Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että geneettinen poisto

Muc2

geeni aiheuttaa peräsuolen syöpiä hiirillä. Nykyinen tutkimus osoitti lisäksi, että varhaisessa vaiheessa ( 3 kk)

Muc2

hiirten spontaanisti kroonisen tulehduksen paksusuolen ja peräsuolen, samanlaisia ​​patologisia piirteitä kuin ihmisen paksusuolen tulehdus; ja klo myöhäisessä vaiheessa ( 3 kk) hiiret osoittivat peräsuolen syöpä, mukaan lukien ainutlaatuinen fenotyyppiä peräsuolen prolapsed (peräsuolen vakava tulehdus ja adenokarsinooma). Siten 3 kuukauden iästä voisi olla keskeinen pisteen siirtyminen kroonisen tulehduksen syöpään. Voit selvittää mekanismeja pahanlaatuisen muutoksen, teimme miRNA sijaintipaikat paksusuolen epiteelisolut 3 kk

Muc2

– /- ja

+ /+ hiirillä. MicroRNA profilointi osoitti ero ilmentymistä miRNA (eli pienempi tai suurempi ilmaus rikastusta) in

Muc2

– /- hiirissä. 15 heistä todensi kvantitatiivinen PCR. Perustuen merkitystä sytokiinien ja syövän, 4 miRNA (miR-138, miR-145, miR-146a, ja miR-150) olivat validate ja todettiin merkittävästi vaimentua ihmisen paksusuolen tulehdus ja peräsuolen syövän kudoksissa. Verkko tavoitteista näiden miRNA leimasi ja interestedly miRNA liittyvät sytokiinien lisättiin merkittävästi

Muc2

– /- hiirissä. Tämä on ensimmäinen paljastaa, että on tärkeää poikkeavasta ilmentymisen miRNA dynaamisesti muutos kroonisesta koliitti ja koliitti-liittyvän syöpään. Nämä havainnot valottavat paljastamaan mekanismeja kroonisen koliitin pahanlaatuisen muutoksen.

Citation: Bao Y, Guo Y, Li Z, Fang W, Yang Y, Li X, et al. (2014) MicroRNA Profilointi in

Muc2

Knockout Hiiret of Colitis-Associated Cancer malli paljastaa Epigeneettiset muutostyöt aikana Krooninen Colitis pahanlaatuisiksi. PLoS ONE 9 (6): e99132. doi: 10,1371 /journal.pone.0099132

Editor: Sergei Grivennikov, Fox Chase Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 helmikuu 2014; Hyväksytty: 11. toukokuuta 2014; Julkaistu: 18 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Bao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustusta National Natural Science Foundation of China (avustus # 91229115 ja 81272251), avustusta Innovatiiviset Team of Science and Technology Department of Education, Henan maakunnassa Kiinassa, ja tohtori Research Fund (# 100820 ja 505011) ja Startup Fund Xinxiang Medical University, Kiina. Teos myös tukee osittain National College Student Innovative Projects of China (# 201310472005 XL, 201310472012 ja BX, ja 201310472016 että ZL). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmas yleinen pahanlaatuinen sairaus ja toinen johtavista syistä syövän liittyvät kuolemat [1]. Samanlaisia ​​kuin muiden pahanlaatuisten kasvainten geneettiset tekijät paljon CRC muodostumiseen, mutta vain noin 20% CRC tapauksista voidaan geneettisesti johtuvan tuttuja historia [2] – [4]. Itse asiassa suurin osa satunnaista CRC ovat vahvasti sidoksissa ympäristötekijöihin, jolla useimmiten mutaatioita adenomatoottisen polypoosin coli (APC) tuumorisuppressorigeeniä lukemiin tuhoutumiseen APC /GSK3p /ak- siini monimutkainen ja aktivointi Wnt /β-kateniinin reitin [ ,,,0],2], [5], [6] Poikkeava aktivaation Wnt /β-kateniinin reitti ei ainoastaan ​​edistää proliferaatiota suolen epiteelisolujen, vaan myös indusoi pidätyksestä, kun ne liikkuvat kohti loppua crypt ja estää leviämistä tai apoptoosin transformoituneiden solujen. Kanoninen ”geneettinen polku peräsuolen syöpä” on ollut hyvin tutkimuksia. Syntymässä mekanismit peräsuolen syövän muodostumisen ympäristötekijöistä liittyvät krooniseen tulehdukseen, nimeltään koliitti liittyvä peräsuolen syöpä (CAC) [7] – [10] On muuttunut ruokavalion ja elämäntapa Kiinassa, CRC ilmaantuvuus kasvaa nopeasti kuin muita syöpiä viime vuosina [11], ja melko määrä CRC tapauksista liittyy krooninen tulehduksellinen suolistosairaus (IBD). On hyväksyttävää, että CAC edeltää kliinisesti havaittavaa IBD [8], [12], kuten Crohnin tauti (CD) tai haavainen paksusuolen tulehdus (UC). Epidemiologiaa ja kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että UC lisää CAC riskiä jopa 18-20%, kun taas CD jopa 8% 30 vuoden aktiivisen taudin [13] – [15]. Hiiren malleissa, yksi pistos karsinogeeni azoxymethane (AOM) johtaa useiden koolonikasvainten, vain kun siihen liittyy krooninen koliitti aiheuttama dekstraaninatriumsulfaatti (DSS), kun taas kun tulehdus on poissa kestää useita injektioita AOM ja pidemmän aikaa kasvaimen muodostumisen [16], [17]. Nämä kliiniset ja kokeelliset havainnot selvästi paikantaa CAC klassiseksi tulehdus perustuva syöpä. Toisin kuin APC /Wnt /β-kateniinin reitissä olevien mekanismien koliitti liittyvän syöpään, ja erityisesti, koliitin pahanlaatuisiksi, ovat suurelta osin epäselviä, majorly puutteen vuoksi asianmukaisen mallin dynaamiset tutkimuksessa.

