Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lihavuus ja tyypin 2 diabetekseen liittyy kohonnut riski kehittämiseksi tiettyjen syöpäsairauksien, kuten paksusuolen syöpä . Julkaiseminen erittäin kiistanalainen epidemiologisista tutkimuksista vuonna 2009 nosti esiin mahdollisuuden, että käyttävät insuliinianalogin glargiini kasvaa tätä riskiä entisestään. Ei kuitenkaan ole selvää, miten mitogeenisiä vaikutuksia insuliinin ja insuliinin analogit mitataan

in vitro

korreloi kasvaimen kasvua edistävät vaikutukset

in vivo

. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia mahdollista kasvua edistävät vaikutukset ihmisen natiivin insuliini, insuliini X10 ja IGF-1, joita pidetään positiiviset kontrollit

in vitro

, joka lyhyen aikavälin eläinmallissa sellaisen lihavuuteen ja diabetes-asiaan syöpä. Olemme tunnettu insuliinin ja IGF-1-reseptorin ilmentymisen ja hoitovasteen insuliinilla, X10 ja IGF-1 hiiren koolonisyöpäsolulinja (MC38-solut)

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi tutkimme farmakokinetiikkaa ja farmakodynamiikkaa ja seurataan kasvua MC38 solun allograftien hiirissä ruokavalion aiheuttama ylipaino hoidetaan ihmisen insuliini, X10 ja IGF-1. Hoito X10 ja IGF-1 lisäsi merkittävästi kasvua MC38 solun allograftien hiirissä ruokavalion aiheuttama ylipaino ja voimme siis päätellä, että edellä-farmakologinen annoksia insuliinianalogin X10, joka on super-mitogeeninen

in vitro

ja lisääntynyt ilmaantuvuus rintarauhaskasvainten naisten rotilla 12 kuukauden myrkyllisyystutkimus, myös lisätä kasvua kasvaimen allograftien lyhyen aikavälin eläinmallissa.

Citation: Valkoinen H, Blouin MJ, birma E, Damgaard J, Poulsen F, Fels JJ, et al. (2013) insuliinihoitoa Analogiset X10 ja IGF-1 Lisäykset kasvu Colon Cancer Allotranplantaatit. PLoS ONE 8 (11): e79710. doi: 10,1371 /journal.pone.0079710

Editor: Josep Bassaganya-Riera, Virginia Tech, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 24 syyskuu 2013; Julkaistu: 18 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Hvid et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli osittain tuettu avustus (TFF-116128) Kanadan Institute of Health Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat eturistiriitoja ilmoittaa: H Valkoinen, J Damgaard, JJ Fels, F Poulsen, C Fledelius ja BF Hansen ovat työntekijöitä Novo Nordisk ja pidä yhtiön osakkeita. M Pollak on konsultti Novo Nordisk. Kaikkien jäljellä kirjoittajat ei ole eturistiriitoja raportoida. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Lihavuus ja tyypin 2 diabetekseen liittyy kohonnut riski sairastua tiettyjä syövän muotoja, kuten rinta-, haima- ja paksusuolen syöpä [1] – [5]. Erittäin kiistanalainen epidemiologiset tutkimukset ehdotti, että terapeuttinen käyttö insuliinianalogin glargininsuliinin oli liittyy lisääntynyt riski syövän kehittymistä [6], [7], mutta ORIGIN tutkimus äskettäin esiin vahvaa näyttöä siitä, että tämä ei ole [8]. Kuitenkin epidemiologiset tutkimukset julkaistiin vuonna 2009 ja keskustelujen korosti prekliinisten turvallisuuden arvioinnin insuliinianalogeja. Lisäksi rauhoittavaa koskevat tulokset glargiini- eivät vähennä ennen näyttöä yhdistyksen välillä tyypin 2 diabeteksen ja kohonnut tai huonompi ennuste tiettyjen syöpien, kuten paksusuolen syöpä, ja taustalla olevia mekanismeja tämä yhdistys on edelleen tärkeä aihe.

