Krooninen sairaus

tiivistelmä

Turvallinen ja tehokas syövän lääke on tarpeen lisääntyvistä väestöstä syöpäpotilaille, joiden tiettyjen sairauksien ei voida parantaa, joita tällä hetkellä käytettävissä oleva hoito. Adenoviruksen (Ad) vektorit lupaava terapeuttinen lääke ihmisen syövän hoidossa. Kuitenkin useita parannuksia tarvitaan, jotta Ad-vektorit olisivat tehokkaita syövän terapeuttisia, jotka sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, parantaa soluunottoa, tehostetut syöpäsolujen tappaminen aktiivisuutta ja kykyä vektorin visualisointi ja seuranta, kun injektoitiin potilaille . Tätä varten olemme yrittäneet kehittää ilmoitus monitoiminen alusta sisältää kohdentamista, kuvantamis- ja terapeuttinen motiiveja. Tässä tutkimuksessa selvitimme hyödyllisyys Ehdotetun foorumin tuottamalla ilmoitus vektori, joka sisältää poly-lysiiniä (PK), herpes simplex -viruksen tyypin 1 (HSV-1) tymidiinikinaasi (TK), ja monomeerisen punainen fluoresoiva proteiini ( mRFP1) kuten kohdentaminen, kasvainsolun tappamisen, ja kuvantaminen kuviot, tässä järjestyksessä. Tutkimuksemme tässä osoittaa sukupolven triple mosaiikki Ad vektori, jossa pK, HSV-1 TK, ja mRFP1 klo karboksyylipäät Ad vähäinen kapsidiproteiini IX (pIX). Lisäksi toiminnot pK, HSV-1 TK, ja mRFP1 proteiineja Ad vektorin jäivät mikä vahvistettiin vastaavat toiminnalliset analyysit, osoittaa mahdollisia monitoiminen soveltamisesta uuden Ad vektori syövän geeniterapiassa. Validointi on kolminkertainen mosaiikki Ad vektoreita väittää myös, että kyky pIX muutoksen pohjana kehittämiseen monimuotoisen Ad vektorit.

Citation: Tang Y, Wu H, Ugai H, Matthews QL, Curiel DT ( 2009) johtaminen Triple Mosaic adenovirus for Cancer Gene Therapy. PLoS ONE 4 (12): e8526. doi: 10,1371 /journal.pone.0008526

Editor: Maciej Lesniak, The University of Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 lokakuu 2009; Hyväksytty: 7. joulukuuta 2009; Julkaistu: 31 joulukuu 2009

Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat NIH avustus 5R01CA111569 (Dr. DT Curiel) ja Juvenile Diabetes Research Foundation apurahan 1-2005-71 (Dr. H. Wu). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on toiseksi yleisin kuolinsyy maailmanlaajuisesti, ja oli noin 7,9 miljoonaa kuolemantapausta (13% kaikista kuolemista) mukaan vuonna 2007 Maailman terveysjärjestön (WHO, ”top 10 kuolinsyyt”) . Geeniterapia on uusi paradigma, että ihmisten sairauksien hoidossa lisätyllä geenipankit osaksi yksilön soluihin hoitotarkoituksiin [1]. Kaikista hoitomenetelmiä syövän geeniterapian edustaa uutta molekyyli toimenpide, joka on potentiaalia antituumoritehoon selektiivisiä ja turvallisuus [2].

Tähän mennessä 65,2% kaikista geenihoidon kliinisissä tutkimuksissa on kohdistettu syöpä [3]. Joukossa useita syövän geeniterapian strategioita kuitenkin hyvin harvat niistä ovat osoittaneet voimakas terapeuttinen vaikutus ihmispotilailla. Lisäksi monimutkaisuus ja epäselvyys kasvaimen, muita esteitä, jotka voivat selittää sitä, että useiden syövän geeniterapian sovellukset sisältävät alhainen transduktion tehokkuus syöpälääkkeiden ja kyvyttömyys transduktion koko tuumorisolupopulaatioon; huono selektiivisyys ja puute pitkän aikavälin kesto syöpälääkkeet kasvaimissa johtaa huonoon terapeuttinen tehokkuus sekä turvallisuuskysymyksiä. Käsite tuumorisolujen kohdistaminen osoitteet näistä esteistä ja saattaa olla merkittävä parannus kehittämisessä geeniterapiaa kuin syövän terapeuttista. Koska tehokas kohdentaminen, tämä syöpälääkkeen voi paitsi saavuttaa erittäin valikoivia ja erityisiä kasvainsolun murhat, mutta myös välttää ottoa normaalit solut ja myöhemmät myrkyllisyys.

in vivo

kuvantamismodaliteetin, joka tarjoaa keinon tutkia jakauma (esim kertymistä, leviäminen, säilyttäminen, ja niin edelleen) syövän hoitomuotoja, voi käsitellä keskeisiä kysymyksiä, jotka ovat olennaisia ​​suunnittelun ja testi uusien syöpälääkkeiden, varsinkin replikatiivisia virus terapeuttisten [4] – [7]. Yhdistää nämä toiminnot ja pyritään luomaan tehokkaampia ja luotettava anti-syöpähoitojen, yritimme luoda monitoiminen adenoviruksen (Ad) vektori havaitsemiseen ja syövän hoitoon. Ilmoitukseen sisältyy kohdentamista, kuvantamis- ja syövän hoitomuotojen.

