentaminen siRNA ilmentävien plasmidien

Kolme pientä häiritseviä oligonukleotidien (A: 5′-aactatccactggtgaaacaa-3 ’, B: 5′-aaacttgtcagtggccagaaa-3′, C: 5’-aaagtcttgattgattggcca-3 ’) suunniteltiin perustuen sekvensseihin ihmisen TLR 1 -10 (taulukko 1) ja syntetisoitu. RNAi plasmidivektorit (kuvio S1), joka ilmaisee siRNA: t ja TLR2 valvonnassa ihmisen CMV-promoottorin, tuotettiin lisäämällä paria hehkutettu DNA-oligonukleotidit, jotka ovat spesifisiä TLR2 Hindlll ja BamHI peräkkäin osaksi pGenesil-1-plasmidia (shTLR2, taulukko 2). PGenesil-1-salattu vektoria käytettiin kontrollina.

Kvalitatiivinen RT-PCR

TRIzol-reagenssia (Invitrogen) käytettiin eristämään kokonais-RNA mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. A4 ug: n näyte kokonais-RNA sekoitettiin oligo-dT-aluketta ja myeloblastoosiviruksesta (MLV) käänteistranskriptaasia (Promega, Madison, WI). PCR-alukkeet TLR 1-10, sekä GAPDH kontrollina, on suunniteltu, kuten on esitetty taulukossa 1. PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 30 sykliä 95 ° C 1 min, 55 ° C 1 min, ja 72 ° C 1 min. Lopullinen pidennys oli 72 ° C: ssa 10 min. PCR-tuotteet analysoitiin 1,5% (paino /tilavuus) agaroosigeelissä, joka sisälsi 0, 5 ug /ml etidiumbromidia ja visualisoitiin UV-valon alla. Band tiheys analysoitiin ja kvantitoitiin käyttäen ImageQuant ohjelmistoa (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Reaaliaikainen PCR

Reaktioseos sisälsi 45 ui DEPC-H

2O, 1,0 ui cDNA klo 1:100 laimennus, 2,0 ui (10 uM) kutakin aluketta ja kylmäkuivattiin jauhe mukaan manfacturer n ohjeita AccuPower Greenstar® qPCR esisekoitetta. Menettely PCR oli seuraava: 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 40 sykliä 94 ° C 30 sekuntia, 55 ° C 30 sekuntia, 72 ° C 30 sekunnin ajan. Fluoresenssi mitattiin kunkin ekstensiovaihe 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan (Eppendorf, Saksa). Lopussa Reaktion sulamiskäyrä kunkin näyte analysoitiin. BIONEER Exicycler ™ analyysin ohjelmisto (Bioneer Corp., Daejeon, Korea) käytettiin saamiseksi C

t-arvot. Suhteellinen ilmentyminen kohdegeenien määritettiin 2

-ΔΔ CT menetelmällä [12].

virtaussytometria Detection TLR Protein Expression

Suspensiota, jossa oli 2 x 10

6 viljellyt BEL-7402 solut valmistettiin ja läpäiseviksi havaitsemaan TLR proteiinin ilmentyminen. Solut kerättiin ja pestiin kahdesti 1 x PBS: llä, värjättiin sitten 5 ui puhdistettua anti-ihmis-TLR2-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 4 ° C: ssa 1 h valolta suojattuna. Kun oli pesty kaksi kertaa 1 x PBS: llä, solut kerättiin sentrifugoimalla alhaisella nopeudella (1500 g, 10 min) ja inkuboitiin 2 ui PE-konjugoitua vuohen anti-kani-lgG-mAb (Santa Cruz Biotechnology) 4 ° C: ssa 30 min tumma, mitä seurasi kaksi pesua 1 x PBS: llä. Lopuksi värjätään solut suspendoitiin 500 ul: aan 1 x PBS: ää, ja analysoitiin virtaussytometrialla (FACScalibur, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) käyttäen BD CellQuest-ohjelmaa. Negatiivinen kontrolli oli käsitelty samalla tavalla mutta ilman anti-TLR2-vasta-ainetta.