tässä yhteydessä insuliinianalogin X10 on mielenkiintoinen ligandi. X10 kehitettiin lyhytvaikutteinen insuliini analoginen korvaamalla histidiini asemassa B10 asparagiinihapolla [9]. Tämä yksittäinen aminohapposubstituutio lisääntynyt sitoutumisaffiniteetti X10 IGF-1-reseptorin (IGF-1 R) ja insuliinireseptoriin (IR), 3- tai 5-kertaiseksi ja 2-kertaiseksi [10], [11]. Lisäksi X10 on vähentynyt off-rate IR verrattuna natiivin ihmisen insuliini (HI), joka johtaa kestävään signaloinnin IR [12]. Äskettäin on osoitettu, että X10 johtaa suhteellisesti vahvempi aktivointi fosforylaation sivustoja Juxta-kalvo ja kinaasin domeenit IR kuin C-terminaalinen domeeni [13]. Nämä reseptoriin sitoutumisen ja -activation ominaisuudet antaa X10 3-15 kertaa suurempi mitogeenisestä vaikutuksesta kuin HI

in vitro

[14] ja 12 kuukauden kroonista toksisuutta supra-farmakologinen annokset X10 lisääntynyt esiintyvyys spontaanien rintarauhaskasvainten Sprague Dawley [15]. Jatkokehittely X10 kliiniseen käyttöön oli siis lopetettiin, mutta taustalla olevia mekanismeja lisääntynyt kasvaimen esiintymistiheys ei ole koskaan selvitetty (katso [16] yksityiskohtaisen tarkastelun).

Aiemmat eläinkokeissa käyttämällä geneettisiä tai ruokavalion aiheuttama malleja lihavuuden tai diabeteksen korreloivat insuliinipitoisuuden lisääntyneen muodostumisen kemiallisesti indusoidun esineoplastiset solumuutoksia paksusuolessa [17], [18], kasvua kemiallisesti aiheuttama paksusuolen kasvaimissa [19], [20] sekä kasvua hiiren syöpäsolun vieraskudossiirteitä [21 ] – [25]. Rottamalleissa kemiallisen syöpäsairauden, insuliinihoitoa tehostettu kasvu azyoxymethane aiheuttaman paksusuolen kasvaimissa [26] ja 7,12-dimetyylibents (a) antraseeni-indusoidun nisäkasvaimia [27]. On myös osoitettu, että jatkuva infuusio insuliinin rotille 12 h lisääntyvän leviämisen paksusuolen epiteelisolujen [28], ja edellä farmakologisia annoksia HI tai Glargiini varten 18 viikkoa lisääntyvän leviämisen paksusuolen epiteelisolujen ja muodostumista preneoplastiset leesiot, mutta ei johtanut kasvainten muodostumiseen [29]. Vuonna turvallisuustutkimuksissa, joka perinteisesti suoritetaan kuten karsinogeenisyystutkimukset tai kroonisen myrkyllisyyden tutkimukset 6-24 kuukautta kestävät hiirillä tai rotilla [30], ei lisääntynyt kasvaimen esiintymistiheys havaittiin Sprague Dawley ja NMRI-hiirillä hoidon jälkeen suhteellisen pienillä annoksilla glargininsuliinin ja HI korkeintaan 24 kuukautta [31]. Kuitenkin, kuten edellä on mainittu, hoito suurilla annoksilla X10 on 12 kuukautta lisääntynyt ilmaantuvuus maitorauhasen kasvainten nisäkasvaimen-altis naaras Sprague Dawley [32]. Vaikka suositukset turvallisuustutkimuksia insuliinin ja insuliinin analogit perustuvat validoitu hyvin tieteellisen käytännön, perin kehitetty tutkimukset mutageenien, nykyisten tietojen mukaan kasvaimen kasvua lisäävän vaikutuksen insuliinin ja insuliinin analogit on merkityksellisempää huolta, kuin huoli lisääntynyt kasvaimen aloittamisen kautta lisääntynyt mutaatioaste aiheuttama lisääntynyt leviämisen, kuten myös ehdotettu aiemmin [33]. Kustannustehokkuus seulontaohjelmien eri syövän korostaa, että ei ole harvinaista aikuisille, kuten diabeetikoille, on huomaamatta premaligni varhain syöpiä [34], [35]. Sen vuoksi on relevantti tutkia miten insuliinihoitoa ja insuliinin analogit vaikuttavat käyttäytymiseen nykyisten syöpien, ja tehdä tämä eläinmalleissa diabetes tai liikalihavuus yhdistettynä insuliiniresistenssin, koska nämä tekijät ovat tunnettuja riskitekijöitä syövän kehittymisen.

