Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

metastasoituneen eturauhassyövän (PCA ) yhdellä aineet ovat osoittaneet vain vähän tehoa. Oletimme dual esto eri reittejä PCA johtaa parempaan kasvaimen estoon. Src-ryhmän kinaasien (SFK) ja insuliinin kaltainen kasvutekijä-1 (IGF-1) signalointi akselit poikkeavasti käyttää molemmissa ensisijainen PCa ja luustometastaaseja ja säätelevät erillisiä ja päällekkäisiä toimintoja PCA etenemistä. Tutkimme antituumorivaikutukset yhdistettynä eston näistä reiteistä.

Materiaalit ja menetelmät

Src andIGF-1-reseptori (IGF-1 R) estyi

in vitro

lyhyillä hiusneula (sh) RNA: n ja

in vitro

ja

in vivo

pienmolekyylisalpaajilla (dasatinibin BMS-754807, vastaan ​​SFK ja IGF-1 R /insuliini-reseptorin (IR), tässä järjestyksessä).

tulokset

In vitro

, IGF-1 signalointi vaikuttaa solujen eloonjäämistä ja proliferaatiota. SFK saarto yksin ollut vähäinen vaikutus proliferaatioon, mutta merkittävästi parannettu IGF-1 R saarto. Nämä havainnot korreloivat vankka eston IGF-1 aiheuttama Akt1 fosforylaatiossa by dasatinibihoidon, kun taas Akt2 fosforylaatio oli SFK itsenäinen ja inhiboitui ainoastaan ​​BMS-754807. Siten täydellinen estyminen molempien Akt geenit, ei nähnyt joko lääke yksin, on todennäköisesti merkittävä mekanismi vähentynyt selviytymisen Eturauhassyövän soluja. Lisäksi Dasatinibin BMS-754807 esti

in vivo

kasvun ensisijainen ihmisen ksenograftissa MDA PCa 133, jossa vastaava esto Akt kasvaimissa. Myös molemmat potilaalle tehdä ja sääriluunsisäinen kasvaimen kasvu PC-3-soluja voimakkaammin inhiboi dual SFK ja IGF-1 R /IR saarto verrattuna joko koulutusjakson yksin, ja vastaava lasku luun aineenvaihdunnan merkkiaineiden.

Johtopäätökset

Dual IGF-1 R /IR ja SFK esto voi olla järkevä terapeuttinen lähestymistapa PCA estämällä sekä riippumattomat ja toisiaan täydentävistä kriittistä kasvaimen kasvua.

Citation: Dayyani F, Parikh NU, Varkaris AS Song JH, Moorthy S, Chatterji T, et ai. (2012) yhdistettyyn IGF-1 R /IR ja Src-ryhmän kinaasien Tehostaa antituumorivaikutukset in Eturauhassyöpä vähentämällä Aktivoitu eloonjäämisreittejä. PLoS ONE 7 (12): e51189. doi: 10,1371 /journal.pone.0051189

Editor: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 3. heinäkuuta 2012 Hyväksytty: 30 lokakuu 2012; Julkaistu: 26 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Dayyani et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: F.D. tukivat Yhdysvaltain National Institutes of Health avustuksen T32 CA009666; F. D., G.E.G., J.C.A., ja C.J.L. tuettiin 1 P50 CA140388-01; F. D., G.E.G., ja C.J.L. Lisäksi tuetaan apurahan, jonka Eturauhassyöpä Foundation. Tätä työtä tukee myös NIH kautta MD Anderson Cancer Center Support Grant, 5 P30 CA016672-35. S.N.M. tukivat Eturauhassyöpä -tutkimusohjelma avustuksen UTMDACC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat konflikteja. He ilmoittavat, että J. C. ja M. G. työskentelee Bristol-Myers Squibb. Tämä ei muuta niiden noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Metastasoitunut eturauhassyöpä (PCA) muodostaa arviolta 28,000 kuolemaa vuonna 2012 [1]. Kehittyneissä, kastraatiotason kestävä metastaattinen PCa (CRPC), muutaman hoitovaihtoehtoja on olemassa. On vain 3 FDA-hyväksyttyjä kemoterapeuttisten aineiden CRPC: doketakseli ja kabatsitakseli [2], [3], jotka molemmat osoittavat vain vähän selviytymisen etu Miesten CRPC, ja viime aikoina myös CYP17 estäjä abirateronin asetaatti, hyväksytty käytettäväksi jälkeen doketakseli epäonnistumisen (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00638690), parantaa yleistä elinaikaa 3,9 kuukautta [4]. Mahdollisimman vähän oireenmukaista metastaattinen CRPC, satunnaistetussa vaiheen 3 tutkimuksessa osoitti selviytymisen etu rokotteen Sipuleucel-T [5] .Thus, vaikka lupaavia aineita parantavan eloonjäämistä Eturauhassyövän potilaiden, muita terapeuttisia aineita ovat selvästi tarvitaan pitkälle tauti [6].

