Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

puute luotettava ennustava biomarkkerit on kompastuskivi eturauhassyövän hoito (CAP). Eturauhasen-antigeenin (PSA) käytetään laajasti klinikoilla on useita varoitukset kuin korkki biomarkkereiden. Afrikkalainen Amerikan CaP potilailla on huono ennuste kuin valkoihoisilla, ja erityisesti seerumin-PSA ei toimi hyvin tässä ryhmässä. Lisäksi jotkut miehet matalan seerumin-PSA jäädä huomaamatta suojusta, kunnes he kehittävät tauti. Näin ollen, on olemassa tarve tunnistaa luotettavia diagnostisia ja ennakoivan biomarkkereiden CaP. Tässä osoitamme, että BMI1 kantasolujen proteiini on eritys- ja voitaisiin tutkia varten biomarkkereiden käyttö korkki potilailla.

Menetelmät /Principal Havainnot

Semi-kvantitatiivinen analyysi BMI1 suoritettiin eturauhaskudoksista TRAMP (alkuperäisten siirtogeenisen hiiren mallia), ihmisen CaP potilasta, ja solujen perustuvia malleja, jotka edustavat normaalin ja maatalouspolitiikan eri fenotyyppejä Afrikkalainen Amerikan ja valkoihoinen miehiä, käyttämällä immunohistokemiallisesti, immunoblottauksen ja Slot-blottauksella. Kvantitatiivinen analyysi BMI1 ja PSA tehtiin veren ja kulttuuri-media siRNA-transfektoiduissa ja ei-transfektoiduissa soluissa käyttämällä ELISA. BMI1 proteiini on (i) erittävät CaP-solut, (ii) lisääntynyt apikaalisella alueella epiteelisolujen ja strooman alueella eturauhasen kasvaimia, ja (iii) havaitaan ihmisen veressä. BMI1 on havaittavissa veressä CaP potilaiden suuruusluokkaa kasvava kasvain vaiheessa näytteille positiivinen korrelaatio seerumin-PSA ja tärkeintä on havaittavissa potilailla, joilla on alhainen seerumin-PSA. Kliininen merkitys BMI1 biomarkkerina voitiin todeta havainnosta, että cap-solut erittävät tätä proteiinia korkeampi kuin solujen tyypillinen eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH).

Johtopäätökset /merkitys

BMI1 voisi kehitetään dual biomarkkerimenetelmin (seerumi ja biopsia) diagnosointiin ja ennusteen CaP valkoihoisilla ja Afrikkalainen Amerikan miehet. Vaikka vakuuttava nämä tiedot aihetta lisätutkimuksia kohortin Afrikkalainen Amerikan potilailla.

Citation: Siddique HR, Parray A, Zhong W, Karnes RJ, Bergstralh EJ, Koochekpour S, et al. (2013) BMI1, Stem Cell Factor Toimiminen Novel Serum-biomarkkereiden Kaukasian ja Afrikkalainen Amerikan Eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (1): e52993. doi: 10,1371 /journal.pone.0052993

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 lokakuu 2012; Hyväksytty: 27 marraskuu 2012; Julkaistu: 07 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Siddique et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tukee puolustusministeriön CDMRP myöntää W81XWH-08-1-0605 vastaavaan tekijän. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mukaan American Cancer Society, 241740 diagnosoidaan eturauhassyöpä (CAP) ja 28170 CaP potilasta ennustetaan kuolla vuonna 2012 pelkästään Yhdysvalloissa [1]. Epätyydyttävän tuloksen yleistä hallinnointia (hoitostrategioita ja ennusteen seuranta) YMP tauti voidaan yhdistää puuttumisesta luotettavan prognoosi- seerumi-biomarkkereiden. Vaikka käytetään laajalti, useita tärkeitä epävarmuustekijöitä on raportoitu seerumin PSA ennustetyövälineenä biomarkkeri [2]. Esimerkiksi joissakin CaP tapauksissa seerumin-PSA on (a) havaitaan vähän, jos lainkaan, (b) ei ole riittävän herkkä, ja (c) ei syrjiä mahdollisesti merkittäviä syövät päässä merkityksetön niistä [2] – [4]. PSA ei heijasta syövän biologian ja suuren erehdyksen vaaraa tuloksia [5] – [6]. Lisäksi eroavuudet PSA diagnostisena merkki eri roturyhmiä kuten valkoisilla ja Afrikkalainen Amerikan ovat sekoitti hallinnoinnin syöpä [6] – [7]. Siksi suuri tarve säilyy parannettujen serologinen biomarkkereiden Cap, joka on luotettava ennuste ja diagnoosi valkoihoisilla ja Afrikkalainen Amerikan potilailla.