Mainoksen on yksi yleisimmin käytetty virusvektoreita lukuisissa syöpägeeniterapia Kliinisissä tutkimuksissa [3]. Näissä tutkimuksissa käytetään ensimmäisen tai toisen sukupolven adenovirusvektoreita on osoittanut terapeuttista ilmentymistä, mutta yleinen kliininen tehokkuus on ollut heikko, koska edellä mainitut rajoitukset. Rajoitusten voittamiseksi, monet ponnistelut ovat keskittyneet muuttamalla Ad kapsidin yksilöllisesti syöpätyypin perusteella. Esimerkiksi muuttaminen Ad kapsidin kanssa kohdistaminen ligandien suunnattu tuumoriantigeenejä kasvatti Ad transduktio tuumorisoluissa

in vitro

ja

in vivo

[8], [9]. Muut tähtäävän Ad visualisointi ja seuranta johti leimaamalla Ad kapsidin kanssa bioluminesenssin tai fluoresenssi. Tämä strategia mahdollisti dynaamisen ja suoraa seurantaa fyysinen sijainti ja replikointi viruspartikkelien

in vivo

[4], [10], [11]. Lisäksi sisällyttäminen herpes simplex -viruksen tyypin 1 (HSV-1) tymidiinikinaasi (TK) Ad kapsidin pinnalla sallitaan välitön toiminnallinen soveltamisesta proteiinin itsemurha geeniterapian ja microPET kuvantamisen [12].

Meidän lab ja muut ovat vahvisti mahtuu roolia Mainostyyppi 5 vähäinen kapsidiproteiini IX (pIX) sisällyttämistä ja toiminnallinen näyttö heterologisten polypeptidien ja proteiinien, kuten polylysiini (pK) [13], vihreä ja punainen fluoresenssi proteiineja (GFP ja RFP) [4], [10], [11], tai HSV-1 TK [12], [14]. Olemme edelleen osoittaneet mahdollisuutta luoda kolminkertainen mosaiikki Ad esittämällä kolmea eri heterologisia epitooppeja klo plX locales yhdelle ilmoitus vektorin geneettisen tai ei-geneettisiä muunnoksia [15]. Tässä tutkimuksessa selvitimme pIX näyttää kolme toiminnallista epitooppien – pk (kohdentamiseksi), monomeerinen RFP (mRFP1) (kuvantaminen) ja HSV-1 TK (terapeuttista) yhdellä Ad vektorin meidän vaivaa tuottaa monimuotoisen Ad vektorit.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta

pix-spesifinen vasta-aine oli ystävällinen lahjoitus tri I. Dmitriev (Gene Therapy Center, University of Alabama at Birmingham) . Kanin polyklonaalinen anti-TK-aine oli ystävällinen lahjoitus tri J. M. Mathis (Gene Therapy Program, Department of Cellular Biology ja anatomia, NY Health Sciences). Hiiren anti-His

6 monoklonaalinen vasta-aine hankittiin Qiagen (Valencia, CA). Vuohen polyklonaalinen anti-His

6-vasta-ainetta hankittiin Abcam (Cambridge, MA.). Anti-Flag M2 -vasta-ainetta ja kanin polyklonaalista anti-c-myc-vasta-aine hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO.). Kanin polyklonaalinen anti-RFP-vasta ostettiin Chemiconilta (Temecula, CA.). (HRP) konjugoitua vuohen anti-hiiri, ja vuohen anti-kaniini-vasta-aineita, alkalinen fosfataasi (AP) konjugoitua vuohen anti-hiiri, vuohen anti-kaniini-vasta-aineita, ja elektronimikroskopia (EM) luokka 18 nm kolloidisen kulta- konjugoidulla aasin anti-vuohi-vasta ostettiin Jackson Immuno- Laboratories Inc. (West Grove, PA.). EM-laatu 10 nm kulta-konjugoidulla aasin anti-hiiri, ja EM-laatu 25 nm kulta-konjugoidulla aasin anti-kaniini-vasta-aineet hankittiin Electron Microscopy Science (EMS, Ft. Washington, PA.).

Solut

ihmisen alkion munuaissoluja (293), ihmisen keuhko (A549), ja ihmisen rinta- syöpäsolujen (AU-565) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA.). Kaikkia solulinjoja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa kosteassa inkubaattorissa. AU-565-soluja viljeltiin RPMI-1640 (2 mM L-glutamiinia, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaattia, 4,5 g /l glukoosia, 1,5 g /l natriumbikarbonaattia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 10% naudan sikiön seerumia). Kaikki muut solulinjat kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium-Hamin F12 (50/50) väliaineessa (Sigma), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (HighClone, Logan, Utah), 2 mM L-glutamiinia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä.