tavoitteena oli tutkia mahdollisia kasvaimen kasvua edistävää vaikutusta hoidon HI, X10 ja IGF-1 hiiren paksusuolensyöpä allotransplantaatteja malli (MC38-solut) perustettiin vuonna hiirillä ruokavalion aiheuttama ylipaino (DIO) ja insuliiniresistenssi. Siksi tunnettu MC38 solulinjaa käytettiin siirteen tutkimuksista laajasti ja esiintynyt useita eläinkokeita saataisiin luotettava arvio mahdollisista kasvaimen kasvua edistävää vaikutusta HI, X10 ja IGF-1

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

eläinkokeet

Jotta voidaan tutkia hoidon vaikutusta HI, X10 ja IGF-1 kasvuun MC38 kasvaimen allograftien teimme viisi identtistä eläinkokeita. Olemme keskittyneet eri päätepisteet näissä eläinkokeissa ja seurataan kasvaimen kasvua kaikissa kokeissa, katso taulukko 1. Eläinten Kokeet suoritettiin kuten on kuvattu äskettäin [36]. Lyhyesti, C57BL /6-hiiriä hankittiin Jackson Laboratories iässä 18 viikon jossa hiiret oli säilytetty runsasrasvainen ruokavalio (jyrsijän ruokavalio 60 kcal% rasvaa, D12492, Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ, USA) jälkeen 6 viikon ikäisinä. Karakterisointiin metabolisen fenotyypin DIO-hiirillä (katso taulukko 2), metabolisten parametrien mitattiin myös samanikäisiin vähärasvaisen hiiriä ruokittiin ohjaus ruokavalio, (jyrsijä ruokavalio 10 kcal% rasvaa, D12450B, Research Diets) mukana kolmessa kokeet. Eläinten hoito ja hoidot tehtiin vakiintuneiden ohjeiden ja protokollien hyväksymä Lady Davis Institute (protokolla # 5951) ja McGill University Animal eettisen komitean. Hiiriä pidettiin yksi hiiri häkkiä kohti ad libitum pääsy vesijohtovettä ja korkea- tai vähärasvainen ruokavalio, vastaavasti, koko opintojen. Lämpötila eläinten huoneissa pidettiin 20-25 ° C: ssa, jossa on valoisa /pimeä-sykli 14/10 tuntia. Hiiriä sopeutunut 7-10 vuorokautta ennen koetoimenpiteet aloitettiin. Koepäivänä 0, 2,0 x 10

5 (koe A) tai 5,0 x 10

5 (kaikki muut kokeet) MC38-solut, suspendoitiin 100 ul: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), injektoitiin ihon alle (sc) oikeaan kylkeen hiirillä. Tämän jälkeen kukin hiiri injektoitiin kahdesti päivässä joko vehikkelillä (aqueos, joka sisälsi 7 mM fosfaattia, 150 mM glyseroli, 22 mM NaCl ja 30 mM fenolia, pH 7,4), ihmisen rekombinantti-insuliinia 600 nmol /kg, insuliinianalogin X10 (insuliinianalogin B10Asp) (Novo Nordisk A /S, Kööpenhamina, Tanska) 600 nmol /kg tai rekombinanttia ihmisen IGF-1 (Increlex, IPSEN Pharma GmbH, Ettlingen, Saksa) 600 nmol /kg. Koko kasvain allograftien mitattiin kolme kertaa viikossa ja tilavuus lasketaan käyttäen seuraavaa kaavaa: pituus x leveys

2 x 0,52. Joka perustuu kasvaimen tiedot kunkin hiiren, laskimme ala kasvaimen kasvukäyriä (kasvaimen kasvun AUC). Tällä koe lopetettiin, hiiret nukutettiin isofluraanilla. Veri kerättiin sydänpunktiolla ja välittömästi sen jälkeen, kun eutanasia taittamalla niiltä niskat, näytteitä maksan, paksusuolen, kaksoiskantalihas ja MC38 kasvain allograftit leikeltiin pois ja pikajäädytettiin nestemäisessä typessä myöhempää valmistamiseksi kudoksen lysaatin.

verensokerin ja HbA1c

Voit seurata farmakodynaaminen vaikutus hoidon HI, X10 ja IGF-1, verensokerin mitattiin ennen hoitoa ja 15 min, 1 h, 2,5 h ja 6 h hoidon jälkeen. Veri kerättiin punktio jalkavarreniholaskimon ja verensokerin mitattiin käyttämällä OneTouch Ultra Glucometer (LifeScan, Inc., Milpitas, CA, USA).

