PLoS ONE: GSK3p Yliekspressio Osoittaa huono ennuste ja sen esto Vähentää Cell Proliferation ja Survival of Non-pienisoluinen keuhkosyöpä solut
tiivistelmä
Background
Glykogeenisyntaasikinaasi 3 beta (GSK3p) on keskeisesti mukana erilaisissa solun prosesseissa, kuten solujen lisääntymisen ja apoptoosin. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia vaikutusta GSK3p ilmaisun ennusteeseen ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja vaikutukset GSK3p eston in NSCLC solulinjoissa.
Methods
immunohistokemiallinen ja western blot määrityksiä käytettiin arvioimaan GSK3p ilmentymistaso ihmisen NSCLC kudoksissa. Lentiviruksen RNA-interferenssi suoritettiin ekspression inhiboimiseen GSK3p että A549, H292, H1299 ja SK-MES-1-solulinjat. Solujen eloonjääminen, apoptoosin ja liikkuvuus arvioitiin
in vivo
ja
in vitro
.
Tulokset
tasot GSK3p oli suurempaa NSCLC kudoksissa (n = 211) kuin verrokeilla kudoksissa (n = 194) (
P
0,001). 5-vuoden seuranta-analyysi osoitti, että positiivinen GSK3p ilmentyminen oli osoitus huonoon ennusteeseen (
P
= 0,006). Lisäksi knockdovvn GSK3p NSCLC solulinjoissa tukahdutetaan solujen lisääntymistä, pidätettiin kasvainsoluja G0 /G1 vaiheessa aiheuttaman apoptoosin ja vähentää solun liikkuvuus. Ksenograftimallia osoitti, että vapauttaminen GSK3p vaimenee tumorigeneesin, mikä vahvistetaan alentunut solujen lisääntymisen perustuu Ki-67 ja lisäsi merkittävästi apoptoottisen solukuoleman. Estyminen GSK3p oli ristiriidassa vaikutuksia ekspressioon β-kateniinin, riippuen solutyypistä tutkittiin.
Johtopäätös
Poikkeava ilmentyminen GSK3p toimii itsenäisenä merkki huonosta ennusteesta ja NSCLC. Estyminen GSK3p tukahdutti kasvaimen kehittymisen vaimentamalla solujen lisääntymistä, lisäämällä apoptoosia ja hillitsemiseksi solun liikkuvuus. Nämä tulokset tunnistaa GSK3p kasvain promoottori ja mahdollinen terapeuttinen kohde NSCLC.
Citation: Zeng J, Liu D, Qiu Z, Huang Y, Chen B, Wang L, et ai. (2014) GSK3p Yliekspressio Osoittaa huono ennuste ja sen esto Vähentää Cell Proliferation ja Survival of Non-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 9 (3): e91231. doi: 10,1371 /journal.pone.0091231
Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat
vastaanotettu: 11 syyskuu 2013; Hyväksytty: 10 helmikuu 2014; Julkaistu: 11 maaliskuu 2014
Copyright: © 2014 Zeng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Nature Science Foundation of China (81201851 Dan liu ja 81641028 on Weimin Li). Verkkosivuilla National Nature Science Foundation of China on https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default166.htm. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Keuhkosyöpä on johtava syy maailmanlaajuisesti syöpään liittyvien kuolemien vuosikymmeniä [1]. Kiinassa määrä keuhkosyöpää ja liittyvät kuolemat keuhkosyöpään on kasvanut yhä savuke hyväksikäyttö ja epäpuhtaustasot [2]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joka sisältää ensisijaisesti adenokarsinooma ja okasolusyöpä, osuus on lähes 85% keuhkosyövässä. Vaikka uusia hoitomenetelmiä on otettu käyttöön, useimmat potilaat ovat edelleen diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa, ja 5 vuoden pysyvyys on edelleen alle 15% [1]. Parantaa lopputulosta ja elämänlaatua potilailla, joilla on NSCLC, monet viimeaikaiset tutkimukset ovat keskittyneet löytää uusia terapeuttisia kohteita ja tunnistaa biomarkkerit helpottaa hoito on yksilöllisempää [3].
