Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syövän kuolema länsimaissa, jolla on pienin 1 vuoden selviytymisprosentti diagnosoiduista syövistä. Luotettava biomarkkereita haimasyövän diagnoosi puuttuu ja tarvitaan kipeästi, jotta parantavaan leikkaukseen. Kuten microRNA (miRNA) äskettäin tullut ehdokas biomarkkereita tähän sairauteen, selvitimme esillä pilottitutkimuksessa erot syljen microRNA profiilien välillä potilailla, joilla haiman kasvaimia, jotka eivät ole oikeutettuja kirurgia, syövän esiasteita, tulehdussairaus tai syöpä-ilmaiseksi potilaille mahdollisena varhaisen diagnostinen työkalu.

Methods

Koko sylkinäytteellä potilailta haimasyöpä (n = 7), haimatulehdus (n = 4), IPMN (n = 2), tai terveiden verrokkien (n = 4) saatiin aikana tähystys. Sen jälkeen koko RNA: n eristys, ilmaus 94 ehdokkaan miRNA seulottiin q (RT) PCR käyttäen Biomark Fluidgm. Ihmisperäisiä haimasyövän soluja ksenosiirrettyjä kateenkorvattomissa hiirissä kokeellisena mallina haimasyövän.

Tulokset

tunnistettu HSA-miR-21, HSA-miR-23a, HSA-asennuspalveli- 23b ja miR-29c olevan merkittävästi yliaktiivista syljessä haimasyövän potilaat verrattuna kontrolliin, joka osoittaa herkkyyden 71,4%, 85,7%, 85,7% ja 57%, vastaavasti ja erinomainen spesifisyys (100%). Mielenkiintoista on, että HSA-miR-23a: n ja HSA-miR23b yliekspressoituvat syljen potilaiden haimasyöpä esiasteleesioita. Olemme havainneet, että HSA-miR-210 ja anna-7c on yli-ilmentyy syljen potilaiden haimatulehdus verrattuna kontrolliryhmään, jossa herkkyys on 100% ja 75%, ja spesifisyys on 100% ja 80%, vastaavasti. Viime HSA-miR-216 säädeltiin voimakkaammaksi syöpäpotilailla verrattuna potilaisiin diagnosoitu haimatulehdus, jossa herkkyys on 50% ja spesifisyys 100%. Kokeellisissa malleissa PDAC, syljen microRNA tunnistus edeltää systeemisen havaitseminen syöpäsolujen markkereita.

Johtopäätökset

romaani havainnot osoittavat, että syljen miRNA ovat syrjiviä haimasyövän potilaat, jotka eivät ole oikeutettuja leikkausta. Lisäksi osoitamme kokeellisissa malleissa että syljen miRNA tunnistus edeltää systeemisen havaitseminen syöpäsolujen markkereita. Tutkimuksessa varret käyttöön syljen miRNA biomarkkerina varhaiseen diagnosointiin potilailla, joilla on leikattavissa haimasyöpä.

Citation: HUMEAU M, Vignolle-Vidoni A, Sicard F, Martins F, Bournet B, Buscail L, et ai. (2015) Syljen MicroRNA in Haimasyöpä Potilaat. PLoS ONE 10 (6): e0130996. doi: 10,1371 /journal.pone.0130996

Editor: Kandiah Jeyaseelan, National University of Singapore, SINGAPORE

vastaanotettu: 10 joulukuu 2014; Hyväksytty: 27 toukokuu 2015; Julkaistu: 29 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 HUMEAU et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: Nämä kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat jättäneet patentti ”käyttöä syljen microRNA diagnosoimiseksi haimasyövän ”. Luonnos on kirjoitettu yhteistyössä meidän IP osastolla (INSERM Transfert), ja joka on talletettu # EP15305020.8 mutta ei ole vielä saatavilla verkossa. Kuitenkin, tämä ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja. Kirjoittajat eivät muut asiaan liittyvät ilmoitukset työhön, konsultointi, patentit, tuotteiden kehittämiseen tai muunnettuja tuotteita.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (haimasyöpä, PDAC) on neljäs johtava syy syövän kuolema länsimaissa, jolla on pienin viiden vuoden suhteellinen [1] ja 1 vuoden eloonjääminen [2] keskuudessa diagnosoiduista syövistä. haimasyöpä odotetaan siirtyä toiseksi suurin syy syövän kuolemaan maailmanlaajuisesti vuoteen 2020 mennessä ilman parannuksia hoidon [3]. Tällä hetkellä ei ole keinoja luotettavan diagnoosin varhaisessa vaiheessa haimasyöpä. Näin ollen suurin osa potilaista (85%), näyttää edennyt sairaus, joka johtaa alhaisen resektio määrä (15% potilaista), joka johtaa synkkä yleistä mediaanielossaolosta 4-6 kuukautta. Siten löytää biomarkkereita varhaisen haimasyövän diagnoosi voi suosia alussa potilaiden hallintaan ja ennustetta.

