Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Erityisiä geenit metyloitiin korkealla taajuudella peräsuolen neoplasia, ja saattaa vuotaa verta. Havaitseminen useita metyloitua DNA biomarkkereita veressä voi parantaa määrityksen herkkyyttä ja peräsuolen syöpä (CRC) suhteessa yhden merkki. Suoritimme tapauskontrollitutkimuksessa arvioidaan läsnä kaksi metylaation DNA-markkereita,

BCAT1

ja

IKZF1

, liikkeessä onko ne täydentävät toisiaan havaitsemiseen CRC.

menetelmät

Metylaatiospesifinen PCR-määrityksissä kehitettiin mittaamaan tasoa metyloitua

BCAT1

ja

IKZF1

DNA uutettu plasmasta saatu kolonoskopia-vahvisti 144 tervettä verrokkia ja 74 CRC tapauksissa.

tulokset

DNA saannot vaihtelivat 2-730 ng /ml plasmaa (keskiarvo 18.6ng /ml; 95% CI 11-26 ng /ml) ja ei korreloinut sukupuolen, iän tai CRC tila. Metyloitu

BCAT1

ja

IKZF1

DNA havaittiin vastaavasti 48 (65%) ja 50 (68%) 74 syöpiä. Sitä vastoin vain 5 (4%) ja 7 (5%) kontrollit olivat positiivisia

BCAT1

ja

IKZF1

DNA: n metylaatio, vastaavasti. Kahden geenin luokittelija malli ( ”joko tai” sääntö) parannettu erottelu CRC kontrolleista 57 74 syöpiä (77%) verrattuna ainoastaan ​​11 144 (7,6%) valvonta on positiivisia

BCAT1

ja /tai

IKZF1

DNA: n metylaatio. Lisääntyvää metyloitua DNA: ta havaittiin CRC vaiheessa edetessä.

Johtopäätökset

Detection of metyloitu

BCAT1

ja /tai

IKZF1

DNA plasmassa saattaa olla kliininen sovellus uutena verikoe CRC. Yhdistämällä tulokset kahdesta metylaatiospesifinen PCR-määrityksissä parannetaan CRC havaitseminen juuri lainkaan spesifisyys. Edelleen validointi tämän kahden geenin verikoe, jotta sovellus seulonnassa on nyt osoitettu.

Citation: Pedersen SK, Baker RT, McEvoy A, Murray DH, Thomas M, Molloy PL, et al. (2015) Kaksinkäsinhallintalaitteet Gene verikoe Metyloidut DNA Sensitive peräsuolen syövän. PLoS ONE 10 (4): e0125041. doi: 10,1371 /journal.pone.0125041

Academic Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, lääketieteellisen tiedekunnan, CHILE

vastaanotettu 13 marraskuuta 2014; Hyväksytty: 08 maaliskuu 2015; Julkaistu: 30 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Pedersen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ oli osarahoittama Clinical Genomics Pty Ltd, ja Kansainyhteisön tieteellisen ja teollisen tutkimuksen Organization (CSIRO). LCL, SKP, RTB, AM, DHM ja MT työskentelee Clinical Genomics Pty Ltd: PLM, SM ja TL työskentelee CSIRO. GPY on maksettu konsultti of Clinical Genomics Pty. Ltd. rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Seuraavat Kirjoittajat julistaa potentiaali kilpailevia intressejä, että he työskentelevät, tai vastaanotettu konsulttipalkkiot päässä, Clinical Genomics Technologies Pty. Ltd .: LCL, SKP, RTB, AM, DHM, MT, ja GPY. LCL, RTB, SKP, PLM, SM, TL ovat keksijät yhden tai useamman patenttihakemuksia, jotka kattavat metylaatio DNA biomarkkereita kuvattu tässä asiakirjassa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on merkittävä kansanterveydellinen haaste ja seulonta on tärkeä työkalu syöpä ohjaus maissa, joissa on merkittävä CRC taakka. Osallistuvien määrä on kuitenkin seulonta perustuu invasiivisen kolonoskopia tai ulosteen näytteenotto ovat alhaiset [1]. Tuore tutkimus seulonta-ikä aiheita tukee todennäköisesti hyväksyttävyyden verikoe CRC 78% osallistujista mieluummin verikoe ulosteesta testi [2].

Viimeaikaiset parannukset molekyylitekniikoiden ovat osoittaneet, että kasvain- nukleiinihapot veressä voidaan havaita vankka ja toistettavalla tavalla [3]. Erityisesti on kertynyt kirjallisuutta dokumentointi verenkierrossa kasvainspesifisiä mutatoituja ja /tai denaturoitua DNA: n ja RNA: n [4-8].