Glykogeenisyntaasikinaasi 3 beta (GSK3p) on monitoiminen seriini /treoniini proteiinikinaasi, joka eristettiin alun perin kanin luurankolihaksen [4]. Under lepotilassa, GSK3p on konstitutiivisesti aktiivinen johtuu tyrosiinia 216 fosforylaation, ja se fosforyloi ja estää monipuolinen joukko pro-onkogeenisen alustoille, kuten β-kateniinin, sykliini D1, c-Jun, c-Myc ja CREB. Puolestaan fosforylaatiota seriini-9 inaktivoi GSK3 £: [5] – [7]. Perustuen näihin toimintoihin, GSK3p on mahdollinen tuumorisuppressorin, ja inaktivointi GSK3p on raportoitu monia syöpäsoluja [8], [9]. Kuitenkin, monet tutkimukset ovat osoittaneet, että GSK3p voi positiivisesti säädellä proliferaatiota ja kasvainsolujen apoptoosin [10] – [18]. Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että inhibitio GSK3p vaimentaa eloonjäämistä ja proliferaatiota ja indusoi apoptoosia erilaisissa syövissä, kuten haimasyövän [11], paksusuolen ja peräsuolen syövän [12], [15] ja virtsarakon syövän [18]. Kuitenkin rooli GSK3p eroaa eri syöpiä [19], ja täsmällistä asemaa GSK3p NSCLC jää epäselväksi.
Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmaus GSK3p ihmisen NSCLC kudoksissa ja sen ennustetekijöiden merkitys. Vuonna H292, H1299, SK-MES-1 ja A549 NSCLC solulinjat, GSK3p ilmentyminen inhiboitui pieni hiusneula-RNA (shRNA) siirretään lentivirusvektorilla. Vakaa Knockdown solulinjoja tarkastettiin ja käytettiin lisätutkimuksia. Tumorigeneesin, leviämisen, apoptoosin ja solumigraatio arvioitiin myös sekä
in vivo
ja
in vitro
, ja tulokset osoittivat, että poikkeava ilmentyminen GSK3p toimi itsenäisenä indikaattorina huonon ennusteen NSCLC. Lisäksi esto GSK3p RNA ylijännitesuojalla tumorigeneesin vaimentamalla solujen lisääntymistä, lisäämällä apoptoosia ja tukahduttaa solujen invaasiota. Yhdessä nämä havainnot tunnistaa GSK3p kuin kasvain promoottori ja potentiaalinen terapeuttinen kohde NSCLC.
Materiaalit ja menetelmät
1. Potilaat ja kudoksen keräys
Kirurgisesti resektoitiin NSCLC kudoksissa (n = 211), ja näytteet normaalin keuhkojen vieressä kasvainkudoksessa (n = 194) saatiin West China Hospital, Sichuan University. Kukaan potilaista oli hoidettu tahansa ennen leikkausta kemoterapiaa tai sädehoitoa. Seuranta oli saatavilla 160 tapausta. Patologisen vaiheet määritettiin mukaan International Union Against Cancer (UICC) kasvain-solmu-etäpesäke (TNM) luokittelujärjestelmän pahanlaatuisia kasvaimia. Edelleen tutkia, missä määrin erilaistumista ja histologinen tyyppi määritettiin mukaan Maailman terveysjärjestön luokitusta NSCLC. Sen jälkeen kirurginen resektio, kaikki potilaat saivat standardin hoitojen mukaan vuoden 2004 NCCN Clinical Practice suuntaviivat onkologian varten NSCLC. Kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan ja Institutional Review Board hyväksyntä Tutkimuksen saatiin West China Hospital, Sichuanin yliopistossa.
2. Vakaa geenien käyttäen pieniä häiritseviä RNA välittämien lentivirusvektorilla
Ihmisen keuhkojen NSCLC solulinjat A549, H292, H1299 ja SK-MES-1, joka saatiin American Type Culture Collection (ATCC), kasvatettiin mukaan ATCC protokollia.
Jaksot (GAAGAAAGATGAGGTCTAT) kohdistaminen GSK3p (GenBank: NM_002093), joka oli suunniteltu käyttäen BLOCK-iT RNA-interferenssi (RNAi) Suunnittelija (Invitrogen, Carlsbad, CA) on valittu. Sekvenssi liity GSK3p-geeni (TTCTCCGAACGTGTCACGT) suunniteltiin negatiivisena kontrollina (NC) [20]. PGCSIL-GFP lentivirusvektorilla hankittiin GeneChem ja NeuronBiotech Corp (Shanghai, Kiina). Vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) käytettiin merkkiaineena tarkkailla ja järjestää transfektoituja kasvainsoluja fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS). Vaikutukset RNA-häirintää arvioitiin RT-PCR: llä (5
th päivää transfektion jälkeen) ja western-blottauksella (7
th päivää transfektion jälkeen). Sitten NSCLC solulinjoja vakaa ja jatkuva GSK3p geeni kaataa saatiin edelleen
in vivo
ja
in vitro
tutkimuksissa. Solut infektoitiin lentivirus että toimitettu sekvenssin kohdistaminen GSK3 mainittiin myös kaataa ryhmä (KD ryhmä). Samoin solut, jotka sisältävät lentivirus toimitettuna NC sekvenssi nimettiin NC ryhmä; ja nämä kasvaimen solut eivät tartunnan lentivirukselle käytettiin tavallisena ohjaus ja nimetty kontrolliryhmän (CON ryhmä).