Viimeaikaiset edistysaskeleet ymmärtämistä signalointireittien säätelevät kasvua Eturauhassyövän luuytimessä ovat johtaneet lukuisiin kliinisiin kokeisiin kohdistettuja hoitomuotoja. Yksi lupaavimmista tavoitteet PCa ovat Src-perheen kinaasit (SFKs), perheen ei-reseptoriproteiinityrosiinikinaasien, ilmaisun ja erityisiä toimia, joita lisätään useita erilaisia ​​ihmisen kasvaimissa [7]. Prekliiniset tiedot PCA osoittavat, että esto SFKs vähenee leviämisen ja voimakkaammin, invaasio ja muuttoliike [8], [9]. Lisäksi, Src-aktiivisuus on tärkeää mikroympäristössä, jotka vaikuttavat osteoklastien toimintaa. Siten Src inhibiittorit lohko, osittain kasvaimen /mikroympäristölle vuorovaikutukset, jotka johtavat ”noidankehä” luun etäpesäke [10]. Tutkimuksissa, joissa

in vivo

ortotooppisten hiiren kokeissa inhibitio SFKs väheni sekä eturauhasen tuumorin kasvua ja kehitystä imusolmukemetastaaseja [11]. Perustuvat osittain nämä havainnot ja lupaavia tuloksia vaiheen 1/2 tutkimuksessa [12], dasatinibi, pienimolekyylinen usean estäjä selektiivisten forSFK /Abl [8], on testattu yhdistettynä dosetakselia Satunnaistetussa vaiheen 3 tutkimuksessa potilailla, joilla CRPC (ClinicalTrials.gov ID: NCT00744497).

Analyysit vaiheen 1/2 tutkimus osoittaa SFK esto ja doketakselin ei aiheuttanut merkityksellisiä kliinisiä vasteita enemmistö potilaista, mutta olivat erittäin lupaavia osajoukon potilaille [13]. Siten tunnistetaan ylimääräisiä signalointireittejä, jotka edistävät metastaattista kasvua PCa, ja se voi lisätä vaikutuksia Src inhibitio tuottaa todennäköisesti lupaavia yhdistelmiä estäjiä, jotka ovat tehokkaampia hoidossa PCa.

Yksi tällainen reitti vapautettu PCA välittää insuliinin kaltaisen kasvutekijä-1-reseptorin (IGF-1 R). IGF-1 R on osallisena leviämisen ja eloonjäämisen monien kasvaintyypeissä [14] ja on yli-ilmentynyt PCa [15]. IGF-1 R signalointi on yhdistetty PCa riski, ja yksi sen ligandien, IGF-2, yli-ilmentyy myös PCa luun etäpesäkkeitä [16], missä se edistää proliferaatiota ja eloonjäämistä PCa-solujen [17], [18], [ ,,,0],19], [20], [21]. Tutkimukset monoklonaalisia vasta-aineita IGF-1 R ovat osallisina tämän reseptorin tärkeänä PCA etenemisen androgen-herkkien sekä kestävä kasvainmuodoista [22]. Vaikka IGF-1 R signalointi välittyy osittain Src polku, muut alavirtaan signalointireiteissä IGF-1 R ovat Src riippumattomia ja vaikuta Src esto [14]; näitä ylimääräisiä reittejä on osoitettu äskettäin tärkeä rooli PCA solujen eloonjäämistä [23]. Aktivointi Src ja IGF-1 R on myös aktivoi Akt, joka on keskeinen efektori PI3K /Akt /mTOR reitin, joka on poikkeuksellisesti aktivoitu useimmissa maligniteettien, edistää solujen kasvua, lisääntymistä, ja eloonjäämisen [24], [25] .Kuitenkin ovatko nämä inhibiittorit ovat yhtä tehokkaita estämään Akt1, 2, ja 3 toimintojen ei tiedetä, ja jos niiden yhdistäminen tuotti parempia tuloksia estämällä tällä selviytymisreittiin oli tavoite tämän työn. Täällä, tutkimme yksilön ja yhdistetyt vaikutukset dasatinibihoidon, joka on SFK estäjä, ja BMS-754807, joka on voimakas ja palautuva pienmolekyylisalpaaja- IGF-1 R [26] ja insuliinin reseptorin (IR), jonka vaikutus kohdistuu erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia

in vitro

sekä useita ksenograftimalleissa [26]. Koska inhibiittorit ovat off-tavoite vaikutuksia, molekyyli- knockdown näiden reittien käytettiin myös. Osoitamme, että esto näiden reittien tuottaa täydentäviä biologisia vaikutuksia

in vitro

ja

in vivo

ja että läsnä IGF-1, esto molempien reittien tarvitaan estävän tehokkaasti Akt fosforylaation ja alavirran välittäjinä syövän solujen eloonjäämistä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät

PC-3 ja LNCaP-solut saatiin American Type Culture Collection. Ne edustavat sekä adeno- ja pienisoluinen variantteja PCa [27]. PC3-MM2 [28] ja PC3-LG soluista [29] ystävällisesti Dr. Jesajan Fidleriltä (University of Texas MD Anderson Cancer Center). PC-3 villityypin soluissa ja stabiilit transfektantit pidettiin DMEM F-12-alustassa (Hyclone), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Hyclone) ja 1% penisilliiniä /streptomysiiniä (Gibco). LNCaP villityypin soluissa ja stabiilit transfektantit pidettiin RPMI 1640-alustassa (Hyclone), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. BMS-754807 tarjosi Bristol-Myers Squibb, ja dasatinibi luovutti ystävällisesti Dr. John C. Araujo (MD Anderson). Cell todennus ja Mycoplasma seulonta suoritettiin kuuden kuukauden välein hoitokäytännön mukaisesti.

Stable transfektantteja

Valmiit transfektoimaan lyhyt hiusneula (sh) RNA-GFP-puromysiini konstruktioita ihmisen IGF1-R (# SR302344) ja Src (# SR304574) ostettiin Origene Technologies. Universaali sekoitetun negatiivinen kontrolli shRNA (# SR30004) saatiin valmistajalta. Solut transfektoitiin käyttämällä Fugene 6-reagenssia (Roche) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vakaa kloonit valittiin kanssa puromysiini. Target pudotus varmistettiin 3-4 viikkoa transfektion jälkeen Western blotit, kuten alla on kuvattu.

Soluproliferaatiomääritys

Solut (3 x 10

4per kuoppa) viljeltiin 6-kuoppaisilla astiat jopa 96 tuntia ja ilman dasatinibi (100 nM) tai BMS-754807 (0,5-5 pM). Solujen laskenta eri ajankohtina, solut pestiin kerran PBS: llä (Gibco), inkuboitiin TrypLE dissosiaation reagenssia (Gibco), ja laskettiin käyttäen automatisoitua solujen elinkykyä analysaattori (Vi-Cell XR; Beckman Coulter). Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

anneksiini V-värjäys

värjäys apoptoottisten solujen suoritettiin käyttäen anneksiini V-PE detektioreagenssipakkaus (BD Pharmingen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, soluja viljeltiin 48 tunnin ajan, mitä seurasi värjäys anneksiini V-PE. Solut analysoitiin BD FACS Canto -virtaussytometriä käyttämällä FACS Diva ohjelmisto (BD Biosciences).

Cell cycle

Soluja viljeltiin 24 tunnin ajan, kerättiin ja pestiin kerran PBS: ssä, sitten uudelleen jääkylmään 70% etanolia ja pidettiin -20 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Sitten solut pestiin jälleen PBS: llä ja käsiteltiin 45 minuuttia DNAasi-vapaata RNaasi (Invitrogen) 37 ° C: ssa. Propidiumjodidia lisättiin lopulliseen konsentraatioon 1 ug /ml, ja soluja inkuboitiin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Analyysi tehtiin BD FACS Canto -virtaussytometriä käyttämällä FACS Diva ohjelmisto.

Eläimet

Swiss nu-nu /NCR nude-hiiret ostettiin eläintenpitoyksikköön alue Department of Experimental Radiation Oncology MD Anderson. Kaikki hiiret majoitettu ja ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa mukaan MD Andersonin Institutional Animal Care ja Käytä komitean ohjeita. MD Anderson Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) tarkistetaan tämän tutkimuksen sekä erikseen hyväksynyt sen.

ksenograftikasvaimissa

ihonalainen köynnöksen MDA PCa 133 (vierassiirrännänmallissa peräisin kastraatiotason kestävästä potilas johdettu luusta etäpesäke, joka ilmaisee AR ja PSA: n ja kasvaa vain hiirillä ei soluviljelmissä) tuotettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [30]. Lyhyesti, fragmentit kasvaimet istutettiin subkutaanisesti severe combined immuunivajavaisiin (SCID) hiirillä koko on alle 1 mm

3. Kasvainten annettiin kasvaa, kunnes ne saavuttivat koon 3 mm

3, ja sitten hiiret (n = 4 kussakin ryhmässä) hoidettiin päivittäin Dasatinibin BMS-754807, yksin ja yhdessä, 26 päivän ajan. Kasvaimet mitattiin kahdesti viikossa, ja tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa

V = W

2 x L /2

. Päivänä 26 hiiret lopetettiin, kasvaimet kerättiin, ja proteiini lysaatit valmistettiin kuten alla Western blot.