Olemme aiemmin kuvattu löytö ja validointi uudenlaisia ​​hypermetyloitunut tunnusomaisen geenin peräsuolen kasvainkudoksessa [9]. Metylaatiospesifisen määritykset on suunniteltu havaitsemaan nämä hypermetyloitunut geenit oli minimaaliset signaalin DNA: ta, yhdistettiin verestä terveiden luovuttajien osajoukon merkkien [9]. Joka perustuu niiden pitoisuudet mahdollisten tausta valitsimme kaksi geeniä, haaraketjuaminohapot transaminaasin 1,

BCAT1

, ja Ikaros perheen sinkkisormen proteiini 1,

IKZF1

[9,10], kuten lyijy ehdokkaita arvioinnin perustana verikoe CRC.

raportoivat arvioinnin kaksi metylaatiospesifistä PCR-määrityksissä havaitsemiseen metyloitu

BCAT1

ja

IKZF1

DNA uutetaan plasmanäytteistä 218 kolonoskopia tarkasteltava yksilöitä (144 tervettä verrokkia ja 74 CRC tapausta), voiko Metylointilaitteistoon biomarkkereita täydentävät toisiaan havaitsemiseen CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Kotelot ja tarkastukset

Verta saatiin vapaaehtoistyön ja ilmoittivat aiheista suunniteltu kolonoskopia Flinders Medical Centre (FMC) tai kotiuttaminen General Hospital (Adelaide, SA, Australia) joka kirjallisen suostumuksensa yhdenmukaiset kanssa tutkimussuunnitelman tarkistaa ja hyväksyy tutkimus- ja eettinen komitea paluumuutosta General Hospital ja eettisen komitean Flinders Medical Centre. Veri kerättiin phlebotomy jälkeen suoliston valmistuksessa, mutta ennen kolonoskopia. Kliininen diagnoosi määritettiin perusteella colonoscopic havaintojen ja histologisia arviointi. Syövät oli lavastettu mukaan AJCC Cancer pysähdyspaikan 7

painos. Muita plasma näytteet kolonoskopia tarkastellaan koehenkilöille peräisin Proteogenex Inc. CA, USA (PGX), jotka kerättiin verta vapaaehtoisilla 3-10 päivää sen jälkeen, kun heidän valmistelevan kolonoskopia. Näytteet valittiin analysoitavaksi takautuvasti kolonoskopia-pohjainen diagnoosi. Syöpätapausta (FMC: n = 25, PGX: n = 49) valittiin perustuen määrään saatavuudesta, kun taas valvonta (FMC: n = 85, PGX: n = 84) valittiin perustuen ei ulkonäköön hyperplastic ja adenomatoottisten polyypit (mutta sallii lieviä sairauksia kuten peräpukamia ja divertikuliitti), jossa yritetään sukupuolen ikä ottelun CRC tapauksissa testattaviksi.

plasma valmistelu

plasman komponenttia kokoverestä kerätty K

3EDTA Vacuette putket (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Saksa) eristettiin sentrifugoimalla 1,500g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa (jarrut pois käytöstä sentrifugi). Yläkerroksen plasma fraktio talteen ja sentrifugointi toistettiin. Saatu ”kaksi-spin” plasma säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka. Kokonaisaika verestä vedon jäädyttämisen plasmasta enintään neljä tuntia ollenkaan rekrytointisivustoja.

prosessinhallinnan

plasmapoolista sukupuoli- ja ikä-haun luovuttajien alle 30-vuotiaita on kaupallisesti hankittu (Bioreclamation, NY, USA) ja käytettiin siisti negatiivisena kontrollina tai johon on lisätty sonikoitiin täysin metyloitu ihmisen genomista DNA: ta (Millipore, MA, USA), 1250pg /ml, positiivisena kontrollina. Nämä Prosessinohjaus- tehtiin kuin 2 litran erissä ja sen jälkeen varastoidaan 4 ml erinä -80 ° C: ssa, kunnes sitä tarvitaan.

Tutkimusasetelma

Plasma näytteet jaettiin satunnaisesti käsitellään erissä 24 näytettä, joista yksi positiivinen prosessinohjaus, yhden negatiivisen prosessin ohjaus ja 22 kliinisissä näytteissä (fenotyyppien sokkoutettu määritystä operaattorit).