3. Tuumorigeneesiä ksenosiirrettyjä hiirillä
Nude-hiirten (BALB /c-nu /nu, n = 6 kussakin ryhmässä, yhtä paljon uroksia ja naaraita, ikä 6-8 viikkoa) toimitti laboratoriossa Animal Center of Sichuan Yliopisto. Hiiret majoitettiin laminaarivirtausmittaria kaappien erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa ja ruokitaan ad libitum. Kaikki tutkimukset, joissa hiirille tehtiin mukaan National Institutes of Health suuntaviivat hoito ja käyttö Laboratory Animals. Hyväksyntä Tutkimuksen antoivat Institutional Animal Care ja hoito komitean Sichuanin yliopistossa.
hoidon jälkeen erilaisia viruksia, eksponentiaalisesti kasvavia A549-soluja ihon alle ruiskutetaan selkään Balb /c nude-hiiriin (1 x 10
6 /ml kutakin). Kasvainten tilavuuden arvioitiin joka 3 päivä mukaan seuraavan kaavan mukaisesti: kasvaimen tilavuus (mm
3) = d
2 x D x 0,52. Neljä viikkoa tuumorin implantaation jälkeen, hiiret tapettiin kivuttomasti. Heidän elimet tutkittiin törkeästä todisteita anatomisia muutoksia.
4. Soluproliferaatiomäärityksiä
Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Rockville, USA) käytettiin arvioimaan solujen lisääntymistä mukaan valmistajan protokollaa. Tuumorisoluja (2 x 10
3 per kuoppa) siirrostettiin 96-kuoppaisille viljelylevyille, ja käsiteltiin 10% FBS: ää ja inkuboitiin 37 ° C: ssa. Optinen tiheys 450 nm: ssä mitattiin 24, 48, 72, 96 ja 120 h kuluttua viruksen transfektiota. Esitetyt tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta ja esitetään keskiarvona ± S.D.
5. Solusyklin analyysi
Seitsemänkymmentäkaksi tuntia transfektion jälkeen, solusyklin tiedot saatiin analysoimalla PI-värjättyjen solujen fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS), jossa on FACSCalibur-virtaussytometrillä (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA ). Kutakin näytettä varten vähintään 3 x 10
5 solut laskettiin, ja tiedot analysoitiin BD CellQuest ohjelmisto. Esitetyt tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta ja esitetään keskiarvona ± S.D.
6. Apoptoosin analysointi
tuumorisoluja (noin 5 x 10
5), värjättiin 5 ui anneksiini V-APC ja 7AAD (KeyGen, Nanjing, Kiina) huoneen lämpötilassa ja analysoitiin sitten virtaussytometrillä kuluessa 1 h. Anneksiini V (+) /7AAD (-) solut pidettiin apoptoottisia soluja.
TUNEL menetelmä (In situ Cell Death Detection Kit AP, Roche, Sveitsi) käytettiin tason määrittämiseksi apoptoosin vierassiirrekokeissa kasvainkudoksia. Apoptoottisia soluja havaittiin käyttämällä alkalista fosfataasia ja värjätään punaisella. Kunkin kasvain, apoptoottisten solujen 5 random suuritehoisia kenttiä laskettiin, ja nopeus apoptoosin laskettiin seuraavalla kaavalla:
Apoptosis rate = apoptoottisten solujen määrässä /kokonaismäärä kasvainsolujen laskettiin x 100 %.
7. RNA ja reaaliaikainen PCR-
Alukkeet ihmisen GSK3p oli 5′-ATTTCCAGGGGATAGTGGTGT-3 ’(sense) ja 5′-TCCTGACGAATCCTTAGTCCAAG-3′ (antisense); sekä ne GAPDH olivat 5’-CCATCACCATCTTCCAGG-3 ’(sense) ja 5’ATGAGTCCTTCCACGATAC -3’ (antisense). Alukkeet ja koettimet ostettiin GeneChem, Shanghai, Kiina. MRNA ilmaisu tasojen määrä kolmena kappaleena reaaliaikaisella RT-PCR käyttämällä 2720 lämpösyklilaitetta (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia). Suhteelliset tasot tavoite transkriptien kvantitoitiin käyttäen 2 (delta Delta Ct) menetelmää [21] ja normalisoitu tasolle ihmisen GAPDH selostukset.