Orthotopic eturauhasen /sääriluunsisäinen injektiot

Intraprostatic injektion lusiferaasia ekspressoivan PC3 -LG soluihin suoritettiin kuten aiemmin julkaistu ryhmämme [31]. Lyhyesti, 40 Swiss nu-nu /NCR karvattomia hiiriä (8-12 viikkoa vanhoja) nukutettiin 2% isofluraani käytettäessä isofluraani-happi kammio ja sitten laitetaan selälleen. Keskiviivan viilto tehtiin alavatsan, ja eturauhasen exteriorized kuten on kuvattu julkaisussa Park et al. [32]. Viisikymmentä mikrolitraa HBSS, joka sisälsi PC3-LG (yhteensä 5 x 10

5 solua) ortotooppisesti injektoitiin kuten aiemmin on kuvattu [31] tulee sivusuunnassa etu- rauhasen lohkoon. Haava suljettiin metalli kirurgiset leikkeitä. Kymmenen päivän kuluttua ksenograftissa injektion kasvain engraftmentti määritettiin

in vivo

bioluminenssina kuvantaminen (IVISTM 100 järjestelmän Xenogen Co.) kanssa hiirillä alle 2% isofluraani hengitysteitse anestesian. Kolmekymmentäkaksi hiiret osoittavat lusiferaasiaktiivisuuden lähellä mediaani valittiin ja satunnaistettiin käyttämällä Excel® (Microsoft) ohjelma 4 ryhmään (n = 8 kullekin ryhmälle): ohjaus ajoneuvon, BMS-754807 yksinään (12,5 mg /kg kehon paino /päivä), dasatinib yksinään (12,5 mg /kg kehon paino /päivä), ja yhdistelmä BMS-754807 (6,25 mg /kg kehon paino /päivä) ja dasatinib (12,5 mg /kg ruumiinpainoa /päivä). Nämä pitoisuudet tietoisesti tasolle, jossa yhden aineen aktiivisuus ei odotettu. Kaikki lääkkeet ylläpitäjä letkulla suun kautta 6 päivää /viikko. Hiiret lopetettiin 4 viikkoa injektion jälkeen soluja. Ensisijainen kasvaimia eturauhasen leikattiin irti ja punnittiin.

sääriluunsisäinen injektion PC3-MM2-soluissa suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [28]; lyhyesti nude-hiiret nukutettiin, kuten edellä, ja 2,5 x 10

5 solua injektoitiin sääriluun, kuten on kuvattu [28]. Kaksitoista päivää injektion jälkeen hiiret käsiteltiin suolaliuoksella (n = 10) dasatinib (n = 9), BMS-754807 (n = 9) tai molemmat (n = 8) annoksilla on kuvattu edellä. Neljän viikon kuluttua hoidon aloittamisesta, hiiret lopetettiin. Röntgenkuvat otettiin kaikki hiiret, ja 4 hiirtä kussakin ryhmässä, sääriluiden kerättiin ja valmistettiin ja tietokonetomografia suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [32], [33].

Bone hävittämisen sääriluunsisäinen injektio PC3-MM2-solut nude-hiirissä luokiteltiin perustuu seuraaviin pisteet: 0 = Minimal muutoksia; 1 = Lyyttinen luuleesioita, aivokuori ehjä; 2 = Cortex tuhoaminen, ei merkittävää pehmytkudoksen turvotus; 3 = Cortex tuhoaminen, merkittävä pehmytkudoksen osallistumista.

Immunoblottausmääritys

Immunoblottausmääritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [34]. Lyhyesti, solut hajotettiin ja selvitetty, ja proteiinit erotettiin kautta 8% SDS-PAGE, jonka jälkeen se siirretään kiinni polyvinylidenedifluoride kalvoja (Millipore). Membraanit inkuboitiin vasta-aineiden Src, Yes, Fyn, Lyn, IGF-1 R, Akt, Erk1 /2, ja S6 (kaikki ostettu Cell Signaling) ja LC3 (Sigma), minkä jälkeen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineilla (Bio -Rad).