RNA Interference Pitoisuus

transfektoitiin GFP-proteiinia ekspressoivien plasmidin pGsil-1 (Genesil, Wuhan, Kiina ) sisältävät vastaan ​​suunnattu siRNA TLR2, kuten on esitetty taulukossa 2. transfektoidut solut ympättiin 2 x 10

5-soluja /kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä ja kasvatettiin yön yli kunnes ne saavuttivat 70% konfluenssin. Transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine ™ 2000-reagenssia (Invitrogen) seuraten valmistajan ohjeita. Neljä ug plasmidi-DNA: ta (sh-TLR2 RNAi (A), sh-TLR2 RNAi (B), sh-TLR2 RNAi (C), vektori pGenesil-1 ja salattu siRNA) käytettiin transfektioon soluihin vastaavasti (SunShineclean ™ Without- endotoksiini Plasmidi Mini Extraction Kit, SunShineBio, Kiina). Transfektoituja soluja inkuboitiin 72 tuntia, sitten fluoresenssi havaittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia. Tällä hetkellä solut kerättiin myös FCM ja immunofluoresenssimäärityksellä.

Immunofluoresenssianalyysi

BEL-7402-solut transfektoitiin eri siRNA plasmidit ja viljeltiin yön yli, sitten kiinnitettiin alkoholia 30 min ja blokattiin 1 x PBS: ssä (pH 7,4) liuoksen, jossa on 3% BSA: ta. Anti-TLR2-vasta-ainetta (sc-166900, Santa Cruz Biotechnology), lisättiin 1:200 laimennus- ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa kostutetussa laatikossa. Pesun jälkeen fluoresoivan sekundaarisen vasta-aineen (sc-22766, Santa Cruz Biotechnology), lisättiin 1:100 laimennus- ja inkuboitiin 2 tuntia. Sitten solut pestiin kolme kertaa 1 x PBS: ää, ja vasta-värjättiin DAPI. Konfokaalimikroskopia tehtiin ja fluoresenssia analysoitiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Leica DMI4000B, Buffalo Grove, IL).

proliferaatiomääritystä

MTT-määrityksellä (Sigma, St. Louis, MO) oli käytetään arvioimaan solujen lisääntymistä transfektion jälkeen. Soluja viljeltiin 96-kuoppaisilla solujen levyille (1 x 10

4 /kuoppa, 5 syvennystä per ehto) yön yli, ja solujen transfektiot suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. 48 tunnin kuluttua näyte transfektoitujen solujen kerättiin 0 h näytteessä, kun taas muut solut jatkettiin viljellään 24 tuntia, 48 tuntia ja 72 tuntia. Lopussa kunkin hoitojakson aikana MTT lisättiin viljelyalustaan ​​kuhunkin kuoppaan konsentraationa 5 mg /ml (Sigma Chemical Co., St Louis, MO), ja sitten inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Sitten supernatantti poistettiin ja solut sekoitettiin 100 ul /kuoppa dimetyylisulfoksidia. Absorptio mitattiin käyttämällä automaattista mikrolevyn spektrofotometrillä (340st; Anthos Zenyth, Salzburg, Itävalta) 490 nm: ssä.

Human tulehduksellinen sytokiini Pitoisuus

Supernatantti kerättiin transfektoiduista soluista. IL-6 ja IL-8 tasoa todettiin käyttäen ihmisen tulehduksellinen sytokiini Kit (BD ™ Sytometrisen Helmet Array) mukaan valmistajan ohjeiden.

Kokeilu Mouse Model in vivo

Kateenkorvattomiin nude hiiret (Balb /c -nu /nu, 5-7 viikkoa ikäisiä) jaettiin viiteen hoitoryhmään kymmenen hiirtä per hoitoryhmä. Eläinten käsittely ja kokeellisia menettelyjä hyväksynyt eläinkokeet komitean Nanjing Medical University. Suspensiota, jossa oli BEL-7402-soluja (1 x 10

7) 500 ul: aan PBS: ää injektoitiin ihon alle ja abodomen. Tämä solupitoisuus oli tarpeen yhdenmukaista paikallista kasvaimen kasvua 10 päivän kuluessa implantaatiosta. Päivinä 10 ja 15 implantaation jälkeen, kasvaimet injektoitiin vastaavasti plasmidi-DNA: ta (sh-TLR2 RNAi (A), sh-TLR2 RNAi (B), sh-TLR2 RNAi (C), vektori pGenesil-1 ja salattu siRNA) , 150 ug kerta. Kasvain asteikko määritettiin silmämääräisesti ja mitattiin työntömitalla 15 d toisen injektion jälkeen.

Tilastollinen analyysi

Data osoittaneet ovat vähintään kolmesta erillisestä kokeesta ja ovat edustettuina keinoja ± keskihajonta (SD). Opiskelijan

t

-testin ja ANOVA käytettiin määrittämään merkitystä, ja erot katsottiin merkitsevä

P

arvo on alle 0,05.

