Krooninen sairaus

tiivistelmä

Taksaania kemoterapian on tavanomaista hoitoa hoidon kastraatio kestävä eturauhassyövän (CRPC). On olemassa vakuuttavaa näyttöä siitä, että taksaani hoito vaikuttaa androgeenireseptorin (AR), mutta tarkkaa mekanismia täytyy edelleen selvittämättä. Tutkimuksemme tunnistettu c-jun, mikä on ratkaiseva keskeinen pelaaja joka on vuorovaikutuksessa AR siis määrittää tuloksen taksaanin hoito annetaan. Doketakseli (Doc) ja paklitakselin (Pac) aineet osoittivat erilaisia ​​vaikutuksia LNCaP ja LNb4 osoituksena muutoksen proteiini ja mRNA taan C-jun, AR ja PSA. Dosetakseli aiheuttama fosforylaatiossa c-jun tapahtui ennen JNK-fosforylaation, joka viittaa siihen, että c-jun fosforylaatio on riippumaton JNK reittejä eturauhassyöpäsoluissa. Ksenografti tutkimus osoitti, että hiirissä, joita käsiteltiin Pac ja bikalutamidin osoitti huonompi tulos tukee hypoteesia, että ylössäätely c-jun saattaa toimia voimakas antiapoptoottisten tekijä. Havaitsimme meidän in vitro -tutkimuksissa käänteinen säätely PSA- ja AR-mRNA-tasot Doc käsitelty LNb4 soluja. Tämä havaittiin myös kallikreiini 2 (KLK 2), joka noudattaa samaa kaavaa. Koska vaste taksaani hoito mitataan PSA lasku meidän on otettava huomioon, että tämä ei ehkä vastaa todellisuutta aktiivisuutta AR CRPC potilailla.

Citation: Tinzl M, Chen B, Chen SY, Semenas J Abrahamsson PA, Dizeyi N (2013) vuorovaikutus c-jun ja androgeenireseptorin, ratkaisee Taksaania Therapy in kastraatio Kestää eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (11): e79573. doi: 10,1371 /journal.pone.0079573

Editor: Elad Katz, AMS Biotechnology, Iso-Britannia

vastaanotettu: 12 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 25 syyskuu 2013; Julkaistu: 08 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Tinzl et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke rahoittaa Sandbergs yksityistä rahoitusta, Percy Falk Foundation ja Malmö syöpä rahoitusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

hoitovaihtoehtoja potilaalla on kastraatio resistenttejä eturauhassyöpä (CRPC) ovat edelleen vähäisiä. Vaikka uusia lupaavia lääkkeitä kuten CYP17A1 estäjä arbiraterone ja MDV3100 ovat tulleet markkinoille, taksaani kemoterapian pidetään edelleen maailmanlaajuisesti tärkein kulmakivi kohtelun androgeenideprivaatio hoito (ADT) on epäonnistunut [1-4]. Lisäksi klassinen taksaanit, Doketakseli ja paklitakselia, Kabatsitakseli käytetään kemoterapeuttisen aineen hoidossa CRPC potilaita, jälkimmäinen lähinnä potilailla, joilla on Doc resistenttejä [5].

taksaanit pidätyksen solut G2-M vaihetta hyperstabilization on mikrotubulusten kehotetaan solujen solukuolemaan [6]. Tämän lisäksi hyvin kuvattu vaikutus kasvainsoluissa on vakuuttavaa näyttöä siitä, että taksaani hoito häiritsee myös androgeenireseptorin (AR) eturauhassyöpäsoluissa [7-11]. Ryhmämme on tunnistettu c-jun tärkeänä keskeinen toimija tässä vuorovaikutus AR ja taksaanien joka vaikuttaa lopputulokseen kohtelun kastraatio resistenteiksi syöpäsolujen.

Transkriptiotekijän c-jun on prototyypin onkogeenin ja kuuluu AP-1 perhe, joka koostuu jun, fos ja ATF-2-alaryhmää [12,13]. AP-1-proteiinien homo- tai hetero- ennen sitoutumalla DNA kohdepaikkaan. AP-1-proteiinit ovat monikäyttöisiä ja osallistuvat säännellä stressivaste signaaleja, solujen kasvuun ja apoptoosin [12]. On kuitenkin olemassa tietoja, jotka viittaavat vahvasti siihen, että c-jun on kasvun edistäjänä ja esikasvaintekijän [14,15]. Shemshedini ja työtoverit osoittivat, että samanlainen kuin mitä on havaittu muiden AR koaktivaattoreiden, c-jun voi välittää AR N-to-C vuorovaikutuksen lisäämiseksi DNA sitova [16,17]. Lisäksi fosforyloitu c-jun on usein yli-ilmentyy ihmisen syövissä [18,19] ja on yhdistetty invasiivisia ominaisuuksia eturauhas- ja rintasyövän [18,20,21]. Kuitenkin rooli c-jun aktivointi ja mahdollinen vuorovaikutus AR solussa kohtalo altistumisen jälkeen Doc on osa monimutkaista verkostoa ja vielä selvittämättä. Tämä tutkimus suoritettiin tutkimaan seurausta vuorovaikutuksesta c-jun ja AR taksaania hoidossa kastraation resistenttien syöpäsolujen. Optimoida tehoa kemoterapiaan taksaanien meidän täytyy tunnistaa tietyn molekyylin tai polku, joka voi antaa vastauksen tai vastarintaa. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet tutkimaan, miten taksaaneja yksin tai yhdessä bikalutamidin päälle AR ja sen kofaktori c-jun