Tasot glykosyloidun hemoglobiinin (HbA1c) veressä DIO- ja laiha kontrollihiiret mitattiin käyttäen Tina-quant hemoglobiini A1c Gen.3 analyysi pakki ja Cobas 6000 väline (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Saksa), valmistajan ohjeiden mukaisesti.

kokoelma Plasma Näytteet ja mittaukset C-peptidi, ihmisen insuliini, insuliini X10 ja Human IGF-1

Ennen kokeet aloitettiin, systeeminen tasot hiiren insuliinin mitattiin käyttäen rotan /hiiren insuliini ELISA-kittiä (Millipore Corp., Bilerica, MA , USA), mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Plasmanäytteet kerättiin päättymisen kokeet analysoitiin hiiren C-peptidi, ihmisen insuliini, insuliinianalogi X10 tai ihmisen IGF-1. Hiiren C-peptidi määritettiin rotan /hiiren C-peptidi 2 ELISA Kit (Millipore), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Plasman pitoisuudet ihmisen IGF-1 mitattiin IDS-Isys IGF-1 ELISA Kit (IDS immunodiagnostiikkaan, Fountain Hills, AZ, USA), mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Plasma analysoitiin käyttöön natiivin ihmisen insuliinin käyttäen Luminescence Oxygen kanavointi Immuno-määritys (LOCI-määritys), kuten aiemmin on kuvattu [37]. Insuliini X10 mitattiin hiiren plasmassa käyttäen wash-LOCI määrityksessä, kuten myös kuvattu äskettäin [38]. Katso Materiaalit S1 yksityiskohtaiset tiedot näistä määrityksissä.

Cell Culture

MC38-solut (hiirisolulinjaa kuvanneet Corbett et al. (1975) [39] ja jalomielinen lahjoitus tohtori Pnina Brodt , McGill University, Montreal, QC) ja MCF-7-solut (ATCC, Manassas, VA, USA), viljeltiin DMEM-alustassa, joka sisälsi 4,5 g /l glukoosia (Wisent Inc., Montreal, QC, Kanada), johon on lisätty 10% ( v /v) naudan sikiön seerumia (FBS, Invitrogen) ja 20 ug /ml gentamysiini (Sandoz Canada, Boucherville, QC, Kanada) (eli kasvualusta). Solut, joita käytetään eläinkokeissa trypsinoitiin, pestiin kerran PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään (4 ° C), jonka pitoisuus on 5,0 x 10

6 solua /ml, ja pidettiin jäissä, kunnes sc injektion hiirissä. Signalointia kokeissa MC38-soluja viljeltiin kasvatusalustassa kaksi päivää, kunnes 80-90% konfluentteja, soluviljelmiä huuhdeltiin sitten kerran PBS: ssä (huoneenlämpötilassa), ja nälkiinnityskasvatusaine (samanlainen kasvualustaan, paitsi että se sisälsi ainoastaan ​​0,25% (v /v) FBS: ää ja ilman fenolipunaista), lisättiin 3 h. Ruoattaolon jälkeen soluja käsiteltiin natiivin ihmisen insuliinia, X10 tai IGF-1 lopullisina konsentraatioina 1 tai 10 nM nälkiinnityskasvatusaine. Täsmälleen 30 minuutin kuluttua käsittelystä, solut huuhdeltiin kerran PBS: llä (4 ° C) ja hajotettiin lisäämällä lyysipuskuria, kuten edellä on kuvattu. Jokainen signalointi Koe käsitti kaksi samanlaiset näytteet käsittelyä kohden ja kolmen erillisen kokeen tehtiin. MC38-solut, joita käytetään luonnehdinta IR ja IGF-1 R ilmentyminen viljeltiin, kerättiin ja lyysattiin, kuten on kuvattu signalointi kokeissa edellä, paitsi, että ne eivät olleet ilman ravintoa ennen lyysiä.