Tulokset

ilmentäminen TLR: ien in BEL-7402 Cell Line

Puolikvantitatiivinen RT-PCR-analyysi paljasti, että mRNA TLR (TLR 2-10) ilmaistaan ​​BEL-7402-soluja (kuvio 1A), kun taas TLR1, 7 mRNA ilmentyminen oli tuskin havaittavissa. Tarkempi analyysi reaaliaikaisella PCR osoitti, että TLR7 ilmentyy alimmalla tasolla. Siksi päätimme antaa kaikki muut TLR mRNA-tasot suhteessa tasoon TLR7 mRNA. TLR2 ja TLR4 osoittivat korkeimmat ekspressiotasot, jotka voivat viitata niillä on jokin funktio in BEL-7402 solujen kasvua ja etenemistä (kuvio 1 B).

Semi-kvantitatiivinen RT-PCR tulos TLR in BEL-7402. GAPDH mRNA käytettiin kontrollina (A). Reaaliaikainen RT-PCR TLR in BEL-7402. Ilmaus TLR7 normalisoitiin 1.0 sen taso oli alhaisin kaikista TLR (B). TLR-proteiinin ekspressiotasot BEL-7402 virtaussytometrialla (C). Kaikki tulokset ovat edustavat kolmea erillistä koetta.

TLR-proteiinin ilmentymisen tasot määritettiin virtaussytometrialla (FCM). TLR2 ilmentyi korkeimmilla tasoilla TLR1-10, muut TLR olivat ilmaisseet kohtuullisella tasolla ilmaistuna tai heikosti (kuvio 1 C). Yhdessä tuloksemme osoittavat, että BEL-7402-soluille ilmaista TLR2-TLR10, jossa TLR2 on pisimmälle ilmaistu. Tämä tulos kannusti meitä tutkimaan tarkemmin toiminta TLR2 kasvuun ja etenemiseen BEL-7402-soluissa.

tehokas knockdovvn TLR2 Expression in BEL-7402 Cell Line Three siRNA

tutkimiseksi edelleen potentiaalifunktio TLR2: n maksasyöpä, käytimme pieni hiusneula-RNA: iden ja pudotus endogeenisen TLR2 geenin ilmentymisen [Gene ID: 10333]. Plasmidivektorit rakennettiin ilmaista kolme erilaista siRNA: t, sh-TLR2 RNAi (A), sh-TLR2 RNAi (B), sh-TLR2 RNAi (C). Kaikki kolme kokeellista siRNA vektorit transfektoitiin BEL-7402-soluissa, joissa salattu siRNA vektori ja tyhjän vektorin verrokkeina. 48 h jälkeen keskimääräinen transfektion tehokkuus oli noin 70% arvioima vihreän fluoresenssin positiiviset solut alla florescence mikroskoopilla. Kaikki kolme kokeellista siRNA vähentää tehokkaasti TLR2 mRNA ilmentyminen transfektoiduissa soluissa (kuvio 2I). TLR2-mRNA-tasot olivat 29.85% ± 9,2%, 50,75 ± 6,7% ja 31,34 ± 8,3% tyhjän vektorin ohjaus sh-TLR2 RNAi (A), sh-TLR2 RNAi (B) ja sh-TLR2 RNAi (C) vastaavasti, tilastollisesti merkittävä lasku ilmaisun verrattuna tyhjän vektorisäätö solut (

P

0,05) (kuvio 2ii). Ei tilastollisesti merkittävä lasku ilmentyminen havaittiin soluissa, jotka oli transfektoitu salattu siRNA (

P

0,05). TLR2-proteiinin ilmentyminen väheni kaikilla kolmella siRNA: t, joissa tasolla 33,0% ± 3,0% (sh-TLR2 RNAi (A)), 57,9% ± 4,7% (sh-TLR2 RNAi (B)) ja 43,7% ± 4,5% (SH- TLR2 RNAi (C)) ja tyhjän vektorin ohjaus (kuvio 2III). Ei ole merkittävää eroa TLR2-proteiinin ilmentyminen nähtiin salattu siRNA ohjaus (

P

0,05). Nämä tiedot osoittavat, että sh-TLR2 RNAi (B) on tehokkain rekombinanttiplasmidin vaientaa TLR2. Siksi valittu käyttämään ainoastaan ​​sh-TLR2 RNAi (B) lisäkokeita.

