PLoS ONE: BRAF Mutaatiot Koirien Cancers
tiivistelmä
aktivointi mutaatioita
BRAF
geeni lukemiin konstitutiivisen aktivoitumisen MAPK-reitin. Vaikka monet ihmisen syövät kanna mutatoitunut
BRAF
geeni, tämä mutaatio ei ole vielä tunnettu koirien syöpiin. Koska ihmisen ja koiran syövistä jakaa molekyyli poikkeavuuksia, me arveltu, että
BRAF
geenimutaatioita olemassa myös koirien syöpiin. Tämän hypoteesin testaamiseksi, sekvensoimme eksoni 15
BRAF
, mutaatio hot spot geenin, vuonna 667 koirien ensisijainen kasvaimia ja 38 kontrollisilkkipaperia. Sekvensointi paljasti, että yhden nukleotidin T: n transversio nukleotidin 1349 sattui 64 primaarikasvainten (9,6%), jossa on erityisen korkea taajuus eturauhassyöpä (20/25, 80%) ja urothelial karsinooma (30/45, 67%) . Tämä mutaatio johtaa aminohapposubstituutio glutamiinihapon valiinilla kodonissa 450 (V450E) koirien
BRAF
, jotka vastaavat yleisintä
BRAF
mutaatio ihmisen syövässä, V600E. Lajikehityksellisen säilyttäminen
BRAF
V600E mutaatio korostetaan MAPK-reitin aktivaation neoplasian ja voivat tarjota mahdollisuuden molekyylidiagnostiikassa ja kohdennettuja terapeuttisia koirille varustettujen
BRAF
-mutated syöpiä.
Citation: Mochizuki H, Kennedy K, Shapiro SG, Breen M (2015) BRAF Mutaatiot Canine Syövät. PLoS ONE 10 (6): e0129534. doi: 10,1371 /journal.pone.0129534
Academic Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Yhdysvallat |
vastaanotettu: 06 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 11. toukokuuta 2015 Julkaistu: 08 kesäkuu 2015
Copyright: © 2015 Mochizuki et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään
Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.
Rahoitus: Tämä tutkimuksen rahoittivat North Carolina State University (NCSU) Cancer Genomics Fund (MB).
Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
RAF proteiinit ovat evoluution konservoituneita seriini /treoniinikinaaseja, jotka säätelevät olennainen solun prosesseja, mukaan lukien kasvu, erilaistuminen ja selviytymistä. RAF perhe kuuluu kolme jäsentä: araF, BRAF ja CRAF. Kaikki RAF proteiinit aktivoituvat RAS ja sen jälkeen aktivoida MEK, aloittaessaan signaalitransduktiota lukuisiin MAPK-reitin. Konstitutiivisen aktivaation MAPK-reitin aiheuttamien onkogeeninen mutaatioista
RAF
geenien aiheuttaa epänormaalia lisääntymistä ja erilaistumista. Niistä kolme muotoa
RAF
geenejä,
BRAF
geeni useimmin mutatoitunut ihmisen syövässä [1-3].
Yleisimmät ( 90%) somaattinen mutaatio ihmisen
BRAF
geeni on T-to-transversio A: n eksonissa 15 nukleotidiin 1799 (c.1799T A), jolloin aminohappo substituutio valiinista glutamiinihapoksi kodonissa 600 ( V600E) [2]. V600E mutaatio tapahtuu aktivointi geenisegmentin ja jäljittelee fosforylaatio, voimakkaasti ylentävä kinaasiaktiivisuutta ja aktivointi alavirran signaalin [3,4]. Tämä aktivoiva mutaatio on raportoitu melanooman (~ 60%) [4,5], kilpirauhassyöpä (20-40%) [6-9], karvainen-cell leukemia (~ 100%) [10] ja monet muut syövät kanssa muuttuva taajuus. Yhdessä usein mutaatioita
RAS
geenien läsnäolo
BRAF
mutaatiot monenlaisia ihmisen syövissä korostaa, että on tärkeää MAPK-reitin aktivointi yhteisenä kasvaimia synnyttävän rakenteisen.