in vitro

ja

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

Ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa LNCaP-ja PC-3 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassass, VA ). LNb4 solut tuotettiin laboratoriossamme päässä LNCaP-solut altistettiin bikalutamidin (5 uM seerumin alennetaan 5%). Soluja viljeltiin RPMI: ssä (LNCaP) ja Hams F12 (PC-3), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Life Technologies, Paisley, UK). Soluja Docetaxel (Taxotere®, Sanofi Aventis) ja paklitakselin (Paclitaxel®, Actavis, Hafnarfjordeur, Islanti) pitoisuuden todettiin kussakin kuvassa. Dihydrotestosteroni (DHT) hankittiin Steraloids Inc. (Newport, RI) ja bikalutamidi AstraZenecan (London, UK). Kaikki Western blot reagenssit hankittiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), paitsi JNK estäjä XIV SR 3306 (Calbiochem, Darmstadt, Saksa).

Transfektio ja Sirna (siRNA) B

Transient transfektiot c-jun, c-jun mutantti (c-jun Ala63 /73) ja AR plasmidit (kaikki ystävällisesti Shao-Yong Chen, Harvard Medical School) PC-3 syöpäsolujen tehtiin käyttämällä FuGENE 6 (Roche Diagnostics , Mannheim, Saksa) valmistajan suosittelemia. C-jun mutantti (c-jun Ala63 /73), johon tässä viitataan kuin juna kokeissa käytettyjen kuljettaa mutaation seriinikohtaan 63/73 (Ala63 /73), joka on tärkein tavoite fosforylaatiossa stressin ärsykkeille. SiRNA kokeissa, PC-3 ja LNCaP-solut transfektoitiin 48 tuntia 100 nM siRNA c-jun tai ei-suunnattu siRNA (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Transfektio suoritettiin käyttämällä X-tremeGENE siRNA transfektioreagenssia (Roche Diagnostics) valmistajan ohjeen mukaisesti.

leviämisen

Solujen elinkelpoisuus määritettiin trypaanisinieksluusiolla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). PC-3, LNCaP ja LNb4 solut ympättiin 24-kuoppaisille levyille tiheydellä 25000 solua per kuoppa. Kun oli kulunut 24 ja 48 tuntia hoidon Doc tai DMSO (Sigma-Aldrich) annettuina pitoisuuksina kelluva ja kiinnitetään solut kerättiin trypsinoimalla. Yhtä suureen osaan solususpensioiden ja 0,4% trypaanisinisellä sekoitettiin, ja elinvoimaisten, trypaanisininen-ilman solut laskettiin käyttämällä hemasytometriä. Prosenttiosuus Elävien solujen ilmaistaan ​​100 koko solujen (keskiarvo ± SD). transfektoituja PC-3-solut edelleen arvioitiin MTS-määritys. 48 tunnin jälkeen transfektion solut altistettiin Doc tai jätettiin käsittelemättä edelleen 48 tunnin ajan. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 4 tuntia, elävien solujen lukumäärän mitattiin käyttämällä 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2 – (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium (MTS) määrityksellä (CellTiter 96 Aqueous One-ratkaisu Soluproliferaatiomääritys, Promega, Madison, WI, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä käyttäen kuopan levy, lukija (malli 680, Bio-Rad, Richmond, CA, USA), jossa kuoppiin, jotka sisältävät ainoastaan ​​väliaineessa, joka toimii tyhjä valvontaa.

Virtaussytometria solusyklin ja apoptoosin analyysien

Cell cycle jakautuminen analysoitiin virtaussytometrialla. Lyhyesti, transfektoituja soluja käsiteltiin Doc 48 tuntia ja kiinnitettiin ja värjättiin propidiumjodidilla 40 min. Elinkelpoiset solut porteilla, ja DNA-pitoisuus on vähintään 10 000 leimattujen solujen määrä määritettiin fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelija. Apoptoosi määritettiin anneksiini V konjugoitu fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) ja 7-AAD värjäytymistä (BD Pharmingen BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Soluja käsiteltiin Doc 48 ja 72 tuntia ja värjätään solut altistettiin virtaussytometria analyysi FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) väline. Esitetyt tiedot on saatu kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta kaksoiskappaleissa ja analysoitiin FCS Express -ohjelmiston (Denovo Software, Los Angeles, CA, USA).