Rakentaminen rekombinanttiplasmidien

Generation of sukkulaplasmideja. Kaikki vanhempien plasmidit hankittiin kaupallisista lähteistä tai ovat olleet luonteeltaan aiemmin: pShlpIXNhe [13], pShuttle-IX-mRFP1 [4], pShuttle-IX-flag-sr39tk [12], pShuttle-CMV ja pAdEasy-1 (Stratagene, La Jolla, CA). Sukkula plasmidit konstruoitiin käyttäen rajoitus ja PCR kloonaus kuin seuraavat. pShldpIX = pShlpIXNhe /Bglll /Nhel /tylppä /SL (itseligaasin); PCR-tuote (pcrIXpK), joka sisältää koodaavan sekvenssin pIX-pK-fuusioproteiini synnytettiin käyttäen pShlpIXNhe templaattina ja alukkeita 5′-GGGGTACCGGGCGTGGTTAAGGGTG ja 5′-GGGGTACCTTTATTTATGTTCTTGTCATCGTCATCCTTATAATC; pShlpIXflagpK = pShldpIX /Kpnl + pcrIXpK /Kpnl. PCR-tuote (pcrH6TK), joka sisältää koodaavan sekvenssin H6-sr39tk proteiini synnytettiin käyttäen pShuttle-IX-flag-sr39tk templaattina ja alukkeita 5′-CTAGCTAGCCACCATCACCATCACCAT CTAGCCGGATCCGGTTC ja 5′-CTAGCTAGCTCAATTAGCCTCCCCCATC; pShlpIXH6TK = pShlpIXNhe /Nhel + pcrH6TK /Nhel. PCR-tuote (pcrMycmRFP1), joka sisältää koodaavan sekvenssin c-myc-mRFP1 proteiini synnytettiin käyttäen pShuttle-IX-mRFP1 templaattina ja alukkeita 5′-CTAGCTAGCGGCGG AGGGAGCGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAAGATCTGGGAAGCGCCTCCTCCGAGGACGTCAT ja 5′- CTAGCTAGCTTAGGCGCCGGTGGAGTG; pShlpIXmycmRFP1 = pShlpIXNhe /Nhel + pcrMycmRFP1 /Nhel. Kaikki kloonit varmistettiin restriktiopilkkomisella ja sekvensoinnilla.

Generation of pIX-muunnetun adenoviruksen genomeja homologisella rekombinaatiolla

Escherichia coli

[16]. Sukkula vektorit pShlpIXflagpK, pShlpIXH6TK, ja pShlpIXmycmRFP1 linearisoitiin Pmel-restriktioentsyymillä ja rekombinoitunut homologisesti pAdEasy-1 elektrokompetenteissa BJ5183-AD1 (Stratagene, La Jolla, CA). Syntyvä adenoviruksen genomi sisältää IX-pK, IX-sr39tk tai IX-mRFP1 modifioitu pIX geeni poistetaan E1-alueella. Konstrukteja Tuloksena Ad plasmidien pAdpIXflagpK, pAdpIXH6TK, ja pAdpIXmycmRFP1 vahvistettiin restriktiodigestiolla ja sekvensoinnilla.

Virus Rescue, eteneminen ja puhdistus

pAdpIXflagpK, pAdpIXH6TK, ja pAdpIXmycmRFP1 plasmidit linearisoitiin PacI: lla restriktioentsyymillä ja transfektoitiin 293-soluissa, joita kasvatettiin 25-cm

2 pulloissa käyttäen Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Solut kerättiin, kun ilmeistä solutuhovaikutus (CPE) havaittiin seurasi häiriöt neljällä jäädytys ja sulatus syklien. Lysaatit sentrifugoitiin 3000 x g: ssä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa solujätteen poistamiseksi. Vapautuneet virukset supernatantissa sen jälkeen käytetään myöhempää lisäystä, kunnes riittävä määrä 293-solut infektoitiin (kymmenen 175-cm

2 pulloissa). Ad infektoituneissa soluissa puhdistettiin oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [15]. Lyhyesti, solut hajotettiin neljä jäädytys ja sulatus syklien ja sentrifugoitiin 3800 x g 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa solujätteen poistamiseksi. Solu uutteet sisältävät viruksia lastattiin yläosassa 1,33 /1,45 CsCI vaihegradientti ja sentrifugoitiin 55000 x g 3 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Alempi kaista, joka sisältää tarttuvia viruspartikkeleita, uudelleen sentrifugoitiin toisella 1,33 /1,45 CsCI vaihegradientin 100,000 x g yli yön 4 ° C: ssa. Saatu bändi adenovirusten otettiin talteen ja dialysoitiin neljä kertaa vastaan ​​500 ml: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), joka sisälsi 10% glyserolia, 2 tuntia kerrallaan. Syntyvä mainokset nimettiin Ad-IX-lippu-pK, Ad-IX-H6-sr39tk, ja Ad-IX-myc-mRFP1. Viruspartikkelin (VP) tiitterit määritettiin spektrofotometrisesti OD260 standardimenetelmiä käyttäen [17].

