Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Mahasyöpää (GC) liittyy korkea kuolleisuus ja epäsuotuisa ennuste on pitkälle edennyt. Lisäksi ei ole olemassa tehokkaita menetelmiä diagnosoimiseksi mahasyövän varhaisessa vaiheessa tai lopputuloksen ennustaminen varten valitsemiseksi potilaskohtaista hoitovaihtoehtoja. Sen vuoksi on tärkeää tutkia uusia menetelmiä GC diagnoosi.

Menetelmät /Principal Havainnot

laitteistojen käyttö diagnostisessa ympäristössä, ryhmä 74 geenien kanssa ja ennustavia tiedot käännettiin räätälöidyn microarray joka sisältää suppean joukon 1042 koettimia soveltuu suurikapasiteettisten käsittely. Tässä raportissa, osoitamme ensimmäistä kertaa, että mukautetun mini-array voidaan käyttää luotettavana diagnostinen väline mahasyövässä. AUC-arvo 0,565 (95% CI 0,305-0,825) osoittaa täydellisen testin herkkyys ja spesifisyys diagnoosin ROC käyrä laskettiin olevan 70% ja 80%, vastaavasti.

Johtopäätökset /merkitys

Tiedot osoittavat selvästi toistettavuus ja kestävyys pieniä mittatilaustyönä mikrosirun. Matriisi on erinomainen työkalu luokitteluun ja lopputuloksen ennustaminen taudin mahasyöpäpotilaista.

Citation: Yin Y, Zhuo W, Zhao Y, Chen S, Li J, Wang L, et al. (2013) muuntaminen Microarray allekirjoitus osaksi Diagnostiikkasivun A Trial of Custom 74 Gene Array selvennystä ja ennustaminen ennustetta mahasyövän. PLoS ONE 8 (12): e81561. doi: 10,1371 /journal.pone.0081561

Editor: Courtney G. Montgomery, Oklahoma Medical Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 14 lokakuu 2013; Julkaistu: 3. joulukuuta 2013

Copyright: © 2013 Yin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (81302070, 81272678, 81071961) (https://www.nsfc.gov.cn), National Basic Research Program of China (973 Program) (2012CB945004) (www.973.gov .cn). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on korkea esiintyvyys ja on toiseksi suurin syy syövän kuolleisuus [1,2]. Ennuste GC on erittäin riippuvainen sairauden vaiheesta diagnoosin ja käsittelymenetelmä [3]. 5 vuoden pysyvyys pitkälle mahasyövässä potilailla on noin 20%, kun taas alkuvaiheen mahasyöpä se on yli 60% [4-6]. Kuitenkin on ollut tehokasta ja toteuttamiskelpoisia menetelmiä havaitsemiseksi varhaisessa vaiheessa syöpä ja ennustamiseen mahdollisen ennusteen tarjota sopivan käsittelyn kullekin potilaalle. Japanissa, vaikka ne voisivat tehokkaammin havaita ja hoitaa varhainen mahalaukun syövän (EGC) kautta laajan seulonnan, vain tähystys voitaisiin käyttää yleisesti havaitsemiseksi EGC. Tämän vuoksi varhaisen diagnoosin ja kykyä erottaa pahanlaatuisten ja syöpää edeltävät leesiot ovat tärkeitä [7]. Sen vuoksi on tärkeää tutkia uusia menetelmiä GC diagnostisten tai prognostisen ennusteita kliinisiä sovelluksia.

Tietyt geenin muutokset eivät voi liittyä canceration ja etenemisen GC [8-11]. Esimerkiksi aiemmat tiedot tutkittiin ehdotti, että kollageeni geenit saattavat olla potentiaalinen biomerkkiaine erottaa pahanlaatuisten peräisin syöpää edeltävät leesiot mahassa [12]. Koska etenemistä taudin premaligni ehtoja GC on dynaaminen prosessi [13-15], havaitsemista geenin muutoksia saattaa sallia tunnistaminen sairauteen liittyvää geenit aikaisintaan patologisia tutkimuksia. Lisäksi geenien ilmentyminen antaa lisätietoja potilaan tila [16]. Siksi mikrosiruanalyysi voi olla tärkeä ja hyödyllinen menetelmä diagnoosiin ja riskin kerrostuminen mahasyövän.