I, RT-PCR-TLR2 peräisin pGenesil-1 vektori, ScrambledsiRNA, sh-TLR2 RNAi (A, B, C) transfektoitiin BEL-7402. II, ilmentyminen TLR2 mRNA tasolla pGenesil-1 vektorin, ScrambledsiRNA, ja sh-TLR2 RNAi (A, B, C) transfektoituja BEL-7402 reaaliaikaista PCR. III, virtaussytometria analyysi TLR2 ilmaisun, opiskelijan

t

-testin ja ANOVA käytettiin määrittämään merkitystä.

TLR2-proteiinin ilmentymistä in BEL-7402-soluissa edelleen määritettiin immunovärjäämällä anti-TLR2-vasta-aineen ja visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla. Positiivinen värjäys väheni dramaattisesti by sh-TLR2 RNAi (B) verrattuna tyhjän vektorisäädön (Fig. 3IV). Ei merkittävää eroa ei havaittu värjäytymistä tasoilla sekoitetun siRNA ohjaus verrattuna tyhjän vektorin kontrolli (Fig. 3IV).

I, MTT-analyysi proliferatiivinen nopeus pGenesil-1 vektorin, ScrambledsiRNA ja sh-TLR2 RNAi (B) transfektoiduista soluista. II ja III, IL-6 ja IL-8 läsnäolo supernatantissa erittämän pGenesil-1 vektorin, salatut siRNA ja sh-TLR2 RNAi (B) transfektoiduista soluista. Cell supernatantti kerättiin ja analysoitiin käyttäen virtaussytometrialla. Kaikki tulokset edustavat kolmea erillistä koetta, opiskelijan

t

-testin ja ANOVA käytettiin määrittämään merkitystä. IV, immunofluoresenssianalyysillä geenispesifinen siRNA on TLR2-proteiinin ilmentymisen pGenesil-1 vektorin (i), Salattu siRNA (ii) ja sh-TLR2 RNAi (B) (iii) transfektoiduista soluista. Tumavärjäystä suoritettiin käyttäen DAPI (sininen) (200 x). TLR2 hiljentäminen estää kasvaimen kasvua käytettäessä hiirimallissa. Vertailu kasvainten tilavuuden kustakin hoitoryhmässä näytettiin. Hoito BEL-7402 solu (VI_i), sh-TLR2 RNAi (B) rakentava DNA injektoitiin kasvaimen ryhmässä (VI_ii), Merkittävät erot kontrolliryhmää (V.▪, VI_iii) olivat edustettuina tähdellä (

P

0,05).

Näin ollen olemme osoittaneet erityisiä siRNA-suunnattu pudotus ja TLR2-geenin ihmisen maksasolusyövän solulinja BEL-7402, ja osoitettu, että sh-TLR2 RNAi (B ) oli tehokkain rekombinanttiplasmidin äänenvaimennusjärjestelmissä TLR2.

lisäkasvu Transfektoituja BEL-7402 Cell Line jälkeen TLR2 Gene Knock Down

Käytimme MTT-määritystä määrittää vaikutukset sh-TLR2 RNAi (B) -välitteisen TLR2 hiljentäminen soluproliferaatioon. Soluja viljeltiin 0 h, 24 h, 48 h ja 72 h kuluttua 48 h transfektion jälkeen. Prosenttiosuus elävien solujen pienennettiin läsnä TLR2 siRNA mukaan -50% keskimäärin verrattuna soluihin ilman hoitoa. Proliferatiivinen kyky BEL-7402-soluissa vähennettiin sh-TLR2 RNAi (B) transfektiolla (Kuva 3I). Mitään merkittävää eroa ei havaittu soluissa, jotka oli transfektoitu siRNA ohjaus (

P

0,05).

Down-regulation TLR2 siRNA Blocks sen Downstream Signaling in BEL-7402 Cells

biologisia muutoksia aiheuttamat TLR2 alassäätöä voi johtua muutoksiin TLR2-välitteisen loppupään signalointi johtaa muutoksiin myöhemmin tehtävät.

