Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mikrotubulukset ovat erittäin validoitu kohde syövän hoidossa. Kuitenkin kliininen kehittäminen tubuliinia sitovien aineiden (TBA) on haitannut myrkyllisyys ja chemoresistance kysymyksiä ja on edellyttänyt etsittäessä uusia TBAs. Tässä raportoimme tunnistaminen uuden solun läpäisevä, tubuliinia horjuttaa molekyyli – 4,5,6,7-tetrahydro-1 H-indatsoli-3-karboksyylihappo [1p-tolyyli-menetel- (E) -ylideeni] hydratsidi (kutsutaan kuten Suprafenacine, SRF). SRF, jonka tunnuksena on

in silico

seulontaan selityksin kemiallisten kirjastojen, osoitettiin sitoutuvan mikrotubuluksiin on kolkisiinin sitoutumiskohtaan ja estää polymeroitumisen. Tämä johti G

2 /M solusyklin pysähtymiseen ja solukuoleman kautta mitokondrioiden välittämän apoptoottisen reitin. Solukuolemaa edelsi mitokondrion kalvon potentiaalia, JNK – välitteisen fosforylaation Bcl-2 ja Bad, ja kaspaasi-3. Kiehtovan, SRF havaittiin selektiivisesti syöpäsolun lisääntymistä ja oli tehokas lääkeresitentteiä syöpäsoluja, koska sen kyky ohittaa monilääkeresistenttisyyden kuljettaja P-glykoproteiiniin. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että SRF on potentiaalia kemoterapeuttinen aine syövän hoitoon ja tarjoaa vaihtoehtoisen tukirakenteen parannettujen syöpälääkkeet.

Citation: Choi BH, Chattopadhaya S, Thanh LN, Feng L, Nguyen QT, Lim CB, et al. (2014) Suprafenacine, joka on Indatsoli-Hydrazide Agent, tavoitteet Syöpäsolut Through Microtubule destabilisaatio. PLoS ONE 9 (10): e110955. doi: 10,1371 /journal.pone.0110955

Editor: Ben CB. Ko, Hongkongin Polytechnic University, Hong Kong

vastaanotettu: 10 lokakuu 2012; Hyväksytty: 26 syyskuu 2014; Julkaistu: 29 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Choi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat terveysministeriön Singapore Grant NMRC1177 /2008. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mikrotubulukset – pitkä, rihmamaisia, putken muotoista polymeerit – välittäjänä tärkeitä rooleja solun signalointi, kuljetusta lastien, perustaminen solun polariteetti, ylläpito solun muodon, solumigraatiota ja solunjakautumisen [1], [2]. Muodostuu α- ja β-tubuliinin heterodimeerejä sidottu pää-häntä tavalla, mikrotubulusten eivät ole yksinkertaisia ​​tasapainossa polymeerit; vaan ne ovat erittäin dynaamisia rakenteita ja nopea kokoaminen ja purkaminen dynamiikka on ratkaisevan tärkeää, suurelta osin niiden solutoiminnoille. Ei ole yllättävää, mikrotubulusten polymeroitumisen edellyttää tiukkaa ajallisen ja sääntelyä ja tämä saavutetaan useilla tasoilla, kuten (1) transkription eri tubuliinin isotyyppien joilla on eri tehtävät; (2) säätämällä α /β – tubuliinia tunnusluvut ja heterodimeerin taittuvat (3) kautta eri translaation jälkeisiä modifikaatioita tubuliinin, joka puolestaan ​​muuttaa mikrotubulusten lokalisointi ja /tai sen vuorovaikutusta signalointipolkujen ja (4) kautta vuorovaikutuksessa microtubule- siihen liittyvät proteiinit (MAP), kuten dynein ja kinesiiniin moottori proteiineja, stathmin, TOG, EB1, dynactin 1, Rac1 jne [3] – [5]. Paradoksaalisesti sama dynaaminen luonne mikrotubulusten myös tekee niistä erityisen herkkä estäjiä. Hajottamalla viritetty käyttäytymistä mikrotubulusten, tubuliinia sitovat lääkkeet häiritse prosessia solunjakautumisen ja ne ovat osoittautuneet erittäin tehokkaiksi syöpäpotilailla [6].

