Krooninen sairaus

tiivistelmä

sappiteiden syöpä (BTC) on usein vaikea diagnosoida lopullisesti, jopa läpi histologinen tutkimus. MikroRNA (miRNA) säätelevät erilaisia ​​fysiologisia prosesseja. Viime vuosina on ehdotettu, että profiilit verenkierrossa miRNA, samoin kuin kudoksen miRNA, on mahdollista käyttää diagnostisina biomarkkereita syöpään. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia vahvistaa olemassa miRNA ihmisen sapessa ja arvioida niiden mahdollisuuksia kliinistä biomarkkereita BTC. Me näytteet sappi potilailta, joille tehtiin sapen viemärit sapen sairauksiin kuten BTC ja choledocholithiasis. PCR-pohjainen miRNA havaitseminen ja miRNA kloonaus tehtiin tunnistamiseksi sappi miRNA. Käyttämällä korkean suoritustehon reaaliaikainen PCR-pohjainen miRNA mikrosirut, ilmaus profiilit 667 miRNA verrattiin potilailla, joilla on pahanlaatuinen sairaus (

n

= 9) ja iän suhteen potilailla, joilla on hyvänlaatuinen tauti choledocholithiasis (

n

= 9). Olemme sittemmin tunnettu sappi miRNA vakauden kannalta ja lokalisointi. Kloonaamalla ja käyttäen PCR-menetelmillä, olemme vahvistaneet miRNA olemassa sappeen. Differential analyysi bile miRNA osoitti, että 10 667 miRNA merkittävästi korkeammin ilmaistu pahanlaatuinen ryhmässä kuin hyvänlaatuinen ryhmässä

P

0,0005. Asettaminen spesifisyys kynnyksen 100% osoitti, että jotkut miRNA (

miR-9

,

miR-302c *

,

miR-199-3p

ja

asennuspalveli- 222 *

) herkkyys oli tasolle 88,9%, ja vastaanotin toimineiden ominaisuus analyysi osoitti, että

miR-9

ja

miR-145 *

voisi olla hyödyllinen diagnostinen merkkiaineita BTC. Lisäksi olemme todentaa pitkän aikavälin vakaus miRNA sappeen, ominaisuus, joka tekee niistä sopivia diagnostisia käytettäväksi hoitopaikassa. Olemme myös vahvistaneet, että sappi miRNA on lokalisoitu pahanlaatuinen /hyvänlaatuinen sapen epiteelin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että sappi miRNA voisi olla informatiivinen biomarkkereita hepatobiliaarinen tauti ja että jotkut miRNA, erityisesti

miR

-9, voi olla apua diagnosointiin ja kliinisen hoidon BTC.

Citation: Shigehara K, Yokomuro S, Ishibashi O, Mizuguchi Y, Arima Y, Kawahigashi Y, et ai. (2011) Real-Time PCR-Based Analysis of Human Bile MicroRNAome Tunnistaa

miR-9

mahdollisena Diagnostic biomarkkeri sappiteiden syöpä. PLoS ONE 6 (8): e23584. doi: 10,1371 /journal.pone.0023584

Editor: Carlo Gaetano, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Italia

vastaanotettu: 28 joulukuu 2010; Hyväksytty: 21 heinäkuu 2011; Julkaistu: 17 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Shigehara et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Apurahat-in-Aid ja ”Research Core” Project Private University: Matching Fund tuki (S0801034) alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology, Japani. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

joukossa hepatobiliaarisen pahanlaatuiset kasvaimet, sappiteiden syöpä (BTC), joka sisältää sisäisen ja ekstrahepaattisen kolangiokarsinooma ja sappirakkosyöpä [1], kasvaa esiintyvyys. BTC syntyy sappiteiden epiteelin ja aiheuttaa usein kurouma tai tukos sappitiehyen [2]. Jo tämän seurauksena tukos on säilyttämisen sappi, joka johtaa keltaisuus. Potilaat, joiden epäillään sairastavan BTC ja joilla esiintyy kliinisiä oireita kuten keltaisuutta yleensä tutkittiin käyttäen diagnostisia kuvantamismenetelmiä kuten ultrasonography, tietokonetomografia (CT), ja magneettikolangiografia (MRCP). Nämä tekniikat ovat rajattu herkkyys havaitsemiseksi BTC [3] sekä tarkka diagnoosi syövän kliinisessä on usein vaikeaa, koska monet hyvänlaatuiset sairaudet esiintyä vastaavia oireita. Tuloksena on usein viivästynyt diagnoosi BTC [4]. Varhainen havaitseminen BTC on kriittinen potilaiden hoitotuloksiin koska a) BTC liittyy huonoon ennusteeseen [4]; b) se on ominaista ei-vaste /heikompi vaste kemoterapiaa ja sädehoitoa; ja c) ainoa parantava hoito on kirurginen resektio [5], [6]. BTC potilailla on usein leikkaukseen ennen niiden kunnon lopullisesti määritetty olevan pahanlaatuinen [7]. Niinpä diagnostisen tarkkuuden parantuneen varten BTC tarvitaan, erityisesti kun otetaan huomioon kasvava maailmanlaajuinen taudin esiintyvyyden. Viime 10 vuoden aikana huomattavaa edistystä on tapahtunut ymmärtämisessä patogeneesissä BTC, ja useita geenejä ja proteiineja, jotka edistävät molekyylimekanismeihin sappitiesairaus syövän synnyn on tunnistettu [8], [9], [10], [11 ], [12].