MikroRNA (miRNA) ovat äskettäin tullut uusi luokka vankka biomarkkereita syövän diagnosointiin, mukaan lukien PDAC [4]. Nämä voimakas sääntelyviranomaisten geenin ilmentymisen voidaan perusteellisesti määrällisesti erilaisissa kudoksissa ja nesteissä, johtuen niiden luontainen erittäin vakaa verrattuna proteiinien ja RNA: iden. On tärkeää, miRNA voidaan mitata hyvin pieniä määriä materiaalia, mukaan lukien mikro-biopsiat, ja erittäin hajonnut näytteissä. Viimeaikaiset raportit laajasti osoitettu, että miRNA profiilit voivat menestyksekkäästi erottamaan normaalit alkaen syöpä- haimakudoksesta, ja se voi myös ennustaa syövän ennustetta tai hoitovaste [4]. Vakautta miRNA on jälleen korostetusti kuin miRNA profiloinnin plasmassa osoittivat äskettäin erottamaan PDAC potilaita terveisiin kontrolleihin [4]. Tällaiset havainnot tietä käyttöä verenkierrossa miRNA kuin vähän invasiivisia PDAC biomarkkerit.

Useat muiden kehon nesteiden, kuten virtsan, siemennesteen ja sylki on äskettäin pidetään varastoja syövän diagnosointiin [5,6]. Sylki on ylivoimainen etu, sillä näyte kokoelma on yksinkertainen, ei-invasiivisia, aiheuttaa vähän ahdistusta puolelta potilaiden ja voidaan toistaa. Sylki on osoitettu sisältävän proteiineja /peptidejä, nukleiinihappoja, elektrolyyttejä, ja hormonit, jotka ovat peräisin sekä paikallisesti että systeemisesti lähteistä ja viimeaikaiset tutkimukset ovat herättäneet kiinnostusta käyttää syljen lähteenä biomarkkereita. Näin ollen, käyttämällä syljen havaitsemiseksi suun sairauksien on laajasti osoitettu, [7], ja syljen äskettäin tullut rikas lähde miRNA, kuten on-miR-31, oraaliseen syövän diagnosointiin [8-11]. Toisaalta, sylki käyttö systeeminen sairaus on pitkälti epäselvä. Viime vuosina metabolinen [12], transcriptomic [13] ja mikrobiston [14] syljen profiilit osoitettiin olevan erottelukykyä havaitsemiseksi PDAC, joilla on korkea spesifisyys ja herkkyys.

Tietääksemme käyttö syljen miRNA diagnosointiin ei kokoisen haimasyövän ei ole raportoitu tähän mennessä. Näin ollen tavoitteena oli tutkia tieteellisen näytön ja antaa perustelut käytön sylki varten leikkaushoitoon PDAC havaitsemiseen, joka edustaa valtaosa potilaista diagnosoidaan tämä syöpä. Tässä pilottitutkimuksessa, huomasimme, että neljä syljen miRNA (HSA-miR-21, HSA-miR-23a, HSA-miR-23b ja HSA-miR-29c) onnistuneesti erotettu PDAC potilaita syöpää luovuttajilla, kun taas HSA-miR -210 ja anna-7c osoittavat haimatulehdus ja HSA-miR-216 erottelee haimatulehdus syöpään. Lisäksi osoitamme tässä kokeellisissa malleissa PDAC että syljen miRNA havaitseminen edeltää systeemisen syöpäsolujen markkereita. Yhdessä me alustavia tietoja, jotka osoittavat merkittäviä eroja miRNA profiilien välillä syljen potilailta, joilla PDAC ja sylki potilailta, jotka ovat kasvaimettomina. Löydetyn syljen biomarkkerit omata luontaista syrjivä potentiaalia noninvasive diagnostiikassa PDAC, potilailla, jotka eivät ole oikeutettuja leikkausta.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat

Tämä protokolla hyväksymän eettisen lautakunnan (

Comité de Protection des personnes Sud-Ouest et Outre Mer nro 1

,

numero 10-01-21

). Välttämiseksi veren välityksellä, potilaita pyydettiin olemaan harjata hampaansa 45 minuuttia ennen näytteenottoa. Sylki kerättiin steriilejä vihjeitä ja mikropipetit aikana tähystystutki- nukutuksessa propofoliin. Sylki oli heti laitetaan ennalta jäähdytetty 1,5 ml mikrosentrifugiputkiin sisältävien ja yhtä suuri tilavuus syljen suojaavat reagenssia (Qiagen) ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Tässä pilottitutkimuksessa, olemme mukana vanhemmilla potilailla 18 vuotta, joka oli antanut kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Muut pääsyvaatimukset eivät ole vasta yleisanestesiaa tai endoskooppinen ultraääni. Hieno neula pyrkimys materiaalia käytettiin histologista, Sytologisten ja molekyylien (KRAS aktivoiva mutaatio analyysi [15]) haimatulehdus diagnosoidaan tai haimasyöpä. Kaksikymmentäyksi potilasta osallistui tähän tutkimukseen; 7 diagnosoitiin paikallisesti edennyt, leikattavissa haimasyöpä, 4 diagnosoitiin haimatulehdus (joko akuutti tai krooninen) ja 4 oli etuyhteydettömille ruoansulatuskanavan sairaudet (kontrolliryhmä) (taulukko 1). Potilaat, joilla on diagnosoitu intraduktaalisissa papillaarinen mucinous neoplasia (IPMN) (n = 2) on myös mukana. Potilaita ei ole käsitelty ennen sylkeä kokoelma.

Kokeellinen protokolla

Kaikki eläimet kokeet tehtiin mukaan kansallisen eettiset ohjeet kokeellisen tutkimuksen ja protokolla hyväksyi alueellisen eettisen komitean Anexplo UMS 006 eläinkokeiden ja tehtiin mukaisesti opas hoito ja käyttö Laboratory Animals (US National Institutes of Health). Ihmisen haimasyövän johdettu Mia PACA-2 solut, jotka ilmentävät erittyy Lucia lusiferaasi [16,17] kasvatetaan RPMI 10% vasikan sikiön seerumia, L-glutamiinia, joka on antibiootti, joka on antimykoottista cocktail (Life Technologies), ja Plasmocin ( InvivoGen) kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO

2. Kuusi kahden viikon ikäiset naaras nu /nu-hiiret nukutettiin injektoimalla intraperitoneaalisesti pentobarbitaalia (80 mg /kg), laimennettu 0,9% NaCl, johon on lisätty suun anestesiaa käyttäen happi /isofluoraanilla (2,5 seosta) ja Mia PACA-2 Lucia soluja istutettiin hännän haima kuten aikaisemmin on kuvattu [16,17]. Syljen eritys ei kannustanut pilokarpiinin. Sylki saatiin suuontelon mikropipetillä ja laitettiin välittömästi ennalta jäähdytetty 1,5 ml: n mikrosentrifugiputkiin, joka sisältää ja yhtä suuri tilavuus syljen suojata reagenssia (Qiagen). Kokoelma saatiin päätökseen 20 minuutissa ja näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa kunnes analysoitiin. Ei-invasiivisia seuranta kasvaimen kasvua, veri otettiin näytteitä silmäkuopan keräys ja sentrifugoitiin 1000 x

g

10 min mikrosentrifugiputkiin käsiteltiin EDTA: lla. Lucia tuotanto mitattiin 5 ui plasmaa käyttämällä koelenteratsiini (50 uM) substraattina. Sillä miRNA määrän tutkimuksia, kasvaimia jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Lopussa kokeiden, hiiret tapettiin injektoimalla tappava annos pentobarbitaalia.

RNA

Ennen syljen näytteitä käytettiin, ne sulatettiin jään päällä ja sentrifugoitiin 15 minuuttia 2600 x

g

4 ° C: ssa. Solujen supernatantti otettiin talteen pelletistä ja käytettiin välittömästi seuraavassa vaiheessa. Kokonais-RNA eristettiin 250 ui sylkeä supernatantti ja kasvaimista, käyttämällä Trizol-LS-reagenssia (Life Technologies) ja miRNAeasy (Qiagen), vastaavasti. DNaasi I hoito (DNaasi I, Qiagen) käytettiin poistamaan kontaminoivaa DNA aikana RNA. Konsentraatio kokonais-RNA mitattiin käyttäen Nanodrop N-100.