On yhä enemmän todisteita siitä, että Polycomb (PCG) proteiinien keskeinen rooli syövän kehittymisessä ja tauti uusiutuu [8]. B-solu-spesifinen hiiren Moloney-leukemiaviruksen integraatiokohdan 1 (BMI1) on hyvin tunnettu markkeri käytetään kantasolujen biology [8] – [9]. BMI1 joka on läsnä ilmentymiskuvio lähes kaikissa kudoksissa on usein säädelty erilaisten ihmisen syöpien [8] – [10]. Tarkistimme äskettäin merkitys BMI1 syntymistä chemoresistance eri syöpien kuten CaP [8]. Nykyinen tutkimus on ensimmäinen kliininen näyttö siitä, että BMI1 on eritysproteiinia joka on valtavat mahdollisuudet kehitetään seerumipohjaista biomarkkeri korkki ja sen ennustetta sekä Kaukasian ja Afrikkalainen Amerikan väestöstä. Ehdotamme, että seerumi-BMI1 biomarkkerina toimisi tehokkaammin kuin PSA. Edelleen, BMI1 voitaisiin käyttää kahta biomarkkerina seerumin sekä koepala.

Materiaalit ja menetelmät

eturauhasen kudosten ja seeruminäytteet ihmisen CaP potilaista

Eturauhasen kudosten kirurgisesti korjattu ihmisen CaP potilaista ja vastaavia parafiiniblokit hankittiin päässä Cooperative Human Tissue Network keskilännen Division, The Ohio State University (Columbus, OH). Seeruminäytteistä ihmisen CaP potilaita hankittiin seerumista pankin (BioServe, Beltsville, MD). Muita parafiiniin upotetut leikkeet ihmisen eturauhasen kudosten 70 potilaalla normaali ja adenokarsinooma saatiin ISU Abxis Co Ltd, (Seoul, Etelä-Korea).

Solulinjat

Solulinjat peräisin sekä Kaukasian ja Afrikkalainen amerikkalainen miehen käytettiin tutkimuksessamme. Normaali ja kuolemattomaksi eturauhasen epiteelisolujen linja (RWPE1), CaP solulinjat (LNCaP, C42b, PC3, DU145, Vcap ja PCa-2b), eturauhasen strooman myofibroblasteja (WPMY1), paksusuolen normaalin epiteelisolujen (FHC) ja paksusuolen syöpäsolulinjoissa ( SW480, HCT116 ja HT29) sekä ihmisen haiman sinoomasolulinjoja PANC1 ja AsPC1 saatiin ATCC (Manassas, VA). Normaali haimatiehyen epiteeli-soluja, esipahanlaatuinen Kras mutantti E6E7-Ras ja pahanlaatuisten Kras mutantti E6E7-Kras-st solut saatiin D. Paul M. Campbell (H. Lee Moffitt Cancer Center, Tampa, FL) [11]. BPH-1-solut hankittiin tri Simon Hayward (Vanderbilt University, Nashville, TN), joka kehitti heitä kuvatulla [12]. Perustaminen ja karakterisointi RC77N /E, RC77T /E ja E006 solujen aiemmin on kuvattu [13] – [14]. Soluja kasvatettiin sopivassa-alusta täydennettynä 10% FBS: ää (ATCC, Manassas, VA) ja 1% penisilliini-streptomysiini (Invitrogen, Carlsbad, CA) tavanomaisissa soluviljelyolosuhteissa 5% CO

2 inkubaattorissa 37 ° C.

Cell Selection

(a) valkoihoinen Cells: RWPE1 (normaali), BPH-1 (ei-pahanlaatuinen liikakasvu) ja LNCaP, C4-2B, PC-3, DU145 ja VCAP edustavat valkoihoinen eturauhassyöpää. WPMYI1 strooman fibroblasteja käytettiin myös. (B) Afrikkalainen amerikkalainen Cells: RC77N /E (normaali), ja RC77T /E PCA-2B, E006 edustavat Afrikkalainen amerikkalainen eturauhassyöpää.

Antibody, plasmidit ja siRNA

Monoklonaaliset anti BMI1 vasta-aine hankittiin Millipore (Temecula, CA). pBabe-BMI1 plasmidi (BMI1-yliekspressoivassa) oli ystävällinen lahjoitus tri Chi V. Dang (John Hopkins University, Baltimore, MD). BMI1-siRNA: t ovat kaupallisesti ostettiin Dharmacon (Lafayette, CO).

immunohistokemia

immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [15] – [16]. Lyhyesti, parafiini osat (täytyy arvioida BMI1) esikäsiteltiin sitraattipuskurilla (pH 6) 10 minuutin ajan mikroaaltouunissa antigeenin haku. Leikkeitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (anti-BMI1) laimennoksena 1:50 12 tuntia 4 ° C: ssa. Leikkeitä inkuboitiin sitten 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa asianmukaiset HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Lasit kehitettiin 3, 3′-diaminobenzidene (DAB kit, Invitrogen, Carlsbad, CA) ja laskuri värjättiin hematoksyliinillä. Värjättyjä laseja poistettiin vesi ja asennettu Permount-peitinlaseilla liuokseen peitinlasit.

