Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cellular motiliteetti on perusta syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäke. Siinä tapauksessa, rintasyövän, yleisin syöpä naisilla, etäpesäke edustaa tuhoisin sairauden vaiheesta. Keskeinen rooli solujen liikkuvuuden syövän kehittymisessä korostaa ymmärtämisen erityisten mekanismien mukana tässä prosessissa. Tässä yhteydessä kasvainten kehittymiseen ja etäpesäkkeiden olisivat seurausta menetys tai vika mekanismeja, jotka kontrolloivat solun tukirangan remodeling. Profiliiniin I kuuluu perheeseen pieniä aktiinin sitovia proteiineja, joita ajatellaan auttamaan aktiinifilamentin venymä kärjessä vaeltavia solujen. Perinteisesti profiliinia I on pidetty olennaisena ohjauselementin aktiinin polymerointiin ja solujen vaeltamiseen. Expression of profiliiniin I säätyy alas rinta- ja erilaisia ​​muita syöpäsoluja. MDA-MB-231-soluja, rintasyöpä solulinjassa, edelleen esto profiliiniin I ilmaisun edistää hypermotiliteettia ja metastaaseja toteaminen erottuvalla ehdotettu roolia profiliiniin parantamisessa polymeroinnissa. Tässä raportissa olemme hyödyntäneet fluoresenssin elpymisen jälkeen Valovalkaistuminen (FRAP) GFP-aktiini määrällisesti ja verrata aktiini dynamiikka kärjessä tasolla sekä syöpää ja ei-syöpäsolujen malleja. Tuloksemme viittaavat siihen, että (i) korkeatasoisen aktiini dynamiikkaa (eli suuri mobiili murto aktiinisäikeiden ja nopea uusiutuminen) on yhteinen piirre joidenkin syöpäsolujen; (Ii) aktiini polymerointi osoittaa laaja riippumattomuus läsnäolosta ekstrasellulaarisen kasvutekijöiden; ja (iii) tuloksemme myös tukevat roolia profiliiniin I säätelyssä aktiini polymerointi, kuten nostamalla solunsisäisiä tasoja profiliiniin I pieneni mobiili murto suhde aktiinisäikeiden ja hidastivat polymeroitumisnopeuteen; Lisäksi lisääntynyt profiliinia tasot myös vähentänyt yksittäisten solujen nopeuden ja paikantuu.

Citation: Lorente G, Syriani E, Morales M (2014) aktiinisäikeiden kärjessä syöpäsolujen luonnehtii korkea Mobile Fraction ja liikevaihto asetuksen profiliiniin I. PLoS ONE 9 (1): e85817. doi: 10,1371 /journal.pone.0085817

Editor: Yulia Komarova, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 30, 2013; Hyväksytty 3 joulukuuta 2013 mennessä; Julkaistu: 17 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Lorente et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Espanjan ministeriön Research (SAF2010-16024, BFU 2012-17537, KUN 2010 ja 2011) sekä Fundación Rioja varoja. GL oli apurahan haltija Universidad de Barcelona. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cellular liikkuvuutta on monimutkainen prosessi, joka esiintyy kaikissa solutyypeissä [1]. Muuttoliike yli tasainen pinta käsittää ulkonemat ohut kalvo vaipan, lamelli, täynnä monivaiheinen aktiini haarautunut verkko. Voima varten kalvon ulokkeen ja laajennus tarjoaa kontrolloiduissa ja rajoitettua aktiini polymerointi lähimpään reunaan kalvon, ns etureunan. Pidentämisen aikana, aktiinisäikeiden on polarisoitunut niiden piikkilanka loppuun (tai plus pää) osoittaa kohti kalvo [2], joka työntää säikeiden pakottaen laajentaminen lamellin. Lamellilaikalla laajennus on siis mikä määrää aikaan ja liike solun [3]. Reguloinnista solumigraation on kehityksen kannalta välttämätöntä, haavan paranemisen ja immuunivastetta, kun taas poikkeava ja hallitsematon solun liikkuvuus on toistuva piirre useita syöpäsoluja.

Useat tutkimukset osoittavat, että profiliiniin I (PfnI) olennainen aktiini-sitovaa proteiinia, voi olla tärkeä sääntelyn rooli prosessissa solujen liikkuvuutta. Siten

Dictyostelium amoebae

mutantteja PfnI näytteille motiliteetin ja sytokineesiin viat [4], samoin kuin ”chickadee”, null mutantti varten homologia PfnI in

Drosophila

[5]. Samoin hiljentäminen PfnI ihmisen verisuonten endoteelisoluissa indusoi eston liikkuvuutta ja vikojen kalvo pullistuma [6]. Lisäksi PfnI knockout on osoitettu johtavan alussa alkion solujen kuolemaan hiirillä [7].