eristäminen ja bisulfiitin muuntaminen cell-free kiertävä DNA

Cell-free kiertävän DNA (cfDNA) uutettiin 4 ml plasmaa käyttämällä QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Saksa). Uutto puoliautomaattinen kahteen QIACube nestemäistä käsittelijät (12 näytettä per instrumentti per run) suosittelemia valmistajan (Qiagen). Eluutiotilavuus oli asetettu 40 ui ja eluaatti uudelleen manuaalisesti soveltaa silikageelipylväässä parantaa cfDNA saannolla. EpiTect Fast bisulfiittikonversion (Qiagen) käytettiin rajana muuntaa yksittäisiä cfDNA. Bisulfiittimenetelmällä muunnetaan DNA puhdistettiin QIACube instrumentoinnin avulla EpiTect Plus bisulfiittimodifiointi (Qiagen), jossa kaksi muutosta: 1) sarakkeet QIAamp Kiertävä Nucleic Acid Kit käytettiin sijasta sarakkeisiin annetaan Epitect Plus bisulfiittimodifiointi kit; 2) Epitect Plus Binding puskuri valmistettiin isopropanolilla sijasta etanolia. Eluutiotilavuus oli asetettu 40 ui ja eluaatti uudelleen manuaalisesti soveltaa silikageelipylväässä parantaa cfDNA saannolla. Kaikkiaan 36μL bisulfiitin muuntaa cfDNA otettiin talteen kustakin 4 ml plasmaa näytteestä. Onnistunut talteenotto bisulfiitin muunnetaan cfDNA vahvistettiin kahtena tuloon 5 ui 1: 5 laimennettua bisulfiittimassasta muunnetaan DNA käyttämällä ACTB PCR aikaisemmin kuvatulla [11] vähäisin muutoksin (katso S1 taulukko). Kukin PCR run sisälsi kolme no-mallia kontrollinäytteitä ja standardikäyrä perustuu 4-kertainen sarjalaimennokselle 5 ng bisulfiitin-muunnettu ihmisen DNA eristetään valkosolujen (WBC; Roche Applied Science, Basel, Sveitsi), joka valmistettiin taustalla nukleaasitonta vettä (Promega, WI, USA). Massa talteen bisulfiitin muunnetaan cfDNA kunkin jalostettujen näytteen arvioitiin standardikäyrältä käyttämällä lineaarista regressio sopii Cycle kynnys (Ct) arvot (katso S1 kuvio).

Detection of metyloitu

BCAT1

ja

IKZF1

DNA

Ulkonäkö metyloitu

BCAT1

ja

IKZF1

DNA liikkeessä mitattiin kolmena kappaleena tuloon 5 ui puhdistettua bisulfiitin muunnetaan DNA (esim vastaava ja 0,5 ml plasmaa per PCR) käyttäen bisulfiitti conversion- ja metylaatiospesifisen kuten on aikaisemmin kuvattu [9] vähäisin muutoksin (katso S1 taulukko). Lyhyesti, kaksi reaaliaikaista PCR-määrityksissä suunnattu metyloitu CpG sivustoja alueilla ulottuu 102- tai 95- nukleotidin joko tai juuri ennen ensimmäistä eksonia

BCAT1

ja

IKZF1

geenit, vastaavasti (katso S2 kuvio). DNA kohteen monistus suoritettiin 50 sykliä käytettäessä LC480 LightCycler, malli II (Roche). Ct-arvot laskettiin käyttäen 2

nd johdannainen algoritmi mukana LC480 ohjelmiston.

BCAT1

PCR (hydrolyysikoetin) ja

IKZF1

PCR (SYBR vihreä /sula) olivat laadullisesti nimeltään ”positiivisiin”

BCAT1

metylaatio jos yhteensä muutos fluoresenssin intensiteetin yllä taustatasoja mitattiin 50 PCR-monistamisen syklit. Edelleen, sillä

IKZF1

positiivinen tehtävissä, smältprofil analyysi komponentti

IKZF1

PCR-määritys oli antaa sulamislämpötila on yli 80 ° C (katso S1 taulukko). PCR-määrityksissä ilman signaalia jaettiin mielivaltainen Ct-arvo 50 painotuotteisiin. Kukin PCR run sisälsi kolme no-mallia vertailunäytteet, kolme 5 ng bis-muunnettu WBC DNA (Roche) negatiivinen kontrolli näytteitä, ja standardikäyrä perustuu 4-kertainen sarjalaimennokselle 5 ng bisulfiitin-muunnetaan täysin metyloitu ihmisen genomista DNA: ta (Millipore) valmistettu on taustalla bisulfiitin-muunnetaan WBC DNA (Roche) (katso S2 kuvio). Jokainen standardi piste pitoisuus oli kaikkiaan 5 ng DNA. Metylointi erityisiä määritykset olivat määrällisiä iältään 20 pg (0,4%) ja 5 ng (100%) metyloitua kohde-DNA taustalla WBC DNA (R

2 square arvot:

BCAT1

, 0,9370;

IKZF1

, 0,9387, S2 kuvassa), mutta pystyy havaitsemaan alas 5PG (vastaa 1-2 genomista kopiota) ja metyloituja

BCAT1

ja

IKZF1

DNA. Massa metyloitu

BCAT1

ja

IZKF1

DNA kunkin jalostettujen näytteen arvioitiin standardikäyrältä käyttämällä lineaarista regressio sopii Ct-arvoja. Massa metyloitu

BCAT1

tai

IKZF1

DNA ilmaistiin keskimääräinen massa (pikogramma; s) ja metyloituja

BCAT1

tai

IKZF1

DNA kohti kolmena kappaleena PCR tai millilitrassa plasmaa (ks S2 taulukko).