Western blot-analyysi

Immunoblotit-analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [16] – [17]. Lyhyesti, solulysaatteja valmistettiin kylmään hajotuspuskuriin [(0,05 mmol /L Tris-HCI, 0,15 mmol /l NaCI, 1 mol /l EGTA: a, 1 mol /l EDTA: a, 20 mmol /L NaF, 100 mmol /l Na

3VO4, 0,5% NP-40, 1% Triton X-100, 1 mol /l fenyyli metyylisulfonyyli fluoridi (pH 7,4)], jossa proteaasi Inhibitor Cocktail (Roche, Indianapolis, IN). lysaatti kerättiin ja säilytettiin -80 ° C: ° C. proteiinipitoisuus lysaateissa mitattiin BCA proteiinimäärityksellä (Pierce, Rockford, IL), kuten per toimittajan protokollan. Western blot -analyysiä varten, 40 ug proteiinia erotettiin 10% SDS-PAGE-geeleillä, siirrettiin PVDF- kalvoja (Millipore, Bedford, MA) ja sen jälkeen inkuboitiin estopuskurissa (5% rasvatonta kuivamaitoa /1% Tween 20, 20 mmol /L TBS, pH 7,6) 2 tunnin ajan. blotit inkuboitiin BMI1 primaarisen vasta-aineen, pestiin ja inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (Sigma, Saint Louise, MO). blotit havaittu kemiluminesenssin (ECL kit, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). tasainen panostus proteiinin varmistettiin strippaamalla pyyhkii ja uudelleen tunnustelemalla β-aktiini (Sigma, St. Louis, MO). Densitometrian mittaukset skannatun bändejä suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [16].

Detection of Protein soluviljelmässä mediassa

Solujen annettiin kasvaa jopa 80% konfluenssiin täydellisessä media. 80% konfluentteja tasolla, media poistettiin ja solut pestiin kahdesti PBS: llä. Pesun jälkeen soluja lisättiin seerumittomassa alustassa. Soluja viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa 24 h ajan. 24 tunnin kuluttua, media kerättiin ja analysoitiin BMI1 eritysproteiinia käyttämällä Immuno-Slot blot-määritystä. Slot-blot-määritys suoritettiin kohti valmistajien protokollan (Whatman, Florham Park, NJ). Lyhyesti, Slot blot laite koottiin käyttäen Whatman suodatinpaperin ja ennalta kostutettu nitroselluloosamembraani. Seuraavaksi laite on yhdistetty tyhjöpumppuun. Slots olivat täynnä näytettä (media /seerumi) ja sitten vedetään alipaineella (käyttämättömät ajat olivat täynnä PBS). Membraanit blokattiin sitten 2 h estopuskurissa (5% rasvatonta kuivamaitoa). Blotteja inkuboitiin BMI1 primaarisen vasta-aineen, pestiin ja inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (Sigma, Saint Louise, MO). Blotit havaittu kemiluminesenssin (ECL kit, Amersham Biosciences).

Poistaminen albumiini seeruminäytteistä

albumiini poistettiin ihmisen seeruminäytteistä käyttämällä Albumin Removal Kit (Pierce, Rockford, IL ) kohti myyjän protokollaa. Näytteet, jotka sisälsivät 1000 ug kokonaisproteiinia ladattiin yhdelle poisto levy, jossa jokainen levy on raportoitu olevan sitova kapasiteetti 2 mg albumiini.

Arvio PSA-proteiinin tasot ELISAlla

Tämä suoritettiin käyttämällä ihmisen PSA-spesifisiä ELISA (Anogen, Ontario, Kanada) per toimittajan protokollan.

kvantifiointi eritys- BMI1 proteiinia kasvatusalustaan ​​

Tämä suoritettiin käyttäen BMI1-erityisiä ELISA (Antibodies-verkossa Inc., Atlanta, GA). Rekombinantti BMI1 proteiinia käytettiin palvelemaan vakiona tätä analyysiä varten.

BMI1-siRNA ja pBabe-BMI1 (BMI1 ilmentävä plasmidi) transfektiota vahvistaa, että BMI1 todellakin erittävät CaP solut

transfektoinneilla suoritettiin käyttäen Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA) kohti toimittajan protokollan. Tästä syystä ensimmäinen solunsisäinen BMI1 alkaen valkoihoinen CAP (LNCaP ja DU145) ja Afrikkalainen amerikkalainen CAP (E006) epiteelisoluja määritettiin.

Alle 1

st lähestymistapaa.

BMI1 lyötiin alas shRNA valkoihoisilla ja Afrikkalainen amerikkalainen soluja. 12 h transfektion jälkeen, solut kasvatettiin täyteen kasvatusliuokseen 12 tuntia. 24 tunnin kuluttua transfektion jälkeen, media poistettiin ja soluja kasvatettiin seerumittomassa elatusaineessa 24 h ajan. 24 tunnin kuluttua, seerumittomassa mediaa BMI1-pudotus solut kerättiin ja erittävät-BMI1 tasot mitattiin ELISA: lla.