Useimmat mikrotubulusta sitova lääkkeet tähän mennessä tunnistetuista on eristetty joko kasveista tai meren eliöiden aikana laajamittainen näytöt luonnontuotteiden. Mikroputkia kohdennettuja antimitoottinen lääkkeet luokitellaan yleensä kahteen ryhmään – mikrotubulusten destabilointiaineita, kuten vinka-alkaloidit, kolkisiini ja mikrotubuluksia stabiloivia aineita, kuten paklitakseli ja dosetakseli. Vaikka taksaaneja ja vinka-alkaloideja edelleen annostella monenlaisia ​​syöpiä ja usein integroitu yhdistelmä kemoterapiahoitojen [7], [8], nykyinen sarja tubuliinia sitovien lääkeaineiden on useita haittoja. Verrattuna muihin syöpälääkkeiden, mikrotubulia sitovat lääkkeet ovat rakenteellisesti monimutkaisia, kemiallisesti monipuolinen ja vähäliukoisena. Lisäksi aktiiviset lääkkeet esiintyy vain pieniä määriä luonnossa ja niukkuus niiden luonnollisista lähteistä on vakavasti vaikeuttanut niiden kliinistä kehitystä. Vaikka tätä kysymystä käsiteltiin kehittämällä osittain tai kokonaan synteesimenetelmiä [9] ja kautta aineenvaihdunnan muokkaamisessa reitin välituotteiden [10], on edelleen ongelma, jossa uusien mikrotubulia sitovat yhdisteet ovat huolissaan. Toinen haittapuoli on lääkeresistenssi johtuu mutaatioista ja /tai ilmentymistä eri tubuliinin isotyyppien kuten βIII-tubuliinia. Lääkeaineresistenssi voi myös johtua yli-ilmentyminen huumeisiin effluksipumppujen, kuten usealle lääkkeelle resistenssiä kuljettaja P-glykoproteiinin (P-gp) tai monelle liittyvää proteiinia (MRP) [11]. Potilaita, jotka annettiin mikrotubulia sideaineita kärsivät yleensä perifeerinen aksonimikrotubuluksiin neuropatia, joka rajoittaa siedettävä annos [12]. Näistä rajoituksista huolimatta useat antimitoottisena lääkkeiden monipuolista sitoutumiskohdat tubuliinin ovat eri vaiheissa kliinistä kehitystä. Armamentarium mikrotubulusten kohdistettujen aineet parannettu farmakodynaamisten ja farmakokineettisten profiilien, minimaalinen neurologinen toksisuus ja laajakirjoinen teho, jatkaa kasvuaan [13] – [15]. Ihannetapauksessa tällaiset johdot olisi myös vailla P-gp-välitteistä lääkevuoto- ja soveltua helppo kemiallista synteesiä lähestymistapoja.

Tässä työssä me raportoimme uuden yhdisteen, joka perustuu indatsoli rakennusteline, 4,5,6 , 7-tetrahydro-1 H-indatsoli-3-karboksyylihappo [1p-tolyyli-menetel- (E) -ylideeni] hydratsidi (Suprafenacine tai SRF), joka osoittaa tehokasta syövän vastaista ominaisuuksia. Keskustelemme tunnistaminen SRF käyttämällä

in silico

suurikapasiteettisten seulontaan, sen kemiallinen optimointi ja selvittäminen sen mikrotubuluksen sitova tilassa. SRF destabilizes mikrotubuluskimppujen johtaa solukierron pidätyksen G2 /M vaiheessa ja solukuolema. Lisäksi osoitamme, että SRF voi ohittaa P-glykoproteiinin kuljettajaan, kohdistuu erityisesti syöpäsoluja ja tehoaa useisiin eri syöpätyyppejä.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja vasta-

nokodatsolin, paklitakseli (Taxol), vinblastiini, ja kolkisiini ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). SRF ostettiin ChemDiv taas SB203580, PD98059 ja SP600125 olivat yhtiöstä Calbiochem (San Diego, CA). Vasta-aineet saatiin seuraavilta yrityksiltä: vimentiinista, α- ja β-tubuliinin JNK-1, MDR-1, Bcl-2, pBcl-2 (T56), pBcl-2 (S70), pBcl-2 (S87) ( Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA); pp38, pERK1 /2, pJNK (Cell Signaling Technology, Denver, MA); monoklonaalinen anti P-glykoproteiini (MDR) (Sigma, USA) ja monoklonaaliset aktiini vasta-aineet olivat peräisin BD Pharmingen (San Diego, CA). [

3H] vinblastiini (spesifinen aktiivisuus, 11,6 Ci /mmol) ja streptavidiinilla päällystettyjä yttriumsilikaattia tuikeläheisyysmääritys (SPA) helmiä hankittiin GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). [

3H] kolkisiinin (spesifinen aktiivisuus 80,4 Ci /mmol) saatiin PerkinElmer (Boston, MA, USA).

Cell Culture

Ihmisen syöpä solulinjoja (HeLa, MDA -MB-231, A549, HCT15, Jurkat, PC12 ja SH-SY5Y) ja ihmisen fibroblastisolulinjat (CCL-116 ja Wi-38) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). SNU16, ihmisen mahasyöpä solulinja, saatiin Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea). Ihmisen epiteelisolujen ensisijainen solulinja F10, ja emosolulinjassa varten lääkkeille vastustuskykyisten mutantit, KB-3-1, ja monilääkeresistenteistä linja, KB-V1 oli antelias lahja tri Peter Dröge (NTU, Singapore) ja Dr. M. Gottesman (NCI, Bethesda, MD), vastaavasti [16]. Solulinjoja kasvatettiin joko Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) tai RPMI 1640, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, 1% penisilliini /streptomysiiniä ja pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2 kammioon. KB-3-1 ja KB-1V, media täydennettiin vielä 1 mM natriumpyruvaattia ja 10 ug /ml vinblastiini, vastaavasti. Kaikki resistenttejä linjat inkuboitiin huumeeton media ennen soluproliferaatioon määrityksiä.