jäsenet profiliiniin perheen (PfnI ja pFN IV), PfnI on yleisimmin ilmaistuna. Se oli alun perin tunnistettiin G-aktiini pidättävää proteiini [8], ja sen jälkeen se on luokiteltu useita muita toimintoja, kuten ydinvoima-sytoplasmaan liikenne aktiini sitoutumalla exportin 6 [9], mRNA [10], sekä vesicular endosytoosin vuorovaikutuksessa clathrin ja valosin sisältävä proteiini [11]. Nykyään se on yleisesti hyväksytty, että sen tärkein tehtävä on edistää aktiini polymerointi kataly- vaihtamalla ADP ATP G-aktiini monomeerin [12]. Lisäksi rakenne PfnI sisältää yhden polyproliini sitovan domeenin (PLP) [13], [14] ja kaksi fosfoinositidi sitoutumiskohdat [15] – [17]. Nojalla entisen, PfnI vuorovaikutuksessa runsaus proliini-rikas proteiineja. Muun muassa se sitoutuu suoraan Ena /VASP [18], N-WASP [19], WAVE [20] ja aktiini kidealkion perheen formins [21]. Kaikki nämä proteiinit rekrytoida PfnI vyöhykkeisiin dynaamisen aktiini remodeling, kuten etureuna lamellipodioihin. Solunsisäinen lokalisaatio PfnI vahvistaa yhdessä alueiden intensiivistä aktiini polymerointi ja siten PfnI löytyy PTk2 microfilaments of marsupial fibroblastien [22], Leech hermosolujen kasvua kartioita [23], naudan trabekkelikudokseen lamellit [24], ulkonevat alueet rotan fibroblasti [25], ja lähellä etenevä reunaa endoteelisolujen [26].

olennainen piirre kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden on lisääntynyt liikkuvuus ja muuttoliike kapasiteetti soluja. Mielenkiintoista on, että ekspressiotasot PfnI ovat alas-säädellä useita invasiivisia rinta-, haima- ja maksan syöpäsolun tyypit [27] – [31]. Lisävähennys PfnI tasojen hiljentämällä sen poistaminen johtaa jopa suurempi liikkuvuudessa [29], [32] ja kasvaimen etenemiseen [33]. Päinvastainen on myös totta: kasvua PfnI tasoilla vähentää solujen invasiivisuus ja liikkuvuus, jonka jälkeen ylössäätöä stressiin kuitujen ja polttovälin tarttuvuus [27], [29]. Lisäksi PfnI yliekspressio estää sekä kohdunulkoinen ja potilaalle tehdä tuumorigeenisyyteen ja mikro-etäpesäkkeitä [32]. Kasvaimen suppressioaktiivisuutta esiintyy tämän mekanismin kautta, sekä aktiinin ja fosfoinositidin sitoutumiskohdat PfnI tulee toimia [30], [32], [34]. Lisäksi PfnI yli-ilmentyminen on raportoitu säätää ylös PTEN ilme, siis epäsuorasti estämällä Akt-aktiivisuutta säätelemällä fosfoinositidi tuotanto [35].

fosfoinositidi sitoutuminen PfnI on tärkeämpää kuin aiemmin arvioitiin. ENA /VASP perheen proteiinien uncaps vapaiden piikkilanka päät aktiini, joka mahdollistaa niiden asteittaisen venymisen [36]. Lamellipodin (LPD) sitoutuu Ena /VASP kautta EVH1 domain, ja erityisesti vuorovaikutuksessa PI (3,4) P

2. Tällä tavalla kalvo tavoite LPD pystyy rekrytointi Ena /VASP kalvoon. Äskeittäin havainnot viittaavat siihen, että PfnI rajoittaa käytettävissä olevan PI (3,4) P

2. Tällä tavoin PfnI olisi säädellä negatiivisesti fosfoinositidi tasot kalvon, ja epäsuorasti rajoittaa LPD-Ena /VASP kohdistaminen kalvoon [37]. MDA-MB-231-solujen, PfnI ehtyminen säätelee LPD kertymistä, epäsuorasti nostamalla Ena /VASP pitoisuus eturintamassa, ja näin edistää aktiini polymerointi ja raportoitu hypermotiliteettia jälkeen PfnI ehtyminen [38]. Kuitenkin taustalla seurauksia näillä PfnI ehkäisevästä toimet aktiini liikevaihdon jäävät selvittämättä. Kokeelliset todisteet osoittavat, että funktionaalinen aktiinin sitovan domeenin PfnI on tärkeää vähentää syöpäsolujen liikkuvuutta ja kasvaimen fenotyypin [29], [30]. Koska lukuisat kokeellisten todiste tärkeyttä PfnI säätelyssä aktiini polymerointi ja solujen vaeltaminen, on hämmentävää, kuinka alhainen ekspressiotasot PfnI liittyvät parannettu solujen liikkuvuutta, ja miten aktiini treadmilling voidaan säädellä.