Generation Triple pIX-Modified Ad tartuttamalla

Ten 175-cm

2 pulloja 293-solut infektoitiin Ad-IX-lippu-pK, Ad-IX-H6-sr39tk, ja Ad-IX-myc-mRFP1 at yhteensä MOI 200-300 VP /solu. Infektoituja soluja kerättiin Ad puhdistus, kuten on kuvattu edellä.

Protein Elektroforeesi ja Western-blottaus

5 x 10

9 VP puhdistettua virusten keitettiin Laemmli-näytepuskurissa 5 minuutin ajan ja erotettiin 4-15% gradientilla natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE). Erotetut proteiinit siirrettiin sitten polyvinylideenidifluoridi (PVDF), joka blokattiin 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,05% Tween-20 (TBS-T), jota seurasi inkubointi primaaristen vasta-aineiden (hiiren anti-Flag, 1 :1000; kanin anti-TK, 1:500, kanin anti-RFP, 1:500). Pesun jälkeen ja uudelleen esto, kaivoa inkuboitiin sopivan sekundaarisen vasta-aineita on konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (HRP) on 1:1000 laimennus. HRP signaali kehitettiin ECL plus Western blotting tunnistusjärjestelmä (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), ja sitten havaittiin BioMax MR tieteellinen kuvantaminen elokuvia (Kodak, Chalon-sur-Saone, Ranska) ja lääketieteellisen elokuva prosessori SRX-101A (Konica, Tokio, Japani).

ELISA

Kiinteän faasin sitovia entsyymi-immunologiset määritykset (ELISA: t) suoritettiin olennaisesti kuten aiemmin on kuvattu [18]. Lyhyesti, 10

9 VP viruksia tehtiin sarjalaimennos (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128), 100 ui 100 mM karbonaattipuskuria (pH 9,5), ja immobilisoitu kolmena kappaleena 96-kuoppalevylle (Nunc Maxisorp) inkuboimalla yön yli 4 ° C: ssa. Kun 4 pesua TBS-T: n ja estää TBS-T, joka sisältää 2% naudan seerumin albumiinia (BSA), virukset koetettiin primaarisen vasta-aineen, ja sitten AP-konjugoidun sekundaarisen vasta-TBS-T, joka sisälsi 0,5% BSA: ta huoneenlämpötilassa 2 tuntia, ja pesujen ja esto välillä.

p

nitrofenyyli- fosfaatti (Sigma) käytettiin värin kehityksen valmistaja on kuvannut, ja valon absorbanssi (405 nm) saatiin mikrolevylukijalla (PowerWave HT 340, BioTek, Winooski, VT.) Jälkeen inkuboitu 150 minuuttia huoneen lämpötilassa.

immunoelektronimikroskopiassa

immunoelektronimikroskopiassa suoritettiin oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [15]. Lyhyesti, virusten kiinni 400-mesh nikkeli verkkojen tuetaan hiilipinnoitteiset formvar kalvo (EMS). Pestiin 1% BSA /PBS kahdesti 10 minuuttia kutakin, ristikot koetettiin 1% BSA /PBS laimennettu ensisijainen aineita (1:200 M2 anti-Flag, vuohen anti-His

6, ja kanin anti-c- myc) ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunti. Sen jälkeen 2 sykliä 1% BSA /PBS pesuja, ristikot inkuboitiin 1:10 laimennettu toissijainen vasta (10 nm kulta-aasin anti-hiiri, 18 nm kulta-aasin anti-vuohi, ja 25 nm: n kulta-aasin anti-kani) huoneen lämpötilassa 45 min. Korjausten jälkeen 1% glutaraldehydillä /PBS 20 min, ristikot alistettiin negatiivisesti värjätty 2% uranyyliasetaatilla 12 sekunnin ja tutkitaan transmissioelektronimikroskoopin 60 KV vuonna UAB High Resolution Imaging Facility.

Cell Sidonta Inhibitiomääritvs

sitoutumisen inhibition määritys suoritettiin oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [13]. AU-565-solut vapautettiin pulloihin käyttäen Versene, pestiin kerran PBS: llä, ja pelletoitiin ja suspendoitiin uudelleen 0,5 x 10

7 solua /ml sitomispuskuria (DMEM /F12, jossa 1% BSA). 100 ui solujen alikvootteja siirrettiin kukin 5 ml: n koeputkeen, ja lisättiin 50 ui inhibiittoria (liukoinen CAR (arpi), hepariini, tai PBS: ää). 30 minuutin kuluttua ravistellen 4 ° C: ssa, virusten infektiokertoimella (MOI) 500 VP /solu 50 ul: ssa sitomispuskuria, lisättiin kuhunkin putkeen, ja niitä ravisteltiin 4 ° C: ssa 1,5 tunnin ajan. Solut pestiin kerran 4 ml: aan sitoutumispuskuria ja niiden kokonais-DNA uutettiin ja suoritettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (TaqMan) mitata Ad5 E4 kopioluku. Kokonais-DNA kussakin näytteessä kvantitoitiin OD260.