Immunosaostaminen

Voit selvittää fosforylaatiota Akt1- ja 2 sanottuna PC-3-soluja seerumia jopa 48 tuntia ja sitten inkuboitiin 2 tuntia dasatinibihoidon (100 nM), BMS-754807 (5 uM), tai molemmat, ja sen jälkeen 15 minuutin stimulaation 50 ng /ml rhIGF-1 (R α 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

IGF-1 R esto vaikuttaa solujen lisääntymisen ja apoptoosin

Testasimme perustelut yhdistetyn estyminen Src ja IGF-1 R reitit määrittämällä vaikutukset kasvuun ja apoptoosin sitten signaalitransduktion, jonka jälkeen vaikutukset kasvaimen kasvuun useissa asiaan eläinmalleissa. Soluja kasvatettiin 10% FBS: ää, riittävän johtaa aktivoitu IGF-1 R. Näissä olosuhteissa, inhibitio Src: n ja IGF-1 R: n yhdistelmällä dasatinibin ja BMS-754807 väheni soluproliferaation sekä PC-3 ja LNCaP-soluissa, kuten on esitetty kuviossa. 1A. Ensin vahvisti ilmaus SFKs Src, Yes, Fyn, ja Lyn kaikissa PCa soluissa tutkittiin (Kuva. S1A). Sen määrittämiseksi, oliko inhibiittorit liittyisi lähinnä Src ja IGF-1 R, vakaa shRNA välittämä knockdowns tehtiin

SRC

ja

IGF-1 R

, vastaavasti. A 90% pudotus kunkin signaloinnin entsyymit saavutettiin (Fig. S1B). SFK esto dasatinibihoidon vähentynyt leviämisen PC-3-solut, yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen [11]; knockdovvn

IGF-1 R

vähentynyt proliferaatio 96 tunnin yli dasatinibi teki (

P

0,05, S1C), ja yhdistelmä SFK eston ja

IGF-1 R

knockdown edelleen vähentynyt proliferaatio (

P

0,05). Nämä havainnot vahvistettiin MTS-määritys 96 tunnin viljelmästä (tuloksia ei ole esitetty). Estyminen leviämisen havaittiin BMS-754807 oli huomattavampi molemmissa solulinjoissa kuin shIGF-1R, mikä viittaa siihen, että fenotyyppi nähdään BMS-754807 johtuu todennäköisesti osittain sen kyky BMS-754807 estää insuliinin reseptoria (IR) sekä [26] .Voit erityisesti vaikutusten tutkimiseksi BMS-754807 on IGF-1-IGF-1 R, määritimme lisäävät annokset estäjän PARP pilkkominen. Kuten kuviossa S1D, PARP lohkaisu oli annoksesta riippuvaa. Tutkimme myös aika-riippuvuus kasvun eston. Kun läsnä on BMS-754807, kasvun kinetiikka inhiboitui ajasta riippuvalla tavalla verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio S1E). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​BMS-754807, jotka vaikuttavat solujen kasvuun lisäämällä apoptoosin.

(A) PC-3 tai LNCaP-soluja viljeltiin 96 tuntia ja ilman dasatinibi (DSA, 100 nM) ja BMS-754807 ( BMS-807; 2 uM PC-3 ja 0,5 uM LNCaP-solut), yksinään ja yhdistelmänä, ja solujen määrä määritettiin, kuten on kuvattu menetelmissä. (B) PC-3 ja LNCaP-soluja inkuboitiin 24 tuntia ja ilman DSA (100 nM) ja BMS-754807 (5 uM PC-3 ja 1 uM LNCaP), yksin ja yhdessä, ja solusyklin värjäys 24 tunnin kuluttua suoritettiin käyttäen propidiumjodidia. (C) PC-3-soluja inkuboitiin 48 tuntia ja ilman DSA (100 nM) ja BMS-754807 (2 uM), yksinään ja yhdistelmänä, ja prosenttiosuus apoptoottisten solujen määritettiin virtaussytometria-analyysi anneksiini-V värjäystä. (D) Vasen: solusyklin propidiumjodidilla PC-3-shIGF-1R-soluja. Oikea: PC-3-shIGF-1R ja ohjaus soluja inkuboitiin 48 tuntia ja ilman DSA (100 nM), ja prosenttiosuus apoptoottisten solujen määritettiin virtaussytometria-analyysi anneksiini-V-värjäyksellä. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. *

P

0,05; N. S. ei merkittävää.