8. Cell invaasiomääritys
The Cell Invasion Assay Kit (ECM550, Chemicon, Kalifornia, USA) käytettiin arvioimaan solujen invasiivisuus. Sen jälkeen, kun virus transfektion, alikvootti valmistettua solususpensiota (300 ui, 1,0 x 10
6 solua /ml) lisättiin kuhunkin ylempään insertin. 48 tunnin kuluttua inkubaation insertit kastettiin värjäysliuos 20 min värjäämiseksi invasiivisia solujen kalvolle. Sitten invasiivisia soluja 5 random mikroskooppi näkemyksiä laskettiin. Esitetyt tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta ja esitetään keskiarvona ± S.D.
9. Western blotting-analyysi
Yhteensä proteiinit uutettiin NSCLC kasvainkudoksissa ja transfektoitiin viljeltyjä soluja, ja sitten pätevä käyttämällä proteiini Extraction Kit (KEYGEN, Nanjing, Kiina) ja BCA Protein Assay-reagenssia (Thermo tieteellinen, Rockford, USA) . Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja visualisoitiin immunoblottauksella vasta- aineilla, jotka ovat spesifisiä GSK3p (# 9315, laimennettu 1: 400) ja β-kateniinin (# 9582, laimennettu 1: 200) (Cell Signaling Technology, Beverly, USA). Altistumisen jälkeen kemiluminesoiva HRP-substraattia (Millipore, Billerica, USA), kohde-proteiinit havaittiin käyttäen ChemiDoc XRS järjestelmä (Bio-Rad, Philadelphia, USA), ja kuvat analysoitiin Gel-Pro Analyzer 4.0 ohjelmiston (Media Cybernetics ).
10. Immunohistokemiallinen määritys
GSK3p NSCLC kasvain kudosten ja viereisen normaaleissa kudoksissa oli immunohistokemialli- värjättiin kuten kuvattu aiemmissa tutkimuksissa [22] – [24]. Semikvantitatiivinen arviointi jaksoissa suoritettiin 2 patologia pidennetyn tavalla. Negatiivinen kontrolli immunovärjäämistä suoritettiin ilman primaarista vasta-ainetta. Sekä osa ja intensiteetti immuno- kasvainsolujen pidettiin. Jae pisteet laskettiin keskimäärin 5 satunnaisesti valitun suuritehoisia kentät arvioitiin valomikroskoopilla seuraavasti: 0, ei värjätään kohdesoluja (kasvain, keuhkoputken tai alveolaarinen soluja); 1, 20% värjättyjen solujen; 2, 20~50% värjättyjen solujen; ja 3, yli 50% soluista värjättiin. Intensiteetti pisteet on määritelty seuraavasti: 0, ei ole merkittävää värjäytymistä kohdesolujen; 1, tuskin havaittavissa olevaa värjäytymistä sytoplasmassa ja /tai tumassa kohdesolujen; 2, helposti ilmeistä ruskea värjäytyminen; ja 3, tummanruskea värjäystä. Jae ja intensiteetti tulokset kerrottiin antaa yhteensä pisteet välillä 0 9 Tulospalvelu välillä 2 ja 9 pidettiin positiivisina ilme. Immunohistokemialliset suoritettiin myös histologisen osissa parafinoidut ksenograftikasvaimissa.
Värjäys proliferatiivinen markkerin Ki-67 arvioimiseksi suoritettiin kasvua ksenograftikasvaimissa. Ki-67-vasta-ainetta (# MA1-80199, laimennettu 1: 100) saatiin Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA. Ki-67 merkintöjä indeksi (Ki-67 LI) laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti:
Ki-67 LI = määrä Ki-67-positiivisia soluja /kokonaismäärä kasvainsolujen lasketaan x 100%.
11. Tilastollinen analyysi
SPSS 17.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, Ill, USA) käytettiin kaikkien tietojen analysointia. Immunohistokemia tulokset ja niiden yhteenliittymien kanssa kliinisiä tekijöitä analysoitiin käyttäen chi-neliö testi. Spearmanin rank testillä analysoidaan korrelaatio proteiinin fenotyyppejä. Kaplan-Meier menetelmää käytettiin analysoimaan univariate selviytymisen, ja vertailuja elossapysymisaikajakaumat ryhmissä suoritettiin käyttäen log-rank-testi. Prognostisia merkitys GSK3p lausekkeen suhteessa muihin patologisiin muuttujiin arvioitiin käyttäen Coxin monimuuttuja regressioanalyysiä. Määrälliset tiedot ilmaistaan keskiarvona ± S.D. Tilastollinen merkitys eroja ryhmien määritettiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Fisherin PLSD jälkikäteen testi. Kaikki
P
arvot olivat 2-tailed, ja arvot
P
0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.