MikroRNA (miRNA) ovat endogeenisesti ilmaistaan, lyhyt, ei-koodaavaa RNA: t 18-25 nukleotidin pituisia, että tukahduttamiseksi proteiini käännös sitoutumaan kohde-mRNA: t. Alalla syöpä, useita tutkimuksia on tehty kudoksiin miRNA pyrkimyksenä valaista tautimekanismien ja parantavat nykyisten ja ennustavia indikaattoreita [13], [14], [15]. Viime aikoina tutkimukset hyödyllisyyttä miRNA peräisin solunulkoisia osia, erityisesti seerumi ja plasma, on raportoitu [16], [17], [18]. Esimerkiksi on osoitettu, että istukan liittyvät kiertävän miRNA korreloi raskauden etenemisen [16]. Cogswell

et al.

Talteen miRNA päässä aivo-selkäydinnesteestä ja löysi Alzheimerin taudin aiheuttaman miRNA muuttuu sopusoinnussa niiden tehtävä potentiaalisina biomarkkereita taudin [19]. Melkonyan

et al.

Havaita erilaisia ​​miRNA virtsassa, kuten jotkut erittyy transrenally, ja ehdotti uusia diagnostisia mahdollisuuksia transrenal nukleiinihapon analyysi [20]. Muualla Michael

et al.

Uutettu miRNA maasta eksosomeiksi saatu syljen terveiden verrokkien ja potilaan Sjögrenin syndrooma [21]. Yhteydessä syövän, miRNA seerumissa potilailla, joilla on rintasyöpä ja diffuusi suuren B-solujen lymfooma, on osoitettu olevan stabiili ja erittäin ennustava maligniteetin ja selviytymisen [17], [18]. Nämä raportit viittaavat siihen merkittäviä rooleja solunulkoisen miRNA, lisäksi muita kudosta miRNA, säätelyssä monissa fysiologisissa prosesseissa. Koska tällä alalla kehittyy, nämä miRNA voi tulla diagnostisia ja terapeuttisia kohteita kliinisesti merkittävää tilanteissa. Nämä raportit edistänyt voimme spekuloida, että miRNA voi olla läsnä ja vakaa ihmisen sapessa, aivan kuten ne ovat muiden kehon nesteiden, ja että sappi levittämä miRNA voitaisiin käyttää uusien biomarkkereiden varten BTC.

pääkomponentit ihmisen sappi ovat sappihapon, kolesteroli, bilirubiini, bikarbonaatteja, elektrolyyttejä ja vettä. Bile tuotetaan maksasolujen maksassa ja virtaa kautta sappitiehyen pohjukaissuoleen, missä se auttaa lipidien ruoansulatus ja imeytyminen [22]. Kuten veri, sappi voi noutaa potilailla, joille tehdään diagnostisia ja /tai terapeuttisia sapen salaojitus. Näin ollen voidaan ymmärtää hyödyllisyys BTC biomarkkereiden sapen ja /tai seerumin. Sappi- biomarkkereiden voisi nopeuttaa diagnoosia BTC kehottamalla edelleen histologiset tutkimukset kuten sappi sytologisesta, harja sytologia, ja pihdit koepala sappitiehyen.

Tässä tutkimuksessa ensin tutki miRNA olemassa ja ne voidaan havaita ihmisen sapessa pienten RNA kirjasto sekvensointi. Seuraavaksi määritetään, spesifisten miRNA sapen vaihtelee syöpäpotilaiden ja ilman syövän käyttäen suuren läpimenon reaaliaikainen PCR-pohjainen miRNA ilmaisun mikrosiruja. Lopuksi arvioidaan mahdollisia sapen miRNA uusina biomarkkereita BTC.