Cell Cycle Analysis

solusyklin etenemistä seurattiin käyttämällä DNA virtaussytometria. Solut ympättiin tiheydellä noin 2 x 10

5 solua /kuoppa 24-kuoppaiselle levylle. Kun yksisolukerrokset olivat 50-70% konfluentteja soluja käsiteltiin lääkkeillä, kuten on ilmoitettu. 24 tunnin kuluttua hoidon, solut trypsinoitiin, pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 80% etanolissa 1 tunti -20 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut suspendoitiin uudelleen propidiumjodidilla (PI) värjäämällä-puskuria (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 10 mM NaCl, 50 ug /ml PI, 10 ug /L RNaasi A, 0,1% NP-40) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa pimeässä. DNA pitoisuus määritettiin FACSCalibur System (BD Biosciences, San Jose, CA). Jokaista analyysia varten 10000 solut laskettiin ja solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa laskettiin käyttäen ModFit LT ohjelmistoa.

Apoptosis määritykset

Apoptoosi seurattiin käyttämällä anneksiini V-propidiumjodidi (PI) double värjäysmenetelmällä. Solut värjättiin käyttämällä anneksiini V-FLOUS -värjäyspakkausta (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut analysoitiin BD LSR II virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA) käyttäen 488 nm: n sinisen laser viritykseen ja 505LP peili-530/30 BP suodatin ja 550LP peili-575/26 BP suodatin yhdistelmiä havaitsemaan fluoreseiini ja PI fluoresenssi, vastaavasti. Jokaisesta näytteestä, 10000 tapahtumien kerättiin.

Mitokondrioiden kalvojännite Mittaukset

muutokset mitokondrion kalvon potentiaali havaittiin käyttäen mitokondrion kalvon Potential Detection Kit (Stratagene, Cedar Creek, TX) ja se perustuu käytöstä kationinen väriaine, 5,5 ’, 6,6′-tetrakloori-1,1′, 3,3’- tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodidia (yleisesti tunnettu JC-1). JC-1 muotojen loisteputki punainen aggregaatteja mitokondrioissa ehjien solujen ollessa apoptoottisia soluja, romahdus mitokondrioiden potentiaali aiheuttaa JC-1 jäädä sytoplasmaan sen monomeerinen vihreä muoto. Lyhyesti, soluja käsiteltiin SRF, läsnä ollessa tai puuttuessa JNK-inhibiittori SP600125, ja inkuboitiin yön yli. Sitten solut trypsinoitiin, pestiin PBS: llä ja pelletöityä (400

g

, 5 min, RT). Seuraavaksi pelletit (1 x 10

6 solua /näyte) suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan 1 X JC-1 Värjäysliuos ja inkuboitiin 15 min 37 ° C: ssa, 5% CO

2 kosteutetussa ilmakehässä. Sen jälkeen 2X pesee määrityspuskurissa, solut suspendoitiin uudelleen lopulliseen tilavuuteen 500 ui koepuskuria. Fluoresenssivoimakkuudet mitattiin BD FACSCalibur System (BD Biosciences, San Jose, CA) ja CellQuest ohjelmistoa käytettiin tietojen analysointia. Mitokondrion potentiaali mitattiin suhde puna-to-vihreän fluoresenssin; käsittelemättömiin soluihin verrattuna, tämä suhde pienenee apoptoottisten solujen.

Caspase aktivointi Pitoisuus

kaspaasi-3-aktiivisuus mitattiin käyttämällä CaspACE Assay System (Promega, Madison, WI), mukaan myyjän protokollaa. Lyhyesti, 2 x 10

5 solua /kuoppa ympättiin 6-kuoppaiselle levylle. Kun yksisolukerrokset olivat 50-60% konfluentteja soluja käsiteltiin SRF: n läsnä tai poissa ollessa JNK-inhibiittori, SP600125 ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa, 5% CO

2 kosteutetussa ilmakehässä. Sen jälkeen kun solut kerättiin, pelletit pestiin jääkylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen Cell Lysis Buffer. Jäädytys-sulatus-menetelmää käytettiin hajottamaan solut ja lysaatit pidettiin jäillä 15 minuutin ajan. Seuraavat lysaattien kirkastaminen sentrifugoimalla (15, 000

g

, 20 min, 4 ° C), supernatantti käytettiin määrittämään kaspaasi-3: n aktiivisuuden. 96-kuoppalevylle, 2 ui (10 mM varastoliuos) Ac-DEVD-pNA substraattia lisättiin reaktioseokseen, joka sisälsi solujen lysaattia, DTT: tä, kaspaasi Assay Buffer ja deionisoitua vettä lopulliseen tilavuuteen 100 ui. Levyjä inkuboitiin yön yli 20-22 ° C: ssa 4 h ja absorbanssi mitattiin 405 nm: ssä käyttämällä Benchmark Plus mikrolevylukijalla (Bio-Rad, Hercules). Käsittelemätön solu-uutteet käytettiin kontrollina kokeisiin.