Western Blot-analyysi ja immunosaostus

Western blot -analyysiä varten yhteensä proteiini uutettiin käyttämällä radioimmunosaostuskokeella (RIPA) puskurissa (50 mmol /L Tris-HCI, 150 mM NaCI, 20 mM EDTA, 1 % NP40, 0,1% SDS, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF ja 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia), johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoriseosta Complete Mini (Roche, Mannheim, Saksa). Kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-proteiinin määritystä (Pierce, Rockford, IL). Proteiininäytteet (20-30 ug) ladattiin 4-12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille Bio-Rad-määrityksellä (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja sille suoritettiin elektroforeettinen analyysi ja blottauksella. Membraanit tutkittiin yön yli 4 ° C: ssa seuraavat primaaristen vasta-aineiden: anti-AR (441 ja N-20), anti-c-jun, anti-p-cjun (ser 63/73), ja anti-β-aktiini, kaikki ostettu Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, CA), anti-PSA (Dako, Glostrup, Tanska), p-JNK Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Toissijainen vasta-aineita (IRDye 680, IRdye 800) saatiin Li-Cor Biotechnology (Nebraska, USA) ja proteiinia, jotka havaitaan Odyssey® Infrared Imaging System.

immunosaostus solut käsiteltiin kuten korjattujen ja hajotuspuskuria. Solulysaatit homogenisoitiin, proteiinipitoisuus mitataan ja 500 ug esiselkeytettiin proteiinia inkuboitiin anti-AR-vasta-ainetta 4 ° C: ssa yön yli koko ajan sekoittaen. Yhtä suuret määrät hiiren IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina. Proteiini-G-helmiä (Pierce, Rockford, IL, USA), lisättiin sitten kuhunkin näytteeseen ja inkuboitiin 4 ° C: ssa 2 tunnin ajan. Sitten näytteitä sentrifugoitiin 2000 x g: 2 min ja Laemmlin näytepuskuria (30 ui) ilman β-merkaptoetanolia ja seosta inkuboidaan 65 ° C: ssa 15 minuuttia eluoimiseksi sitoutuneiden proteiinien. Eluaattifraktiot sentrifugoitiin 2000 x g, 1 ui β-merkaptoetanolia lisättiin ja näytteet alistettiin Western-blottauksella, kuten yllä on kuvattu. Proteiinin ilmentyminen arvioitiin suhteessa p-aktiinin ilmentymistä densitometrisellä analyysillä.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-analyysi

Kokonais-RNA eristettiin LNCaP ja LNb4 soluihin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, West Sussex, UK) noudattaen valmistajan protokollaa ja käsiteltiin RNaasi-vapaata DNaasia (DNaasi I, Amersham Pharmacia Biotech, Sollentuna, Ruotsi) poistaa mahdolliset genomista DNA: ta epäpuhtauksia. Kukin cDNA syntetisoitiin käänteis- transkription 1 ug kokonais-RNA: sta käyttäen StrataScript Ensimmäisen Strand Synthesis System ja satunnaisia ​​heksameerialukkeita (Stratagene, AH diagnostiikka, Tukholma, Ruotsi). Reaaliaikainen PCR suoritettiin SYBR Green QPCR master mix (iScript BioRadilta) on MX 3000P tunnistusjärjestelmä (Stratagene) sytytyksen vaihe 95 ° C: ssa 10 minuuttia, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 56 ° C: ssa 1 minuutti ja 72 ° C 1 minuutin ajan.

Seuraavat alukkeet kunkin geenin käytettiin: PSA (F5′-AGGCCTTCCCTGTACACCAA-3 ’ja R5′-GTCTTGGCCTGGTCATTTCC-3′), AR (F 5’-GTACCTGTCAGCCCCTGAAC-3 ’ja R5’ GGAGAGCTGCT TTCG- CTTAG-3 ’), GAPDH (5’ -CGA CCA CTT TGT CAA GCT CA-3 ’ja 5′-AGG GGT CTA CAT GGCAACTG-3′), c-jun (F 5’-GCATGAGGAACCGCA- TCGCTGCCTCCAAGT-3 ja R5 ’GCGACCAAGTCCTTCCCACTCGTGCA- CACT-3 ’), NKX3.1 (F 5’GTACCTGTCGGCCCCTGAACG-3’ja R5′-GCT- GTTA TACACGGAGACCAGG-3′), c-Myc (F 5′-GGCGGGCACTTTGCACTGGA-3’and R5′- TCGCGGGAGGCTGCTGGTTT-3′), KLK2 (F 5′-AGATGAAGACTCC-AGCCAT-3’ja R 5′-GATACCTTGAAGCACACCA -3′), β-aktiini (F-5′-CGTGG- GGCGCCCCAG -3′ ja R 5′-TTGGCCTTGGGGTTCAGGGGG – 3’).

mRNA määrä määritettiin käyttämällä vertailevan C

T -menetelmä. Näytteet analysoitiin kolmena kappaleena ja data verrataan mRNA: n ei-hoidettuun kontrolliryhmään, joka oli asetettu viitearvo.