tässä raportissa liikevaihto lamellipodial aktiini tutkittiin käyttäen Fluoresenssi Recovery jälkeen Valovalkaistuminen (FRAP) [39]. Tuloksemme osoittavat, että solun tukirangan kärjessä syöpäsolujen on paljon dynaamisempi kuin ei-kasvainsoluja. Lisäksi kasvava PfnI tasot syöpäsoluissa johtaa vähentyneeseen aktiini treadmilling ja heikentynyt solujen liikkuvuutta. Lopulta löysimme myös näyttöä siitä, että aktiini treadmilling syöpäsoluissa on herkkä solunulkoinen sääntelyä kasvutekijöiden.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät

MDA-MB-231 ihmisen rinta- kasvaimen solulinjojen viljeltiin DMEM F12-Ham väliaineessa ja 10% FBS: ää (Sigma). MCF10A ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen solulinja kasvatettiin seuraavassa viljelyväliaineessa: HEPES 15 mM, hevosen seerumia 5%, EGF 20 ng /ml, hydrokortisoni 0,5 mg /ml, koleratoksiini 100 ng /ml, ihmisen insuliini 10 mg /ml, 50 mg /ml penisilliiniä ja 50 U /ml streptomysiiniä DMEM F12 HAM (kaikkia myy Sigma). A549-ihmisen keuhkosyövän solulinjassa, MEF hiiren alkion fibroblasteja ja HeLa ihmisen kohdunkaulan kasvaimen solulinja viljeltiin DMEM: ssa, jossa on 50 mg /ml penisilliiniä, 50 U /ml streptomysiiniä ja 10% FBS: ää (Sigma Aldrich). MDA-MB-231-solut hankittiin ATCC (USA; Ref. HTB-26). MCF10A soluja, väylän 8, oli antelias lahja LP Saucedo (CNIO, Madrid, Espanja). A549 ja HeLa-solut, passage 10, oli antelias lahja muoto H. Aguilar (ICO, Barcelona, ​​Espanja). MEF-solut, passage 6, oli antelias lahja A. Angulo (IDIBAPS, Barcelona).

Immunosytokemia ja kuva-analyysi

lyhyesti, sillä immunosytokemiallisia analyysejä, soluviljelmiä huuhdeltiin PBS: ssä ja vahvistettua 15 min 4% paraformaldehydi /PBS: ssä. Peitinlasit pestiin sitten kolme kertaa PBS: ssä ja inkuboitiin 30 min estoliuoksessa (2% vuohen seerumia, 2% seerumialbumiinia, 0,1% Triton X-100 PBS: ssä). Vasta-aineet laimennettiin sopivaan konsentraatioon blokkausliuoksessa. Peitinlasit inkuboitiin 60 min vasta-aineen liuokseen. Näytteet pestiin sen jälkeen kolme kertaa ja inkuboitiin 30 min sopivan fluoresenssi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita. Lopuksi peitelaseja pestiin viisi kertaa ja asennettu Mowiol. Fluoresenssi kuvat saatiin käännettyä mikroskooppia (Olympus IX70) käyttäen TILL monokromaattoria kuin valonlähde. Kuvat on otettu, johon on kiinnitetty jäähdytetty CCD-kamera (Orca II-ER, Hamamatsu).

Seuraavia vasta-aineita käytettiin: anti-vinkuliinin monoklonaalinen vasta-aine (Chemicon, ref. MAB3574) ja anti-profiliiniin polyklonaalisia ja monoklonaalisia vasta-aineita (Cell Signaling, ref. 3237 ja Synaptic järjestelmä, ref. 308 011). Toissijainen vasta, Oregon vihreä falloidiinia ja falloidiinia-Alexa Fluor® 594 ostettiin Invitrogen. Image J analyysin ohjelmisto (National Institutes of Health) käytettiin määrällisesti leviämisen ja polttovälin tarttuvuus.

Solun Kuuluvuusmittaukset ja Focal kiinnikkeistä kvantifiointiin

Lyhyesti, 10000 solua siirrostettiin 12 mm: n peitelaseille 24-kuoppaisilla levyillä. Sen jälkeen, kun vastaava käsittely, solut kiinnitettiin 4% PFA ja värjättiin Oregon vihreä falloidiinia tai falloidiinia-Alexa Fluor® 594 puutteesta huolimatta rasitukseen liittyviä säikeitä, falloidiinia värjäys mahdollisti mittauksen koko solun pinnalla. Solun alueella kvantifioitiin digitaalisen raja-analyysillä käyttäen Image J ohjelmisto.

rekombinanttiproteiini

Joissakin kokeissa solunsisäisiä tasoja profiliiniin muutettiin käyttäen läpäisevä membraani versio PfnI [24], [ ,,,0],40]. PTD4-profiliiniin (21 kDa) tuotettiin fuusioimalla transduktiodomeeni, PTD4 [41], jotta profiliiniin. Rekombinanttiproteiinia ilmaistu