Immunofluoresenssimikroskopia

Immunohistokemiaa solut kiinnitettiin 3,7% PFA jälkeen inkuboitiin blokkausliuosta (5% BSA: ta PBS: ssä) ja 30 min 4 ° C: ssa. Jälkeen 3X PBS pesun, solut tehtiin läpäiseviksi 0,2% Triton X-100, pestiin 3 x PBS: llä ja sitten niitä inkuboitiin yön yli α- tai β-tubuliinin vasta-aineita, 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen näytteitä inkuboitiin AlexaFluor 488-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (Molecular Probes, Eugene, Oregon) 1 h huoneen lämpötilassa. Objektilasit kiinnitettiin käyttäen pidentää Gold antihäipyminen liuosta (Molecular Probes, Eugene, Oregon), joka sisältää DAPI ja visualisoidaan klo 60X suurennus Zeiss LSM META510 CLSM. Kaikki hankinnan jälkeisten kuvankäsittelyn ja analyysi tehtiin käyttäen MetaMorph ohjelmistoa (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA).

In vitro

Tubuliinipolymerisaatio Pitoisuus

Tubuliinipolymerisaatio oli mitattuna

in vitro

käyttäen Tubuliinipolymerisaatio Assay kit (Cytoskeleton, Denver, CO). Tubuliinia liuotettiin puskuriin 1 (80 mM PIPES, 2 mM MgCI

2, 0,5 mM EGTA, pH 6,9, 10 uM fluoresoivaa reportteri, 1 mM GTP) lopulliseen konsentraatioon 10 mg /ml. Koetta tubuliinin polymerisaatiota, seos, joka sisältää 85 ui tubuliinia (lopullinen konsentraatio 2 mg /ml), 4,4 ui GTP (varastossa 100 mM), 280 ui puskuria 1 ja 75 ui Tubulin glyserolia (80 mM PIPES, 2 mM MgCI

2, 0,5 mM EGTA, 60% glyseroli, pH 6,9), tehtiin ja pidettiin jäillä. Seuraavaksi 5 ui koeyhdistettä, paklitakseli, nokodatsoli tai kontrollipuskurin alikvootitettiin kussakin kuopassa puolen alueen 96-, musta, Tasapohjaisia ​​levylle (Corning Costar). Levyä lämmitetään 1 min 37 ° C esilämmitettyyn levylukijalla. Polymerointi aloitettiin pipetoimalla 50 ui reaktioseosta /hyvin ja seurataan mittaamalla fluoresenssin muutoksen (E

x = 360 nm; E

m = 420 nm). Mittaus tehtiin käyttäen Spectrafluor Plus mikrolevynlukijaa (TECAN GmbH, Itävalta). Lukemat otettiin joka minuutti 1 tunnin (yhteensä 61 lukemat).

Tubulin Competition-Binding tuikeläheisyysmääritys

Tämä määritys suoritettiin kilpailun sitoutumisesta kolkisiini ja vinblastiinin sitoutumiskohdista tubuliinia ja suoritettiin 96-kuoppalevylle. Biotiini-leimattu tubuliinin (Cytoskeleton, Denver, CO) liuotettiin G-PEM puskurissa (80 mM PIPES, pH 6,8, 2 mM MgCI

2, 0,5 mM EGTA, 1 mM GTP: tä ja 10% glyserolia) lopulliseen konsentraatioon 0,8-1 mg /ml. [

3H] kolkisiinin ja [

3H] vinblastiini (lopullinen pitoisuus 50 nM ja 100 mM, vastaavasti), 50 uM SRF ja 1,0 ug biotiini-leimattu tubuliinin sekoitettiin lopullinen reaktio 100 ul: G-PEM-puskuria ja inkuboitiin 45 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Streptavidiini-SPA-helmiä (80 ug /kuoppa) lisättiin kuhunkin reaktioseokseen ja inkuboitiin vielä 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Radioaktiivinen määrä mitattiin käyttäen Wallac Microbeta-tuikelaskurilla (PerkinElmer, Waltham, MA). Valvontaa reaktioita, SRF jätettiin pois reaktioseoksesta.