Koirat kehittävät spontaanin syövät monia yhtäläisyyksiä ihmisen syövissä, kuten anatomisia sijainti, histologinen ulkonäkö ja hoitovasteen. Syöpä koirilla jakaa paitsi biologista käyttäytymistä ihmisten kanssa, mutta myös molekyyli- poikkeavuuksia [11,12]. Koska aktivoiva
BRAF
mutaatiot ovat läsnä monenlaisia ihmisen syövän, me arveltu, että
BRAF
geenin mutaatiot ovat samalla tavoin mukana koiran syövissä, mikä hyperactivation, että MAPK-reitin ja solun transformaatio. Tämän hypoteesin testaamiseksi olemme seulottiin läsnäolo
BRAF
eksonin 15 mutaatioiden kohortin 667 patologisesti vahvistettu koirien Tuumorinäytteet, joka käsittää sarjan hematopoieettisen kasvain (n = 245), sarkoomat (n = 160) karsinoomien (n = 115), melanocytic kasvain (n = 72), sekä muita, vähemmän yleisin syöpä (n = 75).
Materiaalit ja menetelmät
tuore ja formaliiniin Tuumorinäytteet eri koirien kiinteitä kasvaimia, ja EDTA verinäytteet koiraeläin leukemia tapauksissa jätetty asiakkaalta omistamien koirien (joissa tietoon omistajan suostumuksella) yksityisten eläinlääkärivastaanottoja kaikkialla Yhdysvalloissa osana tavanomaisten diagnostisten toimenpiteiden (no IACUC tarvita). Muita kasvain näytteet rekrytoitiin välityksellä North Carolina State University (NCSU) kliiniset tutkimukset Core, joista jokaisella on tietoon omistajan suostumuksella ja jälkeen NCSU IACUC hyväksytty protokolla (hyväksymisnumero 13-022-O), joka kattoi menettelyä käytettiin näytteiden saamiseksi ja niiden myöhemmästä käytöstä tutkimuksen sovellus. Hematoksyliinillä ja eosiini-värjättyä dioja formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) näytteet tarkistaa board-sertifioitu eläinlääkintä- patologi ja vahvisti neoplastisten kaikissa mutta leukemia yksilöitä. Leukemia diagnoosit perustuivat arviointiin sytologinen ja immunophenotypical tutkiminen leukemiasolujen jonka board-sertifioitu kliinisen patologi.
Perimän DNA eristettiin tuoreesta kudoksesta /verinäytteet tai FFPE kudoksiin. Kaikkiaan 667 kasvaimen yksilöt mukana tässä tutkimuksessa. Tiedot näytteen väestöstä on esitetty taulukoissa 1 ja 2. DNA eristettiin käyttäen QIAamp FFPE DNA (Qiagen, Valencia, CA, USA) tai DNeasy Veri ja Tissue Kit (Qiagen). Spektrofotometria (NanoDrop, Thermo Scientific, Wilmington, DE) ja agaroosigeelielektroforeesilla määrittämiseen käytettiin DNA määrän ja eheys. Ei-neoplastisia ohjaimet (n = 38), DNA eristettiin koiran virtsarakkoepiteeliin 30 koiraa ja eturauhasen rauhaset 8 koiraa, joka saadaan ruumiinavauksessa ilman näyttöä neoplastisten muutosten yhteydessä histopatologiselle.