miRNA määrän

Yhteensä syljen, solu- tai kasvaimen RNA: ta (20 ng), tehtiin käänteistranskriptio, ja pre-monistettiin käyttämällä Universal cDNA-synteesin kit (Exiqon), jota seurasi Erityinen kohde Amplification (STA) käyttäen TaqMan Esivahvistustaso Master Mix (Life Technologies) ja yhdistettiin 94 microRNA LNA PCR sarjaa (Exiqon, lueteltu S1 taulukko). Sen jälkeen 15 pre-amplifaction syklit, STA reaktiot 1:10 nukleaasia vapaaseen veteen. qPCR määritys Mix koostui TaqMan Gene Expression Master Mix (Life technologies), DNA Binding Dye Sample Loading Reagent (Fluidigm), EvaGreen (Biorad), eteen- ja taaksepäin nalliseoksesta (Exiqon) ja Pitoisuus Loading Reagent, ja valmistettu kohti valmistajan suositusten . Näytteet ja näytteen seos ladattiin Fluidigm chip (Fluidgm) ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-reaktio suoritettiin 95 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 30 sykliä 95 ° C: ssa 10 sekunnin ajan ja 60 ° C: ssa 1 minuutti on Fluidigm platform (Fluidgm). Kvantifiointia sykli (Cq) arvo määritellään syklin numero fluoresenssiemission, joka ylittää kiinteän kynnysarvon. CQ 15 30 pidettiin korkeana ilmaisun ja Cq 35 pidetään pienenä ilme. CQ-arvo yli 40 pidettiin huomaamaton miRNA. Tiedot normalisointi suoritettiin käyttäen RQ manager 1.2.1 ja Data Assist v3.0 Applied Biosystems.

Tilastollinen

qPCR-pohjainen geeniekspressiota arvot eri ryhmien verrattiin käyttäen epäparametrisia Wilcoxonin-sum test. Ehdokas biomarkkereiden miRNA valittiin sitten perustuu P 0.05.

Tulokset

tunnistaminen haimasyövän-spesifisessä sylki miRNA

Tästä esitutkimus, 94 miRNA valittiin kirjallisuudesta seuraavat: aiemmin raportoitu biomarkkereita syöpä, aiemmin raportoitu biomarkkereita haimasyövän, verestä syöpäpotilaiden tai havaita syljestä syöpäpotilaiden (S1 taulukko). Expression ehdokas miRNA seulottiin q (RT) PCR: llä käyttäen Biomark Fluidgm potilailla, joilla on haimasyöpä (n = 7), haimatulehdus (n = 4), intraduktaalisissa papillaarinen mucinous neoplasia (IPMN, n = 2) tai ilman syövän (n = 4) (taulukko 1).

Näistä 94 miRNA, 23 miRNA olivat havaittavissa kaikissa testatuissa näytteissä (S2 taulukko). Olemme havainneet, että 4 miRNA (HSA-miR-21, HSA-miR23a, HSA-miR-23b: n ja HSA-miR-29c) on merkittävästi ilmaistaan ​​syljen potilaiden haimasyöpä (n = 7), kun taas havaita syljestä verrokeilla (n = 4; Wilcoxonin testi, 0,001

p

0,03) (kuvio 1 ja taulukko 2). Ilmaus ehdokas miRNA oli ehdottoman erityisiä haimasyövän (100%), jolla on erinomainen herkkyys (aina 57%: sta 86%, taulukko 2). Ehdokas miRNA havaittiin myös sisällä syljen potilaan diagnosoitu muita syöpiä (n = 2, taulukko 2), kun taas HSA-miR23a ja HSA-miR-23b havaittiin syljen joilla potilailla on diagnosoitu IPMN, hyvin tunnettu esiasteleesio of PDAC. Huomata, HSA-miR-21, HSA-miR23a, HSA-miR-23b: n ja HSA-miR-29c voidaan havaita syljestä potilailla, joilla on haimatulehdus (kuvio 1).

Tulokset esitetään Viiksekkäät box (min-max) ja keskiarvo (+) on merkitty.

p

arvo (nonparametric Wilcoxonin-sum test) on merkitty.