Alle 2

nd lähestymistapaa.

eturauhassyövän solut edustavat valkoihoinen ja Afrikkalainen amerikkalainen tauti transfektoitiin BMI1 yliekspressoivia plasmidiin. 12 h transfektion jälkeen, solut kasvatettiin täyteen kasvatusliuokseen 12 tuntia. 24 tunnin kuluttua transfektion jälkeen, media poistettiin ja soluja kasvatettiin seerumittomassa elatusaineessa 24 h ajan. 24 tunnin kuluttua, seerumittomassa alustassa päässä BMI1-yli-ilmentävät solut otettiin talteen ja eritetty-BMI1 tasot mitattiin ELISA: lla.

Androgeenien solujen käsittely

Tästä syystä Caucasian ja Afrikkalainen Amerikan eturauhasen epiteelisolut käsiteltiin androgeenien analoginen (R1881) 12 tuntia. 12 tunnin kuluttua väliaine heitettiin pois ja soluja kasvatettiin vielä 12 h. 24 tunnin kuluttua solut kerättiin täytyy arvioida solunsisäisen BMI1 ilmentyminen western blot-analyysi.

Tilastolliset analyysit

graafinen yhteenvetoja jakelun värjäytymisen intensiteetti tehtiin käyttäen sirontakuvaajiin ja rasiakuvaajien. Yksinkertainen lineaarinen egression ja korrelaatio menetelmät olivat käytössä arvioimaan assosiaatioita BMI1, PSA ja Cap listalla (1 = normaali, 2 = vaihe II, 3 = vaiheen III, 4 = Vaihe IV). Korjaamiseksi skewness, BMI1 ja PSA analysoitiin log (base2) mittakaavassa. P-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Bmi1 proteiinin tasot eturauhaskudoksista kasvaa asteittain taudin siirtogeenisissä TRAMP hiirimalleihin

Glinsky et ai. [18] aiemmin osoitti Bmi1 proteiini koholla eturauhaskudokset TRAMP hiirten, joilla alkuperäinen hiirimallissa CaP kehitystä, olemme tutkineet jos progressiivinen kasvu tasojen Bmi1 eturauhaskudoksista voitiin havaitaan progressiivinen ikä korkki. Tätä tarkoitusta varten käytimme eturauhaskudoksessa kerättiin eri ikäisille TRAMP siirtogeenisiä hiiriä. Kuten on esitetty kuviossa 1A; Bmi1 proteiinin havaittiin olevan havaittavissa kaikenikäisille TRAMP-hiirissä. Yleisesti, värjäytyminen oli vahvempi eturauhasen epiteelisolujen vanhempia hiiriä kuin eturauhasen epiteelisolujen nuorempia hiirillä. Sileät lihassolut ovat paljon vahvempia värjäystä kuin fibroblastisoluista. Värjäysrintamaan Bmi1 proteiinia verrattiin ikä 17 viikkoa ja 45 viikkoa vanhoja eturauhasen yksilöitä (Fig. 1A). Nämä tiedot osoittivat lisääntynyttä ilmentymisen tasoja Bmi1 proteiinin eturauhasen vanhempien vuotiaiden hiirillä (Kuva. 1A). Oli voimakasta värjäytymistä apikaalisella alueella epiteelisolujen. Strooman alueiden havaittiin olevan positiivista värjäytymistä (Fig. 1A).

(A) mikrovalokuvia edustavat immunovärjäys BMI1 eturauhaskudoksista siirtogeenisten TRAMP-hiirissä. Nuolet osoittavat värjäys BMI1. Suurennus × 40. (Bi) mikrovalokuvia näyttää BMI1-positiivisia neoplastisia ja ei-neoplastisia alueilla eturauhasen yksilöiden CaP potilaiden arvioimana immunovärjäyksellä. Nuolet osoittavat värjäys BMI1. Suurennus × 40. (Bii) Rasiakuvaajat varten BMI1 proteiinia perustuvat pisteet koskevat immunovärjäyty- kuvio normaalissa ja korkki yksilöt strooman alueella. *, P 0,05; musta palkki kohtaan, mediaaniarvot.