eksoni 15 ihmisen
BRAF
geeni evolutionally konservoitunut koirien ja ihmisten (kuvio 1). Näin ollen PCR-monistus suoritettiin monistamiseksi 391-bp: n DNA-fragmentti, joka kattaa genomisen koiran
BRAF
sekvenssin, joka vastaa ihmisen
BRAF
geenin eksonissa 15 (CanFam3.1, koiran kromosomissa (CFA) 16 : 8,296,227-8,296,345). Seuraava alukeparia suunniteltiin käyttäen Primer-BLAST-ohjelmiston (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/): eteenpäin, AAGCAGGTCACATATGCCAAA (CFA 16: 8,296,007-8,296,027); käänteinen, ATTTTTGGACCCTGAGGTGC (CFA 16: 8,296,378-8,296,397). Kukin PCR-reaktio sisälsi 10-20 ng genomista DNA: ta, 250 nM eteenpäin ja taaksepäin-aluketta ja 1 x Taq-RED Master Mix Kit (Genesee Scientific, San Diego, CA, USA). PCR-sykliä koostuvat alkudenaturaatio 95 ° C 2 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 30 s, 60 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C: ssa 30 s ja lopullinen venymä vaihe 95 ° C: ssa 5 min. PCR-tuotteet visualisoitiin käyttäen agaroosigeelielektroforeesilla ja suoritettiin kohdennettu Sangerin sekvensointia analyysin kanssa eteenpäin ja /tai reverse-alukkeita. Sekvenssianalyysi suoritettiin North Carolina State University Genome Research Laboratory (https://research.ncsu.edu/gsl/). Sekvensointigeelit Aineisto analysoitiin 4peaks ohjelmistoa (https://nucleobytes.com/index.php/4peaks) ja vertailtiin sekvenssi (XM_005629550.1) käyttäen CLC Sequence Viewer versio 7 (CLC bio, Aarthus, Tanska).
sekvenssit ovat erittäin konservoituneita ihmisen ja koiran, kuten valiini kodonissa 600 ihmisen BRAF (alleviivattu) ja kodonissa 450 koiran BRAF.
Fisherin testiä suoritettiin tutkia ero
BRAF
mutaatio taajuudet ryhmien välillä ositettu sukupuolen, neuterointi tila, iästä tai rotujen. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin JMP Pro -ohjelmiston versio 11 (SAS Institute, Cary, NC). Arvot P 0,05 pidettiin merkittävinä.
Tulokset ja keskustelu
tutkimiseksi läsnäolon
BRAF
mutaatioita, sekvensoimme
BRAF
geenin eksonissa 15 667 primaarikasvaimen näytteet ja 38 kudosnäytteisiin. Sekvenssianalyysi paljasti T: n transversio A nukleotidiin 1349 (c.1349T A, viite: XM_005629550.1) joka tapahtui 64 primaarikasvaimille, jolloin aminohappo substituutio valiinista glutamiinihapoksi kodonissa 450 (V450E) (kuvio 2). Tämä aminohapon muutos vastaa ihmisen V600E mutaatio (kuvio 1). Merkittävää vaihtelua esiintyy taajuus V450E mutaation poikki koira syöpiä: 0% vuonna hematopoieettiset kasvaimet ja sarkoomat 67% ja 80% urothelial karsinooma (UC) ja eturauhassyöpää (PC), vastaavasti (taulukko 3). Kaikissa V600E mutantit, elektroferogrammit osoitti, että läsnä sekä mutatoidun ja villityypin sekvenssit, mikä viittaa siihen, mutaatio heterotsygotian. Ei ollut tilastollisesti merkittävää eroa mutaation taajuus eri ryhmien neutering, iästä tai rotujen UC ja PC näytteiden välillä sekä mutaatiostatuksesta riippumatta ja sukupuolen UC näytteissä. Tiedot signalments koirien kanssa UC ja PC esitetään S1 taulukossa.
(A) Villityypin sekvenssi on saatu ohjaus eturauhanen DNA. (B) mutatoidun sekvenssin sekoittaa villityypin sekvenssi, saatu eturauhassyöpä. Nuoli osoittaa T-to-A nukleotidisubstituution tuloksena muutos valiini kodonissa 450 glutamiinihapolla.