Näytteet tulosten tulkinnan

Recovery bisulfiitin muunnetun DNA vahvistettiin, jos vähintään yksi toisinto oli positiivinen

ACTB

qPCR määritys. Loput bisulfiitti muunnetun DNA analysoitiin sen jälkeen kun kolmena tulot 5 ui joko

BCAT1

tai

IKZF1

qPCR määrityksissä. Seuraavat tiedot kerättiin kustakin käsitellystä näytteestä: kaksi

ACTB

qPCR Ct mittauksia, massa bisulfiitin muunnetun DNA, kolme

BCAT1

qPCR Ct mittauksia, kolme metyloiduksi

BCAT1

massa mittaukset, kolme

IKZF1

qPCR Ct mittauksia ja kolme metyloitu

IKZF1

mittaukset (S2 taulukko). Kaikki PCR-monistaminen käyrät silmämääräisesti. Ennen paljastamaan näyte fenotyyppejä, yksilö on laadullisesti määriteltiin kliinisesti positiivisia CRC raportointia varten, jos jokin kolmena kappaleena

BCAT1

tai

IKZF1

PCR-määrityksissä olivat positiivisia.

tilastollinen analyysi

tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen GraphPad Prism v5.0d Mac OS X (GraphPad Software, San Diego, CA). Sillä tiheys kuvaajia määriä metyloitu

BCAT1

tai

IKZF1

DNA, näytteiden ”ei signaalia” tuloksia jätettiin pois. Kukin kolmena kappaleena määritykset sisälsivät eristetty DNA, joka vastaa 0,5 ml plasmaa. Empiirinen tiheys ln (metyloitu

BCAT1

, s) tai ln (metyloitu

IKZF1

, s

) B arvioitiin erikseen terve valvontaa, varhaisen vaiheen (vaihe I + II) ja myöhäisessä vaiheessa (vaihe III + IV) syöpä. Olettaen Gaussin jakauman metylaation massa-arvoja (s), että suurin entropia (pahimmassa tapauksessa) kanssa havaitun keskimääräisen ja varianssi, tiheydet olivat jälleen arvioitiin. Käyttämällä näitä tiheyksiä, laskimme kertymäfunktio (F (x) = P (X≤x)) ja raportoivat 1-F (x) ln (s) metyloitua

BCAT1

ja

IKZF1

arvot 3, 3.9 ja 4.6. Raportoimme myös todennäköisyys suhde suhteessa terveisiin kontrolleihin.

Tulokset

eristäminen soluttoman DNA plasmasta näytteet

Kymmenen yksittäisiä eriä suoritettiin käsitellä 218 plasmanäytteet . Process Controls vahvisti ei sekoittavia vaihtelua eräajo (tuloksia ei ole esitetty).

ACTB

qPCR määritys vahvistettiin menestyksekäs perintä bisulfiitin muunnettu DNA kaikista 218 käsitellään plasma näytteitä (katso S3 kuvio ja S2 taulukko) ja mediaani DNA pitoisuudet suhteessa fenotyyppiin ja kliinisten tilojen keräys on koottu taulukkoon 1. suurin osa talteen DNA saannot olivat alueella kaksiosaisella pitoisuusalueella (95% CI-alue: 11.2-26.2ng /ml). Huomattavasti pienempi sadot bisulfiitin muunnetun DNA otettiin talteen kerätyt näytteet FMC verrattuna keskisadot toipunut näytteet kerättiin PGX (mediaani pitoisuudet: FMC: 7.0 ng /ml, PGX: 17.8ng /ml, t-testi, p-arvo 0,0001, katso S3 kuvassa). Inter-site-protokollan eroja on raportoitu aiheuttavan vahvin vaihtelua mitattuna verenkierrossa DNA pitoisuudet [12]. Olemme seurattava huolellisesti keruuta ja käsittelyä menettelyt, joilla varmistetaan yhteisiä sopimuksia. Ainoa järjestelmällinen vaihtelu, joka saattaa selittää nämä keskenään ristiriitaiset DNA sadot oli eri ajankohtina, jolloin veri kerättiin suhteessa kolonoskopia. Ei ollut mitään korrelaatiota määrän DNA talteen plasmasta ja kliinisen fenotyypin (katso S3 kuvio) toisin tutkimuksiin, jotka sisälsivät suuremman osuuden myöhäisessä vaiheessa syöpiä [13,14]. Lisäksi ei havaittu korreloivan DNA tuotto, potilaan iän tai sukupuolen (tuloksia ei esitetty).