Tulokset
1. GSK3p on yliaktiivista NSCLC tuumorikudoksissa
edustaja kuvia immunohistokemiallisella värjäyksellä GSK3p NSCLC kudosten ja vastaavien normaalien kudosten on esitetty kuviossa 1A. GSK3p oli näkyvästi ilmaistu NSCLC (n = 211), pääasiassa sytoplasmassa syöpäsoluja. Vertailuja GSK3p proteiinin tasojen kasvain ja normaali keuhkojen kudoksia on esitetty taulukossa 1. Tulokset osoittivat, että GSK3p taso lisääntyi merkitsevästi NSCLC kudoksissa verrattuna normaaliin keuhkokudokset (
P
0,001). Western blotting määritykset vahvisti myös, että ekspressiotaso GSK3p kasvaimissa oli korkeampi kuin niiden normaalissa kollegansa. (
P
= 0.04, kuvio 1 B).
(A) Tyypillinen IHC värjäys kuvia ihmisen NSCLC kasvain ja normaali keuhkokudoksessa (suurennos x 200). (B) Western blotting määritykset vahvisti, että pariksi normaali /kasvaimen kudokset NSCLC syöpäpotilaiden korkeampia ekspressiotasoja GSK3p kasvaimissa todettiin verrattiin normaalia kollegansa. Kokeet toistettiin 3 kertaa, ja tulokset on esitetty keskiarvona ± SD. *
P
0,001. (C) Fosforyloitunut glykogeenisyntaasia (PG: t), substraatti GSK3p, havaittiin näissä NSCLC solulinjoissa, paitsi H292.
Koska substraatti GSK3p, proteiinin ilmentymistä fosforyloidun glykogeenisyntaasia (PGS) käytettiin osoittamaan aktiivisuuden GSK3p. Näissä 4 solulinjoissa, paitsi H292 PGS, havaittiin (kuvio 1 C), joka ehdotti suuri aktiivisuus GSK3p ihmisen keuhkosyöpä.
2. Positiivinen ilmaus GSK3p liittyy huono ennuste NSCLC
Potilaat, joilla on täydelliset kliiniset tiedot (160 tapausta, 39 naista ja 121 miestä, 61,19 ± 10,53 vuotta) oli mukana selviytymisen analyysiin. Mediaani-ikä oli 60,00 vuotta (vaihteluväli 29-83 vuotta). Kliiniset ominaispiirteet ja selviytyminen analyysitulokset esitetään yhteenvetona taulukossa 2 ja kuviossa 2. 5 vuoden pysyvyys koko ryhmässä oli 49,07%, ja mediaani seuranta-aika oli 58,00 kuukautta (vaihteluväli 0-77,67kuukautta).
(A) Kun koko ryhmä, potilailla, joilla on positiivinen GSK3p ilme oli lyhyempi selviytymistä kertaa,
P
= 0,006. Kuva 2B-D esittää selviytymistä analyysi alaryhmiin. (B) Vuonna alempi erilaistuminen alaryhmä, potilailla, joilla on positiivinen GSK3p ilme oli huomattavasti lyhyempi selviytymistä kertaa,
P
= 0,013. (C) Kun T1 + T2 alaryhmä, potilailla, joilla on positiivinen GSK3p ilme oli huomattavasti lyhyempi selviytymistä kertaa,
P
= 0,003. (D) Kun N0 + N1 alaryhmä, potilailla, joilla on positiivinen GSK3p ilme oli huomattavasti lyhyempi selviytymistä kertaa,
P
= 0.010. (E) potilaat M0 alaryhmä positiivisia GSK3p ilme oli huomattavasti lyhyempi selviytymistä kertaa,
P
= 0,008. Kaplan-Meier -käyrät tutkittujen proteiinien käytettiin vertaamaan positiivinen (
katkoviivat
) ja negatiivinen fenotyypit (
kiinteät viivat
).
univariate analyysi suoritettiin arvioida suhde kliinisiä piirteitä ja GSK3p ilmaisun. Kuten taulukosta 2, pienisoluista keuhkosyöpää erilaisia kliinisiä piirteitä, kuten sukupuoli, ikä, histologinen tyyppi ja kasvaimen solmu-etäpesäke (TNM) vaihe, osoitti samalla tasolla GSK3p. Prognostisia merkitys positiivinen GSK3p ilmaisun eri alaryhmiin arvioitiin käyttäen log rank testi. Vuonna koko ryhmä, potilailla, joilla on positiivinen GSK3p ilme oli lyhyempi elossaoloaika (
P
= 0,006, kuva 2A). Tulokset osoittivat myös, että miessukupuoli, ikä ja okasolusyöpä (SCC) on myönteisiä GSK3p ilme liittyi huonompi ennuste (
P
= 0,019,
P
= 0,020 ja
P
= 0,002, vastaavasti). Lisäksi NSCLC potilaiden huonosti eriytetty kasvaimia tai suhteellisen varhaisessa vaiheessa alaryhmiin (T1 + T2, N0 + N1 ja M0) positiivisella GSK3p ilme oli huomattavasti lyhyempi elossaoloaika (
P
= 0,013,
P
= 0,003,
P
= 0,010 ja
P
= 0,008, vastaavasti, kuviossa 2B-E).