Haimatulehdus on yleinen haimatulehdus. Huolimatta modernit kuvantamismenetelmät, vaikeudet jatkuvat erottamaan PDAC hyvänlaatuisesta sairaudet kuten krooninen haimatulehdus erityisesti sen pseudotumoral muodossa [15]. Tällainen näkökohta on kriittinen, jotta vältetään tarpeeton resektio hyvänlaatuisia vaurioita (kuten fokaalimuutosten krooninen haimatulehdus tai autoimmuunipankreatiitti) tai viivästyttää hoitoon PDAC on potilasryhmässä. Olemme aiemmin osoittaneet, että RNA allekirjoitukset [18] tai

KRAS

mutaatio analyysi [15,19] voi olla apua diagnostinen. Tässä työssä, tutkimme, syljen miRNA voi edustaa ei-invasiivisia seulontamenetelmä haimatulehduksen havaitsemiseen. Huomasimme, että syljen HSA-miR-216 voi auttaa syrjiä haimatulehdus alkaen PDAC, erinomainen spesifisyys (100%), mutta huono herkkyys (50%) (taulukko 3). Toisaalta, HSA-miR-210 ja anna-7c on yli-ilmentyy syljen joilla potilailla on diagnosoitu haimatulehdus, mutta ei voitu havaita syljestä verrokeilla (taulukko 4). Lisäksi HSA-miR-210 esittelee merkittäviä spesifisyys ja herkkyys haimatulehduksen, joko krooninen tai akuutti (100%, taulukko 3). Toisaalta, HSA-miR-210 havaittiin syljen potilailla, joilla on PDAC. Yhdessä Pilottitutkimuksemme viittaa vahvasti siihen, että syljen miRNA voisi olla hyötyä diagnosoinnissa haimatulehduksen ja muiden kokoisen PDAC.

Syljen miRNA edeltää proteiini-pohjainen, systeeminen havaitseminen PDAC kokeellisissa malleissa

vieressä tutkineet kineettinen syljen miRNA havaitsemiseksi kokeellisessa mallissa haimasyöpä. Mia PACA-2 ihmisperäisiä haimasyövän soluja istutettiin haimassa kateenkorvattomissa hiirissä (n = 6). Olemme havainneet, että nämä solut ja tuloksena ksenografteissa ilmentävät korkeita HSA-miR-21, HSA-miR-23a, HSA-miR-23b ja HSA-miR-29c (S3 ja S4 taulukot). Nämä solut muokattu ilmentämään korkean tason erittyvän lusiferaasin proteiinin, systeeminen-pohjainen, ei-invasiivisia kasvain seuranta [16,17]. Kokeellinen haimasyövän kasvaimia havaittiin 25 päivän kuluessa kasvainsolun siirteen avulla systeemistä annostusta erittyvän lusiferaasi ja ennen kuin niistä tuli kouraantuntuva (kuvio 2).

Tulokset ovat keskiarvo ± S.D. 6 biologisen rinnakkaisnäytettä tehty kokeellinen kolmena rinnakkaisena. miRNA tasot ilmaistaan ​​Cq, Lucia tasot ilmaistaan ​​suhteellisen kevyt yksikköä (r.l.u.). Harmaalle alueelle vastaa kasvaimen havaitsemiseen käyttäen erittyy Lucia, kuten systeeminen, proteiini-pohjainen tuumorimarkkeri.

Mielenkiintoista, HSA-miR-21 on helppo havaita suurina määrinä syljen on kasvain, niin pian kuin 14 päivää kasvaimen induktion (keskiarvo Cq = 24,41 ± 1,29 kuviossa 2 ja S5 taulukko), kun taas havaita syljestä kasvain-eläimissä (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi, syljen HSA-miR-21 ilmentyminen pysyivät kohonneina aikana kokeen (kuvio 2). Toisaalta, syljen HSA-miR-23a, HSA-miR-23b ja HSA-miR-29c havaittiin vähäisinä määrinä syljen PDAC kantavien hiirten (kuvio 2 ja S5 taulukko). Niinpä vahvistaa HSA-miR-21 kuin syljen biomarkkereiden tässä kokeellisessa mallissa PDAC; Lisäksi tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, että syljen miRNA ovat herkempiä kuin systeemisiä proteiinimarkkereita diagnosoimiseksi haiman kasvaimia.