Lisäksi käyttämällä räätälöityjä mini-paneelit kliininen käytäntö voi paitsi olla halvempaa, mutta se voi myös vaatia vähemmän näytteen RNA tulo merkintöjä ja hybridisaatio, sekä tietojen käsittelyyn tarvittava aika voitaisiin huomattavasti heikommat kuin normaali mikrosiruja [17]. Muokattu mikrosiru 70 geenien ennusteeseen rintasyövän, joka on hyväksynyt Food and Drug Administration (FDA), varmentaa toteutettavuus mukautetun microarray kliinisessä käytössä [18,19]. Vaikka on ollut useita tutkimuksia tiettyjen ryhmien geenien GC diagnoosin, microarray tekniikka on tällä hetkellä ole käyttää diagnostisena välineenä mahasyövässä.

Tässä artikkelissa kerrotaan ensimmäisen kerran kehittämistä räätälöityjä diagnostinen GC mini-array ja osoittaa, että mukautetun mini-array voitaisiin käyttää luotettavana diagnostinen ja ennustustyökalun mahasyövän.

Tulokset

Custom mini-joukko ryhmä mahdollisen liittyvistä geeneistä GC canceration ja edistyksen

Aikaisemmassa tutkimuksessa käytimme oligonukleotidi mikrosiru on 38500 geenien systemaattisesti tutkia ero geenien ilmentymisen keskuudessa 33 näytettä normaalista, syöpää edeltäviin, ja pahanlaatuisia leesioita vatsassa [12]. Pieni osa 696 eriytetty-ilmentyminen geenien löytyy Varsinaista tutkimusta oli suunniteltu mukautetun mini-array osana tutkimuksen perusta. Lisäksi tietyt ryhmät, joissa geenit löydettiin, jotka mahdollisesti liittyvät läheisesti GC, mukautetun mini-array myös 44 kollageenin liittyviä geenejä [20-22], 54 geenit sukupuolihormonien reseptoreihin ja polkuja, eriytetty-ilmentyminen geenejä löytyi muissa tutkimuksissa, ja 915 normalisointi geenit (yksityiskohtainen data taulukossa S1). Tässä tutkimuksessa, joka on 1042-geeniekspressioprofiili perustettiin tehokas diagnoosi ja ennustaja taudin tulos mahasyöpäpotilaista.

vertailu 1042-Gene Array Performance kanssa, Original 25k Microarray

onko räätälöityjä mini-array testi suorittaa samanlainen kuin alkuperäinen 25 k mikrosiruja [12], kaksi näytettä ( LYXT ja LYXS) peräisin samasta potilaista käytettiin alkuperäisessä sarjassa kehittää 1042-diagnostinen luokittelija haettiin. Ilmaukset 696 geenien luotu käyttäen diagnostista mini-array olivat hyvin samankaltaisia ​​(Pearsonin korrelaatio 0,957, p 0,01) alkuperäiseen julkaistut tiedot (kuva 1).

Data osoitti ilmaisua suhde pahanlaatuinen /syöpää edeltävä. Ei ollut merkittäviä eroja kahden ryhmän välillä.

tunnistaminen geenit ilmentyvät differentiaalisesti pahanlaatuinen ja premaligni mahan kudoksissa

Kaikki tiedot disointeja tausta-korjattu, normalisoitu, ja analysoidaan tunnistaa Vaihtelevan-ilmentyminen geenien 40 näytettä, jotka edustavat pahanlaatuiset leesiot ja syöpää edeltävät leesiot (n = 20 kussakin ryhmässä). Joukko 371 geenien havaittiin erottaa pahanlaatuisten leesioiden välillä syöpää edeltävät leesiot käyttäen hierarkkinen klusterointi ja SVM jättää-one-out vahvistus, kun taas syöpää edeltävä näyte (MGFS) luokiteltiin pahanlaatuinen ryhmään, ja viisi pahanlaatuiset näytettä (XSHT, GJFT, CXCT , XYT ja QLTT) luokiteltiin osaksi premalignien ryhmään. MGFS ja otos kerättiin ympäröivästä kudoksesta sinettisormukseksi-rengas karsinooma. Patologinen raportti paljasti, että XSHT näyte oli kohtalaisen eriytetty adenokarsinooma, The GJFT näyte oli kohtalaisen hyvin eriytetty adenokarsinooma, kun taas CXCT, XYT ja QLTT näytteet olivat hyvin eriytetty adenokarsinooma. Nämä differentiaalisesti ilmentyvien geenien mukana 199 up-geenien ja 172 alas geenien in pahanlaatuinen vaurioita verrattuna syöpää edeltävät leesiot (kuva 2).