suolen epiteeli on suojattu kerros limaa erittyy pikarisolujen vastaan ​​mekaaniset ja kemialliset vammat, voimakas syyt tulehdusta, ja runsaimmin erittyy suolen musiinin koodaa

Muc2

geenin [18]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että määrän väheneminen pikarisolujen ja pienentää

Muc2

ilmentymistä havaitaan yleisesti haavainen paksusuolen tulehdus ja peräsuolen syöpä [19]. Tärkeys

MUC2

suolen homeostaasin kuvastaa muutoksia solujen lisääntymisen, muuttoliike ja apoptoosin hiiren suolen kun geneettinen poisto

Muc2

geeni [20], ja mikä tärkeintä,

Muc2

-puutos hiiriä (

Muc2

– /- hiiret) kehittävät spontaanisti pieniä ja paksusuolen ja peräsuolen kasvaimet [20]. Mekaaniset tutkimukset ovat osoittaneet, että kasvaimien synnyn liittyy aktivaatio krooninen tulehdus, ja ei liity Wnt /β-kateniinin signalointi [20]. Kuitenkin tulehdus lisääntynyt suolen tuumorigeneesiä APC mutanttihiirillä tuomalla

Muc2

puute hiirille [21], ja menetys sykliiniriippuvaisten estäjät p21WAF1 tehostetun suoliston kasvainten muodostumista

Muc2

– /- hiirissä [22], nykyinen tutkimus osoitti lisäksi, että

Muc2

puutos hiiret kehittävät spontaanisti kroonisen paksusuolentulehduksen niiden varhaisessa iässä ( 3 koit), jonka histopatologia oli samankaltainen haavainen paksusuolen tulehdus potilailla. 3 kuukauden jälkeen,

Muc2

– /- hiiret kehittävät paksusuolen ja peräsuolen kasvaimia. Siksi 3 kuukauden iästä voisi olla keskeinen kohta, jossa krooninen koliitti etenee peräsuolen syöpä eli koliitti pahanlaatuisiksi, ja

Muc2

hiirillä voisi olla yksi maailman parhaat mallit koliitti liittyvän syövän dynastically tutkia mekanismi pahanlaatuisen muutoksen kroonisen koliitin.

paljastaa molekyylimekanismeihin koliitin pahanlaatuisiksi, me eristetty paksusuolen epiteelisolut

Muc2

– /- hiiret ja toteutettiin miRNA profilointi. Löysimme ero ilmentyminen miRNA on avainkysymys pahanlaatuisen muutoksen. Jotkut miRNA leimasi ihmisen paksusuolen tulehdus ja peräsuolen syövän kudoksissa. Mielenkiintoista, vaimentua miRNA vastasivat muutoksia hiirissä ja liittyy kasvaa sytokiinien, mikä viittaa epigeneettiset muutokset voivat kriittisiä rooleja aikana koliitti pahanlaatuisiksi.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement:

eläinten hoito ja käyttö hyväksyttiin Institutional animal Care ja käyttö komitean Xinxiang Medical University ja University of Illinois at Chicago, ja ihmisen näytteitä kerääminen ja käyttö hyväksyttiin Institutional Review Board of Xinxiang Medical Yliopisto. Kaikki potilaat antoivat tietoon perustuvan suostumuksen kirjallisesti.