Detection verenkierrossa metyloitu

BCAT1

ja

IKZF1

DNA

tasot metyloitu

BCAT1

ja

IKZF1

DNA bisulfiittimassasta muunnettu DNA talteen 218 plasmasta näytteet mitattiin kolmena kappaleena analyysin vastaavan plasman tilavuus 0,5 ml plasmaa kohti PCR hyvin. Kuusikymmentä-kahdeksan 218 plasma näytteet olivat positiivisia joko

BCAT1

ja /tai

IKZF1

metylointi (taulukko 1 ja S2 taulukko). Ei havaittu korreloivan määritys positiivisuusasteet ja saanto talteen bisulfiitin muunnetaan cfDNA, potilaan iän (kuvio 1) tai sukupuoleen (katso S4 kuvio). Tilastollisesti merkitsevä korkeampi positiivisuusasteet mitattiin CRC tapauksissa kontrolleihin verrattuna sekä metylaation määrityksissä (kuvio 2, p-arvot 0,0001).

BCAT1

metylaatiomääritystä oli positiivinen 53 218 analysoidaan näytteitä joista 48 (65%) syövistä ja 5 (4%) valvontaa.

IKZF1

määritys oli hieman korkeampi positiivisuus rate 57 positiivisissa näytteissä mukaan lukien 50 (68%) CRC tapauksissa ja 7 (5%) valvontaa. Lisääntyvä positiivisuusasteet havaittiin CRC vaiheessa sekä markkereita, kuten on esitetty taulukossa 1. Vaurion paikoissa tunnettiin 70 74 syöpätapauksista (S2 taulukko). Ei ollut eroa positiivisuusasteet mitattiin proksimaalisesta versus distaalisen syöpiä (proksimaalisten, n = 21, 16 positiivisia (76%), distaalinen, n = 49, 38 positiivisia (78%), t-testi p-arvo: 0,9029).

korrelaatiopisteet keskimääräisten Ct signaaleja mitataan

BCAT1

(mustat kolmiot) ja

IKZF1

(valkoiset kolmiot) metylointi määritykset vastaan ​​(A) massa talteen bisulfiitin muunnetaan DNA per ml plasmaa tai (B) ikä aiheista aikaan veren piirtää. Pitoisuus jäljittelee kanssa ”ei signaalia” jaettiin mielivaltaisesti Ct arvo ’50’ varten kuvaus tarkoituksiin.

BCAT1

(yläpaneeli, mustat kolmiot) ja

IKZF1

(alapaneeli, valkoinen kolmio) metylaatiospesifisen määrityksiä arviointiin käytettiin ulkonäkö verenkierrossa metyloitu

BCAT1

ja

IKZF1

DNA 218 plasman yksilöiden lukien 144 tervettä verrokkia ja 74 syöpiä. Mann-Whitney-t-testit suoritettiin laskettu positiivisuusasteet kunkin fenotyyppinen luokan johtaa P-arvoja. Laskettu 95%: n luottamusväli (95% CI) on esitetty.

metylointi biomarkkerit täydentävät

Kuusikymmentä kahdeksan näytteet olivat positiivisia ainakin toinen metylaation määrityksiä, joista vain 42 oli positiivisia molemmilla metylaation markkereita (41 CRC tapausta ja 1 valvonta). Kuvio 3A osoittaa, että yhdistetty kvalitatiivinen tulos, joka perustuu vähintään yksi positiivinen jäljitellä joko

BCAT1

tai

IKZF1

metylaatiomääritystä tuotti korkeimman luokituksen tarkkuus (0,8469, 95% CI: 0,7848-,9091 ) verrattuna joko markkereita yksinään (

BCAT1

, 0,8070, 95% CI 0,7368-0,8771,

IKZF1

, 0,8135, 95% CI: 0,7448-0,8822). 2-geeni luokittelija malli ( ”joko tai” sääntö) oli arviolta herkkyys CRC 77% (95% CI: 65,8-86,0), jonka spesifisyys 92,4% (95% CI: 86,7-96,4; kuvio 3), mikä parantaa syövän havaitsemiseen korko yli 10%, vähemmän kuin 4%: n lasku spesifisyys. Yhdistetty kahden geenin määritys positiivisuutta CRC vaiheiden I-IV oli 50%, 68%, 87% ja 100% (taulukko 1).

herkkyys, spesifisyys ja erottelutarkkuutta arvot

BCAT1

,

IKZF1

ja yhdistetty kahden geenin määritykset laskettiin oikean ja väärän positiivisuusasteet mitattuna 144 terveillä verrokeilla ja 74 syöpätapausta (A) ja sen jälkeen piirretty Receiver Operator Characteristic (ROC) välilyönti tontit (B). Single-geeni määritykset: plasmaksi yksilö on laadullisesti sanottu positiivinen ”, jos vähintään yksi PCR rinnakkaisnäytteessä johti Ct signaali. Kahden geenin määritys: yksilö on laadullisesti sanottu positiivinen ”, jos vähintään yksi kaksoiskokeina joko

BCAT1

tai

IKZF1

määrityksissä tuotti Ct-arvo.

tasot metyloitu

BCAT1

tai

IKZF1

DNA vs. sairauden vaikeusasteen

Hyvä korrelaatio havaittiin syklin kynnyksen (Ct) arvot mitataan näytteistä positiivisia sekä