Materiaalit ja menetelmät

Bile kokoelma

tutkimusprotokolla hyväksyi Human eettisen komitean Nippon Medical School ja tutkimuksen toimikunta Nippon Medical School. Potilaat, jotka allekirjoittivat kirjallisen tietoisen suostumuksen muoto otettiin tässä tutkimuksessa. Bile kerättiin 18 potilaat kärsivät sapen sairauden (kuten BTC ja choledocholithiasis), joille tehtiin diagnostinen ja /tai terapeuttinen sapen salaojitus kautta perkutaanisen transhepatic cholangiodrainage, perkutaaninen transhepatic sappirakon kuivatus, tai endoskooppinen nasobiliary kuivatus. Yhdeksän potilasta oli diagnosoitu histologisesti adenokarsinooma (seitsemän jossa kolangiokarsinooma ja kaksi sappirakon syöpä). Olemme mukana yhdeksän samanikäisiin verrokeilla diagnosoitu choledocholithiasis ilman nykyisen tai aiemman maligniteetti tai tulehdustila (taulukko 1).

Näytteen käsittely ja RNA

RNA uutettiin 5 ml sappinesteiden kunkin yksittäisen samana päivänä kuin kokoelma. Nukleiinihappo fraktio saadaan uuttamalla fenoli-kloroformi-isoamyylialkoholia (25:24:1), jota seurasi etanolisaostus (-80 ° C: ssa 30 min). Kokonais-RNA saatiin käyttämällä RNAiso Plus (TaKaRa Bio, Tokio, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Uutetaan RNA-näytteet säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

Reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA käänteistranskriboitiin käyttäen ei-spesifisiä alukkeita /alukkeita, jotka ovat spesifisiä kullekin mRNA /miRNA, vastaavasti . Triplikaattinäytteet tuloksena cDNA altistettiin reaaliaikainen PCR käyttäen TaqMan miRNA alukkeita /koettimia (Applied Biosystems, Tokio, Japani), jossa on 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems).

Small RNA kirjasto sekvensointi sapen miRNA

miRNA kloonauksen menetelmät kuvataan edellisessä raportissa [23]. Lyhyesti, kokonais-RNA-näytteet uutettiin sapen avulla RNAiso Plus (TaKaRa Bio) (katso edellä) ja erotettiin denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä. 18-24-nt fraktio talteen. Seuraava, 5′- ja 3′-adapterit ligoitiin RNA: ita, ja reaaliaikainen PCR suoritettiin. Amplification cDNA-fragmentit saatiin aikaan kaksi peräkkäistä PCR-ajoa. Erityiset restriktioentsyymidigestiolla sovittimien sallittu concatemerization cDNA suuremmiksi palasiksi. Nämä fragmentit kloonattiin sitten vektorin luomiseksi cDNA-kirjastosta. Concatemerization lisää pituudet informatiivinen sekvenssejä, jotka voidaan saada kunkin kloonin. Pieni RNA-sekvenssit analysoitiin homologiaa tunnettujen miRNA. Merkinnästä miRNA suoritettiin käyttäen miRBase (viimeisin versio) homologia analyysi toiminta.

Reaaliaikainen PCR-pohjainen miRNA ilmentymisen profilointi

Yhteensä miRNA (350 ng) käänteistranskriptoituneet käyttäen Megaplex RT Alukkeet (Applied Biosystems). Saatu cDNA: t esi-monistettiin käyttämällä Megaplex Esivahvistustaso Alukkeet (Applied Biosystems) ja pre-monistettujen tuotteiden soveltaa TaqMan Human MicroRNA Array paneeli (A ja B, v2.0). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen 7900HT Fast Real-Time System (Applied Biosystems). Reaaliaikaisen PCR saadut käyttäen TaqMan MicroRNA Panel analysoitiin Applied Biosystems ohjelmisto (SDS ver. 2.3 ja RQ johtaja ver. 1.2). miRNA ekspressiotasot potilaan M9 (katso taulukko 1) asetettiin 1,0. miRNA jonka ilme ei ollut havaittavissa potilaan M9 (katso taulukko 1) jätettiin pois lisäanalyysiä. Kvantifiointiin suhteellinen CT menetelmä (ΔΔCT menetelmä) levitettiin. U6 käytettiin sisäisenä kontrollina. Kaikkien 18 potilasta, tämä analyysi suoritettiin käyttäen Kentät A ja B Selvitimme cut-off merkitys käyttäen viritys parametri delta, valitaan sen perusteella, että väärien positiivisten määrä on nolla. Array tietoja oli käytetty vastaanottimeen toimineille (ROC) käyrät piirtämällä väliset suhteet utaretulehdusmallia (herkkyys) ja väärien positiivisten (1 – spesifisyys). Alue käyrän alla (AUC), mitta erottelutarkkuutta, laskettiin myös.