Cell Proliferation

Effect testiyhdisteiden proliferaatiota arvioitiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) määritykset, oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [40]. Lyhyesti, MC38-solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille (5000 solua per kuoppa) kasvualustaan. Kun oli inkuboitu 1 päivä, solut huuhdeltiin PBS: ssä (huoneenlämpötilassa), nälkään 3 tuntia ja sitten käsiteltiin HI, X10 tai IGF-1-pitoisuudet vaihtelevat 0,001-1000 nM. Tiedot suhteellinen solujen määrä kolmen kokeiden toisto, joissa jokaisessa on neljä jäljitellä näytettä kunnossa, käytettiin sitten sovittaa annos-vaste-käyrät käyttäen GraphPad Prism versio 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Soluproliferaatiota kokeet tehtiin MCF-7-soluissa, kuten on kuvattu MC38-solujen, paitsi että 20000 solua maljattiin kuoppaa kohti. Katso Materiaalit S1 ja kuvio S1 yksityiskohtaisia ​​täydentäviä tietoja solujen lisääntymisen kokeita.

valmistaminen Kudosten ja solulysaateista ja Western-blottaus

lyysi jäädytetyn kudosnäytteiden ja soluviljelmissä petrimaljoille, sentrifugointi lysaatit, määritys proteiinipitoisuus, sekoittamista solujen tai kudosten lysaatit 2X SDS latauspuskuria, denaturaatio, SDS-PAGE ennalta valettuja 4-15% gradienttigeeleillä (BioRad) ja siirretään 0,45 um nitroselluloosakalvoille suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],36] Ennen blottauksella primaarisilla vasta-aineilla nitroselluloosa kalvoja blokattiin inkuboimalla Tris-puskuroitu suolaliuos, jossa 0,05% (v /v) Tween (TBS-T), jossa on 5% (w /v) naudan seerumialbumiinia (BSA) (silloin, kun blotting fosforylaation-spesifisten primaaristen vasta-aineiden) tai TBS-T 5% (w /v) kuorittua maitoa (kaikki muut primaaristen vasta-aineiden) 1 h huoneen lämpötilassa. Ensisijainen vasta-aineet laimennettiin TBS-T: 5% (w /v) BSA: ta ja inkubointi suoritettiin yön yli 4 ° C: ssa. Seuraavat kanin vasta-aineet, kaikki Cell Signalling Technology Inc., Boston, MA, USA, käytettiin: anti-fosfo-p70S6K (Thr389, kissa. No. 9205), anti-P-S6 (Ser235 /236, cat. No . 2211), anti-fosfo-Akt (Ser473, cat. no. 9271), anti-Akt (cat. no. 9272), anti-fosfo-MAPK (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187, cat. no. 4370) , anti-P-IRS-1 (Ser302, cat. no. 2384), anti-IRβ (cat. no. 3025), anti-IGF-1Rβ (cat. no. 3018), anti-beeta-aktiini (cat. no. 4967). Inkubointi sekundaarisella vasta-aineella (piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä (Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, kat. No 5401), ja visualisointi proteiinivyöhykkeet tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [36]. Intensiteetti proteiinivyöhykkeet kvantitoitiin käyttäen ohjelmistoa ImagePro (BioRad). kussakin solussa signalointi kokeessa, juovien voimakkuudet normalisoitiin keskiarvo ajoneuvon-käsiteltyjen näytteiden. IR ja IGF-1 R bändejä maksassa, lihaksessa paksusuoli ja MC38 solujen allograftit normalisoitiin tarkoittaa juovien voimakkuudet maksan ja lihaksen näytteet, vastaavasti.

määritys maksan triglyseridien pitoisuus valmistetussa lysaatissa maksan näytteet DIO- ja laiha hiiriä tehtiin käyttämällä triglyseridien kolorimetristä määritystä kit (Cayman Chemical Company, Ann Arbor , MI, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

tilastollinen analyysi

tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen SAS-ohjelmiston version 9.1.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). In kaikki analyysit havainnot oletettiin olevan riippumattomia eläinten välillä tai soluviljelmästä koeastioita. Lisäksi tiedot oletettiin noudattavan normaalijakaumaa ja olla varianssi tasalaatuisuus. Täyttääkseen nämä oletukset, tiedot transformoitiin käyttämällä luonnollisen logaritmin tarvittaessa. Tietojen numeerinen standardoidun jäännösarvo 3,0 pidettiin poikkeavuuksien ehdottivat aiemmin [41], ja tilastollinen analyysi tehtiin ja ilman näitä harha (katso jäljempänä).