Cell tappaminen määritys

solukuolemaa määritys suoritettiin oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. Keuhkojen A549-soluja ympättiin 96-kuoppalevylle tiheydellä 10000 solua /kuoppa päivä ennen Ad-infektio. Ad-vektorit kuljettavat pIX-TK-fuusioproteiinien eri MÕIS käytettiin sitten infektoimaan A549-soluja. 2 tunnin kuluttua tai 12 tunnin inkubaation, aihiolääke, gansikloviiri (GCV) (GYTOVENE-IV, Roche Laboratories, Nutley, NJ), lisättiin soluihin loppupitoisuuteen 1 mM. Kun oli kulunut 24 tai 48 tunnin inkuboinnin jälkeen elinkelpoisuus A549-solut arvioitiin käyttäen CellTiter 96® AQ

ueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay -kittiä (Promega, Madison, WI), ja mikrolevynlukijaa (PowerWave HT 340, BioTek, Winooski , VT) mukaisesti manufactories ”ohje.

tilastollinen analyysi

tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen kaksisuuntaisia ​​parittomia Studentin

t

-testaukset ryhmien välillä.

P

arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Generation of Triple pIX-Modified Ad tartuttamalla

Jotta tuottaa triple pIX-modifioitu Ad kuljettaa poly-lysiiniä (pK), HSV-1 tymidiinikinaasi mutantti (HSV-1 sr39tk), ja monomeerisen punainen fluoresoiva proteiini (mRFP1) co-infektio, kolme vanhempien virukset luotiin ensin: Ad- IX-Flag-pK, Ad-IX-H6-TK, ja Ad-IX-myc-mRFP1. Nämä kolme virukset ilmaista pIX-pK, pIX-TK, tai pIX–mRFP1 fuusioproteiinin kanssa Flag, His

6, tai c-myc, vastaavasti (kuvio. 1A). Ellei, kaikki virukset käytettiin tutkimuksessa ovat replikaatiokyvyttömäksi (E1 /E3 poistettu), ja transkriptio muunnetun pIX geenien jokaisessa vanhempien viruksen johtui endogeenisen plX promoottori. Lisäksi pIX–modifioitu mainokset vain ilmaista plX fuusioproteiinia koska natiivi pIX geenit on korvattu muutetun plX geenejä. Kolme vanhempien viruksia käytettiin samanaikaisesti tartuttaa 293-solut, jotka tukevat Ad replikaation tuottaa triple pIX-modifioitu virus. Koska kolme erilaista pIX fuusioproteiinit olivat kaikki ilmaistuna ja voidaan koota kunkin viruspartikkelin, tuloksena virionit odotettiin sisältävät seoksen kolme pIX fuusioproteiinien (Fig. 1 B). Syntyvä ja CsCl-puhdistettua Ad jälkeläisten (nimetty coAdpIXPTM # 1) oli normaali tuotto verrattuna yhden pIX-modifioitu mainokset laboratoriossamme (tuloksia ei ole esitetty). Sisällyttäminen plX-fuusioproteiinien analysoitiin Western-blottauksella anti-Flag, anti-RFP, ja anti-TK-vasta-aineita. Havaitsemiseksi pIX fuusioproteiinin bändejä odotetaan molekyylimassat vahvisti, että kolme pIX fuusioproteiinit (esim pIX-pK, pIX-TK, ja pIX-mRFP1) sisältyivät viruspartikkelit puhdistetun viruksen allas (Fig. 1 C).

(A) konstruktit modifioidun pIX geenien genomien kolmen vanhempien virukset: Ad-IX-Flag-pK, Ad-IX-H6-TK, ja Ad-IX-myc-mRFP1. Modified pIX geenit (koodattu Flag, His

6, ja c-myc, vastaavasti) ajettiin natiivi plX promoottori. (B) Rakenteelliset kaavio triple pIX-modifioitu Ad (coAdpIXPTM # 1) tuottama koinfektoinnin strategiaa. pK, TK, ja mRFP1 peptidit /proteiinit sisällytetty C päät plX. (C) Western blotting-analyysi Ad vektorin sisältävien kolminkertainen plX muutoksia. 5 x 10

9 VP CsCl-puhdistettua ohjaus Ad5 (kaista 1) ja kolmen pIX-modifioitu coAdpIXPTM # 1 (kaista 2) tehtiin SDS-PAGE. Erotetut proteiinit värjättiin Gelcode Blue (Pierce, Rockford, IL.), Havaitsemiseksi koko virusproteiineja (vasen paneeli) tai koettimena anti-Flag, anti-RFP, tai anti-TK-vasta-ainetta (oikea paneeli).