miRNA vakauden määritys

stabiilius arvioitiin endogeenisen miRNA sappeen, mittasimme miRNA tasoilla sappi alkaen kolme henkilöä, joita oli inkuboitu huoneen lämpötilassa 0-24 tuntia. Lyhyesti, 5 ml kutakin sapen näytettä inkuboitiin, ja miRNA uutettiin ja puhdistettiin ajastettuna ajankohtina käyttäen edellä kuvattua menetelmää. RNA-näytteet sitten käänteiskopioitiin ja alistettiin real-time PCR. Mittaamaan vakauden eksogeenisten miRNA, synteettinen

Caenorhabditis elegans

miRNA (

cel-miR-39

) lisättiin kuhunkin sappi näytteen alusta itämisaika (0 h) ja altistettiin samalle louhinta ja kvantifiointiin menettelyjä. Normalisoida datan, synteettinen

C. elegans

miRNA

cel-miR-238

lisättiin nukleiinihappofraktio välittömästi ennen käänteistranskriptiolle toimimaan sisäisenä valvonta reaaliaikainen PCR.

Bile fraktiointi

Bile on raportoitu fraktioida neljä komponenttia lisäämällä sekä keskipakovoima ja kesto sentrifugoinnin [24]. Arvioida sappi miRNA lokalisointi, me fraktioitiin 12 ml: n näytteitä sappineste kolme henkilöä differentiaalisentrifugaatiolla [25] ja verrattiin ilmentymistason miRNA kussakin fraktiossa (Fig. 1). Suhteellisen suurten komponenttien kuten kokonaisia ​​soluja, ytimet, ja solujen solun tukirankojen sedimenttiin klo

alhaisella nopeudella

(1000 ×

g

10 min). Sisältäviä pellettejä mitokondriot, lysosomeihin ja peroksisomeihin saatiin klo

keskinopeudella

(20,000 x

g

20 minuuttia), ja mikrosomeissa ja pieniä vesikkeleitä osoitteessa

nopea

( 80000 ×

g

1 h). Lopuksi pienin komponentit (esim ribosomit, virukset, ja suuri makromolekyylien) koottiin

erittäin nopea

kanssa pitkään sentrifugoimalla (150000 x

g

3 h) ( kuva 1). RNA uutettiin kustakin pelletti käyttäen RNAiso Plus (TaKaRa Bio) mukaisesti valmistajan protokollan, ja kuvaamaan joitakin mielivaltaisesti valittu miRNA mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä, kuten edellä on kuvattu. Ilmaisu taso koodaavan mRNA sapen epiteelin merkki sytokeratiini 7 (CK-7) mitattiin myös tarkistaa, että fraktiointi oli toteutettu asianmukaisesti [26], [27], [28], [29].

Ihmisen sappea alistettiin toistettiin sentrifugointi progressiivisesti suuremmilla nopeuksilla erottamiseksi soluista ja organelles. Sentrifugointiolosuhteiden (painovoima ja aika) olivat seuraavat: alhainen nopeus, 1000 x g 10 minuuttia; keskinopeudella, 20000 xg 20 minuutin ajan; nopea, 80000 xg 1 h; erittäin nopea, 150000 x g 3 h.

Tulokset

Vahvistus olemassaolosta miRNA ihmisen sapessa

Toistaiseksi ei ole raportti läsnäolosta miRNA sappeen. Ensisijainen tavoitteemme oli selvittää miRNA olemassa sappi, ja jos on, tunnistaa ne. Reaaliaikainen PCR spesifisiä alukkeita /koettimia osoitti, että

miR-21

oli läsnä sappeen (Fig. 2A). Käyttäen sappeen lähdemateriaalin pieni RNA kirjasto sekvensointi varmisti läsnäolo useita miRNA, jossa

let-7b

ollessa useimmin kloonattu (Fig. 2B ja 2C). Nämä havainnot osoittivat, että miRNA ovat läsnä sapen ja sappi on houkutteleva biologinen materiaali miRNA analyysiä.