Keskustelu

Merkittävä kysymys haimasyöpä tutkimus on tarve biomarkkereita varhaisen diagnoosi, paitsi varhainen havaitseminen taudin kohortin potilaista, mutta myös nopeuttaa päätöksentekoa vaikeasti diagnosoida haiman massoja. Tämä on erittäin tärkeää ottaen huomioon, että potilaiden selviytyminen ja ennusteen riippuvat vaiheessa kasvain aikaan diagnoosin. Teoriassa varhainen diagnoosi voi mahdollistaa kasvaimen resektion ja liittyy yleensä paras ennuste. Kuitenkin vaikeus varhaisen diagnoosin ja korkea esiintyvyys etäpesäkkeiden liittyy haimasyöpä edistää sen synkkä ennuste [1]. Niinpä viime vuosina tapahtunut intensiivisen tutkimuksen etsimisestä herkempiä, erityisiä ja kustannustehokas biomarkkerit. Tähän mennessä monet molekyyli-pohjainen, monen omiikka strategioita hyödynnetään tämän tavoitteen saavuttamiseksi. Tissue miRNA äskettäin osoitettava uusien biomarkkereiden diagnoosia, ennustetta ja ennustuksen hoitovasteen haimasyövän potilaille [4]. Yllättäen nämä pienet ei-koodaavaa RNA: ita voidaan myös havaita monissa, jos ei kaikissa kehon nesteiden [20]. Siten miRNA profilointi veressä äskettäin osoitettiin erottamaan syövän potilaiden terveiden verrokkien [4], ja kiertävä miRNA analyysi on yhä ehdotettu uutena biomarkkeri haimasyövän diagnosointiin.

Viime vuosina, miRNA ihmisen syljessä on osoitettu olevan mahdollisia biomarkkereita diagnoosia varten. Koska kokoelma on ei-invasiivisia, ärsyttämätön ja helposti käyttämällä sylki varhaisen taudin havaitseminen on ihanteellinen. Historiallisesti, HSA-miR-31 oli yksi ensimmäisistä syrjivän miRNA syljen biomarkkereita määritetty suun syöpä [21]. Äskettäin, yli-ilmentyminen on-miR-17 ja on-miR-20a on raportoitu olevan merkittävästi yhteydessä huonoon tulokseen syljen rauhasmainen kystinen karsinooma [22]. Lisäksi 13 miRNA havaittiin merkitsevästi vapautettiin syljessä suun okasolusyöpä potilailla verrattuna terveisiin kontrolleihin [23]. Viime, syljen miRNA profiilit eroavat syljestä potilaista, joilla on pahanlaatuinen syljestä potilailta, joilla on hyvänlaatuinen korvasylkirauhasen kasvain, ja siten edustavat uutta ei-invasiivisia diagnostinen työkalu diagnosoimiseksi kasvaimia sylkirauhaset [9]. Reaktion aikana tämän käsikirjoituksen, Xie

et al

kuvattu, että syljen miR-3679-5p ja miR-940, kaksi hiljattain tunnettu miRNA, joita ei tutkittu esillä olevassa työssä, voi olla erityinen sairastavien potilaiden kokoisen PDAC kohtuullisella spesifisyys ja herkkyys [24]. Toisaalta, sylki käyttö miRNA havaitsemiseen ei ole arvioitu tähän mennessä leikattavissa PDAC potilailla, jotka muodostavat suuren enemmistön (85%) potilaista on diagnosoitu tämä syöpä.

Tässä proof-of-concept tutkimus, keräsimme sylki potilailta, joilla leikkaushoitoon haimasyöpä (n = 7), haimatulehdus (n = 4), IPMN (n = 2), ja syöpä-vapaa potilailla (n = 4), joille tehtiin tähystys. Yli 90 miRNA testattu, 4 tunnistettiin olevan merkittävästi vapautettiin syljessä haimasyövän potilaat kontrolliin verrattuna (HSA-miR-21, HSA-miR-23a, HSA-miR-23b ja HSA-miR-29c). Lisäksi HSA-miR-21, HSA-miR-23a: n ja HSA-miR-23b olivat tiukasti erityisiä syöpäpotilaille, jolla on erinomainen herkkyys (71,4% ja 85,7%, vastaavasti). Toisaalta, Anna-7c ja HSA-miR-210 olivat poissa syljen verrokeilla, mutta helposti havaittavissa syljessä potilaiden haimatulehdukseen, hieno erityinen ja valikoiva (HSA-miR-210).

kuitenkin tässä vaiheessa tämän hankkeen, syljen testaus ei erotella haimatulehdus ja PDAC, kuten HSA-miR-216 havaitaan vain haimatulehdus eikä syöpää, mutta huono herkkyys. Yhdessä osoitamme ensimmäistä kertaa, että syljen miRNA ovat osoitus haiman sairaus, ja sitä voidaan käyttää diagnosoimaan leikkaushoitoon PDAC (HSA-miR-21, HSA-miR-23a, HSA-miR-23b) tai haimatulehdus (HSA-miR -210). HSA-miR-21, HSA-miR-23a ja HSA-miR-23b todettiin merkittävästi vapautettiin syljen kokoisen PDAC potilailla verrattuna terveisiin aikana tietojenkeruuvaiheessa, mutta ei tutkittu tarkemmin, koska ne eivät osoittaneet at vähintään 4-kertainen muutos ilmaisun ryhmien välillä [24].