Muc2

Mouse Model ja patologian karakterisointi:

Kuten raportoitu aiemmin [20] – [22],

Muc2

+/- hiiret takaisinristeytettiin tuottaa

Muc2

– /- ja

Muc2

+ /+ hiirillä, ja 10 hiirtä ryhmää kohden ruokittiin standardi jyrsijämuonaa ruokavalio 3 kuukautta tai 6 kuukautta. Päätepisteissä, hiiret tapettiin, koko maha-suolikanavan avattiin ja pestiin kylmällä PBS: llä ja kiinnitettiin 10%: puskuroituun formaliiniin. Kudokset upotettiin parafiiniin, leikattiin ja värjättiin histopatologian luonnehdinta.

Muc2

Hiiri Colonic epiteelissä Cells Collection, mRNA analyysi, ja miRNA Profilointi:

käyttäminen julkaistun protokollan meille [23] – [25], hiiren paksusuolen epiteelisolut kerättiin 3 kuukauden ikäinen

Muc2

+ /+ ja

Muc2

– /- hiirissä, vastaavasti. Neljä hiirtä kustakin ryhmästä käytettiin. Koko RNA: t uutettiin käyttäen Trizol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) sytokiini- mRNA analyysi ja miRNA erilaisia ​​analyysi. Laatu ja määrä RNA määritettiin käyttäen Bioanalyzer ja geelielektroforesointi. Sytokiinin mRNA-tasot analysoitiin käyttäen q-RT-PCR: llä. Käytetyt alukkeet hiirisytokiini analyysiä lueteltiin taulukossa S1.

miRNA array suoritettiin Genominen Facility University of Chicago (Chicago, Illinois). Affymetrix GeneChip- miRNA Arrays versio 3.0 käytettiin miRNA profiilin. Lyhyesti, 200 ng kokonais-RNA leimattiin käyttäen FlashTag Biotiini HSR Labeling Kit mukaan valmistajan protokollan (Affymatrix), ja noin 130 ui Affymatrix hybridisaatio- cocktail puskuria (FS450-002) käytettiin noin 18 tuntia protokollan mukaisesti (Affymatrix) . Array sitten skannata Affymatrix GeneChip- Scanner 3000. raakadataa käsittelyssä oli Expression Console 1.2.0.20, data-arvo määriteltiin käyttäen Log Expression Signal – RMA-DABG. MiRNA kanssa kertamuutos 2,0 tai 0,5 ja t-testin arvo 0,01 valittiin ilmentyvät eri miRNA. Yksityiskohtainen kokeellinen suunnittelu, yksityiskohtainen protokolla ja tietojen analysointi voi tutustua osoitteessa Gene Expression Omnibus (GEO) (Access # GSE56577).

Hiiri miRNA Validation kvantitatiivisin RT-PCR (qRT-PCR):

Perustuu astetta muuttui miRNA tasoja miRNA array profiilin, 6 eniten voimistunut ja 9 kaikkein vaimentua miRNA validoitiin käyttäen qRT-PCR. Käänteistranskriptioprosessi (RT) pohja- ja eteenpäin alukkeiden ja koettimien käytetään miRNA validointi lueteltiin taulukossa S2. Universaali Taqman koetinta ja yleinen reverse primeri qRT-PCR hankittiin Integrated DNA Technologies (IDT) (taulukko S2).

kokonais-RNA hiiren paksusuolen epiteelissä oli polyadenyloituina Poly (A) Polymerase rikastushiekka Kit (Epicentre ). Lyhyesti, 10 ui reaktiota, mukaan lukien 1 ug RNA: ta, 1 ui 10 x reaktiopuskuria, 1 ui 10 mM ATP: tä ja 1 yksikön Poly (A) polymeraasia inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuuttia, minkä jälkeen entsyymin inaktivointi 65 ° C: ssa 5 minuuttia ja sitten jäihin. Jälkeen polyadenylaatiota, käänteistranskriptio suoritettiin 10 ui reaktioseosta, joka sisälsi 1 ui polyadenylaatiota reaktiotuotteen, 1 ui 0,5 uM RT-aluketta, 0,5 ui 10 mM dNTP: tä, 1 ui AMV 10x reaktiopuskuria, ja 50 yksikköä AMV-korkea suorituskyky käänteiskopioijaentsyymi- (Promega, Madison, WI). Reaktiota inkuboitiin 42 ° C: ssa 60 min, ja sitten pysäytettiin kuumentamalla 70 ° C: ssa 10 min. RT tuotteet monistettiin ja havaittiin käyttäen S-Poly (T) menetelmällä, on raportoinut meille [26]. 20 ui PCR-reaktio sisältää 2 ui RT (4-kertainen laimennus), 10 ui 2x GoTaq® Hot Start Väritön Master Mix (Promega, Madison, WI), 0,2 uM forward-aluke, 0,2 uM yleinen reverse-aluke, ja 0,25 uM universaali Taqman koetinta. PCR-reaktio suoritettiin 95 ° C: ssa 30 s, jonka jälkeen 40 sykliä 95 ° C: ssa 10 s ja 60 ° C: ssa 30 s. QRT-PCR tulokset analysoitiin ilmoittamat meille [27] – [29]. SnoRNA202 käytettiin sisäisenä kontrollina.