BMI1 proteiinin ilmentymistä eturauhasen kudosnäytteitä CaP potilaiden

Huomattakoon, että joitakin epiteelisolujen siirtogeenisen hiiren eturauhasen epiteelisolujen osoitti tiheän apikaalisella värjäytyminen viittaa siihen, että Bmi1 voisi olla eritysproteiinia. Seuraavaksi me tunnistettu ilmaus BMI1 ihmisen CaP yksilöiden immunohistokemiallisella analyysi ja määrittää sen ilmentymistason strooman alueilla 70 parin toisiaan yksilöitä normaalin ja korkki edustavat kaikkia kasvain vaiheissa. Intensiteetti immunoperoksidaasivärjäystä BMI1 pisteytettiin 0 (negatiivinen), 1 (heikko), 2 (kohtalainen) ja 3 (voimakas). Immunostains osoitti värjäämällä sekä ei-neoplastisia ja neoplastisia strooman. Yleisesti, värjäytyminen oli vahvempi neoplastisten strooman kuin ei-neoplastisia stroomaan. Epiteelisolujen suotuisasti värjäystä vasta-aineella (Fig. 1Bi). Sileän lihaksen soluissa on paljon voimakkaampaa värjäytymistä (3) kuin fibroblastisoluja (0-1 +). Värjäysrintamaan BMI1 proteiinia verrattiin vaiheessa II-IV CaP yksilöitä (Fig. 1Bi). Nämä tiedot osoittivat lisääntynyttä ilmentymisen tasoja BMI1 proteiinin korkealuokkaisesta kasvain ihmisen korkki (Kuva. 1Bi). Laatikko tontit datan BMI1 proteiinin ilmentymistä strooman näytteillä laaja välisen mallin vaihtelu syövän yksilöitä, verrattuna normaaleissa kudoksissa ja paljasti merkittävän eron taso proteiinin normaalin ja Cap kudoksissa (p 0,05, Fig. 1Bii ). Keskimääräinen pisteet värjäytymisintensiteettiä BMI1 vuonna stroomaan normaaleissa kudoksissa oli 0,81 ± 0,07 (n = 70), ja oli huomattavasti pienempi kuin korkea-asteen vaiheen II (1,8 ± 0,08, n = 36), vaiheen III (2,26 ± 0,10 n = 28) ja vaihe IV (2,8 ± 0,11, n = 6) syövän yksilöt (Fig. 1Bii; p 0,05). Samanlainen värjäyksen parin toisiaan CaP yksilöitä havaittiin epiteelin että eturauhasen yksilöitä. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että ilmentyminen BMI1 lisääntyy vaiheessa korkki.

BMI1 ilmentymistä normaalissa ja neoplastisten eturauhasen solut edustavat CaP taudin valkoihoinen miesten

Yrityksenä kohti tunnistaa lauseke of BMI1 korkki etenemistä, ensin mitataan proteiinin ekspressiotasot immunoblottausanalyysillä useissa ihmisen valkoihoinen CaP solulinjoissa, LNCaP, DU145 ja PC3 ja verrattiin niitä NHPE (normaali ensisijainen eturauhasen epiteelisolujen) ja RWPE1 (eli normaali kuolemattomaksi eturauhasen epiteelisolujen) vastaavasti. Niistä korkki käytetyt solulinjat, LNCaP on androgeeniriippuvainen taas DU145 ja PC3 ovat androgen riippumaton. Valinta näiden solujen perustuu siihen, että 80% CaP potilaista on androgeenista riippuvainen taudin diagnoosin aikana, joka myöhemmin muuttuu aggressiivisempia, androgeenistä riippumaton taudin [19]. Kuten kuviossa 2 (Ai-ii) kaikki CaP solulinjat osoittivat suuremman ekspression BMI1 proteiinia kuin normaalissa eturauhasessa epiteelisoluissa. Kun proteiinin ekspressio BMI1 verrattiin, joka perustuu densitometrinen analyysi immunoblot, erittäin aggressiivinen PC3-soluissa ja DU145 oli korkeampi ilmentyminen kuin LNCaP-soluissa (kuvio. 2Aii). Kiinnostavaa kyllä, myös havaittiin BMI1 ilmentymistä eturauhasen strooman soluja (WPMY1) (Kuva. 2ai-ii). Mielenkiintoista on, BMI1 ilmentyminen havaittiin olevan erittäin alhainen eturauhasen epiteelisolujen, jotka edustavat eturauhasen hyvänlaatuinen liikakasvu (BPH) ehto (tietoja ei esitetty).

(Ai) Kuva esittää tason BMI1 proteiinin normaaleissa ja CaP solut valkoihoisia arvioituna immunoblot-analyysillä. Equal lastaus proteiinin varmistettiin reprobing immunoblot varten β-aktiini. Täplää kuvassa edustavat kolme näytettä. (AII) Histogrammi osoittaa densitometria analyysi immunobloteista BMI1. *, P 0,05; musta palkki harmaalla ruutuun mediaaniarvot. (Bi) Kuva edustaa tasoa BMI1 proteiinin normaaleissa ja korkki solut Afrikkalainen amerikkalaista alkuperää arvioituna immunoblot-analyysillä. Equal lastaus proteiinin varmistettiin reprobing immunoblot varten β-aktiini. Täplät kuvassa edustavat kolme näytettä. (Bii) Histogrammi osoittaa densitometria analyysi immunobloteista BMI1. *, P 0,05; musta palkki harmaalla ruutuun mediaaniarvot. (C) Kuva edustaa havaitseminen BMI1 ehdollisen viljelyalustassa eri solujen arvioituna Slot-blot analyysiä. Täplät data kuvassa edustavat kolme näytettä. (D) havaitseminen erittyvän BMI1 proteiinin conditioned viljelyalustassa soluja. Jokainen bar histogrammissa edustaa keskiarvo ± SE 3 riippumattomasta kokeesta * edustaa P 0,05.