pinta näyttö Modified pixs Ad Hiukkaset

Voit testata, onko vai ei polypeptidejä /proteiineja osaksi C-päähän pIX esitettiin viruksen pinnalla ja saatavilla vasta, suoritimme entsyymi-immunologiset määritykset (ELISA: t). ELISA-kokeessa, anti-Flag, anti-His

6, ja anti-c-myc-vasta-aineita käytetään havaitsemaan kolme modifioitua pixs. Ohjaus Ad5 sisältävä villityypin plX ei tunnista mitään näistä vasta-aineita. CoAdpIXPTM # 1 virukset tunnistettiin anti-Flag, ja anti-c-myc-vasta-aineita (Fig. 2). Kuitenkin, virukset ei tunnistettu joko anti-His-

6-vasta-ainetta (Fig. 2), tai anti-TK-vasta-ainetta (tuloksia ei ole esitetty). Tämä tulos viittaa siihen, että pK ja mRFP1 sisällytettiin triple pIX modifioidun Ad vektoreita. Merkityksettömiä sitoutuminen anti-His

6 tai anti-TK-vasta-aine on viruksia osoittaa, että TK ei joko ollut tehokkaasti pintamateriaalin paljaana viruskapsideihin tai saatavuutta näiden kahden vasta-aineiden TK proteiinien tällainen konfiguraatio oli riittämätön olla havaittu ELISA.

ELISA analyysi Ad vektorin sisältävien kolminkertainen plX muutoksia. 10

9 VP CsCl-puhdistettua Ad5 (negatiivinen kontrolli) tai coAdpIXPTM # 1 alistettiin sarjalaimennosta (1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1 /64, 1/128) ja immobilisoitu ELISA-levylle. Virukset koetettiin anti-Flag (1:2000), anti-His

6 (1:1000), ja anti-c-myc-vasta-aineita (1:1000), jonka jälkeen inkuboitiin alkaliseen fosfataasiin konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet (1:1000). Jälkeen värin kehittyminen, valon absorbanssi mitattiin ja piirretty Y-akselilla vastaan ​​viruksen pitoisuudet. Jokainen piste edustaa keskiarvo ja keskihajonta (SD) kolminkertaisten määritysten. Jotkut virhepalkkeja seisomaan SD ovat pienempiä kuin niiden symboleita.

Mosaikismi Triple pIX-Modified Ad

Western blotting ja ELISA analyysi puhdistettujen viruspartikkelien osoittaneet, että kolmenlaisia pIX fuusioproteiinit sisällytettiin Ad tuotettujen hiukkasten co-infektio (Fig. 1). Sen tutkimiseksi, onko yksittäinen ilmoitus viruspartikkelin voisi näyttää kaikki kolme toiminnallista proteiinien, suoritimme immunokulta elektronimikroskopia suoraan visualisoida pIX muunnettuja Ad hiukkasia. Anti-Flag, anti-His

6 ja anti-c-myc-vasta-aineita käytettiin havaitsemaan pIX-pK, pIX-TK ja pIX-mRFP1 proteiineja viruspartikkelien vastaavasti seurasi kolme johdetun vasta konjugoitu 10 , 18, ja 25 nm: n kultapartikkeleita, vastaavasti. Kuten on esitetty kuviossa 3, ei ole Kultahiukkas sitoutui ohjaus Ad5 näyttää villityypin pIX, kun Ad viruspartikkelit, jotka sisältävät yhden pIX fuusioproteiinia (Ad-IX-Flag-pK, Ad-IX-H6-TK, ja Ad -Ix-myc-mRFP1) värjättiin vastaavat kultapartikkeleita. Kolminkertainen modifioitu coAdpIXPTM # 1 virukset tunnustettu anti-Flag, anti-His

6 ja anti-c-myc-vasta-aineita ja leimattu 10, 18 ja 25 nm: n kulta hiukkasia. Tulokset osoittivat, että kolme pIX fuusioproteiinien voisi käyttää samanaikaisesti yhdelle viruspartikkelin ja altistettiin sen viruksen pinnalla.

Ohjaus tai pIX-modifioitu Ad-vektorit on lastattu EM verkkojen, testattiin kullan nanohiukkasten konjugoitu vasta- , ja tarkasteltiin elektronimikroskoopilla 60 KV. Hiiren anti-Flag, vuohen anti-His

6, ja kanin anti-c-myc ensisijainen vasta-aineita käytettiin havaitsemiseen kolmenlaisia ​​tagien pK, HSV-1 TK, ja mRFP1, vastaavasti. 10 nm kulta-aasin anti-hiiri, 18 nm kulta-aasin anti-vuohi, ja 25 nm: n kulta-aasin anti-kani-vasta-aineita käytettiin myöhemmin kultaa merkintöjä Ad hiukkasia. Kiinteä ohut nuolet osoittavat 10 nm kultapartikkeleihin, tyhjä nuolet osoittavat 18 nm kultapartikkeleihin, ja paksulla nuolet osoittavat 25 nm kultaa hiukkasia. Mittakaavapalkki kussakin paneelissa edustaa 50 nm: n pituinen.