Human Näytteet Collection:

kuusitoista paires ihmisen kolorektaalisyövän kudoksiin, koliitti kudokset, ja niiden vieressä normaalin paksusuolen limakalvo, kerättiin marraskuussa 2012 lokakuuhun 2013 alkaen First Affiliated sairaala ja Affiliated Xinxiang keskussairaala, Xinxiang Medical University. Osa näytteistä napsahtaa nestetyppeen ja sitten säilytettiin -80 ° C: ssa RNA: n uutto ja qRT-PCR-analyysiin. Kaikki potilaat antoivat tietoon perustuvan suostumuksen kirjallisesti. Näyte kerääminen ja käyttö hyväksyi Institutional Review Board of Xinxiang Medical University.

RNA ja qRT-PCR mRNA-analyysi ihmisen näytteet olivat samanlaiset kuin edellä on kuvattu analyysi hiiren paksusuolen epiteelisoluissa. Alukkeet ja koettimet käytetään miRNA analyysiä listattiin Taulukko S2. SNORD 44 käytettiin sisäisenä kontrollina.

miRNA Tavoitteet tunnistaminen, biologiset toiminnot Luokittelu, ja Network Analysis:

Tunnistaa tavoitteiden miRNA käytimme online-ohjelmisto – David (http: //david.abcc.ncifcrf.gov/) ja ennustettu luettelo konservoituneiden miRNA kohdegeenien saatu targetscan (https://www.targetscan.org/), STARBASE (https://starbase.sysu.edu.cn/) , Tarbase (https://microrna.gr/tarbase/), ja miRbase (https://mirbase.org/index.shtml). Biologinen toiminnot miRNA luokiteltiin Gene Oncology (GO). Voimakkaat tavoitteet verkko ja signalointi ehdotettiin käyttäen Kegg (https://www.kegg.jp) ja Ensembl (https://www.ensembl.org) web työkaluja.

Tulokset

Histopatoloqia on

Muc2

hiirimallissa Colitis liittyvien Cancer:

Edellinen työ ovat osoittaneet, että kohdegeenin tyrmäys

Muc2

geeni aiheutti kasvainten muodostumista koko ruoansulatuskanavassa, kuten pohjukaissuoli, paksusuolen ja peräsuolen [20], ja

Muc2

– /- hiiret ovat alttiita DSS-indusoidun inflammatorisen kulho sairaudet [30]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että 3 kuukauden kuluttua tai aiemmin,

Muc2

– /- hiirille spontaanisti kroonisen tulehduksen paksusuolen ja peräsuolen, mukana muutama kasvaimia näitä sivustoja (kuva 1). Kuten kuviossa 1A on esitetty, paksusuolen limakalvo ei ollut pikarisolujen ja osoitti ominaisuuksia haavainen koliitti, kuten pinnallinen eroosion ja intensiivinen tunkeutumisia tulehdussolujen koko limakalvon, submucosa ja jopa lihaksen kerros paksusuolen, joka oli samanlainen kuin havaittiin ihmisen haavainen paksusuolen tulehdus. Krooninen koliitti oli mukana adenooma. Iässä 6 kuukautta,

Muc2

– /- hiirille kehittyi kasvaimia paksusuolen ja peräsuolen, kuten raportoitu [20], mutta vaikea tulehdus havaittiin vielä sisäisessä kasvaimia ja extra-kasvaimet (kuva 1B). Ainutlaatuinen fenotyyppi oli, että

Muc2

– /- hiirille kehittyi peräsuolen prolapses (kuvio 1 C), joka ei ole koskaan raportoitu aikaisemmin. Histopatologisesti esiinluiskahdus oli adenokarsinooma Vaikeaa tulehdus rectums (kuvio 1 D), näytetään pinnallinen eroosio, tulehdussolujen soluttautumisen ja syöpäsoluinvaasiota. Lisäksi vakavuus tulehdussolujen infiltraatiota liittyy vakavuuden peräsuolen prolase, mutta ei ollut yhteydessä syöpäsolujen invaasion ja erilaistumista peräsuolen (tuloksia ei ole esitetty).