Lisäksi, monimuuttuja Coxin analyysi osoitti, että , tässä ryhmässä, kasvaimen koon, imusolmuke invaasion ja GSK3p ilmaisun olivat riippumattomia ennustajia NSCLC ennustetta. Nämä tulokset viittaavat siihen, GSK3p tärkeä rooli NSCLC kasvainten synnyssä ja pyytää tarkempaa analyysiä.
3. GSK3p säätelee positiivisesti kasvainsoluproliferaation ja selviytymistä NSCLC
lentivirusvektorilla käytettiin siirtämään suunniteltu shRNAs kohdistaminen GSK3p näihin 4 NSCLC solulinjojen sitkeästi hiljentää sen ilme. Vaikutukset RNA-häirintää arvioitiin RT-PCR: llä (5 päivää transfektion jälkeen) ja Western blotting (7 päivää transfektion jälkeen). Nämä tulokset osoittivat, että RNA: n ja proteiinin tasot GSK3p kasvainsoluissa kaikki 4 solulinjat tutkittiin väheni merkitsevästi, kuten on esitetty kuviossa 3A-B (kaikki
P
0,001). Lisäksi ksenografteissa kudokset eristetty nude-hiirissä olivat immunohistokemiallisesti värjätään, ja tulokset todentaa jatkuva vakaa vähentäminen GSK3p tasoilla jälkeen RNA-interferenssi (kuvio 3C). Nämä tulokset osoittivat, että GSK3p oli tehokkaasti ja vakaasti tippuu alas shRNA kaikki 4 NSCLC solulinjoissa.
(A) GSK3p-erityinen shRNAs transfektoitiin NSCLC soluihin lentivirusvektorilla, ja solut kerättiin ja laskettiin 5 päivää transfektion jälkeen. Reaaliaikainen PCR osoitti, että häiriön shRNA tehokkaasti pudotti mRNA ilmaus GSK3p in NSCLC soluissa. (B) Solut kerättiin ja laskettiin 7 päivää transfektion jälkeen. Western blot osoittaa tehokkuutta proteiinin hiljentämiseltä shRNA. (C) jälkeen hoidon GSK3 shRNA (KD ryhmä), negatiivinen kontrolli shRNA (NC ryhmä) tai normaalia suolaliuosta (CON ryhmä), A549-solut (1 x 10
6 /ml) injektoitiin selkään nude-hiirissä. Neljä viikkoa myöhemmin, ksenograftikasvaimissa eristettiin ja immunohistokemiallista värjätään. Tulokset todentaa jatkuva alenemisesta GSK3p vuonna KD ryhmässä verrattuna kontrolliryhmiin. Nuolet osoittavat positiivista värjäytymistä sytoplasmassa kasvainsolujen (suurennos x 400). Kokeet toistettiin 3 kertaa, ja tulokset on ilmoitettu keskiarvona ± SD. *
P
0,001.
CCK-8 määrityksessä osoitti, että knockdovvn GSK3p selvästi tukahdutti elinkelpoisuutta kaikkien 4 solulinjojen (kaikki
P
0,001, kuvio 4A).
in vivo
jossa käytettiin ksenografti hiiriä, kasvaimet KD ryhmä kasvoi merkittävästi hitaammin ja oli pienempi kasvainten koko 4 viikon aikana (
P
= 0,001, kuva 4B ). Lopussa seurantajakso, painot vierassiirrännäiset KD ryhmässä olivat paljon alhaisemmat kuin kontrolliryhmien (
P
= 0,001, kuvio 4C). Lisäksi Ki-67 LI -ksenografteissa dramaattisesti vähentynyt KD ryhmässä verrattuna NC ja CON ryhmät (38.98% vs. 75,14% vs. 73,84%,
P
0,001, Kuva 4D), joka osoitti, että downregulation GSK3p estivät solujen lisääntymistä
in vivo
. Nämä tulokset viittaavat siihen, että GSK3p positiivisesti säätelee kasvun ja kasvaimen kehittymisen NSCLC-solujen, ja seuraavan kerran pyrittiin selvittämään, miten nämä vaikutukset välittämien.