Lisäksi V450E mutaatio, joka on T-to-C siirtymän nukleotidin 1305 (c.1305T C, hiljainen mutaatio) havaittiin suun kautta okasolusyöpä näyte. Introni- poistaminen T (c.1292-189delT) havaittiin yksi kussakin pehmytkudossarkooman ja melanooma näytteitä. Kaikki muut kasvain ja kontrollinäytteiden säilytti villityypin genomisen sekvenssin
BRAF
eksonissa 15.
konstitutiivisen aktivaation MAPK signaloinnin aktivoimalla mutaatiot
BRAF
(~ 60%) tai
sääntelyviranomaisten
(~ 15%) geenejä on tärkeä rooli patogeneesissä ihmisen melanooma [4,5,11,12]. Samoin konstitutiivinen aktivaatio MAPK-reitin on sekaantunut koiran melanooman [13,14], vaikka
RAS
geenit harvoin mutatoitunut [14-16]. Tässä tutkimuksessa on kuitenkin vain 6% ihosyövän (kaksi limakalvon ja yksi ihomelanooman) ja 17% melanocytomas kanna
BRAF
V450E mutaatio. Tämä mutaatio ei havaittu aiemmissa tutkimuksissa koiran melanooman [13,17], mikä johtuu todennäköisesti alhainen taajuus
BRAF
mutaation koiran melanooma. Ihmisen melanooma, läsnäolo
BRAF
mutaatio liittyy ihon altistuminen UV-valoa, ja ihosyövän päälle limakalvokohtiin tai ei-UV-altistunut iho harvoin hallussaan mutaatio [18,19]. Koska koiran melanoomaa esiintyy pääasiassa suun limakalvojen ja harvoin kynsien sängyt ja ei-UV-altistuneet nahkoineen iho, että
BRAF
on mutatoitunut harvoin koiran melanooman on yhdenmukainen havainnot ihmisen kollegansa.
Mielenkiintoista, koiran UC osoitti paljon korkeampi taajuus
BRAF
mutaatio kuin on raportoitu ihmisen UC kasvaimissa [20]. Mutaatiot geeneissä ylävirtaan MAPK-reitin, kuten
HRAS
,
KRAS
ja
FGFR3
geenejä (jotka kaikki ovat ylävirtaan molekyylejä BRAF vuonna MAPK-reitti), havaittiin in 82% ihmisen papillaarisen UC, mikä viittaa siihen, että aktivointi koulutusjakso on tärkein ajo tekijä alaluokka ihmisen UC [21,22]. Vaikka mutatoitunut molekyylien reitti voi olla erilainen ihmisen ja koiran UC, tiheä
BRAF
mutaation koiran UC viittaa siihen, että häiriöstä MAPK reitti voi olla tärkeä rooli sairauden patogeneesissä.
Canine PC on ominaista suuri metastaattista potentiaalia ja paikallisia invasiivisuus mutta vaikuttavia tekijöitä aggressiivinen biologinen käyttäytyminen ovat vielä suurelta osin tuntemattomia. [23] Vaikka
BRAF
V600E mutaatiot ovat harvinaisia ihmisissä [24-26], varaamiseen todisteet osoittavat, että MAPK-reitin tärkeä rooli kehityksen ja etenemisen ihmisen PC, erityisesti etäpesäkkeitä [27]. Somaattiset mutaatiot
RAS
geenejä ja kopion numero voitot
BRAF
ja
CRAF
geenejä havaitaan ihmisen PC taajuuksilla ~ 10, 30% ja 15%, vastaavasti [24-27]. Nämä genomista muutokset johtavat aktivointi ja /tai lisääntynyt ilmauksia RAF proteiineja, jolloin aktivointi alavirran signalointia ja kasvava metastaattinen ominaisuudet [26-28]. Lisäksi toistuvat kromosomitranslokaation joissa
RAS
ja
RAF
geenejä, jotka johtavat kasvaimia synnyttävän -fuusiogeenit, äskettäin löydettiin alaryhmässä (~ 5%) ihmisen PC tapauksissa [29,30] .