On huomattava, että vaikka on olemassa 240 kappaletta pIX molekyylien kussakin viruspartikkelin vain muutama Kultahiukkas-konjugoidut vasta-aineet sidotaan plX-modifioitu Ad viruspartikkelien. Tämä data oli yhdenmukainen aikaisempien raporttien [15], [19], [20]. Tämä johtuu todennäköisesti suhteellisen alhainen saatavuutta pIX peräisin kapsidin pinnalla [20] – [22] ja tilan este vaikutus vasta-konjugoitua kultapartikkelien aikana toisiaan vasten värjäystä. Valitsimme suuret kulta partikkelit helpottaa erottelemaan kolme epitooppeja, jotka ovat jopa korkeammat vasta-aine /kulta-suhde ja korkeampi spatiaalinen esteenä vaikutus kuin pieni kulta hiukkasista, joita käytetään yleisesti. Lisäksi, anti-His

6-vasta-ainetta ei ole tehokkaasti sitoa pIX-TK, kuten on esitetty kuviossa 2. Lisäksi alhainen tehokkuus kolminkertainen värjäys voi olla toinen syy on hajallaan värjäyskuvio esitetty kuviossa 3. Näin ollen, se on ei ole yllättävää, että taajuus kolmasti-leimatun mainokset on pieni – vain noin 1% viruspartikkeleiden värjättiin kaikki kolme kultaa hiukkasia (taulukko 1).

kohdistaminen aktiivisuus Incorporated Poly-lysiini on Triple pIX Mosaic Ad

Ad5 on osoitettu sitoutuvan ensisijaisen solun reseptorin coxsackie B-virus ja adenovirus-reseptori (CAR), koska ensimmäinen askel infektion kautta kuitu nuppi proteiini [23]. Poly-lysiiniä (PK) osaksi plX locales AdLucIXpK on osoitettu välittävän Ad vuorovaikutukseen solujen heparaanisulfaattiproteoglykaanit (HSPGs), jolloin CAR-riippumaton virus-solusitoutumisen ja transduktio [13]. Siksi, jotta voidaan tutkia, onko pK peptidit osaksi triple pIX mosaiikki Ad vektori oli samanlainen kohdentamista aktiivisuus HSPGs teimme solusitoutumisen ja inhibitioanalyyseissä CAR-puutosta (alhainen CAR) AU-565-solujen läsnä ollessa tai puuttuminen hepariinia tai liukoisen CAR (arpi) proteiinia.

Toinen versio triple pIX modifioitua Ad vektori muodostettiin käyttämällä kolmea aikaisemmin tunnettu vanhempien pIX-muokatut virukset: AdLucIXpK [13], Ad-dE1-IX- sr39tk [12], ja Ad-IX-mRFP1 [4] (Flag tunnisteet olivat läsnä kaikissa kolmessa pIX fuusioproteiineja). Sisällyttäminen pIX-pK, pIX-TK, ja pIX-mRFP1 proteiinien johdettujen kolmen mosaiikki Ad (nimetty coAdpIXPTM # 2) varmistettiin Western-blottauksella puhdistetulle viruksia käyttäen anti-Flag, anti-RFP, ja anti- TK-vasta-aineita (Fig. 4C).

(A) konstruktit modifioidun pIX geenien genomien kolmen vanhempien virusten: AdLucIXpK, Ad-dE1-IX-sr39tk, ja Ad-IX-mRFP1. Modified pIX geenit (koodattu Flag) ajettiin natiivi plX promoottori. (B) Rakenteelliset kaavio triple pIX-modifioitu Ad (coAdpIXPTM # 2) tuottama koinfektoinnin strategiaa. (C) 5 x 10

9 VP CsCl-puhdistettua ohjaus Ad5 (kaista 1) ja kolmen pIX-modifioitu coAdpIXPTM # 2 (kaista 2) tehtiin SDS-PAGE. Erotetut proteiinit värjättiin Gelcode Blue (vasemmalla) tai koettimena anti-Flag, anti-RFP, tai anti-TK-vasta-ainetta. Pitkän altistuminen anti-Flag blotti mukaan osoittamaan pIX-pK proteiinia, joka on osa Ad hiukkasia hyvin alhaisella tasolla. Merkillä ”*” Tähdet osoittavat hajoamistuotteita pIX-mRFP1 fuusioproteiinin.