(A) Reaaliaikainen PCR-pohjainen miRNA havaitseminen

miR-21

. TaqMan miRNA real-time PCR käyttäen koetinta /alukkeita, jotka ovat spesifisiä

miR-21

suoritettiin kolme sapen näytteitä ja ei-malli kontrollinäyte (NC). Huomaa, ettei PCR-tuotetta negatiivisen kontrollin (NC). (B) edustaja kromatogrammissa sekvensoinnin tulosten kloonauksen jälkeen sappi miRNA. Rekit yläpuolella kromatogrammissa osoittavat kukin miRNA ja linkkeriä (katso materiaalit ja menetelmät). (C) Taulukko, joka osoittaa miRNA tunnistaa kloonauksesta, niiden suhteellinen tiheys, ja ne kloonattiin BTC tai hyvänlaatuinen tapauksissa.

Suurikapasiteettinen ja määrällinen microRNA ilmentymisen profilointi sappinesteiden potilaalla on sappiteiden syöpä

tunnistaa sappea miRNA jotka poikkeavasti ilmaistu sappitiesairaus sairauksien, erityisesti sappiteiden syövät, analysoimme sappi näytteet kaikista 18 potilasta reaaliaikaisella PCR-pohjainen miRNA ilmentymisen profilointi (Fig. 3A ja Taulukko S1 ). Suhteellinen kvantitointi tiedot osoittivat, että 335 667 miRNA merkittävästi korkeammin ilmaistu pahanlaatuinen ryhmässä kuin hyvänlaatuinen ryhmässä (

P

0,05) (Fig. 3A ja Taulukko S1). Näistä pidämme korostettu 10 miRNA (

miR-9

,

miR-145 *

,

miR-105

,

miR-147b

,

let-7 f-2 *

,

let-7i *

,

miR-302c *

,

miR-199-3p

,

miR -222 *

ja

miR-942

), joiden ekspressio oli merkittävästi suurempi

P

0,0005 (Fig. 3A). Asettaminen spesifisyys kynnyksen 100% [17], [30] osoitti, että

miR-9

,

miR-302c *

,

miR-199-3p

, ja

miR-222 *

herkkyys oli taso 88,9%, mikä osoittaa, että nämä miRNA voivat toimia biologisia merkkiaineita sappiteiden syöpä (Fig. 3B). Herkkyys taso

miR-145 *

,

miR-105

, ja

miR-942

oli 77,8%, ja että

miR-147b

,

let-7 f-2 *

, ja

let-7i *

oli 66,7% (Fig. 3B). Lisäksi, pinta-ala ROC-käyrän analyysi osoitti, että

miR-9

ja

miR-145 *

voisi olla erinomainen diagnostisia markkereita BTC (Fig. 3C). Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että sappi miRNA, varsinkin

miR-9

, on potentiaalia käyttää diagnostisia indikaattoreita sappitiesairaus syöpien.

(A) miRNA lauseke lämpöä kartta, jossa miRNA mukaan lajiteltuna niiden

P

-arvot. Näytteet näkyvät riveihin, ja miRNA sarakkeisiin. miRNA ilmentymisen potilaan M9 (katso taulukko 1) asetettiin 1,0. Täydellinen mikrosirujen tulokset löytyvät lisätiedot. (B) Dot tuloste, joka esittää ilmentymisen tasot 10 miRNA jotka olivat huomattavasti korkeammin ilmaistu pahanlaatuinen ryhmässä kuin hyvänlaatuinen ryhmässä (

P

0,0005). Pystysuora logaritminen akseli esittää suhteellisen kvantifioinnin saadut arvot TaqMan array määritystä. Asettaminen spesifisyys kynnyksen 100% osoitti herkkyyttä olevan 88,9% ja

miR-9

,

miR-302c *

,

miR-199-3p

, ja

miR-222 *

; 77,8% vuonna

miR-145 *

,

miR-105

, ja

miR-942

; ja 66,7% vuonna

miR-147b

,

let-7 f-2 *

, ja

let-7i *

. ○, mediaani arvo. (C) ROC-käyrän analyysia. Ilmaisu profiilin kullekin miRNA käytettiin tulo-vastaanotin toimii (ROC) analyysi. ROC-käyrä näyttää herkkyys versus 1 – spesifisyys. Alue käyrän alla (AUC), mitta erottelutarkkuutta, laskettiin myös.