Jokainen pylväs edustaa näytettä ja kukin rivi geeni. Luonne ”T” viittaa kasvaimen ja luonne ”S” tarkoittaa syöpää edeltäviin kudoksen näytteessä nimiä. Ilmaisut Geenien kahden ryhmän välillä on merkittäviä eroja, kertaluokkamuutos log

2 = 1 tai = -1, P 0,01.

erottaminen ennustetta mahasyövän

valvomattoman, hierarkkinen klusterointialgoritmi pystyimme klusterin 20 GC pahanlaatuinen vaurioita perusteella niiden yhtäläisyydet mitattuna merkittävä geenien 371 differentiaalisesti ilmentyvien geenien välillä pahanlaatuisten ja syöpää edeltävät vauriot. Erityisesti vasemmassa ryhmässä, 4 10 satunnaista potilaista oli varhaisessa vaiheessa GC ja muut esitetään hyvin erilaisia ​​vaurioita, kun taas oikean ryhmän 2 10 satunnaista potilaista oli ryhmästä, joka kehittyi etäispesäkkeitä 5 vuoden kuluessa tai korkea vaiheessa ja huonosti eriytetty vaurioita. Siten, käyttäen valvomattoman klusterointi, voidaan erottaa toisistaan ​​”hyvään ennusteeseen” ja ”huonon ennusteen kasvaimia, jonkin verran (kuvio 3). Lisäksi tyyppi ja vaihe GC: lla potilaista olivat mukana alaryhmien huono tai hyvään ennusteeseen (taulukko 1, yksityiskohtaiset tiedot taulukossa S2).

Jokainen sarake edustaa kasvaimen ja kukin rivi: geenin. Pituus ja osastoimisesta oksat näyttää suhteuttaminen GC (alhaalla) ja geenien ilmentymistä (oikealla). Keltainen viiva merkitsee alajako kahteen hallitseva klustereita. Ilmaisut Geenien kahden ryhmän välillä on merkittäviä eroja, kertaluokkamuutos log

2 = 1 tai = -1, P 0,01.

Ryhmä 1 (Good prognoosi)

Ryhmä 2 (huono ennuste) B Age62.8 ± 7.1161.3 ± 7.02Gender (mies /nainen) 7/38 /2Viritysaste (I /II /III /IV) 2/1/7/01/0/5 /4Pathological tyyppi (Kohtalaisen hyvin eriytetty adenokarsinooma /Huonosti eriytetty adenokarsinooma /sinettisormus karsinooma /mucinous adenokarsinooma) 7/2/1/03/4/1 /2Metastasis 5 years13Table 1. vaihe mahasyöpäpotilaista kahteen ryhmään.

CSV Lataa CSV

Custom array vähimmäismäärä geenejä GC diagnoosia ja ennustamista

valvomaton kaksiulotteinen klusterin analyysi geeni klustereiden ja GC klustereiden suoritettiin itsenäisesti käyttäen agglomerative hierarkkinen klusterointialgoritmi kanssa 371 geenejä, jotka voivat tunnistaa pahanlaatuinen GC ja syöpää edeltävät vauriot. Korrelaatiokerroin ilmaisun kunkin geenin tauti tulos laskettiin, ja 252 geenit havaittiin merkitsevästi yhteydessä sairauteen tulos (korrelaatiokerroin -0.3 tai 0,3) (yksityiskohtaiset tiedot taulukossa S1).