PC-3 ja LNCaP-solut, käsittelemällä yhdistelmä dasatinibin ja BMS-754807 kasvoivat solusyklin pysähtymiseen ja solun kuolemaan, suhteessa joko inhibiittorin (Fig. 1 B). Kun tarkastellaan erityistä panosta kunkin yhdisteen, olemme havainneet, että inkubointi molemmissa solulinjoissa BMS-754807 kasvattanut SubG

1-solut (Fig. 1 B), joka korreloi suurempi osa anneksiini-V-positiivisten solujen 48 tunnin (kun solukuolema oli beginning- (Fig. 1 C) sekä vastaavat, joissa PARP pilkkominen (Fig. S1F). Sitä vastoin, ei lisäyksiä SubG

1 osa ja anneksiini-V-positiivisten solujen havaittiin kanssa lisäksi dasatinibin vain. seulomiseksi mahdollisen induktion autophagy, testasimme myös lääkkeiden indusoimaa muuntaminen LC3-I LC3-II, prosessi osoittaa autophagic toiminnan. Kuten kuviossa. S1G, ei lääkettä (yksin tai yhdistelmä) tuottivat merkittäviä määriä LC3-II, mikä viittaa siihen, autophagy ei ole merkittävä syy solukuoleman.

Koska vain BMS-754807: n indusoiman apoptoosin, me sitten suoritettiin samankaltainen koe, jossa shIGF-1R PC-3-solujen onko vähentynyt IGF-1 R ilmentyminen erityisesti lisääntynyttä apoptoosia. Itse asiassa, kuten kuviossa. 1D, knockdovvn

IGF-1 R

PC-3-solujen kasvattanut SubG

1 sekä anneksiini-V-positiivisten solujen verrattuna kontrolli shRNA soluihin. Knockdovvn

SRC

oli vain vähän vaikutusta (tuloksia ei ole esitetty).

yhdistelmä Dasatinibin ja BMS-754807 tulokset voimakkaampi inhibitio Akt kuin ei kumpikaan lääke yksin

seuraavaksi testasimme, onko yhdistetty inhibitio SFKs ja IGF-1 R vaikuttaa signalointireitteihin eri tavalla kuin teki kummallakaan aineella yksinään. Ensin tutkitaan mahdollisia alavirran välituotteita näiden reittien, Erk1 /2 ja Akt. Kokeet suoritettiin, kun läsnä ja poissa ollessa IGF-1, koska IGF-1 on runsaasti mikroympäristössä CRPC potilailla. Seerumin puutteessa olosuhteissa (tukahduttaa perustason IGF-1 R aktivointia), varmistimme tavoite esto molempien lääkkeiden jälkeen IGF-1 stimulaatio (Fig. 2A). ERK1 /2: n ilmentymisen tai fosforylaatio ei vaikuttanut joko n estäjä yksinään tai kun sitä käytetään yhdessä (Fig. S2). Sen sijaan, Akt aktivaatio inhiboi osittain kunkin inhibiittorin ja estää täysin yhdistelmä. Jotta voitaisiin paremmin ymmärtää mekanismia Akt inhibition, ensin osoitti ekspressiota Akt1 ja 2 (Fig. 2B, C), mutta ei Akt3 (tuloksia ei ole esitetty), ja havaittavia määriä PC-3-soluja. Koska IGF-1, Akt2, mutta ei Akt1, on osittain aktivoitu (Fig. 2B, C). Kun läsnä on IGF-1, Akt1- aktivoituu ja Akt2 fosforylaation kasvaa edelleen. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, 80% Akt1 fosforylaation estyy dasatinibihoidon, kun taas dasatinibin tehoton inhiboimaan IGF-1 aiheuttama Akt2 fosforylaatiota (kuvio. 2C). Sen sijaan, BMS-754807 osittain, mutta ei kokonaan, vähensi sekä fosforylaatio sekä Akt1 ja 2: n läsnä ollessa IGF-1. Dual salpaus IGF-1 R ja SKF yhdistetyllä BMS-754807 ja dasatinib estää täysin havaittavissa Akt1 ja 2 fosforylaatiota, kun läsnä on IGF-1 (Fig. 2B, C). Tutkia vaikutukset alavirran kohde Akt, S6 fosforylaation tutkittiin. Kanssa tulosten Akt eston, osittaisen eston S6 fosforylaation nähtiin sekä Dasatinibin BMS-754807 yksin ja täydellinen esto nähtiin yhdistelmän (Fig. 2D), mikä viittaa siihen, että estämällä Akt toiminnot vaatii sekä dasatinibin ja BMS- 754807. Näin ollen, yhdistelmä dasatinibin ja BMS-754807 pienenee selviytymisen osittain, koska täydellinen inhibitio Akt.