BMI1 ilmentymistä normaalissa ja neoplastisten eturauhasen solut edustavat CaP taudin Afrikka-American men

ikävakioitu tietoja SEER tutkimus osoitti, että Afrikkalainen Amerikan miehillä on 60% suurempi ilmaantuvuus ja 125% korkeampi kuolleisuus Cap kuin valkoihoinen miesten [1], [13]. Rotu ja suvussa ovat kaksi laajimmin hyväksytty riskitekijöitä tämän sairauden [1]. Ymmärtäminen taustalla biologisia mekanismeja CaP etenemisen lopulta johtaa kehitystä tehokkaampia hoitostrategioita. Selvitimme tasot BMI1 ilmentymisen solussa perustuva in vitro -mallissa edustavat eri fenotyyppejä CaP taudin Afrikkalainen Amerikan miehet. Näitä ovat RC77N /E (mikä vastaa tavanomaista eturauhasen epiteelisolujen Afrikkalainen-American men), RC77T /E (eli androgeeniriippuvaisissa tuumorigeenisiä eturauhasen epiteelisolut), E006 (eli androgeeniriippuvaisen ei-tuumorigeenisiä eturauhasen epiteelisolujen) ja PCa-2b ( edustavat CRPC fenotyyppi, mutta säilyttävät androgeenireseptorin reagointia) [13] – [14]. Kuten kuviossa 2 (Bi-ii) kaikki CaP solulinjat RC77T /E, PCa2b ja E006 näytteillä on suurempi ekspressio BMI1 proteiinia kuin normaaleissa soluissa RC77N /E. Nämä tiedot (Fig. 2A-B) viittaavat mahdollisuuteen, että ilmaus solunsisäisen BMI1 proteiini voidaan korreloida erityskanavien BMI1 tasoja ihmisen kudoksissa ja voi olla rooli aggressiivisuutta ihmisen korkki.

BMI1 on sekretorisen proteiini: Detection seerumivapaassa media Cap soluviljelmistä

läsnäolo BMI1 apikaalisella alueella eturauhasen epiteelisolujen ja strooman alue sai meidät oletuksen, että se voisi olla eritysproteiinia luonnossa. Testata hypoteesia kysyimme BMI1 erittyy kasvainsolujen viljelyolosuhteissa. Jotta voidaan havaita BMI1 proteiinin elatusaineet CaP soluja, käytimme Slot-blot tekniikkaa. Solujen konfluenssiin tasolla 80% annettiin kasvaa tuoreessa seerumittomassa elatusaineessa 24 h ajan. Kuten käy ilmi kuvion. 2C, seerumivapaassa (korjattu Cap soluista kulttuuri) positiivisiksi BMI1 proteiinia. Erityisesti media kerätään viljelmistä epiteelisolujen edustavan normaalin ja BPH kunto näytteillä hyvin alhainen BMI1 proteiinia (Fig. 2C).

kvantifiointi sekretorisen BMI1 viljelyväliaineissa solujen edustavat CaP valkoihoisilla ja Afrikkalainen Amerikan miehet

käyttämällä ihmisen erityinen BMI1-ELISA-tekniikka, pystyimme havaitsemaan ja määrällisesti BMI1 erittämä proteiini solujen edustavat CaP valkoihoisilla ja Afrikkalainen Amerikan miehillä (Fig. 2D). Määritimme erittyy BMI1protein tasot (a) elatusaineet normaalia, BPH1, ja (b) elatusaineet syöpäsoluja edustavat eri syöpätyyppeihin. BMI1 havaittiin elatusaineet normaalin eturauhasen solujen (RWPE1, 0,45 ng /ml media) ja kiinnostavasti tasot BMI1 ei ole koholla BPH1 soluissa (Fig. 2D). Verrattuna normaaliin RWPE1 soluihin, cap soluja ilmeni kohonneita eritys- BMI1 proteiinin tasot media (Fig. 2D). LNCaP, C42b, PC3 ja DU145-solujen havaittiin erittää BMI1 proteiinin välillä 1,3-3,4 ng /ml media (Fig. 2D). On huomionarvoista, että BMI1 erittyvän proteiinin havaittiin seerumittomassa elatusaineet kaikenlaisten CaP solulinjojen edustavat normaalista RWPE1 vähemmässä aggressiivinen LNCaP ja kastraatio kestävät eturauhassyöpä (CRPC) solut C42b läpi erittäin aggressiivinen DU145 ja PC3-soluissa. Tämä havainto vahvistavat saatujen tulosten kanssa CaP potilaista, jotka edustavat asteittain taudin, jotka analysoitiin seerumin-BMI1 proteiinin tasot. Erityisesti media kerätään viljelmistä epiteelisolujen E006 (johdettu Afrikkalainen amerikkalainen CaP potilas) osoitti merkitsevästi korkea BMI1 proteiinia (Fig. 2D). Päinvastoin, elatusaineet eturauhasen strooman soluja (WPMY1), normaalit paksusuolen epiteelisolut (FHC) ja normaalin haiman ductal epiteelisolujen (PDE) eivät osoittaneet mitään eritettyjä BMI1 tasot (tuloksia ei ole esitetty). Mielenkiintoista, erittyneen BMI1 tasoja ei saa havaita kaikenlaisia ​​haiman (Kras-mutantti PDE, E6E7-Ras ja E6E7-Ras-st) ja paksusuolen sinoomasolulinjoja (SW480, HCT116), mutta vain erittäin aggressiivinen haiman solulinjoja AsPC1 (hyvin alhaiset; tuloksia ei ole esitetty) ja paksusuolen HT29 (tuloksia ei ole esitetty). ELISA data sekretorisen BMI1 mukainen havaintomme vuonna immunhistochemical analyysiin CaP kudosnäytteiden jossa havaitsimme lisääntynyt strooman värjäys BMI1 proteiinia. Tämä olisi ensimmäinen raportti osoittaa BMI1 kuin eritysproteiinia kasvainsoluista.