tässä työssä olemme ryhtyneet tutkimaan, onko syljen miRNA voi auttaa diagnoosia varten väestöstä on riski sairastua haimasyövän, ja näin voitaisiin käytettävä merkki estämään kasvaimen esiintymistä. Intraduktaalisissa papillaarisen mucinous kasvaimet (IPMNs) ovat ei-invasiivisia esiasteleesioita haimasyövän. Äskettäin miRNA vuonna kysta nestettä on osoitettu tunnistaa korkealaatuista IPMN joka vaatii resektio ja jättää ei-mucinous kystat mikä konservatiivista hoitoa suurella herkkyydellä ja spesifisyys [25]. Olemme saaneet alustavat tulokset viittaa siihen, että HSA-miR-23a ja HSA-miR-23b ovat myös läsnä syljessä potilaiden diagnosoitu IPMN, ja voitaisiin käyttää päätöksenteon IPMN hallintaan.

Kuitenkin meidän tutkimus on taipumus osoittaa, että HSA-miR-21, HSA-miR-23a: n ja HSA-miR-23b ovat läsnä syljessä potilailla, joilla on haimatulehdus, kun taas HSA-miR-210 havaitaan syljen murto-potilailla, joilla on PDAC . Lisäksi HSA-miR-23a: n ja HSA-miR-23b ovat läsnä syljessä potilailla, joilla on IPMN. Tämä olisi helppo selittää haimatulehdus ja IPMN ovat kahden hyvin tunnettu PDAC esiasteleesioita, mikä osoittaa, että PDAC positiivisia HSA-miR-210, tai HSA-miR-23a ja HSA-miR-23b, ehkä peräisin haimatulehdus tai IPMN, vastaavasti. Päinvastoin, joilla potilailla on diagnosoitu haimatulehdus ja kohonnut syljen HSA-miR-21, HSA-miR-23a: n ja HSA-miR-23b, tai potilailla, joilla on diagnosoitu IPMN ja kohonnut syljen HSA-miR-23a: n ja HSA-miR-23b voi olla at-riski PDAC ja saattavat edellyttää huolellista kliinistä seurantaa. Olemme tietoisia siitä, että tässä tutkimuksessa kärsii pienen otoksen koon ja vaatii ulkoisen validointi väestöstä. Näin ollen olemme hiljattain oli ensimmäinen kliinisesti selityksin kohortti haimasyövän potilaiden näytteitä eri laitosten (jäljempänä BACAP aloite, https://www.chu-toulouse.fr/-projet-bacap-). Tällaiset kohortti on suunnattoman informatiivisia lisävalidointia ja tulevaisuuden kliinisissä sovelluksissa meidän menetelmän, koska se on ainutlaatuinen lähde PDAC näytteistä, mutta myös koska se on kerrata ”luonnollinen historia” tämän taudin. Tällaiset kohortti voi auttaa luomaan syljen miRNA yhdessä lisää kliinisiä muuttujia, kuten uusien biomarkkereiden haimasyövän potilaiden hallintaan. Lisäksi meillä on vielä suoritettava vertailevia tutkimuksia eri syöpäpotilaille perustella, että biomarkkerit tunnistimme tässä ovat spesifisiä haimasyövän.