(A) PC-3-soluja seerumia 72 tunnin ajan ja esi-inkuboidaan sitten 2 tunnin ajan BMS-754807 joko 2 uM tai 5 uM, dasatinibihoidon 100 nM, tai molemmat aineet. 2 tunnin jälkeen, soluja stimuloitiin 50 ng /ml rekombinanttia ihmisen IGF-1 (rhIGF-1) 3 minuutin ajan. Seuraavaksi proteiini kerättiin ja (fosfo) proteiineissa IGF-1 R, Src, ja Akt määritettiin western blot (WB). Vinkuliinin käytettiin lastaus ohjaus. (B ja C) PC-3-soluja stimuloitiin DSA (100 nM) ja BMS-754807 (5 uM), kuten edellä, ja sitten solut kerättiin ja immunosaostettiin Akt1: lle (B) tai Akt2 (C), jota seurasi immunoblottaus for fosfo-Akt. (D) PC-3-soluja käsiteltiin kuten (A), ja western blot ajettiin S6 ja fosfo-S6.

Primaarisen ihmisen ksenograftikasvaimissa dasatinibihoidon ja BMS-754807 on tehokas

in vivo

ja indusoi kasvaimen apoptoosin

vaikutuksen määrittämiseksi yhdistetty inhibitio Src: n ja IGF-1 R on suora ksenograftin ihmisen PCa kasvavien solujen hiiren malleissa, ensin käsitellyt hiiret, joissa on ensisijainen ihmisen ksenografti MDA PCa 133 kasvaimet (kastraatiotason kestävä, AR positiivinen) dasatinibihoidon ja BMS-754807 yksin ja yhdistelmänä (n = 4 kussakin ryhmässä). Kuten on esitetty kuviossa. 3A, 3 viikon, lisääntyi kasvaimen koon kontrolliryhmässä sekä yksittäisen lääkkeen ryhmiä, kun taas kasvaimen kasvu väheni merkittävästi yhdistelmä ryhmässä. Tämä vaikutus oli vielä selvempi päivänä 26, jolloin hiiret lopetettiin.

(A) MDA PCa 133 (johdettu luun etäpesäkkeitä) soluja istutettiin subkutaanisesti nude-hiiriin, kuten on kuvattu menetelmät. Kun kasvaimet saavuttivat tilavuuden 3 mm

3, hiiret käsiteltiin dasatinib ja BMS-754807 yksinään ja yhdistelmänä (n = 4 kussakin ryhmässä). Kasvaimet mitattiin kahdesti viikossa. Näkyy on suhteellinen kasvu kasvaimen koon ajan kussakin ryhmässä. *

P

0,05. (B) Hiiret lopetettiin 16 päivää hoidon aloittamisen jälkeen, kasvaimet kerättiin, ja western blotit tehtiin varten ilmoitettu (yhteensä ja fosfo) proteiineissa. Esitetyt tulokset edustavat tulokset kasvaimen kummassakin hoitoryhmässä. (C) kvantifiointi TUNEL värjäys havaita apoptoosin. Näkyy on keskiarvo (± SEM) apoptoottisten solujen määrässä per suuritehoisia kenttä (HPF) kussakin ryhmässä.

Immunoblotit flash-jäädytetty kasvaimet kerättiin monoterapiana saaneilla hiirillä osoittivat estäminen src fosforylaatiota dasatinibin IGF-1 R fosforylaatiota BMS-754807, jotka osoittavat, että nämä lääkkeet osuma niiden keskeisimmistä kohteista. Täsmälleen kuten me havaittu

in vitro

tutkimuksissa Akt ja S6 fosforylaation vain osittain inhiboi kunkin lääkkeen yksin. Sen sijaan, vankka inhibitio Akt ja S6 fosforylaation havaittiin yhdistelmänä ryhmän (Fig. 3B). Lisäksi apoptoosi lisääntyi, määritettynä TUNEL värjäys BMS-754807-käsiteltyjen kasvainten ja edelleen lisääntynyt yhdistelmäryhmä (

P

= 0,01; Fig. 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistettyä esto Src ja IGF-1 R on tehokas ensisijainen ihmisen ksenografteja, välittämä osittain lähes täydelliseen estymiseen Akt-fosforylaation.