TLR2 voi olla rooli TLR2 /MyD88 signalointi ja myöhemmät loppupään toiminnot [17], ja oletamme, että sytokiinien eritys on tulosta TLR2 signalointi. Siksi suunnittelimme protokolla tutkimaan tasolle tulehduksellisten sytokiinien BEL-7402-soluissa TLR2 geenin knockdown. BEL-7402-soluja transfektoitiin sh-TLR2 RNAi (B). 72 tunnin jälkeen supernatantti poistettiin ja tasoja IL-6 ja IL-8 määritettiin sytometria-helmi-määrityksellä. IL-6 ja IL-8-tasojen havaittiin olevan selvästi masentunut. IL-6 pienensi 50,2 ± 2,6% ja IL-8: 49,7 ± 3,5% verrattuna tyhjällä vektorilla hallintalaitteet (

P

0,05); mitään merkittävää eroa ei havaittu siRNA-transfektoiduissa ohjaimet (Kuva 3II ja Kuva 3III).

TLR2 Gene siRNA Estää tuumorigeneesiä Nude hiiret

vahvistettua merkittäviä vaikutuksia TLR2 pudotus RNAi in BEL-7402-solujen

in vitro

, me kysyä, TLR2 RNAi myös tukahduttaa tuumorigeenisyyteen BEL-7402 kasvaimia nude-hiirissä. Päivinä 7 ja 14 implantaation jälkeisten, kasvaimet injektoitiin plasmidi-DNA ilmentävien TLR2 siRNA. Bruttomäärä morfologia primaarikasvainten tutkittiin. Kasvaimet mitattiin ja merkittävästä vähentämisestä kasvaimen havaittiin hiirissä, joita hoidettiin sh-TLR2 RNAi (B) (Kuva 3 V-VI ii).

Keskustelu

Toll-like-reseptorien (TLR ) ovat säilyneet perheen reseptoreita, jotka tunnistavat taudinaiheuttajien tunnistamalla PAMPs [13], [14]. Lisäksi he ovat mukana myös säännellä tulehdus [15], joka on tehtävä, joka on ehdotettu olevan ainakin osittain riippuvainen kyvystä TLR tunnistaa useita endogeenisten TLR ligandien tunnetaan vahinkoja liittyvä molekyyli kuviot (vaimentaa). Viime aikoina monet tutkimukset TLR ja niiden mahdollinen rooli syöpätutkimuksessa ja terapia on raportoitu. Yang et ai [16] tutkittiin mahdollisia rooleja TLR2 signaloinnin kasvaimen etäispesäkkeiden hiirimallissa injektoitiin suonensisäisesti B16-melanoomasoluja. Tuloksena osoittavat, että TLR2 on houkutteleva kohde vastaan ​​etäpesäke, anti-TLR2-vasta-ainetta voitaisiin käyttää torjumaan elämää uhkaavia metastasis.Thompson et ai [11] osoittivat, että hepatoma solulinjat ilmentävät funktionaalista TLR2-reseptoreita, jotka, kun stimuloidaan, aloittaa signalointikaskadin, joka estää hepatiitti B -virus. Xu et al [17] havaittu veren mononukleaarisoluissa HBV-tartunnan saaneilla potilailla osoitti alentuneesta TLR7 ilmaisun ja TLR9 mRNA, mutta nousu TLR9 ilmaisun proteiinitasolla.

Näiden tutkimusten perusteella tiedämme, että TLR2 , TLR7 ja TLR9 avainrooleja maksasairaudet ja TLR2 on potentiaalifunktio säätelyssä kasvain toleranssi, syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden [13]. Orihara ym [18] ovat osoittaneet, että TLR2 ja /tai TLR4 verenkierrossa monosyyttejä merkittävästi säädellään ylöspäin bakteeritartunta. TLR2 ekspressiotasot monosyyttien on osoitettu kriittisen tiedon suunniteltaessa hoitoon bakteeri-infektiotautien [18] ja filarial sairaudet [19], munasarjasyöpä [20], maksasairauksien [21], ja bakteeri-infektiotauti [22], [ ,,,0],23], [24], [25]. Kuitenkin kasvu, leviämisen ja etäpesäkkeiden maksasolusyövän ovat monimutkaisia ​​ja dynaamisia prosesseja. Jokainen prosessi on todennäköisesti liittyä toimien (ja vuorovaikutus) useiden TLR [26]. Ottaen huomioon tämän, päätimme tutkia ilmaisun muiden TLR maksasolukarsinoomassa ja tutkimaan, ovatko nämä voivat vaikuttaa kasvuun, etenemiseen ja selviytyminen maksasyövän. Meidän kokeet osoittavat, että TLR 2-10 ilmaistaan ​​BEL-7402-soluissa sekä mRNA ja proteiini tasoilla. Olemme osoittaneet, reaaliaikaisella PCR-analyysi ja virtaussytometria, että TLR2 on pisimmälle ilmaisivat, että TLR.