, paksusuolitulehdus ja adenooma in hiiren paksusuolen klo 3 kuukauden iästä. Harmaat nuolet muistutti vakava tulehdussolujen, valkoinen nuoli totesi adenooma. B, koolonadenokarsinoomasolulinjalla kanssa tulehdussolujen infiltraatiota klo 6 kuukauden ikäisille. C, peräsuolesta prolapsed 6 kuukautta. D, histopatologia peräsuolen esiinluiskahdus, osoittaa syöpäsoluinvaasiota ja vaikea tulehdus peräsuolen (ikä 6 kuukautta).

miRNA Profilointi Revealed Differential ilmentäminen miRNA in

Muc2

– /-

Hiiret

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, tärkeät roolit miRNA karsinogeneesissä. Tutkimaan, onko poikkeava ilmentymä miRNA ovat mukana koliitti pahanlaatuisiksi, me eristetty paksusuolen epiteelisolut 3 kuukauden ikäisiä hiiriä (4

Muc2

– /- hiirillä ja 4

Muc2

+ /+ hiirillä) ja suoritettu miRNA profilointia. On tunnettua, että vuorovaikutus strooman ja epiteelisolujen näyttelee tärkeää roolia ajo koliitti-liittyvän peräsuolen syöpä (CAC).

Muc2

yliekspressoitiin paksusuolen epiteelisoluissa, ja geneettinen puutos tämän geenin on riittävä aiheuttamaan koliitti ja peräsuolen syövän, kohdistamaan tärkeyttä

Muc2

kehittämiseen koliitti ja CAC. Voit selvittää roolit poikkeavasti ilmaisi miRNA johtui

Muc2

puuttuminen aloittamisessa koliitti ja helpottamalla peräsuolen syövän muutos, käytimme paksusuolen epiteelisolut sijasta stroomasoluista tai koko paksusuoli kudosten miRNA array. MiRNA profilointi analyysi osoitti ero tasoja miRNA, heidän joukossaan 20 miRNA merkittävästi vaimentua ja 71 miRNA merkittävästi voimistunut (taulukko 1) mukaan

Muc2

– /- hiirillä, verrattuna

Muc2

+ /+ hiirillä (muutos kertainen 2 tai 0,5; T 0,01, p-arvo 0,05, q arvo 0,05). Kuten näytetään taulukossa S3 ja taulukossa S4, useimmat miRNA on raportoitu säätelemään tavoitteensa ja kriittisiä rooleja syövän aloittamista etenemisen ja etäpesäkkeiden, eri kudoksissa ja soluissa. Vaikka biologisia toimintoja joidenkin miRNA eivät ole selkeitä ja takaa lisätutkimuksia.

Hiiri miRNA validointi qRT-PCR:

arvioimiseksi tarkkuutta profiloitu miRNA muutos hiiren paksusuolen epiteelisolujen, valitsimme 15 olennaisimmat miRNA validointia käyttämällä qRT-PCR. 6 voimistunut miRNA (MMU-miR-5132-5p, mmu-miR-3104-5p, mmu-miR-669c-5p, mmu-miR-705, mmu-miR-760-3p, mmu-miR-1962) ja 9 vaimentua miRNA (MMU-miR-146a, mmu-miR-138, mmu-miR-5123, mmu-miR-196b, mmu-miR-5099, mmu-miR-150, mmu-miR-145, mmu-miR -27a, mmu-miR-23a) valittu validointi perustuivat myös niiden kohdegeenien ennusti, joiden toiminnot ovat hyvin merkityksellisiä tulehdus ja syöpään. Kuten kuviossa 2 on esitetty, muutoksia miRNA määritettiin qRT-PCR olivat yhdenmukaisia ​​muutoksia profiloitu miRNA erilaisia ​​analyysi.

neljä hiirillä iässä 3 kuukautta kustakin genotyypin ryhmästä lopetettiin ja paksusuolen epiteelisolut olivat eristettynä RNA ja qRT-PCR-analyysillä. Pylväät edusti Mean +/- SD.

Poikkeava ilmentyminen miRNA Human paksusuolitulehdus, peräsuolen kasvain ja vieressä Normaali Mucosa

onko poikkeavasti ilmaisi miRNA ole kliinistä merkitystä, me valitsi 4 miRNA analysoitavaksi ihmisen peräsuolen syövän ja koliitti kudoksiin. Kuten kuviossa 3, on yleisesti ottaen ekspressiotaso miR-138, miR-145, miR-146A ja miR-150 oli vaimentua noin 3,37, 3,39, 2,56 ja 4,99-kertaisesti kolorektaalisyövissä kuin sovitetussa viereiseen normaaliin limakalvo (