(A) CCK-8 testi osoitti, että esto GSK3p tukahdutetaan leviämisen n NSCLC solulinjojen
in vitro
. *
P
0,001. (B)
In vivo
: Kuten on kuvattu kuviossa 3C ksenograftimalleissa kehitettiin nude-hiirissä. Kukin ryhmä koostui 6 eläintä. Havaittu kasvaimia, joka 3 päivä 4 viikon ajan. Ksenograftikasvaimissa hiirten KD ryhmä kasvoi merkittävästi hitaammin (määritettynä kasvaimen tilavuuden) koko tarkkailujakson aikana. *
P
0,001. (C) vertailu eristetyn ksenograftikasvaimissa. Kuvassa näkyy, että kasvaimia eristyksissä KD ryhmästä olivat pienempiä ja kevyempiä kuin kasvaimia kontrolliryhmässä. Tiedot ilmaistaan keskiarvoina ± SD, n = 6. *
P
0,001. (D) edustaja kuvaa Ki-67 IHC on -tuumoriksenografti tarkastella mikroskoopilla. Laskea Ki-67 LI, solujen ruskea-värjätään tumat positiivinen, mikä osoittaa tehokkaan lisääntymisen (suurennos x 400). Tiedot ilmaistaan keskiarvoina ± SD, *
P
0,001. (E) Solusyklianalyysiä 72 tuntia transfektion jälkeen. Tulokset viittaavat siihen, että inhibitio GSK3p johti G1 /S pidätyksen A549 ja SK-MES-1-soluissa ja muutti osuudet solupopulaation eri vaiheissa solusyklin. Tiedot esitetään keskiarvoina ± S.D. 3 itsenäisestä kokeesta, jotka suoritettiin kolmena kappaleena. *
P
0,001. (F) virtaussytometrialla, apoptoottisten analyysin tulokset osoittivat, että inhibitio GSK3p suuresti kasvanut apoptoottisten määrä NSCLC-solujen (paitsi A549-soluja)
in vitro
. *
P
0,001, ▴
P
0,05. (G) tulokset TUNEL määrityksen ksenograftikasvaimissa ehdotti, että inhibitio GSK3p lisääntyi apoptoottisen määrä A549-solut
in vivo
(suurennos x 400). Tiedot ilmaistaan keskiarvoina ± SD, *
P
0,001. (H) TranswellTM jotka osoittavat, että esto GSK3p
in vitro
merkittävästi vähentynyt invasiivisuus NSCLC soluja. Tiedot ilmaistaan keskiarvoina ± S.D. *
P
0,001.
Kun olet suorittanut solusyklin analyysi virtaussytometrialla, huomasimme, että esto GSK3p lisäsi solujen G0 /G1 vaiheessa ja vähensi solujen S-vaiheessa A549 (
P
= 0,003, ja
P
0,001) ja SK-MES-1-solut (
P
= 0,002,
P
= 0,022) (kuvio 4E). Vuonna H1299 ja H292-soluissa, GSK3p knockdown johti suuntaus lisääntyminen G0 /G1 väestö, mutta erot eivät saavuttaneet tilastollista merkittävyyttä (in H1299 soluissa,
P
= 0,056, ja H292-soluissa,
P
= 0,216).
in vitro
, solu apoptoosimäärityksessä ehdotti, että apoptoottinen hinnat KD ryhmässä oli suuresti korkeammat kuin kontrolliryhmiin kanssa poikkeuksena A549 solulinja (H292, H1299 ja SK-MES-1, kaikki
P
0,001, A549,
P
= 0,461, kuva 4F). Sillä ksenograftissa hiiret, TUNEL määritys paljasti, että apoptoottinen korko KD ryhmässä (3,06% ± 1,24%) oli huomattavasti korkeampi kuin muissa ryhmissä (NC ryhmä, 0,11% ± 0,04%, ja CON ryhmä, 0,46% ± 0,23%) (
P
0,001). Kuten on esitetty kuviossa 4G, apoptoottiset solut värjättiin punaiseksi ja kutistunut. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että inhibitio GSK3p indusoiman NSCLC-solujen apoptoosin.
4. Esto GSK3p vähentää invasiivisuus NSCLC-solujen
laskea siirrettyjä soluja
in vitro
, Transvvell- määritys käyttäen NSCLC-solujen toistettiin 3 kertaa, ja tulokset on esitetty kuviossa 4H. Kaikkien 4 solulinjoja, KD ryhmä osoitti merkittävästi vähemmän invasiivisia soluja (kaikki
P
0,001), mikä ehdotti, että inhibitio GSK3p voimakkaasti vaimen- invasiivisuus NSCLC-soluja. Vuonna ksenograftissa Hiirillä ei etäpesäkkeitä todettiin heti brutto tarkastus ja tunnustelu. Lisäksi valomikroskoopilla analyysi ei paljastanut mitään todisteita etäispesäkkeitä kiinnitettiin ja värjättiin elimiä.