eritetty BMI1 elatusaineissa liittyy suoraan solunsisäisiin BMI1 tuumorisolujen

Koska BMI1 havaittiin erittää vuonna elatusaineet, pyrimme onko tämä eritystä liittyy solunsisäisiä BMI1. Käytimme kaksisuuntaista lähestymistapaa, jossa BMI1 joko oli tippuu alas tai yli-ilmennetään korkki soluissa. 24 tunnin kuluttua transfektion jälkeen, BMI1 tukahdutetaan ja BMI1-yliekspressoitu soluja viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa edelleen 24 tuntia. Seuraavaksi seerumivapaassa transfektoiduista soluviljelmistä kerättiin ja analysoitiin BMI proteiinia käyttämällä ELISA. BMI1 proteiini tasot havaittiin olevan erittäin vähennetään BMI1-tippuu alas solujen ja kasvoi BMI1-yli-ilmennetään soluissa (Kuva. 3A-F; p 0,05). Nämä tiedot osoittavat, että BMI1-äänieristys kasvainsoluja merkittävästi erittävät alhainen BMI1 proteiinia ja BMI1-yliekspressoitu CaP soluja erittää merkittävän suuria BMI1 proteiinin elatusaineet, tiedot viittaavat siihen, että solunsisäiset BMI1 korreloi suoraan sekretorisen BMI1 proteiinin tasot ( Fig. 3A-F; p 0,05). Me spekuloida, että kasvu solunsisäisen BMI1 tasojen Cap soluissa merkitsee sen myöhempi vapautuminen epiteelisolujen solun ulkopuoliseen tilaan ja aiheuttaa katkoja erityskanavien BMI1 proteiinin tasoja.

(A-F) Kuva edustaa vaikutusta (A-C) BMI1-hiljentämisen ja (D-F) BM11-yli-ilmentymisen tasolla eritetyn BMI1 proteiinin ehdollisen median eri solujen, kuten arvioitiin ELISA-määrityksellä. Equal lastaus proteiinin varmistettiin reprobing immunopilkkujen varten β-aktiini. Jokainen bar histogrammissa edustaa keskiarvo ± SE 3 riippumattomasta kokeesta * edustaa P 0,05. (Gi) Kuva edustaa tasoa BMI1 proteiinin androgeenien (R1881) käsiteltyjen ja käsittelemättömien CaP soluja arvioitiin immunoblot-analyysillä. Equal lastaus proteiinin varmistettiin reprobing immunoblot varten β-aktiini. (GII) Histogrammi esittää densitometrisesti analyysi immunobloteista BMI1. *, P 0,05; musta palkki harmaalla ruutuun mediaaniarvot.

BMI1 ilmentymistä soluissa, jotka edustavat CaP valkoihoisilla ja Afrikkalainen Amerikan miehillä on riippumaton vaikutuksesta androgeenireseptorin

väliset erot kilpailuihin androgeenikonsentraatiot ja herkkyys pidetään tärkeitä tekijöitä rotuun erot Cap [20]. Kuitenkin androgeenien pitoisuudet eivät aina korreloi PSA syöpäpotilailla ja toisinaan harhaan tuloksista [21]. Seuraavaksi me kysyi BMI1 määrää ihmisille Cap tauti on korrelaatio läsnäolon tai puuttumisen androgen. Tätä varten valitsimme VCAP (edustaa androgeeni-riippumaton CRPC fenotyypin valkoihoinen väestö), E006 (edustaa androgeeniriippuvaisen ei-tuumorigeenisiä eturauhasen epiteelisolujen Afrikkalainen Amerikan väestöstä) ja PCa-2b (androgeeni reagointikykyä CRPC soluja Afrikkalainen Amerikan väestöstä ). Androgeenien hoitoon (R1881, 1 nM) Vcap, E006, ja PCa-2b-solut eivät aiheuta merkittävää muutosta tasot BMI1 proteiinin (Fig. 3Gi-ii, p 0,05), mikä viittaa siihen, että BMI1 ilmentyminen on riippumaton androgeenin tila . Tämä tieto on merkittävä, koska aggressiivinen CaP sekä Kaukasian ja Afrikkalainen Amerikan on usein androgeeniriippumattomaksi [6], [19].