Eläimet ja tuumorin istuttamisen

neljästä kuuteen viikkoa vanhoja NMRI male Nude hiiriä Taconic’ilta Europe (Lille Skensved, Tanska) käytettiin kokeessa. Ksenograftimallia toteutettiin protokollan mukaisesti nimenomaisesti hyväksynyt eettinen komitea Lundin yliopisto (hyväksymisnumero M 239-10). Hiiret pidettiin mukaisesti antamien suuntaviivojen Malmö-Lund eettinen komitea. LNCaP-soluja (2×10

6 solua) injektoitiin ihonalaisesti molempiin kylkiin tuloksena on kaksi kasvaimia hiirtä kohti. Sen jälkeen kun kasvaimet ovat kehittäneet kirurgisen kastraation tehtiin. Eläimiä jaettiin putkiin 6 ryhmään: hiiriä hoidettiin ajoneuvo, Doc, Pac tai bikalutamidi yksittäisenä aineena ja Doc tai Pac yhdistettynä bikalutamidin. Lääkkeitä annettiin intraperitoneaalisesti (i.p.) (20 mg /kg) 100 ul: n tilavuudessa kerran viikossa 5 viikon ajan, paitsi bikalutamidin, joka annettiin kahdesti viikossa. Tuolloin vaiheessa nimetty viikolla 0, hoito aloitettiin ja hiiret tapettiin viikon kuluttua viimeisestä hoidosta. Kasvaimet kerättiin, kiinnitettiin formaliiniin ja parafiiniin upotettuja immunohistokemiallista analyysia varten.

immunohistokemia

Leikellyt ksenograftikasvaimissa fiksoitiin 4% paraformaldehydillä ja sen jälkeen upotettiin parafiiniin. Neljä um: n paksuisia leikkeitä poistettiin parafiini, vedettömät ja mikroaaltouuni käsiteltiin 10 minuutin ajan pH on korkea kohde haku liuosta (Dako, Glostrup, Tanska), ennen kuin käsitellään automaattisen Techmate 500 immunohistokemia värjäysautomaatilla (Dako) käyttäen vasta-aineita AR, c-jun, p -cjun, ja Ki-67 (Dako). DAB (3,3′-diaminobentsidiini) käytettiin kromogeenisen substraatin ja objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä. Näytteet katsella Olympus AX 70 mikroskoopilla suurennuksella x 10. mielivaltainen semikvantitatiivinen pisteytys levitettiin arvioida värjäystä signaalit ja sijoitettiin kolmeen luokkaan; negatiivisesti värjätty (0), heikko, mutta havaittavissa olevaa värjäytymistä joidenkin tai kaikkien solujen (1), kohtalainen värjäytyminen (2) tai vahvaa värjäytymistä (3). Ainakin kaksi osaa kohden kasvaimen määritettiin ja tulokset olivat edustavia vähintään 70% alueen kudoksen analysoidaan.

Sub-solun fraktioinnin

Cellular fraktiointi suoritettiin protokollan mukana NE-PER ydin- ja sytoplasman uuttoreagenssit (Pierce, Rockford, IL). LNCaP-solut altistettiin Doc tai Pac 6, 24 ja 48 tuntia tai jätettiin käsittelemättä. Fraktiot keitettiin SDS-näytepuskurissa, altistettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille ja tutkittiin kuten on osoitettu ensisijainen vasta-aineita AR, β-aktiini tai lamiini A, kaikki Santa Cruz, minkä jälkeen sekundaarisia vasta-aineita (IRDye 680, IRdye 800), jotka on saatu Li-Cor Biotechnology (Nebraska, USA). Proteiinit havaittiin Odyssey® Infrared Imaging System.

Tilastollinen analyysi

tulokset saatiin ainakin kolmen kokeen suorituksen ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Tilastollinen merkittävyys määritettiin parittomia Studentin t-testiä. Arvot p 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

c-jun yliekspressio indusoi resistenssi Doc hoitoon

toiminta c-jun transkriptiotekijänä liittyvät joukkotuhoaseiden leviämisen on todettu eturauhassyöpä ennen [22 ]. Tutkia vaikutusta c-jun on Doc käsiteltyjen syöpäsolujen, suoritettiin kokeita LNCaP, LNb4 ja PC-3-soluja. Havaitsimme, että LNCaP-solut, joita käsiteltiin Doc olivat resistenttejä hoito ilmoitettuina ajankohtina verrattuna PC-3-soluja (30% vs. 9%, p = 0,003) (kuvio 1A). Vaikka emme havaitse tilastollisesti merkitsevää eroa LNCaP ja LNb4 voisimme nähdä suuntaus, että pitkäaikainen hoito bikalutamidin paremman suojan (kuvio 1A). Lisäksi apoptoosin analyysi suoritettiin käyttäen anneksiini V /7AAD vahvistaa vähemmän apoptoosin LNb4 altistuneiden solujen Doc verrattuna vanhempien LNCaP