E. Coli

ja puhdistettiin kuten aiemmin on kuvattu [40]. Lyhyesti, toimivaltaisen

E. Coli

BL21-pLYS transformoitu pRSETA-PTD4-pFN I vektori saatiin aikaan lisäämällä 1 mM IPTG: tä (Sigma) 37 ° C: ssa 6 h. Bakteerien pelletit lysated jäätymisen ja sulamisen protokollan nestemäisessä N

2, jonka jälkeen sonikoimalla jäissä, kun läsnä on DNAasi ja proteiini-inhibiittori cocktail (Sigma). Solulysaateista erotettiin sentrifugoimalla ja liukoinen proteiini eristettiin käyttämällä Ni-NTA-hartsi-pakattuja kolonneja (Qiagen). Proteiini pesu ja eluutio suoritettiin suuria pitoisuuksia imidatsolia. Puskurin vaihto ja pitoisuus rekombinanttiproteiinin suoritettiin sentrifugoimalla Amicon Ultra-15 10000: n MWCO sentrifugisuodattimet (Millipore), joka korvaa Eluointiliuoksen PBS: llä. Proteiinit jäädytettiin nestemäisessä N

2, ja niitä säilytettiin -80 ° C: ssa 10-15% glyserolia PBS: ssä. Bakteerit ja proteiinit hoidetaan suurimmalta osin Safety suuntaviivat Laboratory työskentelevien Trans-Activating Trans- (TAT) Protein transduktiodomeeneja.

Transfektio

Transfektio tehtiin käyttäen Efectene transfektio Reagent Kit Qiagen seuraten valmistajan ohjeita. Useat ekspressiovektorit käytettiin: CMV-GFP, CMV-GFP-aktiini ja CMV-MembraneCherry toimitti ystävällisesti Dr. F Tebar (University of Barcelona, ​​Espanja), ja CMV-GFP-PfnI toimitti ystävällisesti Dr. Hitomi Mimuro (University of Tokio, Japani).

Stable solulinjat

Stable solulinjoja MDA-MB-231 tasyöpäsolulinja transfektoitu ilmentävien plasmidien GFP-aktiini, GFP-PfnI, MembraneCherry-PfnI ja GFP alle CMV promoottori ohjaus (kaikki työ suoritettiin solujakojen 6.-8). Transfektiot suoritettiin Efectene transfektioreagenssin (Qiagen), kuten on kuvattu protokolla. Transfektoidut solut valittiin kolme viikkoa inkuboinnin gentamysiini 1 mg /ml (Sigma). FACS käytettiin erottamaan korkean ja matalan ilmentävät GFP-aktiini soluissa. Puskuri solulajittelussa liuosta käytetään koostui 5 mM EDTA, 25 mM HEPES pH 7,0, 1% FBS (lämpöinaktivoitua) ja PBS ilman Ca

2 + /Mg

2+. Suhteelliset tasot rekombinanttiproteiiniekspressiota analysoitiin Western blot.

Cell liikkuvuuden määritys

MDA-MB-231-solut ympättiin 6-kuoppalevyille (Nunc) 40% yhtymäkohdassa ja leimattu Draq5, solu läpäisevä pitkälle punainen fluoresoiva DNA väriaine, 5 min (Cell Signaling Technology). Culture levyt asennetaan vaihe Leica DMITCS SL laserkeilauksen confocal spektrin mikroskoopilla (Leica Microsystems Heidelberg, GmbH) kiinnitetty Leica DMIRE2 -käänteismikroskoopissa varustettu inkubointijärjestelmästä lämpötilan ja CO

2 ohjaus. Kaikki kokeet suoritettiin 35 ° C: ssa ja 5% CO

2. Sillä visualisointi Draq5 värjättyä ytimien kuvat hankittiin käyttäen 40 × objektiivilinssin (NA 1,32) ja innoissaan 633 nm laser linja. Konfokaalinen pinhole asetettiin 4,94 Airy yksiköissä minimoimiseksi fluoresenssin menetys. Kuvat otettiin joka 5 min 8 h. Image J analyysin ohjelmisto (NIH) käytettiin nopeuden ja paikantuu kvantifiointiin. Suuntatoiminto tiedot esitettiin lineaarista etäisyyttä (End) jaettuna kaiken matkan pituus aikana 8 h, kuten ovat kuvanneet Pankov et al., 2005 [42].