Nämä 252 geenit listalla tilata perusteella suuruuden korrelaatiokerroin. Määrä geenien ”ennustetekijöiden luokittelija” optimoitiin lisäämällä peräkkäin osajoukot 5 geenien ylhäältä tämän listalla-järjestetyn listan ja arvioimalla sen teho luokiteltu oikein käyttämällä ”jätä-yksi-out” menetelmää ristivalidointi. Luokittelu tehtiin perustuen korrelaation ilmaisun tasojen jäljellä näytteitä hyvän ja huonon potilaista. Tarkkuus parani, kunnes optimaalinen määrä markkerigeenejä saavutettiin. Näin ollen 74-geenit määritettiin olevan vähimmäismäärä geenejä, jotka voidaan luokitella kahteen alaryhmiä eri ennuste (kuva 4). AUC-arvo 0,565 (95% CI 0,305-0,825) osoittaa täydellisen testin herkkyys ja spesifisyys diagnoosin ROC käyrä laskettiin olevan 70% ja 80%, vastaavasti (kuva 5).

jokainen pylväs edustaa kasvain ja jokainen rivi geeni.

Perustuu Gene ontologia (GO) funktio luokitus, toiminnallinen merkintä varten osallistuvia geenejä solusyklin, invaasiota ja etäpesäkkeiden, angiogeneesi, ja signaalitransduktion merkittävästi voimistunut että huonon ennusteen allekirjoitus (huomautus geenien luetellaan taulukossa S1). Nämä geenit sisältävät useita ryhmiä, joiden toiminta huomautus antaa selvän käsityksen taustalla olevan biologinen mekanismi johtavat keskeiset toiminnot kasvaimien syntyyn liittyvien ja etenemiseen. Osallistuvia geenejä solusyklin, invaasio ja metastaasi, angiogeneesi, ja signaalitransduktion merkittävästi ilmentyvät differentiaalisesti kahden allekirjoitusta (esimerkiksi GKN1, INHBA, SPP1 ja THBS4). Samaan aikaan, valvomaton klusterin analyysi erottelee eri ennustetekijöiden kasvaimia. Arvioimalla kaikki 74 ennustetekijöiden toimittaja geenit, enemmän kuuluvien geenien näiden toiminnallisten luokkien selviksi (esimerkiksi GKN1, GKN2, GIF, PSCA ja LiPF).

potilaat kahteen ryhmään luokiteltu 74 geenejä ja koko koettimet ovat lähes samat, lukuun ottamatta näytteen LCM, joka oli luokiteltu hyvää ennustetta ryhmän koko koettimet mikrosirulla ja osaksi huonon ennusteen ryhmä 74-geenin luokitus. LCM näyte kerättiin pahanlaatuista kudosta potilaan kärsivän mucinous adenokarsinooma vaiheessa IV on lyhyempi käyttöikä kuin muilla potilailla virallisen ryhmissä. Siksi 74-geenin luokitus microarray voi olla luotettavampi.

tarkastaminen 74 geenien mukautetun array ja korrelaatio mikrosirun datan ennustetekijöiden profiilin

11 GC osallistuneiden potilaiden edellisessä tutkimuksessa [12], laskimme korrelaatiokerroin tason ekspression 74 geenien määritetyn keskimääräisen profiilin näiden geenien kasvaimia sairastavien potilaiden hyvän ennusteen (CI). Potilas jonka korrelaatiokerroin on yli -0,007 (kynnys johti 13 prosentin määrän vääriä negatiivisia tuloksia) sitten luokiteltu ryhmiin kanssa hyvän ennusteen allekirjoitus, ja kaikki muut potilaat on luokiteltu ryhmiin köyhien -prognosis allekirjoitus (kuvio 6). Lisäksi, selviytymisen käyrä kahden ryhmän vaihtelee huomattavasti (p 0,05) (kuvio 7). Siten luokittelija vertailukelpoinen suorituskyky validointi 11 itsenäistä satunnaista kasvaimia ja vahvisti ennusteita ja luotettavuutta ennuste luokittelu 74 geenin mukautetun array.

Keltainen viiva merkitsee alajako kahteen hallitseva klusterit kaksiulotteisella klusterianalyysillä. Valkoisen viivan merkitsee alajako kahteen hallitseva klustereiden optimoitu herkkyys.