(A) Solujen elinkelpoisuus tutkittiin trypaanisinieksluusiolla LNCaP (LN), LNb4 ja PC -3-soluja. (B) Apoptoosin määritys virtaussytometrialla. Käsittelyn jälkeen soluja Doc, missä määrin apoptoosin arvioitiin anneksiini V /7AAD määrityksessä. (C) MTS-määritys in PC-3-solut transfektoitu kuten kuviossa ja käsiteltiin 48 tunnin ajan 5 nM Doc. (D) kuvaajia virtaussytometrialla soluissa mainittuja (C) osoittavat pyöräily solupopulaation värjätään propidiumjodidilla. Soluja käsiteltiin Doc 48 tuntia tai jätettiin käsittelemättä ja lajitellaan eri vaiheissa mitoosin virtaussytometrialla. (E) Western blotting-analyysi osoittaa proteiinin ilmentyminen transfektoiduissa soluissa mainittu (C). (F) analyysi proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen määritetään immunosaostuksella läsnä ollessa tai poissa ollessa Doc tai Pac LN ja LNb4 soluja. Solut immunosaostettiin anti-AR (441) vasta-aine, ja membraanit tutkittiin käyttämällä koettimena anti-c-jun-vasta-ainetta. Valvontaa, 20 ug Solulysaatin tarkoitus syöttää ja yhtäläinen latautui confimed AR vasta-aineella.

(kuvio 1 B). Sen tutkimiseksi, onko c-jun on mukana vastaus Doc hoito, PC-3-solut transfektoitiin c-jun, c-jun mutantti (juna) ja kotransfektoitiin AR (AR /cjun, AR /Juna, vastaavasti) plasmidit ja MTS-määritys suoritetaan. PC-3-solut transfektoitu juna havaittiin tilastollisesti merkittävä lisäys (p = 0,01, juna vs. kontrolli) soluproliferaatioon (kuva 1 C), kun taas transfektion AR vähentynyt solujen elinkelpoisuuden verrattavissa Doc käsitelty kontrolli soluja. Vaikka ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa Doc käsiteltyjen ohjaus soluja ja c-Jun transfektoituja PC-3-solut oli selvä taipumus lisätä elinkelpoisuus jälkimmäisessä. Mielenkiintoista on, että co-Transfektiomenetelmätapa AR PC-3-solut yli-ilmentävät c-jun tai juna ei kumota tätä vaikutusta proliferaatioon (kuvio 1C), mikä viittaa siihen, rooli c-jun, kuten voimakas antiapoptoottisten tekijä. Solusyklianalyysiä suoritettiin sitten ja näkyvät solujen pysähtymisen G2-M-faasin Doc käsitelty PC-3-solut (kuvio 1 D). Havaitsimme, että PC-3-solut transfektoidaan AR tai juna oli samanlainen trendi merkittävä lasku prosentteina solujen G2-M vaihe (18,6% ja 19,9%, tässä järjestyksessä), kun taas S-vaiheessa lisättiin (43 , 4% ja 43,5%, tässä järjestyksessä), mikä viittaa siihen, että fosforylaatiota c-jun on keskeinen rooli solujen vastauksena Doc (kuvio 1 D).

vieressä tutkittiin proteiinin ekspressio transfektoiduissa PC-3-soluja. Western blotting-analyysi osoitti selvän kasvun AR proteiinin soluissa kotransfektoitiin AR /cjun verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu AR yksin tai AR /juna (kuvio 1E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että vuorovaikutus AR ja c-jun on riippuvainen käytettävissä fosforylaatiossa sivuston 63/73. Edelleen vaikutuksen arvioimiseksi taksaanin aineiden vaikutus endogeenisen c-jun ja AR immunosaostus suoritettiin LNCaP ja LNb4. Löysimme välinen vuorovaikutus AR ja c-jun molemmissa solutyypeissä, joka parantaa Doc ja Pac käsittely (kuvio 1 F). Nämä havainnot vahvistavat, että on fyysinen vuorovaikutus c-jun ja AR joka säätelee vaikutusta taksaanin hoidon PC soluissa.