In vivo

tehokkuustutkimuksissa

sekamuotoinen immuunipuutos (SCID) naarashiiriä 4-6 viikon iässä, saatiin Animal Resources Centre (Murdoch, Australia). Istutettiin ihonalaisesti kylkeen 1 x 10

7 HCT15 ihmisen paksusuolen adenokarsinooma soluissa. Hoito alkoi, kun kasvaimen koko saavutti 100-200 mm

3 tai suurempi. Eläimiä hoidettiin intraperitoneaalisesti (i.p.) 20 mg /kg /annos SRF on viimeisen annostelun formulaatiota tai 0,9% suolaliuosta ajoneuvoon. Yhdiste annettiin kasvainta kantavien hiirten päivinä 1, 4, ja 7 jälkeen pysähdyspaikan, ja kasvaimen massa [(pituus x leveys

2) /2], määritettiin kerran kolmen päivän 9 päivää.

tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet itsenäisesti toistettiin vähintään kolme kertaa. Laatua koskevat tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM. Vertailut kahden ryhmän välillä analysoitiin kautta opiskelijan

t

testi, ja arvot

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Identification SRF uutena tubuliinia sitovan pieni molekyyli

tunnistaa uusia syövän vastaisia ​​molekyylejä, jotka toimivat sitoutumalla tubuliinin käynnistimme tavoitteisiin perustuva

in silico

seulonta pienten molekyylien käyttämällä ChemDiv kirjasto . Alkuperäisen osumia tunnistaa virtuaalisen näytön testattiin niiden kyky inhiboida sekä solujen proliferaatiota ja tubuliinin polymerisaatiota. Kaikkien testattujen yhdisteiden, indatsolirenkaan hydratsidi johdannainen – 4,5,6,7-tetrahydro-1 H-indatsoli-3-karboksyylihappo [1- (3-hydroksi-4-metoksifenyyli) -meth- (E) – ylideeni] hydratsidi, havaittiin estävän tehokkaasti mikrotubulusten polymeroitumisen (IC

50 = 0,77 uM). Edelleen tunnistaa analogien parantunut potencies, Structure Activity Relationship (SAR) tutkimukset tehtiin [Methods S1] ja fokusoitu kirjasto 72 analogit syntetisoitiin ja seulottiin niiden kyky estää mikrotubulusten polymeroitumisen. Tätä työtä tunnistaa analoginen 4,5,6,7-tetrahydro-1 H-indatsoli-3-karboksyylihappo [1-

p

tolyyli-menetel- (E) -ylideeni] hydratsidi (analoginen 4; tästä lähtien kutsutaan SRF), koska voimakas molekyyli (IC

50 = 0,38 uM) [Kuva 1A].

(A) kemiallinen rakenne SRF. (B) vaikutus SRF mikrotubulusten polymeroitumisen

in vitro

. Puhdistettu tubuliinin inkuboitiin 37 ° C: ssa ilman (DMSO) tai läsnä lääkkeiden, kuten taksoli (3 uM), nokodatsoli (10 uM), SRF ja absorbanssi mitattiin 420 nm: ssä joka 1 min yli 60 minuutin aikana. SRF esti mikrotubulusten polymeroitumisen pitoisuudesta riippuvalla tavalla osoitettiin väheneminen absorbanssi ajan. (C) konfokaali micrographs HeLa-solujen alttiina SRF, taksolin ja nokodatsoli. Solut leimattiin FITC-konjugoidulla anti-tubuliinia vasta-aine. SRF käsittely tuhoaa monivaiheinen mikrotubulusverkon. Asteikko bar = 10 uM.

SRF estää solujen lisääntymisen eri syöpäsolutyyppien

Käytimme kolorimetristä määritystä arvioimiseksi anti-proliferatiivista vaikutusta SRF syöpäsolujen johdettu laaja edustavien kasvaintyypeille – kohdunkaulan adenokarsinooma (HeLa, KB-3-1, KB-V1), T-solulymfooma (Jurkat), mahasyöpä (SNU-16), rintasyöpä (MDA-MB-231), keuhko syöpä (A549) ja peräsuolen adenokarsinooma (HCT-15) ja neuroblastooma (SH-SY5Y) [Taulukko 1]. Kaikki syöpäsolulinjat testattu osoitti alttius SRF IC

50 arvoja submikromo- laarisena alueella (83-381 nM). Mielenkiintoista, verrattuna taksolin, SRF oli korkeampi teho kohti neuroblastooma SH-SY5Y ja peräsuolen adenokarsinooma HCT-15 solulinjoissa. Lisäksi testasimme myös vaikutus SRF normaaleihin soluihin kuten ihon fibroblastisolulinjassa CCL-116 ja ihmisen epiteelisolujen ensisijainen solulinja F10. Sekä CCL-116 ja F10 osoittivat yli 80% eloonjääminen sen jälkeen, kun 24 tunnin altistuminen SRF, kun taas vain 60% eloonjääminen nähtiin, kun samat solut käsiteltiin taksolin identtisissä olosuhteissa [kuvio S1]. Yhdessä meidän tiedot vahvistavat, että SRF valikoivasti kohdistuu syöpäsoluja ja tehoaa useita eri syöpätyyppejä.