Fluoresenssi toipuminen Valovalkaistuminen (FRAP) B

FRAP kokeet suoritettiin käyttäen seuraavaa protocol:10 yhden skannaa (pre-valkaisu) hankittiin 300 ms välein, jonka jälkeen 20 valkaisuainetta skannaa täydellä laserin teho käyttäen neliön alueella 24 um

2. Aikana jälkivalkaisuun aikana 30-60 skannausta hankittiin 300 ms välein, jonka jälkeen 100 kuvaa hankittu 5 s välein, tämä aika oli tarpeen, jotta fluoresenssi tasapainon saavuttamiseksi. Voidakseen ratkaista alkuperäisen nopea elpyminen, jotkut kokeet suoritettiin käyttämällä Leica lentää tilassa hankinta; valkaisu suoritettiin aikana X lennossa eteenpäin scan käyttäen 100% hitsaustehot, ja aikana taaksepäin skannaus, fluoresenssi luettiin laserintensiteetin asetettu kuvausarvot (185 ms kuvien väli), kun taas jälkivalkaisuun kuvia (30-60 t) hankittiin samalla aikavälillä. Välttää merkittävät fotobleknande, heräte intensiteetti, pieneni -5% laserin teho kuvan ottamisen. Fluoresenssi elpyminen kvantifioitiin käyttäen Image Processing Leica konfokaali Software. Taustafluoresenssi mitattiin satunnaisesti alalla solun ulkopuolella ja vähennetään kaikista mittauksista. Fluoresenssisignaali mitattiin alueella kohteisiin (ROI), korjattiin hankintaan Valovalkaistuminen ja vaihteluita koko fluoresenssi seuraavista kaksinkertainen normalisoinnin menetelmää, määräytyy seuraavasti: Irel = Se /I0 * T0 /Tt, missä se on keskimääräinen intensiteetti ROI hetkellä t; I0 on keskimääräinen intensiteetti ROI edeltävässä valkaisu aikana; T0 on intensiteetti aikana ennen valkaisua ei-valkaistu alue (yleensä, naapurisolun tai ydin- alueen); ja Tt on intensiteetti hetkellä t tällä alueella. Käyttöönotto korjauskerroin (T0 /Tt) vastaa mahdollisia pieniä vaihteluita yhteensä fluoresenssin intensiteetin aiheuttamasta valkaisuaine itse, ja tuottaa tarkempi arvio mitatun fluoresenssin ROI [43], [44].

verkko fluoresenssi elpyminen (liikkuva fraktio; Mf) mitattuna alueella kiinnostava määritettiin: Mf = Fend-Fpost /Fpre-Fpost, jossa Fend on ROI tarkoittaa intensiteetti vakaassa tilassa; Fpost edustaa ROI intensiteetti jälkeen Valovalkaistuminen; ja Fpre on keskimääräinen valmiiksi valkaisu ROI intensiteettiä. Toipumisaika vakio (τ) saatiin käyränsovituksella Prism Software (GraphPad), olettaen yhden eksponentiaalinen malli (alhaalla, sitten lisäämällä alkuun).

Solunsisäinen määriä yhdistelmä-profiliiniin

laskeminen solunsisäisen määriä PTD4-PfnI tehtiin Western blot densitometria. Lyhyesti, solut kasvavat 25 cm

2 pulloissa pestiin viisi kertaa, trypsinoitiin, ja perusteellisesti pestiin sentrifugoimalla pienentämiseksi solunulkoisen proteiinipitoisuus. Solulysaatit ajettiin SDS-polyakryyliamidigeelillä. Laimennettu määriä puhdistettua rekombinanttista PTD4-PfnI, ladattiin samaan kuoppiin. Molemmat proteiinit, endogeenisen profiliinin ja PTD4-PfnI oli helppo erottaa toisistaan ​​niiden molekyylipainot ja käytettiin koettimena monoklonaalista vasta-ainetta vastaan, profiliini I.

Tilastot

Kaikki tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM ja olivat analysoidaan käyttäen Prism-ohjelmiston (versio 4.0 ja 6.0, Graphpad). Aineisto analysoitiin käyttämällä Studentin t-testiä tarvittaessa. Merkitys tasot todettiin seuraavasti: * p 0,05, ** p 0,01 ja *** p 0,001.

Tulokset

Actin dynamiikka syöpäsolujen on ominaista korkea mobiili osa ja lyhyt palautumisaika

jotta tutkia dynamiikkaa aktiinisytoskeletonin kasvavasta kärjessä kasvainsolujen, olemme valinneet MDA-MB-231 rintasyövän solulinjaa. Tämä solulinja kuljettaa

KRAS

G13D ja

BRAF

G464V mutaatioita [45], ja se on erityisen sopiva prekliinisissä tutkimuksissa, koska se on erittäin aggressiivinen sekä

in vitro

ja

in vivo

[46]. MDA-MB-231-soluille omaavat jatkuvan ja korkean motiliteettia lamellin laajennus, esittää lukuisia röyhelöt pitkin kalvo, joka tekee tämän solutyyppi erinomainen ehdokas tutkia liikevaihdon lamellipodial aktiini avulla FRAP. Helpottamiseksi kuvantamisen kokeissa olimme aiemmin luotu vakaa transfektoitu MDA-MB-231, joka ilmentää GFP-aktiini rakentamisen. Suhteellinen taso GFP-aktiinin ilmentymistä tutkittiin Western-blot ja verrattuna GFP ilmaistuna solulinjan kontrollina, keskimäärin ilmentymistä fluoresoiva proteiini johti 5,2% koko profiliiniin (tuloksia ei ole esitetty).