Detection of BMI1 proteiinin veressä ihmisen CaP potilaiden

Koska BMI1 proteiini havaittiin erittyvän ihmisen eturauhasen epiteelisoluissa in vitro. Me seuraavaksi kysytään BMI1 voitu havaita seerumissa CaP potilaista. Käyttämällä Slot-blot analyysiä, määritimme tasot BMI1 proteiinin albumiini-vapaa selvitetty seerumit, ihmisen verestä (satunnaisesti valittu normaalista ja korkki potilasta). Kuten käy ilmi kuvion. 4A, BMI1 proteiini havaittiin seerumissa CaP potilailla.

(A) Kuva esittää havaitsemiseen BMI1 ihmisen seerumissa arvioitiin slot blot -analyysit. Täplää data kuvassa edustavat kolme näytettä. (B) Plot BMI1 (ng /ml, log-2) versus yhtiöiden ryhmässä rank (n = 58). Vaakasuora viiva on ryhmä keskiarvo. (C) Tontti PSA (ng /ml, log-2) versus yhtiöiden ryhmässä rank (n = 58). Vaakasuora viiva on ryhmä keskiarvo. Kukin ryhmä (Fig. F G) edustettuina 1 = normaali, 2 = vaihe II, 3 = vaiheen III, ja 4 = Vaihe IV korkki. (D) Kuva esittää korrelaatio seerumin-PSA (ng /ml, log-2) ja seerumin-BMI1 (ng /ml, log-2) (Spearman r = 0,58, p 0,001) 58 miehillä. Linja on yksinkertainen lineaarinen regressio.

Serum-BMI1 proteiinin tasot nousevat progressiivisesti korkki kehityksen ihmispotilaille

Seuraava kysytään seerumin-BMI1 proteiinin tasot vastaavat translaation merkitystä mahdollisena biomarkkeri lavastus ja kehittämiseen CaP sairauden ihmisille. Tätä tarkoitusta varten selvitettiin, jos seerumin-BMI1 proteiinin tasot osoittavat merkittävää eroa suhteessa eri vaiheissa CaP. Määritimme seerumin-BMI1 tasot kohortin 58 koehenkilöiden tyypillisesti normaaliin taudista vapaan kunnossa, ja maatalouspolitiikan eri vaiheissa, eli., Normaali (n = 10), vaihe II korkki (n = 16), vaihe III korkki (n = 15 ), ja vaiheen IV korkki (n = 17). Keskimääräinen seerumin BMI1 proteiinin tasot normaaleissa ihmisen (n = 10) arvioitiin olevan noin 1,72 ± 0,30 ng /ml seerumia (taulukko 1). Seerumin BMI1 taso kullekin potilaalle annetaan taulukossa 2. Seerumin BMI1 tasot olivat pienemmät normaaleissa koehenkilöillä kuin korkki potilailla. BMI1 proteiini tasot ihmisen CaP potilailla oli 3,91 ± 0,60 ng /ml vaiheessa II korkki, 8,55 ± 1,95 ng /ml vaiheessa III korkki ja 10,84 ± 2,44 ng /ml IV vaiheessa kansi (taulukko 1). Nämä tulokset osoittivat, että seerumin keskimääräiset-BMI1 proteiinin tasot olivat progressiivisesti kasvoivat, vaiheessa CaP sairauden ihmisille (r = 0,72, p 0,001, Fig. 4B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että seerumin-BMI1 proteiinin tasot hallussaan translaation mahdollisuudet kehittää uutena seerumi-biomarkkeri CaP tauti kuitenkin lisätutkimuksia suuressa kohortin potilaista ovat perusteltuja.

Serum -BMI1protein tasot korreloivat seerumin PSA-arvot

Seuraavaksi tutkimme, jos nostettaisiin BMI1 aikana CaP kehitys on korrelaatio PSA-tasot näillä potilailla (n = 58). Tässä kohortin CaP potilaiden yhdistys PSA etenemisen CaP havaittiin myös (r = 0,57, p 0,001, Fig. 4C). Seerumin PSA taso kullekin potilaalle annetaan taulukossa 2. BMI1 vähäisessä korreloi PSA (r = 0,58, p 0,001, Fig. 4D). BMI1 pysyi merkitsevästi (p 0,001) säädettäessä varten PSA regressiomallia ennustamiseen syöpä vaiheessa ryhmä.

Keskustelu

ennustetekijöiden biomarkkereiden antaa näyttöä siitä potilaan mahdollisista tuloksista sairaudesta riippumaton annettu hoito, kun taas ennustettu biomarkkereiden arvioi todennäköisyyden vaste /hyöty tietylle hoito tietyssä tilanteessa [22].