tarkastella potilaalle tehdä kasvain esto, PC-3 LG soluja (valittu niiden androgeenireseptorin [AR] -negatiivinen asema ja vahva kasvu potilaalle tehdä malleissa) injektoitiin prostates nude-hiirten ja käsiteltiin kuvatulla tavalla menetelmät jaksossa. Neljän viikon kuluttua solujen injektion jälkeen hiiret tapettiin ja tuumorit leikattiin ja punnittiin (Fig. S3A). Edustaja kasvainten 4 hoitoryhmään (yhteensä n = 8 kullekin ryhmälle) on esitetty kuviossa. S3B. Ei ollut merkittävää eroa kasvaimen painon välillä ohjaus, dasatinib, ja BMS-754807 ryhmien käytetyillä pitoisuuksilla (kuten odotettiin), mutta hiiret käsiteltiin lääkeaineiden yhdistelmä oli huomattavasti pienempi kasvaimia (

P

dasatinibihoidon, n = 9, BMS-754807, n = 9; yhdistelmä, n = 8). Tällä hetkellä, röntgenkuvat otettiin ja hiiret veri seuraavat euthanization. Osallisena luut kerättiin tietokonetomografia. Eturauhassyövän cell aiheuttama kasvaimen kasvun ja luun tuhoutumista, mitattuna tavalliselle röntgenkuvat, teki vuonna sokkona Menetelmät kuvatulla tavalla. Sekä katsoo, odotetusti, dasatinibihoitoon yksin näytteillä joitakin esto luun tuhoutumisen, yhdistelmä dasatinibin ja BMS-754807 tehokkaammin esti sääriluunsisäinen kasvaimen kasvua luun (Fig. 4A, B). Kuitenkin vain lääkeaineiden yhdistelmä vähensi seerumin luun merkkiaineiden (Fig. 4C, D), mikä osoittaa modulaatio sekä PCA solut ja niiden luun mikroympäristön, mikä häiritsee noidankehä [10]. Kun taas muuttaminen hiiren N-telopeptidi, korvike osteoklastien toimintaa, on osoitus esto osteolyyttisiä PC3-MM2 solulinja, havaitut lasku hiiren AFOS (edustavat osteoblastien aktiivisuus) korostetaan keskinäinen riippuvuus näiden solujen prosessissa luun vaihtuvuus. Dasatinib yksin on osoitettu indusoivan osteoblastien kypsymisen [38]; siten mahdollisesti lisätä RANKL eritystä, joka puolestaan ​​normaalisti aktivoi osteoklastien. Kuitenkin, kuten on esitetty Src – /- hiiri [39], Src on myös tärkeä säätelijä osteoklastien funktio, ja tämä on vahvistettu luun säilytykseen dasatinibiryhmän-alone käsitellyt solut (Fig. 4B). Kuitenkin käytetyt mallit, dasatinibi ainoana lääkkeenä alempaan käytetty pitoisuus on riittämätön estämään kasvaimen kasvua, mikä viittaa siihen, että näissä olosuhteissa, ilmaus RANKL ainakin osittain aktivoi osteoklastien toiminto, mutta että lisäys BMS-754807 dasatinibille todennäköisesti estää osteoblastien kypsymisen, lisäksi vähentämällä osteoklastien aktiivisuutta. Tämä tulos näyttää esiintyvän jokaisessa mallissa, ja siten on yhdenmukainen ominaisuus tämän lääkeyhdistelmän.

Bone-tuhoava PC3-MM2-solua injektoitiin intratibially nude-hiirissä. Seuraavat dasatinibihoitoon, BMS-754807 yksin ja yhdessä, hiiret lopetettiin, ja röntgenkuvat ja lasketun tomograafisten (CT) skannausta pitkien luiden tehtiin (kontrolli, n = 10; dasatinibihoidon, n = 9, BMS-754807 , n = 9; yhdistelmä, n = 8). Verta kerättiin seerumi luun aineenvaihdunnan merkkiaineita. (A) aste luun tuhoutumisen oli sokeasti porrastettu puolikvantitatiivinen muoti perustuu röntgenkuvat Kaikilta hiiriltä. Käyrä näyttää osuutta korkealaatuisesta vaurioita (eli 2 tai 3) kussakin hoitoryhmässä. *

P

0,05 yhdistelmä vs. dasatinibille vain. (B) edustaja TT (ylhäällä) ja röntgenkuvat (alhaalla) hiiriltä kussakin ryhmässä. Nuolet ja numerot osoittavat vauriokohdan ja luokka luun tuhoutumisen. (C ja D) Seerumin hiiren alkalisen phospatase (C) ja N-telopeptidi (D) määritettiin ELISA: lla. Bars osoittaa SEM.