Tässä artikkelissa olemme tunnistaneet HSA-miR-21, HSA-miR -23a ja HSA-miR-23b, jotka eri tavoin ilmaistuna välillä sylkinäytteellä potilaita, joilla on pahanlaatuinen kasvain ja syöpä-vapaa potilailla, erinomainen spesifisyys ja herkkyys. Kun taas HSA-miR-21 liittyy myös monia fysiologisia tiloja, mukaan lukien, mutta ei rajoitu sydän- ja keuhkosairaudet, mukaan lukien sydämen ja keuhkojen fibroosi sekä sydäninfarkti, mutta myös immunologisia ja kehitysprosesseja [26], HSA-miR-21 on yksi mainittu miRNA onkologiaan [27], kuten haimasyövän [4]. Olemme aiemmin osoittaneet, että HSA-miR-21 on aikaisin ilmaistiin haiman syövän synnyn [28], ja että kohdistaminen HSA-miR-21 herättää kasvainregressio kokeellisissa malleissa haimasyövän [17]. Silmiinpistävän, HSA-miR-21 näyttää olevan jatkuvasti ylöspäin säädellään haimasyövän, ja on osoitus huonosta selviytymisen, hoitovaste ja /tai etäpesäkkeitä [4]. Lisäksi äskettäisessä meta-analyysi viime aikoina osoittaneet verenkierrossa HSA-miR-21 ennustetekijöiden sijaan diagnostista merkitystä eri syöpiä [29]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme spekuloida, että syljen HSA-miR-21 voi myös olla kiinnostavia haimasyövän diagnosointiin, ja täydentää edellisen luonnehdinta syljen HSA-miR-21 havaitsemiseksi ruokatorven syöpään [10]. Tietääksemme tarjoamme tässä ensimmäinen osoitus siitä, että HSA-miR-23a: n ja HSA-miR-23b voidaan havaita syljestä joilla potilailla on diagnosoitu syöpä; kuitenkin, spesifisyys kummankin ehdokkaan miRNA varten PDAC on vielä osoitettava. HSA-miR-23a on äskettäin liittynyt KRAS [30] ja C-MYC [31] välitteistä signalointia reitin, ja kuvattu ehdokkaana ajo miRNA haimasyövän [30]. HSA-miR-23a on myös yhdistetty alentunut NK-solun sytotoksisuutta [32], EMT [33] ja kestävyys hoitoa [34-36]. Mielenkiintoista on, että HSA-miR-23b on äskettäin osoitettu säädellä autophagy liittyy radioresistance haimasyövän soluja [37].

tutkimme seuraavaksi kinetiikan havaitsemisen syljen miRNA kokeellisessa mallissa haimasyövän. Kun taas HSA-miR-23a: n ja HSA-miR-23b olivat erittäin ilmaistaan ​​ihmisen haimasyövän soluja johdettu ksenografteja, he olivat tuskin havaittavissa syljen tässä mallissa kasvaimen kantavien hiirten. Toisaalta, HSA-miR-21 oli helposti havaittu kasvaimia, ja sylki hiirten ksenosiirrettyjä ihmisen haimasyövän peräisin olevia soluja, kun taas havaita kontrollieläimissä. Tämä jälkimmäinen havainto viittaavat vahvasti siihen, että syljen HSA-miR-21 on peräisin kokeellisiin kasvaimiin, luultavasti

kautta

kasvain- eksosomeiksi, kuten äskettäin on kuvattu [38]. Lisäksi osoitamme tässä, että syljen HSA-miR-21 tunnistus edeltää syövän havaitseminen-solun erityinen tuumorimarkkeri tässä kokeellisessa mallissa PDAC. Tämä viittaa vahvasti siihen, että syljen miRNA, kuten HSA-miR-21, ovat herkempiä kuin systeemisiä perustuvia proteiinimarkkereita diagnosoimiseksi PDAC.

Johtopäätös

Yhteenvetona osoitamme tässä, että ensimmäisen kerran, että syljen miRNA voisi olla arvokas biomarkkereita erottamiseksi potilaille, joilla on leikattavissa PDAC terveistä valvontaa, ja että syljen miR-210 voi auttaa havaitsemaan haimatulehdus. Vaikka monikeskustutkimuksissa kanssa suurempi otoskoko tarvitaan, tämä työ varret käyttöön syljen miRNA kuin uusien biomarkkereiden diagnosoimiseksi leikkaushoitoon PDAC.

tukeminen Information

S1 Taulukko. miRNA määrällisesti tässä tutkimuksessa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0130996.s001

(XLSX)

S2 Taulukko. miRNA Cq-arvot koko syljestä potilailta, joilla syöpä (n = 4), begning haimatulehdus (n = 4), haiman adenokarsinooma (n = 7) tai IPMN (n = 2).

doi: 10,1371 /journal.pone. 0130996.s002

(XLSX)

S3 Taulukko. Ehdokas miRNA Cq arvot Mia PACA-2 Lucia soluissa (n = 3).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0130996.s003

(XLSX)

S4 Taulukko. Ehdokas miRNA Cq arvot n = 6 kokeellinen haimatuumorien (ET).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0130996.s004

(XLSX)

S5 Taulukko. Eritettyä Luciferase ja syljen ehdokas miRNA Cq arvot n = 6 hiiret kokeellisen haiman kasvaimia.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0130996.s005

(XLSX) B

Kiitokset

kirjoittajat haluavat kiittää Drs Geneviève Tavernier ja Jean-José Maoret heidän hyödyllisiä neuvoja.