SRF voi ohittaa p-glykoproteiinin lääke effluksipumpun

kliininen menestys käytetyt lääkkeet syövän hoidossa on haitannut kehittymistä lääkeresistenssideterminantit. Ilmiö monilääkeaineresistenssin liittyy usein lisääntyminen ilmaus

MDR1

geeni, joka koodaa P-glykoproteiinin (P-gp), energiariippuvainen effluksipumpun. Ollakseen kliinisesti merkittävää, SRF on voitava ohittaa P-gp-välitteistä ulosvirtausta. Siksi määritettiin vaikutus SRF proliferaatioon orvaskeden karsinoomasolulinja KB-V1, joka on vinblastiini kestävä alilinja johdettu vanhempien KB-3-1-solut [16] [Taulukko 2]. KB-V1-solut ovat erittäin rikastettu P-gp: n ja ne osoittavat ristiresistenssiä kolkisiini ja adriamysiini [Kuva S2]. Vertailu anti-proliferatiivinen vaikutus välittyy SRF ja taksolin paljasti, että SRF on 35 kertaa voimakkaampi kuin taksoli vastaan ​​KB-V1-solulinjasta, kun taas molemmat yhdisteet oli yhtä tehokas vastaan ​​KB-3-1-solut, koska nämä solut eivät ole tiedossa yli-ilmentävät P-gp: n [17]. Kyky SRF ohittaa P-gp luultavasti selittää, miksi se on tehokkaampi kuin taksoli SH-SY5Y neuroblastooma ja HCT-15 ja peräsuolen adenokarsinooma soluissa molemmat syöpäsolutyyppien ilmaista kohonneet P-gp-proteiinia [17] – [19].

SRF destabilizes mikrotubulusten kokoonpanoa sitoutumalla kolkisiinin sitoutumiskohtaan

arvioimiseksi pääasiallinen vaikutustapa SRF, me profiloitu sen vaikutus tubuliinin polymerisaatiota

in vitro

[Kuva 1B]. Tulokset osoittavat, että SRF estää tubuliinin polymeroinnin pitoisuudesta riippuvaisella tavalla IC

50 0,38 uM. Lisäksi mikrotubulusten häiritseviä vaikutus SRF verrattiin kahta eri mikrotubulusten kohdennettuja lääkkeitä, taksoli, nokodatsoli, joka tunnetaan nimellä anti-neoplastisia aineita, häiritsemällä polymeroinnin tubuliinin. Erityisesti SRF vaikuttaa puhkeamista polymeroinnin (nukleaatio vaihe) ja sen korko (venymä vaihe) mikä vähentää tubuliinia polymeerin massa. Tutkimme myös vaikutus SRF on mikrotubulusten kokoonpanoa solutason avulla immunohistokemiallisesti. HeLa-solut altistettiin SRF 24 h kiinnitettiin ja mikrotubuleihin värjätään α- tai β-tubuliinia aineita. Verrattuna käsittelemätön kontrolli soluja, jotka ylläpitävät monimutkainen ja järjestäytyneen mikrotubulusverkoston, SRF hoito aiheutti täydellisen tuhoutumisen tämän solun tukirangan verkoston ja ulkonäkö runsas, ominainen lyhyt nippuja jotka jaettiin kaikkialle sytoplasmaan näissä soluissa [Kuva 1C]. Samanlaisia ​​häiriöitä mikrotubulusten havaittiin nokodatsoli altistuminen taas taksolin hoito tuotti lyhyempi mutta tiheämpi mikrotubuleiksi sopusoinnussa rooliaan mikrotubulia stabilointiaine [Kuva 1C].

Yhdisteet, jotka estävät tubuliinin polymerisaatiota lähinnä sitoutuvat tunnettuihin erillisten sivustoja, nimittäin taksoli, vinblastiini, orcolchicine sivustoja tubuliinia. Kilpailuun sitova tuikeläheisyysmääritys (SPA) käytettiin probeSRF sitoutumiskohdasta tubuliinia. SRF ei vähentänyt erityisiä SPA laskee kannustanut konjugoimalla biotiinileimatuilla tubuliinin kanssa [

3H] taksolin tai [

3H] vinblastiinin, mutta voimakkaasti kilpaili sitoutumisesta [

3H] kolkisiinin tubuliiniin [Kuva 2A ja 2B]. Seuraavaksi molekyylimallinnusta ja telakoinnin tutkimukset tehtiin edelleen selvittämään sitoutumispaikan SRF. Käyttämällä kiderakenne tubuliinia kolkisiinin: stathmin-kaltaisen domeenin (ATE 1SA0), sekä kolkisiini [kuvio 2C] ja SRF [kuvio 2D] telakoitiin osaksi kolkisiinia sitovaan taskuun tubuliinia. Huolimatta rakenteellinen erilaisuus, SRF on sama kartesiolaisen tilaa kuin kolkisiini. Toisin kuin kolkisiini, SRF puuttuu vetysidosvuorovaikutuksia kanssa Cys241 of β-ketjun. Sen sijaan indatsolirenkaan SRF muodostaa vetysillalla vuorovaikutus Asn349, Lys352 on β-ketjun sekä Val181 ja Thr179 on α-ketjun, kun taas 4-metyyli-ryhmä distaalisen fenyylirenkaan muotoja hydrofobisia vuorovaikutuksia β-ketjun Lys 254. yhdessä telakointi tutkimukset paljastavat, että vaikka SRF ja kolkisiini sitoutuvat samanlainen sivusto tubuliinin, SRF on sitova tilassa hieman erilainen kuin kolkisiinin [kuvio 2E].