karakterisointi sapen miRNA

sapen miRNA voidaan käyttää diagnostisesti kliinisessä ympäristössä, niiden täytyy olla vakaa. Ottaen huomioon sen hajottavien luonne, oli tärkeää määrittää, kuinka kauan miRNA eheys voidaan säilyttää sappeen. Kuten on esitetty kuviossa. 4, olemme vahvistaneet, että endogeeninen sappi miRNA

miR-21

,

let-7c

, ja

miR-9

olivat vakaat sapen ja että niiden ekspressiotasot pysyi korkeana erityisesti 4 tunnin sisällä 24 tunnin inkubaation. Kuitenkin eksogeeninen miRNA

cel-miR-238

oli heti heikompi, kun lisätään kolme yksittäistä sappi näytettä (katso materiaalit ja menetelmät). Nämä havainnot viittaavat siihen, että endogeeniset sappi miRNA ovat stabiilissa muodossa, joka kestää epäsuotuisat olosuhteet, kuten voimakas RNaasi-aktiivisuus ja voimakas happamuus, jotka aiheuttavat eksogeeniset miRNA on hajonnut. Lisäksi fraktiointi analyysit osoittivat, että kaikki kolme näytettä testataan, kaikki miRNA, mukaan lukien

miR-9

, havaittiin sisältävä komponentti sapen epiteelisolujen, ytimet, ja solun tukirankojen, mikä osoittaa, että sapen miRNA sijaitsevat pääasiassa sisällä solut ja tumat. (Fig. 5).

Endogeeninen ihmisen sapessa miRNA

HSA-miR-21

,

HSA-let-7c

, ja

HSA-miR-9

ovat suhteellisen vakaita. Sen sijaan, synteettinen eksogeeninen miRNA

cel-miR-39

oli hajoaa nopeasti, kun se lisätään sappeen.

tasot mRNA: ta ja miRNA kussakin fraktiossa laskettiin tulosten todellisen -Aika PCR ja kokonaisvesimäärän RNA verrata yksinkertaistetun absoluuttinen määrä kunkin osan. (A) koodaavan mRNA sapen epiteelin merkki CK 7 todettiin pääasiassa havaittu subcellular komponentti, joka sisälsi kokonaisia ​​soluja, ytimet, ja solujen solun tukirankojen. (B) miRNA

miR-21

,

miR-9

, ja

RNU6B

oli saman suuntainen, mikä osoittaa, että suurin osa miRNA sappeen olivat peräisin sapen epiteelisolujen . Fraktiot saatu hidaskäyntisiä (1), keskinopeita (2), nopea (3); ja erittäin nopea sentrifugoimalla (4).

Keskustelu

Täällä kerromme läsnäolosta ja vakautta sappi miRNA, niiden suhteelliset ekspressiotasot, mitattuna suuren suoritustehon reaaliaikainen PCR, ja erot miRNA profiilien välillä sappi näytteitä, joilla on hyvänlaatuinen ja pahanlaatuisia sappitiesairaus. Kun olet vahvistanut olemassaolon miRNA sapen käyttäen spesifisiä miRNA alukkeita, suoritimme kattavamman analyysin avulla miRNA mikrosiruja, joka antoi meille mahdollisuuden testata läsnäolo 667 miRNA lajeja. Vaikka tämä on pieni tutkimus, meillä on luottamus siihen, että meidän käsitettä käytetään miRNA erottamaan hyvän- /pahanlaatuinen sappiteiden sairauksia validoidaan enemmän laajoja tutkimuksia tehdään tulevaisuudessa. Lisäksi ehdotetaan diagnostista käyttöä sapen miRNA olemme kehittäneet luotettavia menetelmiä talteen ja arvioidaan miRNA jotka ovat yhteensopivia kliiniseen testaukseen. Vertaileva analyysi ekspressiotasoja tunnistettiin 10 miRNA joiden taso vaihtelee välillä pahanlaatuisia ja hyvänlaatuisia olosuhteissa (

P

0,0005) (Fig. 3B). ROC-analyysi tunnisti kaksi näistä miRNA olevan sopivia käytettäväksi BTC biomarkkereita (Fig. 3C). Erityisesti

miR-9

osoitti luotettavia diagnostisia spesifisyys ja herkkyys.