X-akseli ilmoittanut kuukauden kuluessa potilaan elossa. Y-akseli osoitti, että osuus elossa potilaista (mukaan lukien ne, joilla etäpesäkkeitä tai toistuminen).

toistettavuus räätälöityjä mini-array

vahvistaa tiedot geenin ilmauksia microarray data, päätimme eriytettyä-ilmentymisen geeni, INHBA, ja tutkitaan sen ilmaisutapoja kvantitatiivinen RT-PCR-analyysillä. Tuloksemme osoittivat, että geenin merkitsevästi muuttunut ilmentyminen pahanlaatuinen kudoksissa verrattuna premaligni kudoksissa 11 parin toisiaan näytteitä, sopusoinnussa saadut tulokset mikrosiruanalyysi (kuva 8).

pystysuora numerot log

2 transformaatio ovat pari toisiaan suhde pahanlaatuisten vaurioiden syöpää edeltäviin vaurioita. A. sarakkeet tarkoittavat tunnusluvut on saatu kvantitatiivinen QRT- PCR kokeilu. B. Vertailu suhdelukua microarray ja kvantitatiivinen QRT-PCR-analyysit.

alaryhmä lisääntymisen liittyvien geenien kanssa mahasyöpä

74-geenin mukautetun microarray lista, me löytäneet ryhmän geenien kanssa GO luokittelun lisääntymiseen (taulukko 2), jossa 5 geenit sukupuolihormonien reseptoreihin ja väyliä (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 ja FOXL2), voi vain tehokkaasti erillisiä pahanlaatuinen alkaen premaligni näytteet, mutta myös luokitella huono ja hyvää ennustetta hierarkkinen klusterointi ja SVM (kuvio 9). Lisäksi kaksi sukupuolihormonien geenit oli merkittäviä differentiated- ilmaus hyvän ennusteen huonoon ennusteeseen GC (ESRRG 8,83, AR 0,37, p 0,01).

Symboli

kertaluokkamuutos

Symbol

Taita change

AMHR20.442DMRT34.8637INHBA11.2072DMRTA10.366MMP142.009SFRP413.0683NOTCH12.2898FOXL23.291PGF2.9307SPP19.4141Table 2. Geenit GO luokittelu lisääntymisen 74 geenien microarray ryhmä.

CSV Lataa CSV

ilmauksia geenien kahden ryhmän välillä on merkittäviä eroja, taita muutos loki

2 = 1 tai = – 1, P 0,01.

keskustelu

Tässä tutkimuksessa raportoimme ensimmäistä kertaa, että mukautetun mikrosirulla voi olla tehokas tapa diagnosointiin ja ennustamista ennusteen GC kliinisesti. Puute kliininen biomarkkereita varhaisen mahasyövän ilman erityisiä ensioireita johtaa taudinmääritys ja myötävaikuttaa korkeaan kuolleisuuteen mahasyövän [23]. Joissakin tapauksissa tapahtuu muutoksia ainoastaan ​​geenin tasolla eikä patologisia muutoksia. Muutoksia geenien ilmentyminen voisi tukea varhaisen diagnoosin, ennusteen ja hoidon ohjausta leikkauksen jälkeisen säteilyn ja kemoterapiaa. Kehittäminen mikrosirun teknologioiden avulla tutkitaan mahdollisuutta patologisten kääntyminen ja arviointia ja ohjausta hoidon. Lisäksi luodaan kohdennettuja mikrosiru laitteet saattavat tehdä tekniikkaa enemmän hyötyä. Heikon spesifisyyden ja puute kypsä yhteisen diagnoosin, mukautettua mikrosiru ei ole sovellettu kliinisessä käytössä mahasyövän vielä, vaikka tutkimukset geenidiagnoosiin.

Microarray-analyysi on laajalti käytetty tekniikka opiskeluun geeniekspression maailmanlaajuisesti. Useat molekyyli määrityksiä työskentelee tällä hetkellä kliinistä arviointia syöpiä ovat peräisin microarray-pohjainen geeniekspressioprofilointi. Yksi esimerkki microarray perustuva määritys on MammaPrint, mukautetun mikrosiru 70 liittyvien geenien riski varhaista kehitystä etäpesäkkeiden nuorilla potilailla, joilla imusolmukkeiden rintasyöpä. MammaPrint on ratifioinut FDA. Kyky käyttää tämän profiili suurikapasiteettisten diagnostinen asetus voisi olla suuri etu ennustetta ja rintasyövän [17-19]. Kuitenkin tekniikka ei tällä hetkellä käytetään rutiini diagnostinen väline mahasyövässä, ja ei ole tutkimus mukautettuja mikrosiruja diagnosointiin käytettyjen tai ennustamiseen ennustetta. Tässä raportissa, osoitamme ensimmäistä kertaa, että mukautetun mini-array voidaan käyttää luotettavana diagnostinen väline mahasyövässä.