5.β-kateniinin ilmentymistä jälkeen inhibitio GSK3p
Kuten kuviossa 5 on esitetty, ilmaisu taso β-kateniinin lisääntyi merkitsevästi KD ryhmässä okasolusyöpä SK-MES (
P
0,001). Lisäksi knockdovvn GSK3p suuresti tukahdutti ilmentymistä β-kateniinin H1299 soluissa (
P
0,001), mutta ei H292 (
P
= 0,108) tai A549-solut (
P
= 0,185).
(A) Tyypillinen bändejä western blot testi osoitti, että proteiini tasot β-kateniinin oli säänneltävä solutyyppispesifisten tavalla sen jälkeen, kun esto GSK3p. (B) kvantitatiivinen analyysi β-kateniinin ilmentymistä. Koe toistettiin 3 kertaa, ja tulokset on ilmoitettu keskiarvoina ± SD. *
P
0,001.
Keskustelu
GSK3p alunperin havaittu olevan merkittävä säätelyentsyymi glykogeenin aineenvaihduntaan [4], [7]. Sen jälkeen tämän proteiinin on havaittu olevan tärkeä säätelijä solujen eloonjäämistä ja apoptoosin, joka yhdistää tämän monimuotoisen kinaasin syöpään [25], [26]. Viime aikoina useat tutkimukset ovat osoittaneet, että GSK3p voi positiivisesti säädellä lisääntymistä ja kasvainsolujen apoptoosin [10] – [18], vaikka tarkkaa roolia GSK3p keuhkosyövässä on tuntematon. Siksi nykyinen tutkimus selvitti ennustetekijöiden merkitys GSK3p ja sen tehtävä NSCLC.
Ensinnäkin yliekspressio GSK3p NSCLC kudoksissa havaittiin verrattaessa NSCLC kudoksiin viereisten normaaleista kudoksista, ja tämä poikkeava kertyminen GSK3p: in NSCLC-solujen liittyi lyhyempi elinaika ja tunnistettu uusi riskitekijä huonoon ennusteeseen. Vaikka vähän huomiota on kiinnitetty ilmentymistä GSK3p keuhkosyövän, viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen p-GSK3p voi toimia markkerina huonompaan ennusteeseen keuhkosyövän [27]. Koska p-GSK3p on inaktiivinen muoto GSK3p, yliekspressio p-GSK3p ei välttämättä vastaa menetys GSK3p, erityisesti silloin, kun koko proteiini taso on myös lisääntyvät voimakkaasti. Tutkimuksessamme korkea ilmauksia Pgs, joka on osoitus GSK3p aktiivisuutta, havaittiin useimmissa NSCLC solulinjojen, mikä osoittaa, että GSK3p on erittäin aktiivinen NSCLC soluissa. Siksi meidän tutkimuksessa todettiin, että yli-ilmentyminen koko GSK3p oli yli-aktivoitu ja siirrettävä huonon ennusteen pienisoluista keuhkosyöpää. Samanlaisia tuloksia on raportoitu virtsarakon syövän [18]. Siksi GSK3p yliekspressio voi toimia biomarkkeri parantamaan varhaisdiagnoosia potilaan valinnan ja määrittämisen ennustetta.
addtion meidän IHC tulokset osoittivat, että GSK3p on lokalisoitu pääasiassa sytoplasmassa potilaan ja ksenografti- tuumorikudoksia. Toisaalta useat tutkimukset osoittivat, että GSK3p oli kertynyt tumassa haiman [11], munuaisten [28] ja virtsarakon syöpien [18]. Näissä tuumorikudoksia, ydin- GSK3p saattaa olla merkitystä NF-KB välittämää syöpäsolun selviytymisen; kuitenkin, kun pudotus GSK3p, NF-KB-ekspressiotasot eri ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat Tutkimuksemme ovat epäjohdonmukaisia, mikä osoittaa, että GSK3p saattaa välittää syövän solujen eloonjäämistä riippumaton NFKB ilmaisun (tuloksia ei ole esitetty). Siksi solunosasijaintia GSK3p on monimutkainen ja tiukasti liittyvät sen molekyylitason mekanismi. Edelleen tutkimus solunosasijaintia roolia GSK3p tarvitsee tehdä.
Seuraava tärkeä kysymys on, miten selittää syvällinen vaikutus GSK3p ennusteeseen NSCLC potilaalle. Tämä tutkimus pyrki tutkimaan perus molekyylimekanismeihin GSK3p
in vitro
ja
in vivo
. On hyvin tunnettua, että GSK3p on keskeinen rooli apoptoosin säätelyyn [26]. Esimerkiksi GSK3p tyrmäys tai litium hoitoon voimistaa apoptoosin hepatosyyteissä [29], ja korotettuun apoptoosin seuraavien eston GSK3p on raportoitu eturauhassyövässä [30], haimasyöpä [11], leukemia [13], gliooma [ ,,,0],17] ja virtsarakon syöpä [18].