ominaista etureuna MDA-MB-231-solujen on 2 pm leveä rakenne rikastettu GFP-aktiini ja helposti tunnistaa falloidiinia-Alexa 594 värjäyksen (kuvio 1A). Suorakulmainen alue riittävän suuri kattamaan koko etureuna (4 pm leveä ja 6 um pitkä) oli photobleached [39] (kuvio 1 B). Kuten kuviossa 1C, MDA-MB-231-solujen osoitti elpymisen fluoresenssia lähes 70%, kun 15 s. Elpyminen kinetiikka kuvattiin kahden komponentin eksponenttikäyrän osoittavat aluksi nopea komponentti seuraa toinen hitaampi komponentti. Lähtökomponentin oli toipumisaikaa lähes 500 ms, samanlainen saatu arvo, kun elpyminen tutkittiin monomeerinen GFP-transfektoiduissa soluissa (tau 100-200 ms; Kuva S1). Tämä johtuu todennäköisimmin nopean levittämisen GFP-aktiini monomeerejä. Alkuperäinen nopea komponentti havaittiin vain, kun nopea hankinta protokollaa käytettiin, ja näin ollen laiminlyöty useimmissa kokeissa. Toinen hitaampi komponentti johtui aktiini polymerointi [47], [48], joka vahvistettiin lisäämällä 90 nM sytokalasiini D (palautuva piikkilanka-end salpaaja) viljelyväliaineeseen viisi minuuttia ennen FRAP kokeilu. Läsnäollessa sytokalasiini D, GFP-aktiini fluoresenssi ei pyytänyt takaisin (kuvio 1 C), joka vahvistaa, että aktiini polymerointi ajaa elpyminen fluoresenssin. Keskimäärin mobiili murto mitattuna 30 sekuntia sen jälkeen, kun suurin valkaisu arvioitiin olevan 71,5 ± 4%; Viimeksi mainittu osa sovitettiin yhden eksponenttikäyrän ja keskiarvo tau-arvo 4 ± 0,3 sekuntia (punainen katkoviiva kuviossa 1C).

A) MDA-MB-231-solujen, jotka oli transfektoitu GFP-aktiini, kaksinkertainen värjättiin falloidiinia-Alexa 594 (a). Actin fluoresenssi kertyy pääasiassa eturintamassa alueella. Mittakaava 5 um. Huomaa, että MDA-MB-231-solujen on näkyvään puute aktiini stressiä kuituja. Rigth: yksityiskohtainen osa etureunan, joka osoittaa kertyminen GFP-aktiini (b) ja aktiinifilamenttien (c). Mittakaava 2 um. B) edustaja kuvakehykset vaiheittaisen FRAP kokeiluja. Ennen FRAP (pre-valkaisu), kun korkean intensiteetin laser altistuksen (valkaisu), alkuvaiheessa toipumisen (5) ja lopussa vakaa osan käyrän (30 t). Valkaistu etureunan alue on merkitty valkoinen laatikko (4 x 6 m). C) Esimerkki FRAP kokeen; fluoresenssi palautuu keskiarvoa 71,5 ± 4% jälkeen monoexponential ajankulku (fit kuvattu punaisella katkoviivalla). Inkubointi sytokalasiini D (90 nM) estää fluoresenssi talteenotto (CytD). D) Yhteenveto kuvaaja keskimääräisen mobiili fraktiot MDA-MB-231-soluja. Stable transfektoiduissa soluissa (s, n = 44), korkea GFP-aktiini ekspressoivat (korkea, n = 10), alhainen GFP-aktiini ekspressoivat (alhainen, n = 10) ja ohimenevästi transfektoituja soluja (231t, n = 6). Keskiarvoja mobiili murto eivät näytä tilastollisia eroja missään koeolosuhteissa verrattuna vakaa transfektoitu solulinja (Studentin t-testi).

Sitten kysytään havaitut mobiili murto-arvot olivat riippuvaisia GFP-aktiinin ilmentymistä tasoilla. Tätä varten olemme analysoineet talteenotto tasoilla kolmen eri olosuhteissa: solut, joilla on korkea tai matala GFP-aktiinin ilmentymistä tasoilla (populaatiot järjestetty virtaussytometrialla päässä syntyy stabiili GFP-aktiini-solulinja), ja sen jälkeen ohimenevän transfektion 48 tuntia. Yhteenveto tuloksista kuviossa 1D, osoitti, että keskimääräinen liikkuva osa oli samanlainen kaikissa kolme ehtoa, joka tukee oletusta, että aktiini hyödyntämisaste ei ollut riippuvainen solunsisäistä GFP-aktiini pitoisuuden.