Effects of c-jun siRNA on Doc vastaus

Sen tutkimiseksi, c-jun downregulation voi muuttaa tietokoneen soluvasteen Doc transfektoimme PC-3 ja LNCaP siRNA tai nontargeted siRNA, joka toimi kontrollina (kuvio 2A). Solut altistettiin Doc 24 tai 48 tuntia ja niille suoritettiin MTS-määritystä. c-jun merkittävästi vaimentua joskaan ei täysin vähentynyt molemmissa solulinjoissa (kuvio 2A). LNCaP vaiennetaan siRNA osoittivat selvän laskun elinkelpoisuutta 24 tunnin jälkeen Doc altistumista verrattuna vanhempien LNCaP (p = 0,002). PC-3-solujen emme havaita merkittävää muutosta solujen elinkelpoisuuden samanaikaisesti pisteen. 48 tunnin kuluttua vaikutus c-jun hiljentäminen laski ja solut otetaan talteen, kuten on esitetty kuviossa 2B.

(A) Western blotting-analyysi osoittaa transfektiotehokkuuden siRNA c-jun sekä PC-3 ja LNCaP-soluissa. (B) Solujen lisääntymistä LNCaP (yläpaneeli) ja PC-3 (alempi paneeli) transfektoitujen solujen c-jun siRNA tai nontargeted (kontrolli) vektori. Soluja käsiteltiin Doc 24 ja 48 tuntia. LNCaP satama c-jun siRNA osoitti merkittävää vähenemistä lisääntymistä (p = 0,002), kun taas PC-3-soluja ei vaikuttanut.

Taksaania aiheuttamaa p-cjun ilme on riippumaton JNK-reitin PC soluissa

On raportoitu, että Doc kemoterapia indusoi sen vaikutus läpi valikoivasti aktivoimalla JNK syöpäsoluissa [23] . Aktivoinnin jälkeen JNK fosforyloi ja aktivoi useita transkriptiotekijöitä kuten c-kesäkuu Tämän kysymyksen osoittamiseksi analysoimme siitä JNK signalointireitille on rooli Doc aiheuttama eturauhasen syöpäsolun kuoleman. PC-3 ja LNCaP-soluja käsiteltiin 500 nM JNK-inhibiittori 2 tai 8 tuntia, kun taas Doc ja Pac käsiteltyjen solujen suoritetaan ajankohtina 2, 4, 8 ja 24 tuntia. Kuten kuviossa 3A esitetään c-jun fosforylaatio indusoitui 2 tunnin altistuksen jälkeen Doc PC-3-soluja, kun taas JNK fosforylaatio esiintyi 24 tunnin kuluttua altistuksesta PC-3-solut vain (kuvio 3A). LNCaP-solut altistettiin Doc ei selviä muutoksia JNK fosforylaatiossa havaittiin tahansa pisteen lääkehoidon (kuvio 3B). Tämä viittaa siihen, että JNK aktivaatio voi olla sivuvaikutus Doc hoidon ja c-jun fosforylaatio on ensisijainen kohde Doc. Erityisesti AR ilmentävät LNCaP, suora vuorovaikutus AR jotka aiheuttavat nopean induktion c-jun fosforylaatio ei voida sulkea pois. Lisäksi samanlaisia ​​tuloksia saatiin edellä mainitussa solut altistetaan Pac (kuva ei ole esitetty). On syytä mainita, että pohjapinta taso p-cjun ei-käsitellyissä soluissa on ilmaistu molemmissa solulinjoissa.

Western blotting-analyysi (A) PC-3 ja (B) LNCaP-solut altistettiin Doc ( 5 nM) jopa 24 tuntia tai jätettiin käsittelemättä (0). PC-3 ja LNCap-soluja siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille tiheydellä 50000 solua per kuoppa ja käsiteltiin Doc ja Pac tai yhdessä 500 nM JNK-inhibiittori (SB), kuten on ilmoitettu.

Taksaania aineet muuttaa proteiinin tasot AR ja PSA

Lisäkokeita yksinomaan suoritettiin LNCaP ja LNb4 soluja vain. Perustuen edellä Tuloksena tarkemmin, miten taksaania hoito vaikuttaa ilmentymistä AR geenien kuten PSA proteiinien tasolla. Havaitsimme samanaikainen kasvu AR ja PSA-proteiinin tasot Doc käsiteltiin LNCaP-solujen (p = 0,01, Doc 24 kontrolliryhmään verrattuna) (kuvio 4A). Kuitenkin Pac käsitelty LNCaP asteittaista laskua AR proteiinin nähtiin samanaikaisesti PSA jälkeen 48 tuntia (kuvio 4A). Mielenkiintoista, kasvu AR proteiinin tason LNb4 soluissa näkyi selvimmin Doc hoito, kun taas PSA-proteiinin taso oli selvästi vähentynyt 48 tunnin kuluttua (p = 0,02, Doc 24 vs Doc 48). Altistuminen LNb4 solujen Pac johti merkittävästi vähentää AR ja PSA-proteiinin ekspressio (kuvio 4B). Expression of p-cjun erosivat LNCaP ja LNb4 (kuvio 4C, D). LNCaP-solut Doc hoito lisäsi p-cjun ilme vähitellen (p = 0,04, Doc 6 vs Doc 48), kun taas Pac käsitellyissä soluissa lisäystä 24 tunnin nähtiin, jota seurasi merkittävä lasku 48 tunnin kohdalla (kuvio 4C) . Kuitenkin LNb4 soluissa Pac käsittely johti ajasta riippuva induktion p-cjun, kun taas Doc kohtelu ole tehnyt niin (kuvio 4D). Ole merkittyjä muutoksia c-jun tasot havaittiin molemmissa solulinjoissa ja kaikissa olosuhteissa tutkittiin.