In vitro

signalointi tiedot analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA) ja sen jälkeen pareittain vertailuja kunkin hoidon ja hallinnan käyttämällä useita t-testit Dunnetts korjaus. Lisäksi kullakin annostasolla, suora vertailu hoidon HI ja X10 ja HI IGF-1 tehtiin käyttämällä Studentin t-testejä. Tiedot kuvaavat IR ja IGF-1 R ilmentymistä hiiren monissa eri kudoksissa analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seuraa pareittain vertailut kudosten käyttämällä useita t-testi Bonferroni korjausta.

hoidon vaikutusta kasvaimen kasvuun kussakin viiden eläinkokeiden analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA ja sen jälkeen pareittain vertaamalla kunkin hoidon ajoneuvon käyttämällä useita t-testit Dunnetts korjaus kummankin kasvaimen kasvun päätepisteet; kasvaimen end määrä ja ala kasvaimen kasvukäyrät (kasvaimen kasvua AUC). Tulokset Tämän analyysin kullekin kokeelle, eli keskimääräiset arvot kullekin käsittelylle, 95% luottamusvälit ja kertamuutos kunkin hoidon ajoneuvon suhteen, on esitetty taulukossa 3.

tutkimiseksi hoidon -aiheiset vaikutukset kasvaimen kasvuun kaikilla viidellä eläinkokeista, me jokaisen päätepisteen (kasvaimen pää määrä ja kasvaimen kasvu AUC) yhdistettiin kaikki tiedot yhteen aineisto ja analysoitiin ne sekoitettu lineaarinen malli hoitojen kiinteä selittävänä muuttujana ja koe kuin satunnainen vaikutus. Mitään merkittävää vuorovaikutusta hoidon ja koe löytynyt jommankumman tulosten (kasvaimen pää määrä ja kasvaimen kasvua AUC). Tutkimaan edelleen eroja hoitojen, pairwise vertailu kunkin hoidon tehtiin käyttämällä useita t-testi Bonferonni korjaus. Ei harha havaittu joukossa 131 havainnot kasvaimen lopussa tilavuus, kun taas yksi harha tunnistettiin joukossa 131 havainnot kasvaimen kasvun AUC. Poissulkeminen tämä harha oli tarpeen täyttämiseksi oletukset tilastollisia malleja ja eivät muuta yleistä analyysin tulos. Keskimääräinen kasvaimen lopputilavuuteen ja kasvaimen kasvun AUC kullekin hoidolle kaikissa viisi koetta, mukaan lukien 95% luottamusvälit ja käännä muutoksen kunkin hoidon suhteessa vehikkelillä käsitellyssä ryhmässä on esitetty taulukossa 3.

Tulokset

MC38 solut reagoivat insuliini, X10 ja IGF-1

tutkitaan ensin, kuinka hoidon HI, X10 ja IGF-1 24 tuntia vaikuttanut leviämisen MC38-solujen ja MCF-7-solut (mukana vertailun), katso kuva 1. Käsittely testiyhdisteiden kasvoi proliferaation molemmissa solulinjoissa. Yhteisymmärryksessä aiempien planktonin kasvu tutkimuksissa MCF-7-solut, ja ≈ 9-kertainen ekspression IGF-1 R kuin IR MCF-7-solujen [42], mitogeenista vaikutus oli suurin IGF-1 X10 HI, kun taas M38 soluja sijoituksen mitogeeninen vaikutus oli X10≥IGF-1 HI. Tämä viittaa siihen, MC38-solut ilmentävät vertailukelpoiset IR ja IGF-1 R.

MCF-7-solut (A) ja MC38-solut (B) altistettiin HI /X10 /IGF 24 tunnin väliaineessa alhainen seerumin pitoisuus (MCF-7, 0,1% (v /v), MC38, 0,25% (v /v)). Lopussa hoitojakson solujen suhteellinen määrä arvioitiin kanssa MTT-määritys. Paneeli A ja B esitetään keskiarvo kolmen erillisen kokeen, joissa jokaisessa on neljä rinnakkaista per ehto, virhe palkit osoittavat SEM. HI, X10 ja IGF-1 lisääntyvän leviämisen MCF-7 ja MC38 solut. Suostumuksella aiemmin julkaistu tietoja ja reseptorin ilmentymisen profiilin, sijoitusta testiyhdisteiden mukaiset mitogeenisesta teho MCF-7-solut oli IGF-1 X10 HI. Vuonna MC38 solut sijoitusta oli X10≥IGF-1 HI. Tämä viittaa siihen, IR ja IGF-1 R ilmentyvät lähes vastaava tasoilla MC38 soluissa.