Tässä artikkelissa kuvaamme kehitystä räätälöidyn diagnostisen mahasyövän mini-array ja kuvata sen luotettava käytettäväksi diagnostisen ympäristössä. Useat kliiniset tutkimukset ovat korreloivat muutoksia ilmaisua yksittäisten geenien mahalaukun syövän lopputulokseen, usein ristiriitaisia ​​tuloksia. Esimerkkejä ovat CXCL1, HOXA10, ja metylaation PCDH10 [24-26]. Nämä geenit eivät olleet mukana meidän mini-array. On mahdollista, että muissa tutkimuksissa kiinnitettävä enemmän huomiota toimintoja näiden geenien, kun taas olemme keskittyneet ilmaisuja mRNA. 74-geeni mukautetun array voi olla mahdollista ennustava työkalu mahasyövän. Tiedot osoittavat selvästi, toistettavuus ja kestävyys pieniä mittatilaustyönä mikrosirun. Käyttö mukautetun microarray voisi tarjota useita etuja, kuten tarkkaa tietoa uusiutumisen riski verrattuna perinteisiin kliiniset kriteerit, ja siten parantaa ohjauksen vaatimus adjuvanttihoito.

Samalla takia 2 kertaa korkeampi esiintymistiheys miehillä kuin naisilla GC [1], useat suuremmat epidemiologiset tutkimukset viittaavat siihen, että sukupuoli oli merkittävä itsenäinen ennustetekijä yleistä selviytymisen GC potilailla [27,28 ] ja miesvaltaisuus mahasyövän korreloi 10-15 vuoden viive puhkeamista suoliston tyyppinen mahasyöpä naisilla kuin miehillä [29]. Tässä profiili 74 geenin custom mini-array, 5-geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä pahanlaatuisten vaurioiden ja syöpää edeltävät leesiot GC (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 ja FOXL2). Tämä ryhmä sukupuoleen liittyvien geenien kanssa mahdollisia rooleja GC ehdotti ensimmäisenä, ja on olemassa joitakin tutkimuksia tähän ryhmään liittyvien geenien syöpiin. On tärkeää huomata, että viimeisimmän tutkimuksen raportoimat Matson ja kollegat osoittivat mahdollista yhteyttä ja polun DMRT1, FOXL2 ja sukupuolten hormoni [30]. DMRT1, DMRT3, ja DMRTA1 ovat kaikki mukana klusterin geeniperheen, joilla on sinkki sormimai- DNA sitova motiivi (DM domain) yhteistä, joka on myös keskeinen säätelijä mies kehityksen kärpäsiä ja sukkulamatoja. Lisäksi tärkein geenit tämän reitin sisältyvät kaikki tietomme. Tiedot voi antaa meille tutkimuksen suunta sukupuoleen liittyvien geenien GC ja paljastavat mahdollisen polun ja mekanismi GC canceration.

Siksi matriisi voi olla erinomainen työkalu luokitteluun ja lopputuloksen ennustaminen taudin mahasyövän potilaille. On kuitenkin olemassa joitakin rajoituksia meidän profiilin. Näytteet tulisi laajentaa tarkistaa kliininen pätevyys ja toistettavuus.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