p

0,0001). Niistä kaikki 16 kolorektaalisyövissä osoitti vaimentua miR-138 ja miR-150 tasoa (kuviot 3A ja 3D), ja 15 ulos 16 ja peräsuolen syöpien osoitti alempi miR-145 ja miR-146a ekspressiotasot kuin normaali ohjaus (kuviot 3B ja 3C). Vain yksi potilas (näyte 6) osoitti ylössäätely miR-145, mutta säätely ei ollut merkitsevä (kuvio 3B, p 0,05). Mielenkiintoista on, että downregulation näiden miRNA havaittiin myös ihmisen kroonisen koliitin kudoksissa (kuviot 4, p 0,0001, verrattuna normaaliin limakalvoon). Vaikka havaintoja saatiin pienissä näytteistä, trendejä merkittävien downregulation miRNA (miR-138, 145, 146A ja miR-150) viittaavat vahvasti siihen, niiden kliinistä merkitystä sidonnaisuus krooninen koliitti ja koliitti liittyvä peräsuolen syöpä, joka epäsuorasti osoittaa heidän mahdollisista biologisista toiminnoista, joihin koliitti pahanlaatuisiksi. Itse asiassa tehtävät näiden miRNA kasvaimen suppression ollaan tutkittavana käyttäen käsiteltyä soluviljelmässä

in vitro

ja kasvain nude-hiiriin

in vivo

.

, miR-138 oli merkittävästi vaimentua vuonna kolorektaalisyövissä. B, miR-145 oli merkittävästi vaimentua vuonna kolorektaalisyövissä. C, miR-146a merkittävästi vaimentua vuonna kolorektaalisyövissä. D, miR-150 oli merkittävästi vaimentua vuonna kolorektaalisyövissä. Jokainen sarake seisoi yksi potilas, yhteensä 16 potilasta. Kokonaiskilpailun seisoi keskiarvo miRNA kaikilla potilailla. (***

p

0,0001 verrattuna viereiseen normaaliin limakalvoon).

, miR-138 oli merkittävästi vaimentua koliitti. B, miR-145 oli merkittävästi vaimentua koliitti. C, miR-146a merkittävästi vaimentua koliitti. D, miR-150 oli merkittävästi vaimentua koliitti. Jokainen sarake seisoi yksi potilas, yhteensä 6 potilasta. Kokonaiskilpailun seisoi keskiarvo miRNA kaikilla potilailla. (***

p

0,0001 verrattuna viereiseen normaaliin limakalvoon).

miRNA Target Network Karakterisointi:

Koska muuttunut miRNA oli suuri merkitys

Muc2

– /- hiirten ja ihmisen paksusuolen tulehdus pahanlaatuisiksi, ja valittu miRNA osoitti downregulation koliitti ja peräsuolen syövät, seuraavan kerran selvitetty, oliko yhteiset tavoitteet näistä miRNA. Valitettavasti, ei ole yhteistä inflammation- ja syöpään liittyvien tavoitteiden kaikille 4 miRNA (miR-138, 145, 146a ja miR-150) tunnistettiin käyttäen miRNA kohde ennustaminen työkaluja. Kuitenkin löysimme joitakin yhteisiä tavoitteita tahansa 3 tai 2 4 miRNA. Kuten kuviossa 5 ja taulukossa 2, oli 21, 13 ja 25 yhteisiä tavoitteita välillä miR-138 ja miR-145, miR-146a ja miR-150, vastaavasti; oli 16 ja 15 yhteistä on miR-145 ja miR-146A ja miR-150, tässä järjestyksessä; ja oli 7 yhteisten tavoitteiden välillä miR-146A ja miR-150. Ole hyvä huomata, että CCT3 ja PAPPA olivat yhteiset tavoitteet miR-138, miR-146A ja miR-150, ja ZHX2 oli yhteinen tavoite miR-138, miR-145 ja miR-150. Mielenkiintoista, useimmat näistä tavoitteista ovat onkogeenien. GO termi merkintä osoitti, että kaikki tavoitteet ovat mukana solun fysiologisen ja aineenvaihduntaa, ja säätelyyn soluprosessia ja sääntely fysiologinen prosessi ovat merkittävästi rikastettu GO termejä. Siten mikä tahansa dysregulaatio näistä miRNA ja niiden tavoitteita voi olla riittävä aiheuttamaan aloittamista tulehduksen ja kroonisen tulehduksen pahanlaatuisiksi, tutkimukset tahansa yhteiset tavoitteet kahden tai useamman miRNA karsinogeneesissä on tärkeämpi kuin minkä tahansa tavoitteet yhden miRNA.

sytokiinien

Muc2

– /-

Mouse Colonic epiteelisoluja Up-säänneltyjä:

oikeellisuus on analyysin miRNA ja niiden ja sytokiinin mRNA: t, myöhemmin usein nähty koliitti liittyvän syövän, me määrittää korjauksilla sytokiinien hiiren paksusuolen. Kuten kuviossa 6 on esitetty, verrattuna

Muc2

+ /+ hiiri,

Muc2

– /- hiiret osoittivat merkittävää voimistumista sytokiinien (esim IL-6, COX2, TNF-a ja IL-1β, jne) koolonin epiteelisolujen normaalin näy paksusuolen limakalvo (p 0,01).

verrattuna

Muc2

+ /+ hiirillä,

Muc2

– /- hiiret osoittivat merkittävää voimistumista sytokiinien (** p 0,01, verrattuna

Muc2

+ /+ hiirillä). Neljä hiirillä 3 kuukauden iästä kustakin genotyypistä ryhmästä lopetettiin ja paksusuolen epiteelisolut eristettiin RNA ja qRT-PCR-analyysillä. Pylväät edusti Mean +/- SD.