Western blotting -analyysi ilmentymisen AR ja PSA: (A) LNCaP ja (B) LNb4 soluja. Solut altistettiin 5 nM Doc, 5 nM Pac tai 10 nM DHT jopa 48 tuntia tai jätettiin käsittelemättä. Sama lysaatit käytettiin ekspression analysoimiseksi p-cjun ja c-jun kohdassa (C) LNCaP ja (D) LNb4 soluja. Proteiinin ekspressiotasoja arvioitiin densitometrisellä analyysi (alempi paneeli).

vaikutus taksaanin kohtelu c-jun ja AR-mRNA ilmaisun

tutkimiseksi RNA muutokset johtuvat taksaania hoitoon, QRT-PCR suoritettiin LNCaP ja LNb4 soluja. Soluja käsiteltiin kuten kuviossa 5. Vaikka havaitsimme aluksi induktio AR- ja PSA mRNA Doc käsitelty LNCaP, tämä ei tapahdu Pac hoidossa. Mielenkiintoista on, että LNb4 soluista osoitti jatkuvan kasvun AR-mRNA: n ilmentymisen aikariippuvainen tavalla, kun käsitellään Doc, kun taas PSA-mRNA: ta korreloi negatiivisesti AR-mRNA: n ilmentyminen (kuvio 5A). Oli tilastollisesti merkitsevä ero AR ja PSA-mRNA: n tasolla 24 ja 48 tunnin altistuksen Doc (p = 0,05 ja p = 0,003, vastaavasti). Kuitenkin Pac käsitelty LNb4 solujen havaitsimme aluksi induktio AR ja PSA-mRNA, joka laski merkittävästi tasolle 48 tunnin kuluttua. Sen sijaan, c-jun-mRNA ilmaisun kasvoi merkittävästi Pac käsiteltyjen LNb4 soluja (p = 0,03), jota ei näy Doc käsitellyissä soluissa (kuvio 5B). Kuten odotettua KLK2 mRNA ilmaisu oli saman suuntainen kuin PSA-mRNA kaikissa soluissa käsitelty. Lisäksi analyysit c-myc, ja NKX3.1 suoritettiin kuten on esitetty kuviossa 5B. Tulokset osoittavat merkittävää suuntausta c-Myc mRNA ilmentymisen riippumatta taksaanin käyttää ja aika hoidon. Olemme kuitenkin havaittu lisääntynyt ilmentyminen NKX3.1 mRNA kaikissa Doc käsitellyissä soluissa, kun taas tämä oli vähäisempää Pac käsitellyissä soluissa (kuvio 5B).

Expression (A) AR ja PSA: n ja (B) c -Jun, KLK2, NKX3.1 ja c-Myc mRNA-tasot vastauksena Doc tai Pac arvioitiin kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR). Suhteellisen keskimääräisen mRNA: n ekspression taso AR geenien mitattiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä kolmena rinnakkaisena.

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat selvän korrelaation AR, c-jun ja PSA taksaania käsitellyissä soluissa. Tuloksista hoito riippuu tilasta AR-reseptorin ja c-jun-mRNA ilmaisun ja tak- käytetty.

Eläinmallijärjestelmiä

arvioimiseksi hoitovasteen eturauhasen syöpä LNCaP in vivo perustimme eläinmallissa kuten kuvassa 5. Hiiriä käsiteltiin Doc tai Pac yksin tai yhdessä bikalutamidin. Statisitically merkittävä väheneminen tuumorin koko hiirissä, joita käsiteltiin Doc yksin osoitettiin (p = 0,04, Doc vs CTR) (kuvio 6A). Hoidetuilla hiirillä Pac vakautus- mutta ei laskua kasvaimen havaittiin (kuvio 6A). Ei ollut merkittävää eroa havaittu Doc käsitellyistä hiiristä ja hiiristä sai yhdistelmähoitoa bikalutamidin (kuvio 6C). Mielenkiintoista on, kasvaimia hiirillä, joille Pac ja bikalutamidin kasvaimet alkoivat kasvattavat jälkeen tasapainotukseen (kuvio 6C). Tilastollisesti merkitsevä tuumorin koon pieneneminen Doc /BIC verrattuna Pac /BIC käsiteltyihin hiiriin (p = 0,003).