On syntymässä todisteita siitä, että monia erilaisia ​​solutyyppejä maksassa ilmaista TLR2 [27]. kuten Kupfferin solut, maksasoluihin sapen epiteelisolujen. TLR-välitteiset signaalit johtaa hepatiitti B, hepatiitti C, alkoholin aiheuttama maksasairaus, alkoholittomat maksasairaudet, ensisijainen maksakirroosi, ensisijainen sklerosoiva kolangiitti, maksan fibroosi, iskeeminen-reperfuusiovaurio ja hylkimisreaktioon [27]. Huang et al. osoittivat, että

Listeria monocytogenes

aktivoitu mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien ja Nukleaaritekijä-KB kasvainsoluissa kautta TLR2 signalointi, jolloin tuotannon kasvu typpioksidin ja interleukiini-6 ja lisääntynyt kasvainsolujen lisääntymistä [7]. Kim et ai. osoittivat, että Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) oli tehokkain makrofagiaktivaattori johtaa interleukiini-6 ja kasvaimen nekroositekijä-α aktivaation kautta Toll-kaltainen reseptori (TLR) perheen jäsenet TLR2 ja TLR6 [9], ja niiden tulokset selitti, kuinka kehittynyt syöpäsolujen muuttaa isännän luonnollinen immuniteetti ja siten tuottaa tulehduksellinen mikroympäristön. Huang et al. osoitti, että mikroympäristö on suuria kasvaimia suosii bakteerien selviytymistä, joka puolestaan ​​suoraan kiihdyttää tuumorin kasvua aktivoimalla kasvainsolun Toll-kaltainen reseptori 2 [7].

Esitulehduksellisten tekijät, kuten typpioksidin, IL-6 ja IL- 12 osoitettiin vapautua kasvainsolujen aiemmissa tutkimuksissa [10]. Sekä IL-6 ja IL-12 tiedetään auttaa kasvainsolujen vastustamaan sytotoksisten T-lymfosyyttien ja luonnollisten tappajasolujen, mikä johtaa kiertämisen päässä immuunivalvonnan [10]. Tutkimuksessamme TLR2 valittiin tutkia toiminnon TLR: ien kasvuun BEL-7402-soluja. Tutkimuksemme osoittaa, että on tärkeää TLR2-välitteisen kasvain leviämisen analysointi tulehdussytokiinejä osoitti masentunut tuotanto TLR2 ilmaisun jälkeen TLR2 Knockdown, ja osoitti, että kyky BEL-7402-solujen vastustamaan immuunijärjestelmän solujen hyökkäys ja helpottaa veronkierron välillä immuunivalvonnan voitaisiin alentaa . Tämä viittaa siihen, että kaikki fenotyyppiset muutokset havaitaan näitä soluja välittämien tukahduttamalla toiminnan TLR2.

hiiritila syövän tutkittiin myös, ja määrä kasvaimen siRNA hoito on osoitettu. By että oli merkittäviä vaikutuksia TLR2 pudotus RNAi in BEL-7402-solujen in vitro, ihmettelemme, onko TLR2 RNAi myös tukahduttaa tuumorigeenisyyteen BEL-7402 kasvaimia nude-hiirissä. Päivinä 10 ja 15 implantaation jälkeen, kasvaimet injisoitiin ilmentävien-DNA sh-TLR2 RNAi. Bruttomäärä morfologia primaarikasvainten tutkittiin. Raju vähennys kasvaimen havaittiin hiirissä, joita hoidettiin sh-TLR2 RNAi (B).

Tulokset esitetään tässä paperissa todistamaan, että TLR2 pudotus ei ainoastaan ​​in vitro, mutta in vivo voisi estää kasvun maksan kasvaimia. TLR2-välitteisen syövän kasvu näyttää olevan tärkeä tekijä syövän etenemiseen. Käyttö systeemisesti toimitetaan TLR2 siRNA voi siten tarjota käyttöön uusi hoito ehkäisyyn syövän etenemistä johtaa paremmat mahdollisuudet jäädä henkiin.

tukeminen Information

Kuva S1.

RNAi plasmidivektorit (pGenesil-1-plasmidi).

doi: 10,1371 /journal.pone.0038890.s001

(JPG) B

Kiitokset

Kiitämme tohtori Dongxu Liu (School of Life Sciences, Hubei University, Hubein, PR Kiina) tarjota teknistä tukea.