Yhteydessä syövän biologian, poikkeava ilmentyminen

miR-9

on liittynyt etäpesäkkeitä [31 ], [32], [33], [34].

miR-9

perheen ylössäädellään [32], [33] tai vaimentua [31], [35] eri ihmisen syövissä. Ero

miR-9

ilmentymisen nähnyt täällä voi olla samanlainen vaiheessa sääntelyn joka osoitettiin

miR-200

maksasyöpää [36]. Aikaisin, kun syöpäsolut tulevat invasiivisia ja niitä epiteelin-mesenkymaalitransitioon,

miR-200

on vaimentua, mutta se on myöhemmin ylössäädelty aikana reepithelialization distaalisen etäpesäkkeitä, kun solut läpikäyvät mesenkymaalisten-epiteelin siirtymistä [36]. Mekanismi

miR-9

säätelyhäiriö tutkimuksessamme on tuntematon mutta saattaa liittyä poikkeavaa metylaatio on promoottorialueen [31], [34], [37], tai f aktivaatio transkriptiotekijän MYC /MYCN [32 ]. Muita funktionaalisia tutkimuksia

miR-9

in BTC tarvitaan.

jälkeen tutkittiin biokemialliset ominaisuudet miRNA sappeen. Plasma on raportoitu vahvaa RNaasi-aktiivisuus [38]. Mitchell

et al.

Vahvisti tämän RNaasi-aktiivisuus ja osoittivat, että alasti miRNA kohdistui hajoamista, kun taas endogeeniset miRNA pysyi vakaana plasmassa, vaikka läsnä voimakkaita RNaasi-aktiivisuuden [39]. Mielenkiintoista, havaitsimme samanlainen eroja vakauden välillä endogeenisen ja eksogeenisen miRNA sappeen (Fig. 4). Vakautta Endogeenisen sapen miRNA tekee niistä sopivia yhtä luotettavia biomarkkereita kliinisissä tilanteissa.

Miten endogeenisten miRNA kestämään denaturointiolosuhteissa sapen on vielä selitettävä. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että suurin osa verenkierrossa miRNA löytyy eksosomeiksi, joka suojaa niitä hajoamiselta ja ovat vastuussa erinomainen vakaus [40], [41], [42]. Eksosomit ovat 40-100 nanometrin kalvovesikkeleiden of endosyyttisissä alkuperää, jotka sisältävät sekä mRNA ja miRNA. Eksosomit voidaan siirtää yhdestä solusta toiseen, ja niiden komponentit voivat toimia uudessa ympäristössä. Useat miRNA profilointi tutkimuksia on suoritettu eksosomeiksi veressä [40], [41], [42]. Alussa oletetaan, että vakaus endogeenisen sappi miRNA seurausta niiden läsnäolo eksosomeiksi. Toisin odotuksia, solufraktioinnin kokeet paljastivat, että suurin osa sapen miRNA ei todettu pieniä vesikkeleitä, mutta kokonaisten solujen ja tumien (Fig. 5). Vaikka ei ole näyttöä siitä, että sappi miRNA on samat toiminnot kuin ne, seerumista tai plasmasta, havaintomme jakotislaamalla tutkimuksista ja PCR-analyysi CK-7 mukaan miRNA uutettu sappi perustuvat pääasiassa ehjiä epiteelisoluja tai pahanlaatuisia soluja, on desquamated peräisin sappeen ärsytystä. Siten endogeenista miRNA pysyvän vakaana sapen kunnes hajoaminen desquamated soluista, joissa ne sisältyvät. Kun miRNA aineita vapautuu näistä rakenteista sappeen, ne todennäköisesti nopeasti hajoavat.

On olemassa todellinen tarve innovatiivisia työkaluja tarkasti diagnosoida BTC. Tällä hetkellä läsnäolo syöpä -antigeeni (CEA) ja hiilihydraattien 19-9 (CA 19-9) seerumin toimii standardina kliininen diagnoosi BTC. Kuten on esitetty taulukossa 1, kuitenkin tämän testin herkkyyttä ei ole niin korkea kuin, että saavutetaan meidän miRNA analyysin. Kahdeksassa yhdeksästä BTC tapauksissa seerumin CEA tasot eivät nousseet, vaikka syöpä oli läsnä. Lisäksi seerumin CA-19-9 tasot olivat kasvoi ainoastaan ​​tietyillä potilailla, luultavasti siksi kolestaasi. Diagnostic kuvitella tekniikoita, kuten endoskooppinen ultraääni (EUS) ja intraduktaalisissa ultraääni käytetään, kun BTC epäillään. EUS mahdollistaa hyvä näkyvyys distaalisesta ekstrahepaattisen sappipuuston, sappirakko, paikallisiin imusolmukkeisiin ja verisuonistossa [5]. Rösch

et al.