BCAT1

ja

IKZF1

DNA: n metylaatio (korrelaatio yhteistyössä tehokkuutta R

2 = 0,9053, kuvio 4A). Kukin kolmena kappaleena määritykset sisälsivät eristetty DNA, joka vastaa 0,5 ml plasmaa. Keskimääräinen massat metyloitu

BCAT1

tai

IKZF1

DNA mitattiin CRC vaiheissa II, III ja IV olivat merkittävästi suuremmat kuin keskimääräinen massa metylaation mitattuna rajoitettu määrä tarkastuksia, jotka olivat positiivisia (kuvio 4B ja 4C). Suhde mitatut verenkierrossa metyloitu

BCAT1

tai

IKZF1

DNA plasmassa ja syövän vaiheessa mallinnettiin arvioida todennäköisyyttä syövän, annetaan metyloitu

BCAT1

tai

IKZF1

DNA massa arvio kohti kolmena kappaleena määritystä. Tiheys tontteja arvioitiin (kuvio 5A ja 5B, katkoviivat) käyttäen vain positiivisia metylaatio massat plasmasta tunnettujen fenotyyppejä luokiteltu terveillä verrokeilla, varhaisessa vaiheessa syöpä (vaihe I + II) ja myöhäisessä vaiheessa syöpä (vaihe III + IV). Mallinnettu tiheys koealojen, olettaen, että havaitut metylaatiotasoilla vedettiin normaalijakaumasta (kuvio 5A ja 5B, kiinteät viivat), jossa käytetään arvioitaessa kumulatiivinen todennäköisyys (kuvio 5C), että plasma näytteen tunnetusta luokituksesta antaisi havaittu syöpää johdettu DNA: n metylaatio taso on yhtä suuri tai suurempi kuin se, joka vastaa 20-, 50- tai 100 pg. Olemme todenneet, että alle 8% positiivisen kontrollin plasman yksilöitä on todettu sisältävän vähintään 20 ug metyloitu

BCAT1

tai

IKZF1

DNA, kun taas 63-77% varhaisen vaiheen syöpiä oli 20 s tai enemmän. Siten todennäköisyys plasma näytteen kanssa ≥ 20 pg metyloitu

BCAT1

tai

IKZF1

DNA olla varhaisessa vaiheessa syöpä on noin 9: 1 ja 210: 1, vastaavasti (alkuvaiheessa CRC: kontrolli). Edelleen, plasma näyte 100 ug metyloitu

IKZF1

DNA on noin 2,5 kertaa todennäköisemmin oltava peräisin rekisteröidylle myöhään CRC (vaihe III tai IV) kuin aihe varhaisvaihetta CRC (vaihe I tai II).

(A) Korrelaatio juoni keskimääräisten Ct-arvojen (log (Ct)) mitattuna

BCAT1

tai

IKZF1

määritykset 144 terveiden verrokkien (musta ympyrät) ja 74 CRC (valkoiset ympyrät). PCR jäljittelee ilman signaalia jaettiin mielivaltainen Ct-arvo 50 kuvaus tarkoituksiin. Square neljännesten (a) (d) edustaa: (a) 15

BCAT1

negatiivisia, mutta

IKZF1

positiivisia tapauksia; (B) 42

BCAT1

ja

IKZF1

positiivisia tapauksia lukien 41 syövän ja 1 valvonta; (C) 11

BCAT1

positiivinen mutta

IKZF1

negatiivisia tapauksia; (D) 150

BCAT1

ja

IKZF1

negatiivisia tapauksia. Lineaarinen regressioanalyysi suoritettiin 38 41

BCAT1

ja

IKZF1

positiivinen CRC tapauksissa (neljänneksessä b) ilman kolme CRC poikkeavia havaintoja. Broken vinoviivat osoittavat 95% CI alue. Laskettu R neliön arvo näytetään. Massa (ng) metyloituja

BCAT1

(B) ja

IKZF1

(C) DNA laskettiin ja piirrettiin massa metylaation per ml plasmaa peräisin 144 ohjaus tapauksissa 4 Stage I, 28 Stage II, 23 vaiheen III, 8 Vaihe IV (8 CRC tapauksissa tuntematon lavastus jätetty pois). Keskimääräiset ja mediaani massa tasot viidellä fenotyypin luokat esitetään alla kuvaajat. Mann-Whitneyn t-testi suoritettiin mediaaniarvoja, ***: p-arvo 0,05, ns: ei-merkitsevä, verrattuna 144 terveillä verrokeilla tapauksissa.

arvioitu keskimääräinen massa (A)

BCAT1

ja (B)

IKZF1

DNA kussakin kolmena rinnakkaisena testeissä, jotka sisältävät DNA: ta eristettiin vastaa 0,5 ml plasmaa terveiden verrokkien (mustat viivat,