Tutkiakseen, onko tämä alue aktiini elpyminen on spesifinen MDA-MB-231-soluja tai on yhteistä se, että useimpien syöpien epiteelin alkuperää, kaksi syöpäsolulinjoja tutkittiin. Näin ollen, aktiini dynamiikka kärjessä HeLa ja A549-soluja, kohdunkaula ja ihmisen keuhkojen adenokarsinooma vastaavasti [49], [50], tutkittiin sen jälkeen, kun ohimenevän transfektion GFP-aktiini (kuvio 2A). Molemmat solulinjat osoittivat suuri mobiili osa 30 sekunnin kuluttua, ja keskiarvot samanlaisia ​​kuin MDA-MB-231-soluja (arvot 62-64%, kuvio 2B) ja talteenotto kertaa vaihtelevat samanlaisen alueella, 2-5 sekuntia (kuvio 2C). Muuten, A549-solut osoittivat nopeimman elpymisen, joiden tau-arvo lähes 2 sekuntia (kuvio 2C).

A) Kaksi esimerkkejä yksittäisistä fluoresenssin talteenotto GFP-aktiini saatu A549 ja HeLa-soluista. B) Pylväsgrafiikka keskimääräisestä mobiili murto vertaamalla MDA-MB-231, HeLa ja A549-soluja. Lasketut keskiarvot olivat 62,4 ± 4,2% ja HeLa (n = 12) ja 64,7 ± 4,3% A549 (n = 10). Ei tilastollisia eroja ei havaittu verrattuna MDA-MB-231-soluja. C) keskiarvot tau räjähdysmäinen saatujen arvojen elpyminen käyriä asentamisesta. MDA-MB-231-solut talteen, joiden tau arvoon 4,1 ± 0,6 s, kun taas HeLa-solut näkyviin tau 5,5 ± 1,7 s. A549 solut osoittivat nopeimman kattaa kaikkia, joiden tau 1,9 ± 0,35 s, mikä oli tilastollisesti erilainen kuin MDA-MB-231 palautumisaika (p 0,005, Studentin t-testi).

Koska MDA-MB-231 rintasyövän soluja on epiteelin alkuperä, vertasimme myös niiden aktiini dynamiikan että ei-syöpäsolun linja MCF10A, ihmisen epiteelin maitorauhasen solulinja on transfektoitu GFP-aktiini. Tulokset (esitetty kuviossa 3) osoitti, että solun tukirangan ja MCF10A oli pienempi aktiinin liikkuva osa kuin vastapuolen syövän solulinja (50% vs. 70%: Kuva 3A-B). Toipumisaika oli myös erilainen, joiden keskimääräinen arvo on lähes 7 sekuntia. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun fibroblastisoluja ei-liittyviä alkuperää tutkittiin. Hiiren alkion fibroblastit (MEF) oli liikkuva bråkdelsvärdet lähes 40%, joiden palautumisaika on noin 8 sekuntia (Kuva 3A-C). Yhteenvetona kokeelliset tiedot osoittavat, että syöpäsolut testattu osoittavat paljon dynaamisempi tukirankansa kuin ei-syöpäsoluja.

A) Kaksi esimerkkejä yksittäisistä aktiini elpymisen käyrät kärjessä jälkeen Valovalkaistuminen GFP-aktiini maasta MCF10A (ihmisen) ja MEF (hiiren) soluja. Talteenotto MDA-MB-231-solut on piirretty punainen katkoviiva vertailua varten. B) Yhteenvetotiedot liikkuvan fraktioiden MEF (39 ± 4,2%, n = 18) ja MCF10A (51,7 ± 1%, n = 6) verrattuna MDA-MB-231 kasvaimen solut. Jokainen solu tyyppi näyttää tilastollisia eroja verrattuna MDA-MB-231 mobiili murto talteenotto (p 0,005, Studentin t-testi). Mobiili jakeet MCF10A ja MEF-solut eivät olleet tilastollisesti erilaisia ​​(Studentin t-testi). C) elpyminen kertaa sekä MEF (tau = 7,5 ± 1,6) ja MCF10A soluja (tau = 6,5 ± 0,4 s) olivat tilastollisesti erilaisia ​​kuin MDA-MB-231-soluja (p 0,005 ja p 0,05; Studentin t- -testi).