Lisäksi tutkimme signalointi akuutisti hoidon jälkeen HI, X10 ja IGF-1. Kuten esitetään kuviossa 2A-2G, hoito valitun annoksilla HI, X10 ja IGF-1 merkittävästi aktivoitu IRS-1, Akt, mTOR, p70S6K ja S6 MC38 solujen fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K) reitin, kun taas huomattava aktivointi p44 /42-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) oli havaittu vain suuren annoksen IGF-1 tänä ajankohtana. Aiemmassa tutkimuksessa on MCF-7-solujen havaittiin, että P-Akt (Ser473) ja P-p70S6K (Ser389) olivat herkkiä päätepisteitä havaitsemisen signalointi eroa HI ja X10 [42]. Siksi suoraan verrata ekvimolaariset annokset HI, X10 ja IGF-1, laskemalla X10 /HI ja IGF-1 /HI suhde kunkin tutkitun kinaasin fosforylaatiokohtaa (kuvio 2H). Suostumuksella Edellisessä tutkimuksessa, hoito X10 lisäsi merkittävästi fosforylaatioon Akt (Ser473) ja p70S6K (Ser389) pienimmällä annoksella 1 nM. Signalointi tiedot olivat myös hyvässä sopusoinnussa leviämisen tiedot, kuten IGF-1 ja X10 esiintyi yhtä voimakkaampi kuin HI stimuloimaan aktivointi Akt, p70S6K ja IRS-1 in MC38 soluissa.

edustaja Länsi-blotit ovat näytetään paneeli A. Solut kerättiin käsittelyn jälkeen 30 ug kokonais-proteiinia ladattiin geeleille. Jokainen koe sisälsi kaksi rinnakkaista per kunnossa. Juovien voimakkuudet kvantitoitiin suhteessa keskiarvo kahden ajoneuvon-käsiteltyjen näytteiden kussakin kokeessa. Kolmen erillisen kokeen suoritettiin ja tulokset kvantifiointi juovien voimakkuudet Länsi blottting P-Akt (B), P-p44 /42 MAPK (C), P-p70S6K (D), P-S6 (E), P-IRS -1 (F) ja P-mTOR (G) ja β-aktiini (load control) yhdistettiin ja analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA, jota seuraa vertailu ajoneuvon käsiteltyjen näytteiden kunkin käsittelyn käyttämällä useita t-testi Dunetts korjaus. Lopuksi vertailla suoraan kinaasin aktivoitumisen HI ja X10 ja HI ja IGF-1, vastaavasti, tehtiin kutakin annostasoa käyttäen opiskelija T-testit (H). Avoimet ympyrät: yksi rinnakkaisia ​​näyte, vaakapalkeilla: keskiarvot, virhepalkkeja: SEM. * Ja *** osoittaa

P

0,05 ja

P

0,0001, vastaavasti.

Hiiret Ruokavalion aiheuttama lihavuus ovat hyperinsulinemic, glukoosi-intoleranssista ja ovat Alennettu insuliiniherkkyyden

Valitut metabolisen parametreja mitattiin DIO-hiirillä ja verrattuna samanikäisiin hiirillä ruokittu ohjaus vähärasvainen ruokavalio. Kuten on esitetty taulukossa 2, DIO-hiirillä oli noin 40% lisääntynyt kehon paino, ja olivat hyperinsulinemic noin 4-kertaisesti lisääntynyt insuliinin tasolle. Kuitenkin DIO-hiiret olivat vain marginaalisesti hyperglykeemisiä, koska HbA1C tasot olivat vain hieman lisääntynyt. Krooninen altistuminen rasvaisen ruokavalion johtanut myös rasvamaksaan ja DIO-hiirillä oli 3- ja 4-kertainen kohonneeseen triglyseridien maksassa. Tällä toiminnallisella tasolla, DIO-hiiret näytetään myös alempi glukoosinsieto ja oli vähentänyt insuliiniherkkyys, määritettynä aikana sokerirasituskoe kuten aiemmin on kuvattu [43].