Havaittiin, että positiivisen kontrollin AdLucIXpK, jossa kaikki pIX molekyylit muutettiin pK, esillä jopa kaksi kertaa solun sitova CAR-puutteellinen AU-565 soluja verrattuna villityypin Ad5. Kolminkertainen mosaiikki Ad5 (coAdpIXPTM # 2), jossa vain osa pIX molekyylien sisälsi pK muutos, osoitti noin 1,5-kertaa suurempi solun sitova aktiivisuus verrattuna villin tyypin Ad5 (Fig. 5). Lisäksi, enemmän kuin 90% solun sitova kyky AdLucIXpK ja 50% coAdpIXPTM # 2 oli inhiboitui vapaalla hepariini, jonka pitoisuus on 500 ug /ml, kun taas solun sitoutuminen ohjaus Ad5 ei vaikuttanut merkittävästi (kuvio. 5). Lisäämällä 200 ug /ml arpi estivät yli 80% solun sitoutumisen ohjaus Ad5, ja jolla on suhteellisen vähäinen vaikutus AdLucIXpK (60%) ja coAdpIXPTM # 2 (25%) (Fig. 5). Yhdessä meidän tietojen mukaan pK peptidit näytetään coAdpIXPTM # 2 capsids voisi välittää CAR-riippumaton solun kohdistaminen kautta vuorovaikutuksessa solun heparaanisulfaatin reseptoreihin.

AU-565 soluja inkuboitiin Ad5, AdLucIXpK tai coAdpIXPTM # 2 MOI 500 VP /solu, kun läsnä on 500 ug /ml hepariinia tai 200 ug /ml arpi proteiinia 4 ° C: ssa. Bound Ad hiukkasia kvantitoitiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR ja normalisoitu koko solun DNA. Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ja SD kolminkertaisten määritysten, ja Tähdet osoittavat merkittävää eroa määriteltyjä ryhmiä.

entsyymiaktiivisuus Incorporated TK on Triple plX Mosaic Ad

HSV-1 TK-proteiinin voidaan geneettisesti sisällyttää ilmoitukseen klo plX locales sen natiivi entsyymiaktiivisuus säilyy, jota voidaan käyttää syövän geeniterapian kanssa prodrug gansikloviirin (GCV), ja voidaan hyödyntää

in vitro

ja

in vivo

kuvantamisen kun yhdessä microPET järjestelmä [12], [14]. Sen tutkimiseksi, onko pIX-TK-fuusioproteiinit voivat toimia normaalisti, arvioimme TK-indusoitua sytotoksisuutta, kun läsnä GCV on farmakologista pitoisuus MTS-määrityksellä. Arvioida pIX-TK-fuusioproteiini suoraan vapautui Ad hiukkasista onnistuneen solun sisälle pääsyä, keuhkojen A549-soluja käytettiin, jonka replikaatio ei-replikatiivista Ad ja plX-geenin ilmentyminen on vähäistä. A549-solut infektoitiin yhden pIX-modifioitu Ad (Ad-DE1-IX-sr39tk) tai kolminkertainen plX mosaiikki Ad (coAdpIXPTM # 2) eri mois. GCV lisättiin infektoituneissa soluissa kaksi tuntia infektion jälkeen, ja solukuoleman välittämä pIX-TK-fuusioproteiini arvioitiin MTS-määritys 24 tuntia tämän jälkeen. Tiedot viittasivat siihen, ettei merkittäviä GCV liittyvä sytotoksisuus aiheuttama joko Ad-DE1-IX-sr39tk tai coAdpIXPTM # 2 infektio korkealla MOI (10000 VP /solu) (Fig. 6A). Kuitenkin alemmalla MOI (5000 VP /solu), vain Ad-DE1-IX-sr39tk infektio osoitti GCV aiheuttamaa merkittävää sytotoksisuutta. Tämä osoitti, että pIX-TK aktiivisuus triple pIX modifioidun Ad oli alhaisempi kuin yhden pIX-TK-modifioitu Ad, joka voi johtua kopioluvun eroista pIX-TK sisällytetty viruspartikkelit.

(A) A549-soluja infektoitiin Ad5 (negatiivinen kontrolli), Ad-dE1-IX-sr39tk tai coAdpIXPTM # 2 eri mois. 2 tuntia myöhemmin, aihiolääke GCV lisättiin päälle solujen lopullinen pitoisuus 1 mM. 24 tuntia myöhemmin, soluntappamisaktiivisuutta indusoimaa muunnettu GCV välittyy pIX-TK arvioitiin MTS-määrityksellä. Solut viruksia normalisoitiin kanssa infektoimattomien solujen suhteellinen solujen eloonjäämistä. (B) A549-soluja infektoitiin yhden pIX-modifioitu Ad-DE1-IX-sr39tk tai coAdpIXPTM # 2 eri MÕIS. 12 tuntia myöhemmin, GCV lisättiin päälle solujen lopullinen pitoisuus 1 mM. 48 tuntia myöhemmin, soluntappamisaktiivisuutta TK /GCV arvioitiin sama kuin edellä on kuvattu.