Keskustelu

Nykyinen tutkimus lisäksi karakterisoineet ulcerosa liittyvän peräsuolen syöpä (CAC) malli

Muc2

– /- hiirissä, joka antaa suoraa näyttöä siitä, että krooninen tulehdus paksusuolen ja peräsuolen voitaisiin pahanlaatuisiksi muuttaneet, ja paljastaen voimakas mekanismit, jotka oli poikkeava miRNA ilmentyminen paksusuolen epiteelisoluissa olivat mukana ja saattaa kriittisiä rooleja aikana pahanlaatuinen muutos krooninen koliitti häiritsemällä kohdegeeneissä.

Lukuisat näyttöön perustuva tutkimukset ovat osoittaneet, että krooninen koliitti on yksi tärkeimmistä syistä peräsuolen syövän, mutta taustalla olevien mekanismien eivät ole selkeitä, yksi tärkeimmistä syistä on puute spontaani koliitti ja koliitti liittyvä kolorektaalisyövän malli. Tällä hetkellä, erilaisia ​​geneettisesti eläinmalleissa on saatavilla ja ne ovat hyvin hyödyllisiä ymmärtämään paremmin molekulaarisia mekanismeja taustalla patogeneesi CAC [31], mutta patologiset näistä malleista ei ole dynaamisesti tunnettu. Tässä tutkimuksessa ominaista

Muc2

hiirimallissa.

Muc2

– /- hiiret kehittävät spontaanisti kroonisen tulehduksen paksusuolen ja peräsuolen varhaisessa vaiheessa ( 3 kk), ja 3 kuukauden kuluttua, krooninen tulehdus edistyksen peräsuolen syöpä. Tärkeintä on, että patologisia piirteitä kroonisen tulehduksen paksusuolen ja peräsuolen olivat samanlaisia ​​kuin ihmisen haavainen koliitti, ja poikkeavasti ilmaistuna miRNA mukana

Muc2

– /- hiiri koliitti pahanlaatuisiin havaittiin ihmisen koliitti ja peräsuolen syövän kudoksissa. Toinen ainutlaatuinen piirre oli peräsuolen prolapses – peräsuolen syöpä on vaikea tulehdus. Siksi

Muc2

– /- hiiri voisi olla sopiva jyrsijän malli CAC, ja sitä voitaisiin käyttää yhtenä parhaista työkaluja syyn selvittämiseksi CAC ja taustalla molekyylitason mekanismeja.

Muc2

– /- hiiri voitaisiin myös käyttää hiirimallissa kemopreventiolle ja terapiaa koliitti-liittyvän paksusuolen ja peräsuolen syövän.

miRNA on 19-22 nukleotidia, ovat uusi luokka pieniä ei-koodaavaa RNA: iden hillitseviä käännös ja vakautta RNA: iden (mRNA: t) sitoutumalla kohdistaa mRNA: iden ’3’-alueet (3′-UTR) [32], miRNA on tärkeitä biologisia ja pathophysical toimintojen mukana kehityksessä, solujen proliferaatiota, erilaistumista, apoptoosia, tulehdusta ja stressin vastaus [33] – [35]. Lisääntyvä todisteita ovat ehdottaneet, että miRNA ovat vaimentua tai yläreguloituja syöpiä, jotka toimivat tuumorisuppressorit tai onkogeenien [33], [35], [36], jossa miRNA kriittisiä rooleja kasvainten synnyssä, erilaistumiseen, etenemiseen (esim muuttoliike, invaasio, angiogeneesi, ja etäpesäkkeiden) [35] – [37], lähinnä häiritsemällä ilmentymisen kohdegeenien. Käyttämällä miRNA array, olemme profiloitu ero ilmentymisen miRNA koolonin epiteelisolujen

Muc2

– /- hiirissä, ja nämä miRNA joko säädelty, kuten onkogeenien tai vaimentua tuumorisuppressoreilla kohdistamalla geenit at luokat aineenvaihduntaa, solukierron, erilaistuminen, solukuoleman, DNA: n kahdentuminen, homeostaasin, signaalitransduktion, vastauksena stimulaation, ja tulehdus, jne. Niistä muuttuvan merkittävästi miRNA, The vaimentua miRNA, miR-138, 145, 146A ja 150 , validoitu sekä hiiren ja ihmisen kudoksissa, erityisesti ihmisen koliitti ja peräsuolen syövän kudoksissa, mikä viittaa tukahduttaa roolit miR-138, 145, 146A ja 150 koliitti pahanlaatuinen siirtymävaiheessa kautta vuorovaikutuksessa sytokiinien ja tulehduksellisten tekijöiden.