BCAT1

: n = 5,

IKZF1

: n = 2 * ), varhaisessa vaiheessa syöpä (siniset viivat, vaihe I + II,

BCAT1

: n = 19,

IKZF1

: n = 17) ja myöhäisessä vaiheessa syöpä (punaiset viivat, vaiheen III + IV

BCAT1

: n = 22,

IKZF1

: n = 26) käytettiin laskemiseen empiirisen todennäköisyystiheysfunktion tontteja, jättäen pois ”ei signaalia” tuloksia (katkoviivat). Yhtenäiset viivat: Population välineet (μ) ja keskihajonnat (σ) laskettiin olettaen normaalijakaumaa kunkin kolmen fenotyyppisen luokittelun. * Viisi seitsemästä positiivisen

IKZF1

ohjaus tapauksissa oli Ct signaaleja viimeisen 5 sykliä PCR, siis ole massa arviointi. (C) kumulatiivinen todennäköisyys sille, että plasma näytteen

BCAT1

tai

IKZF1

DNA metylaatiotasoilla yhtä suuri tai suurempi kuin 20-, 50- tai 100 pg metyloitua DNA: ta, jotka ovat peräisin potilaasta, jolla ilmoitetun fenotyyppinen luokittelu; massa kynnykset määritettiin alue käyrän alla (yhtenäiset viivat paneeleissa A ja B) ln (s) arvo on suurempi kuin 3, 3,9 ja 4,6, vastaavasti (katso pisteviiva pystysuorat linjat ja nuolet) paneeleissa A ja B Todennäköisyys suhdeluvut suhteessa terveisiin kontrolleihin on esitetty suluissa.

keskustelu

Olemme aiemmin raportoineet kehittää kaksi bisulfiitin muuntaminen ja metylaatiospesifisen PCR-määrityksissä käytetään havaitsemaan peräsuolen neoplastisten erityisiä metylaatio geenilokukset

BCAT1

ja

IKZF1

[9]. Olemme optimoitu

BCAT1

ja

IKZF1

metylaatio qPCR määrityksissä havaitsemiseksi metylaation niinkin alhaiset suhteet kuin 0,1%, sillä tällainen alhainen kasvain- DNA on raportoitu plasman näytteitä potilailta, joilla on alkuvaiheessa CRC [4,15]. Tässä tapauskontrollitutkimuksessa me osoittavat, että metyloitu

BCAT1

ja

IKZF1

DNA havaitaan useammin CRC tapauksissa (65% ja 68%, tässä järjestyksessä) kuin kolonoskopia varmistettujen terveiden verrokkien ( 4% ja 5%, vastaavasti) ja että kaksi metylaatio DNA-markkereita ovat täydentäviä (yhdistetty positiivisuus 77% ja 7,6% vuonna CRC ja terveillä verrokeilla, vastaavasti).

yhteensä 41/74 syöpätapauksista oli positiivisia sekä metyloidut

BCAT1

ja

IKZF1

DNA verrattuna vain 1/144 kontrolli). Yhdistämällä tulokset kahdesta analyysistä johti erotteleva tarkkuus 0,8469, joka oli parempi kuin joko määritys yksinään (

BCAT1

määritys: 0,807,

IKZF1

määritys: 0,8135), kuvio 3. Kun ajatellaan joko-tai kaksi-geenin määritys, lisää CRC tapausta havaittiin, joiden oikea eriytymistä 57/74 (77%) ja vain 11/144 (7,6%) terveisiin verrokkeihin on luokitellut väärin. Nämä kaksi-geeni data erittäin voimakkaita, yksinkertainen todisteita siitä, että useita biomarkkereita voi parantaa herkkyyttä ilman suuria kompromisseja diagnostisten hyödyllisyys alhaisempien spesifisyyden.

Detection of metyloitu

BCAT1

ja

IKZF1

DNA veressä ei riipu iästä tai sukupuolesta aihe, tai määrää talteen bisulfiitin muunnetaan cfDNA. Merkittävä suhde havaittu ainoastaan ​​kliiniseen fenotyyppiin. Sekä esiintymistiheys ja määrä metyloitua

BCAT1

ja /tai

IKZF1

DNA vapautuu vereen lisääntynyt syövän vaiheessa. Jälkimmäinen oli tilastollisesti merkitsevä vaihe II, III ja IV syöpiä, joilla on suurempi metylaation massa havaittujen tasosta mitattuna harvoista positiivisen terveiden verrokkien (kuvio 4). Samanlaisia ​​havaintoja on myös havaittu, että hyvin tutkittu

SEPT9

metylaatiomääritystä [16,17]. Asentamalla malleja syövän luokittelu (valvonta, aikaisin tai myöhään syöpä), näytämme mahdollisuuden käyttää tason metyloitua

BCAT1

ja /tai

IKZF1

DNA veressä arvioida todennäköisyyttä positiivinen tulos johtui syövän läsnäolon (kuvio 5). Yhdessä nämä tulokset tukevat yksinkertainen malli, jossa kyky havaita kudokseen johdettuja DNA-markkereita verenkierrossa on funktio laajuudesta hyökkäystä vaurio [18].