Neljäkymmentä kirurgisesti resektoitiin mahasyövässä yksilöitä ja viereisen ei-kasvain näytteet olivat saatu Sir Run Run Shaw sairaala, School of Medicine Zhejiangin yliopistossa ja käytettiin kesäkuussa 2007 toukokuussa 2011. Keräsimme pahanlaatuinen ja premaligni kudosten eri alueilta resektoitua mahan jokaisen potilas leikattiin. Neljäkymmentä ryhmitelty kudosnäytteitä kaksikymmentä primaarisessa mahalaukun syövän, joille tehtiin leikkaus (kaksikymmentä pahanlaatuiset leesiot, kaksikymmentä esipahanlaatuinen leesioita) valittiin oligonukleotidin mikrosiruanalyysi (taulukko 1, yksityiskohtaiset tiedot taulukossa S2). Kaikki kerätyt näytteet kiinnitettiin, upotettu, värjättiin H = 7,0 ja 28S /18S = 0,7. CRNA oli hajanainen kanssa Gene Chip Sample Cleanup Module (Affymetrix, USA) ja leimattu yksivärinen käyttäen Agilent suuremmaksi merkintätapa menetelmällä. Hybridisaatio, värjäys, pesu- ja skannaus menetelmät suoritettiin kuvatulla tavalla Gene Chip Expression Analysis tekninen käsikirja (Affymetrix, USA).

Analyysi oligonukleotidin microarray tietojen

tulokset microarray oli skannataan Agilent skanneri. Data normalisoitiin ja keskusteli sen jälkeen kuvan hankinnan ja kvantifiointiin tunnistaa geenejä, joilla on huomattava ero ilmaisuja käyttäen Feature Extraction ohjelmisto. Avoimen lähdekoodin tulkita tietokoneen kieli (R) käytettiin tilastollisiin laskenta- ja grafiikka [12]. Raakadata mukautetun microarray on ladattu ArrayExpress hakunumerolla A-MEXP-2338.

Tutkimuksen suunnittelu

Käytimme perustuva menetelmä geeniekspressioprofiilien luokitella mahasyövistä osaksi prognostisia tai diagnostisia luokkia. Menetelmä sisälsi seuraavat vaiheet: (1) suunnittelu mukautetun mini-array ryhmä geenejä saattaa liittyä GC canceration ja edistyminen perustuu aiempiin tutkimuksiin, (2) valinta eriytetty-ilmentymisen geenien välillä pahanlaatuisten ja syöpää edeltävät leesiot (fold muutos 2 kertaa ja p 0,05) (3), valvomaton kaksiulotteinen klusterin analyysi geeni klustereiden ja GC klustereiden suorittaa itsenäisesti käyttäen agglomerative hierarkkinen klusterointialgoritmi (4), valinta erotteleva kandidaattigeenejä geeneistä valitaan vaiheessa 2 mukaisesti niiden korrelaatio luokkaan (hyvä tai huono ennuste) (5), määritys optimaalisen joukon reportterigeenien käyttäen jätettävää one-out cross validointimenettelyllä (6), prognostisia tai diagnostisia ennustaminen perustuu geenin ilmentymistä optimaalinen joukko reportterigeenien [18,19], (7) GO merkinnästä reportteri geenien, ja (8) analyysi korrelaatio mikrosirun datan ennustetekijöiden profiilin

kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

kokonais-RNA uutettiin näytteistä käänteisesti cDNA: ksi käyttäen prime script TM RT reagenssipakkaus (Takara, Japani) 37 ° C: ssa 15 min ja 85 ° C: ssa 15 sekunnin ajan. PCR-reaktiot käyttäen SYBR® premis EX Taq TM kit suoritettiin 95 ° C 30 sekuntia, jota seuraa 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia, 60 ° C 10 sekuntia ja 72 ° C: ssa 40 sekunnin ajan kanssa 7500 Real- PCR System (Applied Biosystems, USA). Housekeeping-geeni β-aktiini toimi sisäisenä kontrollina. Forward-aluketta sekvenssi INHBA on GTGATGGCAAGGTCAACATCT, ja käänteinen yksi on GCGGTAGTGGTTGATGACTGT.

Tilastollinen

Käytimme verrannollinen vaaratekijät regressioanalyysiä säätää assosiaatiota korrelaatiokerroin (CI) ja etäpesäkkeitä muiden muuttujien. P-arvot liittyvät kertoimet Tunnuslukujen laskennassa käytetään Fisherin testiä.

tukeminen Information

Taulukko S1.

tiedot geenien askelin tapoja suunnitella mini-array ja lopullinen 74 mini-array geenejä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0081561.s001

(XLS) B Taulukko S2.

yksityiskohtaiset tiedot leesioiden varten microarray.

doi: 10,1371 /journal.pone.0081561.s002

(DOC) B