MDA-MB-231 aktiini dynamiikka ovat riippumattomia läsnäolosta ekstrasellulaarisen kasvutekijöiden

Hankitut riippumattomuus solunulkoisia kasvutekijä signalointi on tyypillinen piirre rintasyöpäsolujen [51]. Ei-syöpäsolujen linjat, soluliikkuvuus ja polarisaatio johdossa paikallinen kertyminen PIP

3; enimmäkseen ohjaavat PI3K aktivointi tai paikallisten integriini aktivointia. Itse asiassa, poikkeava PI3K signalointi on toistuva teema sekä taudin alkamisen ja etenemisen erilaisia ​​syöpiä, kuten rintasyöpää [45]. Meidän vieressä halusi testata riippuvuus aktiini dynamiikka kärjessä solunulkoiseen läsnäolo kasvutekijöiden. Tätä varten tutkittiin aktiini dynamiikkaa syövän ja ei-syöpäsolulinjat jälkeen 16 tunnin seerumistarvaatio aikana. Tulokset osoittavat, että MDA-MB-231 mobiili jae vaikuta seerumistarvaatio ehto (kuvio 4A), joiden keskimääräinen liikkuva osa arvosta 58 ± 3%, ja keskimääräinen tau elpymisen 6,6 sekuntia, mikä ei ollut tilastollisesti erilainen mistä saadut arvot seerumin läsnä ollessa (kuvio 4B ja D). Yksi välitön seuraus puuttuminen kasvutekijöiden on vähentää PIP

3 signalointi on kalvon tasolla. Vahvista vaikutuksen PIP

3 aktiini modulaatio, aktiini dynamiikka kärjessä analysoitiin 30 minuuttia sen jälkeen, kun käsitellään solujen kanssa PI3K estäjän LY294002 (20 uM). Liikkuva osa oli keskiarvo 57 ± 2%, ja fluoresenssi talteen aikavakio 4,2 sekuntia, mikä ei ollut tilastollisesti erilainen kuin hallinnassa tai seerumistarvaatio olosuhteissa (kuvio 4B ja D).

A) Esimerkki fluoresenssin palautuminen FRAP kontrolloiduissa olosuhteissa (10% FBS, FBS juoni) ja seerumistarvaatio 16 tuntia (nälkää tontti). B) Yhteenveto tietojen keskiarvon mobiili jae MDA-MB-231-soluja. Keskimääräinen mobiili murto alle FBS olosuhteissa oli 62 ± 5,2% (n = 6), verrattuna 58 ± 3% 16 tunnin nälkään ja 57 ± 2% (n = 6) jälkeen PI3K inhibitioastetta LY294002 (n = 6) . On syytä huomata, että olemme sisällyttäneet uuden ohjausjärjestelmän soluja, kasvaa rinnakkain ja analysoitiin samana päivänä ja samoissa olosuhteissa; Näin ollen, keskimääräinen matkapuhelun osa on hieman eri arvo, että yleinen keskimääräisiä (70% vs. 65%). C) Liikkuva osa ei-syöpäsolujen alle seerumin puutteessa olosuhteissa oli vähentynyt 27 ± 5,2% (n = 10), hiiren fibroblastien ja 28 ± 2,4% MCF10A (n = 6), (p 0,05; Studentin t-testi). D) Palautumisaika yhteenveto kuvaaja. MDA-MB-231 kasvaa FBS taipumus osoittaa nopeampaa dynamiikan (4,14 ± 0,6 s) ei ollut tilastollisesti merkittäviä, kun ruokittu soluja (6,6 ± 1,7 s). Käyttö LY294002, kemiallisen inhibiittorin PI3K, ei vaikuttanut toipumisaika (4,2 ± 1,0 s). E) Sen sijaan, seerumistarvaatio vaikuttaa toipumisaika ei-syöpäsolujen, lisäämällä aikavakio 8,2 ± 0,2 s ja 9,5 ± 0,1 s MEF (p 0,05) ja 6,5 ​​± 0,4 s arvoon 8,0 ± 1,2 s MCF10A solut (p 0,05; Studentin t-testi).

sen sijaan mobiili osa MCF10A solujen on alennettu seerumistarvaatio olosuhteissa (keskiarvo 28 ± 2,4% verrattuna 51%: kontrolloiduissa olosuhteissa ; kuvio 4C). Samanlaisia ​​riippuvuus solunulkoisen seerumin havaittiin MEF, jonka liikkuva jae laski arvon lähes 40% arvoon noin 27% (kuvio 4C). Toipumisaika vaikuttivat myös vuonna MCF10A soluissa kasvoi 6,5 ± 0,4 sekunnin 8,0 ± 1,2 sekuntia, kun MEF-solujen määrä nousi 8,2 ± 0,2-9,5 ± 0,1 sekuntia (kuvio 4E).

Saaduista tuloksista tässä jaksossa, voimme päätellä, että MDA-MB-231-solujen, sekä aktiini mobiili murto ja aika ja toipuminen ei vaikuta läsnäolo solunulkoisen kasvutekijöiden ja kalvo sääntely PIP

3 tasoa.

PfnI ylössäätöä kasvattaa solun kokoa ja lukumäärää FA

Useat aktiini sitovia proteiineja vapautettu syöpäsolulinjoissa [28], [52], joiden joukossa profiliinia (PfnI), joka oli ehdotettu tuumorisuppressoriproteiinia [27], [30]. PfnI ekspressiotasot ovat merkittävästi alassäädetty erityyppisissä adenokarsinoomasolua.