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet tuumorisuppressoriproteiinia roolit miR-138 syövän biologian. miR-138 esti syöpäsolujen kasvua ja tuumorigeneesiä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja nenänielun syövän kohdistamalla 3-fosfoinositidi-riippuvainen proteiinikinaasi-1 (PDK1) ja CCND1 [38] – [40]. Peräsuolen ja munasarjojen syöpien, miR-138 tukahdutetaan syöpäsolun muuttoliikkeen ja etäpesäkkeiden kautta häiritsivät TWIST2, SOX4 ja HIF1-a [39], [41]. Uusimpien tutkimusten raportoitu, että vaimentua miR-138 jatkuvan inflammatorisen tekijän NF-kB aktivaation ja edistää ruokatorven syövän etenemisessä [42], ja että miR-138 vaste pro-inflammatoristen sytokiinien riippuu vakauttamiseen HIF1-α primaarisissa ihmisen mikrovaskulaarisia endoteelisoluja [43]. miR-145 on myös kasvainsuppressorigeenin. miR145 voisi kohdistaa SOX9 /ADAM17 akselin ja estää kasvaimen-aloittamiseksi soluja ja IL-6-välitteinen parakriinisiä vaikutuksia pään ja kaulan alueen syöpä [44]. Lisäksi microRNA-145 indusoi apoptoosin induktion kanssa tuumorinekroositekijä liittyvää apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) lauseke, kohdennettuja onkogeeni socs7 ja säännelty interferoni-β induktion avulla STST3 tumaansiirtymiseen virtsarakon syövän soluissa [45]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet, että TRAIL estää kemokiinin (CXC-motiivin) -reseptorin 4 (CXCR4) -välitteisen ihmisen rintasyövästä migraatiota jopa säätelevä miR-146a ilmaisun NF-KB signalointi [46], ja että miR-146 säätelee epigeneettiset säädin UHRF1 ja moduloi mahasyövän invaasiota ja etäpesäkkeiden [47], joka esittää yhtä tärkeää roolia miR-146 inhiboimaan syövän etäpesäkkeiden häiritsemällä kemokiinin ja epigeneettiset säädin. Mitä miR-150, melko paljon raportteja ovat osoittaneet kasvaininhibitorisen toiminto [48] – [51]. Vaikka, että miR-150 on vuorovaikutuksessa sytokiinien lymfosyyttien erilaistumiseen ja tulehdukseen on tutkittu. Esimerkiksi sytotoksisia T-lymfosyyttejä (CTL), IL-2R ja tulehduksellisten signaalien toimivat kautta Dicer ja miRNA valvoa sytolyyttinen ohjelma ja CTL erilaistumista, jossa miR-139 ja miR-150 ovat vaimentua tulehduksen CTL: t, ja asennuspalveli- 150 säätelee, että IL-2-reseptorin α-ketju (CD25) [52]. Lisäksi IFN-γ tuotanto on merkittävästi lisääntynyt miR-150 hiirten [53]. Takaisin havaintomme, jotka olivat, sytokiinit lisääntyivät merkitsevästi (kuvio 6) ja miR-138, 145, 146A ja miR-150 oli merkittävästi vähentynyt

Muc2

– /- hiiren paksusuolen ja ihmisen koliitti ja peräsuolen syövän, joissa julkaistun havaintojen voimakkaasti tukevat hypoteesia, että sytokiini liittyvä miRNA, miR-138, 145, 146A ja miR-150, tärkeitä rooleja kroonisen koliitin pahanlaatuisiksi läpi häiritsevät sytokiinien ja tulehduksellisten tekijöiden. Kuitenkin samanlaiset kuin muutokset sytokiinien seurauksena paksusuolentulehduksen hiiren paksusuolen, muutoksia miRNA voisi myös olla seurausta kroonisesta koliitti ja CAC ihmisen paksusuolen kudoksiin. Se voisi olla mahdollista, mutta alustavien tietojen jatkuvaa toiminnallista tutkimukset käyttäen käsiteltyä soluviljelmäjärjestelmiä ja in vivo nude-hiirimallissa on havaittu yksittäisiä tai synergistical potentiaalia näiden miRNA (Bao ja Yang, julkaisematon data), joka vahvistaa kasvain tukahduttaa toimintoja näiden miRNA . Lisäksi voimakas resurssit muuttunut miRNA ihmisen paksusuolen tulehdus ja CRC kudokset eivät ole selkeitä ja niitä on vielä tutkinnan restults tuotettu, jotka voisivat selkeyttää toiminnot aiheuttavat tai seurauksena näiden miRNA kehittämisessä koliitti ja peräsuolen syövän.