BCAT1

ja

IKZF1

ovat molemmat mukana kasvaimen kasvua ja invasiivisuus [19,20]. Hypermetyloitunut

BCAT1

lokus on osoittanut useiden patologioiden kuten CRC [21,22] ja poikkeava epigeneettiset sääntelyn aiheuttaa suhde siirtymän kolmesta

BCAT1

mRNA-transkriptien erilainen vain ensimmäisessä eksonissa, joka satamat vaihtoehto transloimattomat alueet [20]. Miten BCAT1 isoformit vaikuttavat solujen proliferaatio on tuntematon, mutta se on spekuloitu, että huonosti tuotanto haaraketjuaminohapot voi vaikuttaa synteesi makromolekyylien vaaditaan solunjakautumisen kenties G1-to-S solusyklikontrollin kohta [23].

transkriptiotekijä,

IKZF1

, säätelee lukuisia biologisia tapahtumia ja sen roolia lymfopoieesin ja leukemiasolujen neoplasia on tutkittu laajasti. Verkosto epigenetic ja transkriptiotekijöiden säätelevät

IKZF1

geenin toimintaa [24] ja kehittyvien tiedot merkitsevät sitä, että

IKZF1

on erittäin tärkeää myös asianmukaisen sääntelyn lisääntymisen ja erilaistumisen solujen ei-hematopoieettista alkuperää, kuten paksusuoli- [25]. Kun Nurd monimutkainen kuin tärkein vuorovaikutuksessa kumppanin [26], Ikaros ohjaa transkriptionaalista aktiivisuutta pieni joukko geenejä [23,27], kuten

Notch1

[28]. Notch-signalointireitin on kriittinen monien solu-solu-vuorovaikutuksiin, mukaan lukien muodostuminen invadopodia [29].

SEPT9

on negatiivinen säätelijä valejalka muodostumisen [30], joka on keskeinen tapahtuma, joka käynnistää solun levittäminen ja työntövoiman osaksi ympäristö kudokseen ja strooman (tarkasteli hiljattain [31]). Siten menetys

SEPT9

ilmentyminen voi olla aktiivinen rooli kasvaimen invaasio, jossa etäpesäkekasvainten soluihin huonosti mekanismien siirtyä verisuonistoon [32]. Me spekuloida, onko

IKZF1

on ehkä ylävirran säätelijä

SEPT9

aktiivisuutta.

Notch polku on keskeinen rooli itseuudistuvien prosessi paksusuolen crypt kantasolujen ja tuotantoaan lisääntyvien ja kauttakulku-monistamalla erilaistumaton kantasoluiksi, jotka liikkuvat ylös kryptassa ja osaksi villus jossa ne edelleen, eriyttää [33,34]. Me spekuloida jos menetys

IKZF1

aktiivisuus johtuu hypermetylaation johtaa konstitutiivisesti aktiivista Notch signalointia, joka estää erilaistumisen crypt progenitorisolujen ja johtaa suureen kasvuun eriytymättömissä ohimenevä monistamaan soluja kuten aiemmin on kuvattu [35-37].

lisääntynyt positiivisuus havaittiin kaikilla vaiheen I-IV syöpiä merkitsee sitä, että havaitseminen kasvainperäinen metyloituja DNA-markkereita veressä voi riippua suurelta osin verisuonituksesta peräsuolen kasvainkudoksessa ja lisääntynyt hyökkäys yleensä [18,38]. Jos totta, niin standardoitu herkkyys havaita kasvainperäinen markkereita liikkeessä vaikuttavat osa vaiheen I syöpiä, koska suurin osa I vaiheen syövät ovat todennäköisesti ole mitään imusuonten tai laskimoiden aluksen invaasio [18]. Sinänsä, veren perustuvissa määrityksissä on epätodennäköistä havaita huomattava osa varhaisessa vaiheessa syöpiä, jotka voidaan havaita kolonoskopia. Tämä saattaa selittää alhainen herkkyys havaittiin äskettäin mahdollinen arviointi

SEPT9

in 7900 oireeton osallistujien jossa vain 48% 53 CRC tapauksista (mukaan lukien kaksikymmentäkaksi Stage I syövät) ja 11%: adenoomia havaittiin [17]. Meidän oma aineisto mukana vain neljä vaiheen I syöpiä, ja vaikka kaksi (50%) näistä havaittiin, näyte numerot ovat nykyisellään liian alhainen päätellä onko metyloitua

BCAT1 Twitter /

IKZF1

testi antaa hyvän havaitsemisen vaiheen I syöpiä. Sisällyttäminen verisuoniston liittyvät muuttujat (verisuonten invaasio, verisuonten selviytymisen kyky ja tuumoriangiogeneesissa) näyttää parantavan kerrostumista syöpäpotilaiden [39].