(A) kasvukäyrä hoidettujen hiirien Doc tai Pac yksin, Doc vs ctr (p = 0,04). (B) Vastaavat immunohistokemiallisella värjäyksellä kasvainkudoksen. (C) kasvukäyrä hiirten yhdistelmähoito, Doc /bikalutamidi (BIC) vs Pac /Bic (p = 0,003). (D) Vastaavat immunohistokemiallisella värjäyksellä kasvainkudoksen. Huomaa, että p-cjun oli ilmennetty eri hiirillä, joille Doc ja Pac. Ki67 ilmentyminen oli suurempi Pac verrattuna Doc käsitellyillä hiirillä.

vieressä tarkasteltiin ilmentymisen c-jun, p-cjun, AR ja Ki67 proteiineja kasvainkudoksessa korjattu vaikutuksen arvioimiseksi lääkehoidon. Oli merkittävä muutos ydin- AR tasoilla hoidettuihin eläimiin Doc yksinään tai Doc /BIC (kuvio 6B ja 6D, vastaavasti). Molemmissa hoitoryhmissä noin 60% solupopulaation näytetään sytoplasmisen translokaatio AR, verrattuna hiiriin, kontrolliryhmässä (kuvio 6B). Sitä vastoin, hiiret, joita käsiteltiin Pac tai yhdistelmähoidossa sytoplasmista translokaatiota AR oli vähäisempää. Ilmaisulla p-cjun kudoksissa kontrollieläimistä näkyy voimakas värjäytyminen, kun taas me havaitsimme, että ydin- p-cjun oli selvä Pac käsitellyissä hiirissä verrattuna Doc käsiteltyihin eläimiin, jossa myös sytoplasmista ekspressiota havaittiin (kuvio 6B). Mitään merkittävää muutosta rakenteessa c-jun ilmentyminen nähtiin ohjaus ja hoidettujen eläinten. Ki67 ilmentyminen oli selvempi Pac hoidetuissa hiirissä joka heijastaa huono vaste kasvainten tähän taksaania in vivo.

Vahvista sytoplasmisen translokaatiota AR jonka taksaanin hoidon in vitro, Western blotting kokeet suoritettiin LNCaP ( Kuva S1). Yhteisymmärryksessä in vivo -tiedot osoitimme, että riipu taksaani käytetyt AR oli siirtämisellä sytoplasmaan. Translokaation oli selvempi Doc käsitellyissä soluissa (ylempi paneeli) verrattuna Pac käsiteltyjen solujen (alempi paneeli), varsinkin kun 48 tunnin hoidon.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme selventäneet roolia AR ja sen koaktivaattorikompleksien c-jun PC soluvasteen taksaania hoitoa. Olemme osoittaneet, että c-jun yli-ilmentyminen PC-3-solut annetaan tilastollisesti merkitsevästi suurempi vastustuskyky Doc hoitoon verrattuna soluihin, kotransfektoitiin AR /c-jun: n tai AR yksin. LNCaP-solut olivat resistenttejä Doc läsnä ollessa tai puuttuessa bikalutamidin verrattuna PC-3-soluja. Transfektio mutantti juna lisääntynyt elinkelpoisuutta, mikä viittaa siihen, että c-jun ja fosforylaatiossa sivusto 63/73 on keskeinen säätelijä soluvasteen taksaaneja PC. Olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että Doc ja Pac käsittely eri tavalla vaikuttaa proteiini ja mRNA-tasoja AR ja PSA: vanhempien LNCaP ja LNb4 soluja. Nämä erot näkyivät kasvaimen kasvua hiirimallissa. Tulokset esitetään tässä osoittaa, että vaikutus taksaanin hoito on voimakkaasti riippuvainen c-jun ja AR tilan solulinjan käytetty sekä huumeiden hoitoon.

Tiedetään, että AP-1-transkriptiotekijän on monitoiminen ja joskus ristiriitaisesti käsitelty kirjallisuudessa [24]. c-jun on osoitettu transdusointiin mitogeenisella vasteen ja edistää solujen kasvua yhden geenin tai yhteistyössä aktivoidun ras-geenin [25,26]. Näin ollen olemme havainneet, että c-jun yliekspressio (mutantti juna) resistenssin PC-3-solujen Doc hoidon. Mielenkiintoista on, että juna havaittiin olevan tehokkaampi estämään solukuolemaa verrattuna AR viittaa siihen, että fosforylaatiossa sivusto 63/73 on ratkaisevan tärkeää, että vuorovaikutus ja vakauttamiseen AR ja c-jun-komplekseja. Tämä havainto on linjassa aiemmin raportoitu tutkimuksiin, jotka osoittavat, että c-jun voi toimia antiapoptoottisten tekijä sijaan proapoptoottiset asiayhteyden ja altistuminen kemoterapia-aineiden [14,27].