Vertasivat diagnostinen tarkkuus endoskooppinen retrogradinen kolangiopankreatikografia (ERCP), MRCP, CT, ja EUS 50 potilaalla on sapen striktuurat. Herkkyys /spesifisyys diagnoosin maligniteetin oli 85% /75% ERCP, 85% /71% MRCP, 77% /63% CT, ja 79% /62% for EUS [43]. Prospektiivisessa tutkimuksessa potilailla, joilla epäillään kolangiokarsinooma, EUS tehtiin diagnostinen herkkyys 79% ja spesifisyys 62% [44]. Lisäksi äskettäin meta-analyysi, EUS herkkyys oli 78% ja spesifisyys 84% ​​[45]. Intraduktaalisissa ultraäänitutkimus lanka-ohjattu, ohut-kaliiperi, korkea-taajuus koettimilla aikana suoritetaan ERCP, ja aiemmissa tutkimuksissa osoittivat tarkkuus hinnat erottaa hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset tiukkojen säädösten 76-90% [46], [47], [48]. Lisäksi kuvantamismenetelmiä, histologisia menetelmiä kuten sappi sytologisesta, harja sytologia, ja pihdit koepala ovat pakollisia lopullisen diagnoosin. Bile sytologian ja harja sytologia on vain vaatimaton tarkkuuden hinnat määrittämiseksi maligniteetin, vaihtelee 30: stä 70%: useimmissa julkaistuissa tutkimuksissa [5], [49], [50], [51], [52], [53]. Pihdit koepala, joka on suurempi tarkkuus nopeudella kuin muut histologinen tutkimus (43-81%), ei ole laajalti käytössä, koska se vaatii erikoistuneita ja -tekniikkaa [54], [55], [56]. Samoin erikoistuneempia EUS-ohjattu hienoksi neula pyrkimys biopsia, jossa diagnostinen herkkyys 43-86% varten sapen ahtaumat [7], [57], [58], [59], [60], [61], tällä hetkellä käytetään vain haiman kasvaimia ja huonompi sappitiehyen ahtaumat ja ei ole hyväksytty käytettäväksi muissa olosuhteissa. Alhainen diagnostinen tarkkuus joidenkin nykyisin käytössä testit vahvistavat, että BTC voi olla vaikea diagnosoida. Kun otetaan huomioon huono ennuste BTC [4], on toivottavaa parantaa helposti ja tarkkuutta testaus. Tulokset meidän tutkimuksen mukaan mittaus sappi miRNA voi parantaa nopeutta ja tarkkuutta diagnosoinnissa BTC. Lisäksi sappi analyysi on mahdollista, koska sapen miRNA ovat vakaita ja voidaan helposti uuttaa ja analysoida kliinisissä.

Lisätutkimukset kanssa runsaasti potilaita ja eri tutkimus populaatioiden sekä tutkimuksia erilaisen näytön välillä BTC ja pre -malignant sairaudet kuten primaarinen sklerosoiva kolangiitti saavuttamiseksi tarvitaan kliinistä hyväksyntää. Kuitenkin meidän tulokset osoittavat, että mittaus sappi miRNA tasojen on käytännöllinen lähestymistapa avustaminen arviointiin BTC ja on verrattavissa moniin nykyisiin diagnostisia menetelmiä, mukaan luettuna sytologia. Yhteenvetona toteamme, että mittaus miRNA ilmaisun sapen olisi hyödyllistä erottamaan hyvän- ja pahanlaatuisten sairauksien, erityisesti tapauksissa, jotka jäävät diagnosoimatta. Erityisesti sappi

miR-9

on vahva potentiaali käytettäväksi kliininen markkeri sappitiesairaus syöpien.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Expression tasoilla miRNA sappeen. Lämpöä kartta rakennettiin tietojen avulla miRNA mikrosiruja käytetään analysoida sappi näytteitä potilaista, joilla on pahanlaatuinen ja hyvänlaatuinen tauti. miRNA ilmentymisen potilaan M9 (katso taulukko 1) asetettiin 1,0. B, analyysi sappinesteen potilaalta hyvänlaatuinen tauti; M, analyysi sappinesteen potilaalta, joilla on pahanlaatuinen sairaus.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0023584.s001

(XLSX) B

Kiitokset

Kiitämme Takuji Kosuge ja Yoshimi Hinohara niiden asiantuntijoiden teknistä tukea.