ainutlaatuinen piirre koiran PC on, että suurin osa kasvaimista syntyy androgeenista riippumattomalla tavalla, lisääntynyt riski kastroitu koirilla [23]. Toisaalta, hormoni-puutteen hoito on kantavana hoitoon ihmisen PC, androgeeni- kriittinen rooli patogeneesissä. Suurin osa ihmisen PC kuitenkin edetä aggressiivisempi, hormoni-tulenkestävät (kastraatio kestävä) syöpä aikana taudinkulku. Aktivointi BRAF /MAPK signalointi tekee ihmisen PC kasvainsoluja vähemmän riippuvaisia androgeenireseptorin lisääntymisen
in vivo
ja
in vitro
, edistää hormoni tulenkestävät fenotyyppi [31]. Yleisyys
BRAF
mutaatio ja aggressiivinen luonne koira PC voi heijastaa sitä, että suurin osa koira PC kehittää riippumattomasti androgeenistimulaation. Nämä kliiniset ja molekyylitason yhtäläisyyksiä voivat tehdä koira PC toimii spontaanisti esiintyvä eläin syövän mallin merkitystä hormoni tulenkestävät ihmisen PC.
Viime etenemisen molekyylitason tekniikan ansiosta voimme havaita verenkierrossa kasvainsolujen nestemäisiä näytteitä kuten perifeerinen verta. Havaitseminen
BRAF
mutaatioita voidaan käyttää keinona diagnosoimaan ja valvomaan tuumoritaakka nestemäisiä näytteitä, kuten veressä tai virtsassa, ettei siinä ole tarpeen koepala kasvainten (kutsutaan neste koepala, tarkistetaan [32,33] ). Vaikka histopatologinen tutkimus kasvainbiopsiasta on kultakantaan diagnosoimiseksi koiran UC ja PC, anatominen sijainnit näiden kasvainten usein vaikea saada riittävästi kudoksia diagnosoida. Lisäksi lääkärit ja omistajat saattavat lannistaa valitsemasta tämän diagnostisen workup johtuen kustannusten ja invasiivisia toimenpiteitä liittyy koepala. Näin ollen pääsy ei-invasiivinen tapa diagnosoinnissa näistä syövistä on täyttämätön tarve. Korkea
BRAF
mutaationopeutta näissä kasvaimissa tekee BRAF V450E mutaation mahdollisena diagnostinen markkeri vaikuttaa syöpien.
tunnistaminen
BRAF
mutaation koiran syövistä nostaa mahdollisuuksia että terapia kohdistaminen konstitutiivisesti aktivoidun MAPK-reitin voi tarjota kliinistä hyötyä niille kuljettavat
BRAF
V450E mutaatio, varsinkin UC ja PC potilaita. Äskettäin vemurafenib ja dabrafenib, valikoiva BRAF estäjät, parannettu kliinisiä tuloksia potilailla, joilla on melanooma verrattuna tavanomaiseen kemoterapiaan [34,35]. Nämä BRAF inhibiittorit ovat myös osoittaneet terapeuttista potentiaalia muissa kasvaimet kätkeminen
BRAF
mutaatioita [36-38]. Nykyisin hoitovaihtoehtoja koirille UC ja PC ovat rajoitettu tehoa. Koska tehokkuus BRAF /MAPK-täsmähoitoihin ihmisen syövissä, BRAF ja MAPK reitit voidaan lupaavaa terapeuttista tavoitteet näille koirien syöpiin. Arvioinnit
in vitro
ja
in vivo
vaikutuksia BRAF estäjien koirilla takuu kliiniseen soveltamiseen BRAF estäjän koirille laakeri syövän mutatoitunut
BRAF
.
Yhteenvetona olemme tunnistaneet
BRAF
V450E mutaation koiran syövistä eri taajuuksilla. Usein
BRAF
mutaatio koiran UC ja PC korostaa mahdollisen roolin MAPK signalointireitin patogeneesissä näiden kasvainten ja voi tarjota diagnostisia ja terapeuttisia sovellutuksia koirille varustettujen
BRAF
mutaatioita.
tukeminen Information
S1 Taulukko. Signalments koirien diagnosoitu urothelial ja eturauhassyöpää tässä tutkimuksessa.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0129534.s001
(XLSX) B