(A) SRF kilpailee kolkisiinin sitoutumisesta mikrotubulusten kuin määritettiin käyttäen kilpailu sitova tuikeläheisyysmääritys (SPA). Verrattuna kontrolliin (ei kilpailijaa), SRF väheni kolkisiini sitoutumisen 2,5-kertaiseksi. Data esitetään keskiarvoina ± SEM. *

P

0,05, **

P

0,01 vs. kontrolli. (B) SRF ja vinblastiinin on erilaiset sitoutumiskohdat tubuliinin sillä SRF ei kilpaile vinblastiinin. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo (± SD) kolmesta itsenäisestä kokeesta. Data esitetään keskiarvoina ± SEM. *

P

0,05 vs. kontrolli. (C-E) Cartoon esitys sitoutumispaikan kolkisiinia (C) ja SRF (D) tubuliinia. Sitoutumispaikan huumeiden tubuliinin tutkittiin telakoinnin tutkimukset käyttämällä molekyyli- telakointiohjelmaa GOLD (Genetic optimointi Ligandin Docking, Cambridge Crystallographic Data Centre, UK) [Methods S1]. Yhdisteet (kolkisiini tai SRF) on telakoitu johonkin kolkisiinia sitovaan taskuun tubuliinin käyttäen kiderakenne tubuliinia kolkisiinin: stathmin-kaltaisen domeenin [PDB-koodi: 1SA0]. H-sidoksen vuorovaikutuksesta indatsolirenkaan SRF ja N349 ja K352 on β-ketjun (vihreä) sekä T179 ja V181 sekä α-ketju (sininen) on korostettu. Paneeli E näyttää päällekkäin SRF ja kolkisiinin esiin sitoutumisen ero malleja näiden molekyylien.

SRF pidätykset solusyklin G2 /M-vaiheen

Koska mikrotubulusdynamiikan on tärkeä rooli solusyklin etenemistä, mitoosi stall voi johtaa erilaisiin kemoterapeuttiset tuloksia kuten mitoosi kuolema, mitoosi exit, apoptoosin tai aneuploidiaa [11], [20]. Tutkimiseksi vaikutus SRF solusyklin etenemisen, HeLa-soluja käsiteltiin eri pitoisuus SRF 24 h ja solukierron seurattiin virtaussytometrialla. SRF hoito aiheutti täydellisen romahduksen kaikki solut G

1 vaihe annoksesta riippuvaisella tavalla ja dramaattinen kasvu G

2 /M populaatio soluja käsiteltiin 10 uM SRF [kuvio 3A ja Kuva S3]. Samanlaisia ​​vaikutuksia mikrotubuleiksi havaittiin nokodatsoli ja taksolin. Solusyklin pysähtymisen mukana oli epäonnistuminen sukkularihmaston eristää nopeasti jakautuvat solut [Kuva 3B]. Kuitenkaan mitään merkittävää kasvua G

2 /M vaiheessa havaittiin normaaleissa solulinjoissa (CCL-116, WI-38 ja F10) päälle SRF käsittely [Kuva S4]. Koska solukierron pysähtymisen poikkeuksetta laukaisee apoptoosin, suoritimme anneksiini V-PI kaksinkertainen värjäys SRF käsiteltyjä soluja ja näin valvoa fosfatidyyliseriini valotus, signaali varhaisen apoptoosin. Lyhyen 7 h altistuminen, väestön varhaisen apoptoottisten solujen (anneksiini V

+ /PI

-) dramaattisesti kasvoi 2,4% 21,7% [kuvio 3C], mikä osoittaa, että SRF indusoi nopeaa apoptoosia jakautuvat solut .

(A) virtaussytometrinen analyysi DNA-pitoisuus käsiteltyjen solujen SRF (10 uM), nokodatsoli tai taksolin. Esitetyt tulokset edustavat yhden parametrin histogrammit käsiteltyjen solujen. Kuten taksoli ja nokodatsolin, SRF estoa mikrotubulusdynamiikan johti solusyklin pysähtyminen G

2 /M siirtymävaihe. (B) Fluoresenssi micrographs mitoosi soluihin, joita oli esikäsitelty osoitetuilla yhdisteillä. Verrattuna ajoneuvo käsiteltyjä soluja, SRF ja muut TBAs esti muodostumista ja eriytymistä sukkularihmaston. Mikrotubulusten (vihreä) värjättiin FITC-konjugoidulla anti-tubuliinin-vasta-aine; nucleus (sininen) värjättiin DAPI. Kuvat otettiin klo 60X suurennus. Asteikko bar = 5 uM. (C) SRF-hoito indusoi nopeaa apoptoosia jakautuvat solut. Lyhyen 7 tunnin SRF altistus (10 uM), apoptoottinen eteneminen seurattiin kaksinkertainen värjäämällä solut anneksiini V-FITC (FL-1) /PI (FL-2). Tänä aikana prosenttiosuus anneksiini V

+ /PI

– (osoittaa varhaisen apoptoosin) soluja kasvoi 2,4% (valvonta) 21,7%. Kinetiikka Tämän lisäys on samanlainen kuin kanssa nokodatsoli ja taksolin. Molemmat yhdisteet aiheuttaman apoptoosin noin 25,4% (nokodatsoli) ja 33,2% (taksoli) solujen tämän ajan kuluessa. Kokeet tehtiin kolmena kappaleena (n = 3) ja data-arvo laskettiin keskiarvo.

SRF indusoi apoptoosin kautta JNK-välitteisen fosforylaation Bcl-2 ja Bad

Bcl- 2 perheen esikasvaintekijöiden on master sääntelyviranomaisten apoptoosin ja toimivat molekyyli- reostaattien ohjaamaan solujen selviytymisen [21]. Koska anti-mitoottinen lääkkeitä, kuten paklitakselia, vinkristiini, vinblastiini, indusoi Bcl-2 hyperfosforylaation silmukan alueella [22] – [26], tutkimme vaikutus SRF on Bcl-2. Otteita HeLa-soluista käsiteltiin 10pM SRF 24 h analysoitiin immunoblottauksella monoklonaalisilla anti-Bcl-2-vasta-aine. Tulokset osoittavat, että yhdessä Bcl-2, SRF käsiteltyjä soluja on ylimääräinen bändi (t), joka on hitaampi maahanmuuttoluku verrattuna Bcl-2 [Kuva 4A, ylempi ruutu]. Toisin kuin HeLa-solujen, ajoneuvon käsiteltyjä soluja kokonaan puuttui ylimääräinen bändi. Samoin fosforyloitumisaste Bcl-2: n normaalin diploidi keuhkojen fibroblastisolulinjaa WI-38 pysyi muuttumattomana jopa sen jälkeen 24 h SRF hoitoon [kuvio 4A, Lähi-Panel]. Vahvista, että bändi (t) ovat todellakin fosforyloitua muotoja Bcl-2, jälkeen blotit tutkittiin fosfo-Bcl-2-spesifistä vasta-aineita. SRF indusoi Bcl-2: n useita tähteitä (T56, S70 ja S87), jotka kaikki sijaitsevat sisällä joustava silmukka-alueelle [kuvio 4B]. Yhdessä nämä havainnot edelleen muistuttaa siitä, että SRF selektiivinen tavoitteet syöpäsoluja. Sen lisäksi, että Bcl-2, 24 h altistuksen SRF hoito indusoi myös fosforylaation pro-apoptoottisten Bcl-2-perheen jäsenen – Bad [kuvio 4C], kun taas Bcl-x

L, Bak ja Bax pysyi ennallaan [kuvio S5].

(A) Western blot-analyysi HeLa ja WI-38 solu-uutteiden käsiteltiin 10 uM SRF 24 tuntia ja koetettiin anti-Bcl-2-monoklonaalinen vasta-aine. Hitaampi liikkuva vyöhyke, joka vastaa fosforyloitua muotoa Bcl-2 on läsnä HeLa otteita, mutta puuttuu WI-38 lysaateissa, mikä osoittaa, että SRF indusoi valikoiva Bcl-2: n syöpäsoluja. (B) SRF välittää Bcl-2 hyperfosforilointi. Lääkkeellä käsiteltyjen HeLa lysaatit erotettiin 12% SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus tehtiin käyttämällä spesifisiä fosfo-vasta-aineita vastaan, T56, S70 ja S87 jäämiä Bcl-2; kaikki nämä aminohapot sijaitsevat joustavien silmukka-alueen proteiinin. (C) Aika tietenkin analyysi Bad fosforylaation aiheuttama SRF hoitoa. HeLa-solulysaateista analysoitiin immunoblottauksella käyttäen anti-Bad monoklonaalinen vasta-aine. SRF (10 uM) käsittely muuttaa fosforylaation tilan pro-apoptoottisen proteiinin Bad kuten ulkonäkö hitaampi vaeltavat fosfo-Bad juova 24 h. Bändi oli poissa kontrollista (DMSO käsitelty) soluja vielä 24 tunnin jälkeen.

mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien (MAPK), ilmentyy kaikissa solutyypeissä, välittää signaaleja alkaen solukalvon tumaan vastauksena erilaisiin ärsykkeisiin ja myös säädellä monenlaisia ​​biologisia prosesseja kriittinen solujen homeostaasin [27]. Joukossa erilaisia ​​reittejä välittämä MAPK perheenjäseniä, solunulkoinen signaali-säänneltyjen kinaasi 1 ja 2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminaalinen kinaasi /stressi-aktivoidun proteiinikinaasin (JNK /SAPK) ja p38 MAPK, tiedetään