Hoito HI, X10 ja IGF-1 Tulokset Lyhytaikainen mutta korkea systeeminen altistus, Laskua Verensokerin ja Tukahdetut eritys Endogeenisen Insuliini

Kun hiiriä käsiteltiin ekvimolaarisen supra-farmakologinen annokset HI, X10 tai IGF-1 sc injektiona, erittäin korkeat pitoisuudet plasmassa havaittiin pian injektion jälkeen (kuvio 3A). C

max oli noin 1000 nM HI, X10 ja IGF-1. Tämä on noin 1000 kertaa suurempi kuin plasman hiiren endogeenisen insuliinin hyperinsulinemic DIO-hiirillä (taulukko 2). Perustuu plasmassa mitattiin 15 min, 1 h ja 6 h kuluttua sc injektion HI, X10 tai IGF-1 (kuvio 3A), voisimme arvioida, että plasman puoliintumisaika (t

½) HI ja X10 oli noin 30 minuuttia, kun taas t

½ IGF-1 oli noin 70 min, kohtuulliseen sopimukseen nykyisten kirjallisuuteen tiedot ja se, että suurin osa IGF-1 veriplasman sitoutuu IGF-1 sitovia proteiineja [ ,,,0],44], [45].

: plasman mitattu hiirillä, joille HI, X10 tai IGF-1. Alempi toteamisrajat eri määrityksissä olivat: HI; Neljätoista, X10; 233 pM ja IGF-1; 1,3 nM. Hiiriä käsiteltiin hetkellä 0 ja plasma kerättiin 15 minuutin kuluttua, 1 h ja 6 h. Huippupitoisuudet plasmassa mitattiin 15 min käsittelyn jälkeen. 6 h hoidon jälkeen plasman IGF-1 oli ≈ 100 kertaa suurempi kuin plasman HI ja X10. B: Mean verensokerin hoidon jälkeen 600 nmol /kg HI /X10 /IGF-1 ruiskuttamalla sc. Verensokerin palasi perustasoille jälkeen ≈ 3-4 h, n = 8 (HI, X10 ja IGF-1), tai n = 6 (ajoneuvo). Pisteviiva osoittaa veren keskimääräisen glukoosin hetkellä 0. Virheviivat; SEM. C: Plasman 0,5 h ja 5 h kuluttua hoidon HI tai X10, 600 nmol /kg. Erittäin korkeita pitoisuuksia plasmassa havaittiin 0,5 tunnin kuluttua hoidon. Avoimet ympyrät; havaintoja yksittäisistä eläimistä, vaakaviivat; keskiarvoja, virhepalkkeja; SEM. D: tasot C-peptidin plasmassa 0,5 h ja 5 h hoidon jälkeen HI tai X10, 600 nmol /kg, samoille eläimille, kuten on esitetty paneelissa C. tasot C-peptidi oli merkittävästi vähentynyt 0,5 tuntia käsittelyn jälkeen verrattuna C-peptidin mitatut 5 h kuluttua sc injektion HI /X10, kun verensokeri oli palannut perustasoille ja plasman HI ja X10 olivat alhaiset. Avoimet ympyrät; havaintoja yksittäisistä eläimistä, vaakaviivat; keskiarvoja, virhepalkkeja; SEM. * Osoittaa

P

0,05.

Hoito valitun annoksilla HI, X10 ja IGF-1 nopeasti alensi verensokeria hiirillä vertailukelpoisella tavalla, mutta noin 3 -4 h injektion jälkeen veren glukoosi oli palannut perustasoille (kuvio 3B).

Kuten odotettua, tasot C-peptidi oli alhainen pian sen jälkeen HI /X10, jossa erittäin korkea altistus plasmassa havaittiin ( Kuva 3C), mutta koska plasman HI /X10 vähentynyt, tasot C-peptidin nopeasti palasi perustasoille 5 h injektion jälkeen (kuvio 3D). Tämä malli C-peptidin tasoa korreloi myös erinomaisesti kanssa verensokerin (kuva 3B).

Hoito HI, X10 ja IGF-1 Aktivoi merkinanto alavirtaan IR /IGF-1 R MC38 Cell Allotranplantaatit

in vivo

Expression of IR ja IGF-1 R MC38 solussa allotransplantaatteja mitattiin suhteessa viite kudokset maksan ja luuston lihaksen (jäljempänä kaksoiskantalihas) ja normaalin paksusuolen. Sekä IR ja IGF-1 R ilmaistiin MC38 allotransplantaatteja ja verrattavissa MC38-solua

in vitro

, eli fenotyyppi säilyi

in vivo

. Vuonna MC38 vieraskudossiirteitä IR ilmaistiin alemmilla tasoilla kuin maksassa ja paksusuolen, mutta verrattavissa luustolihasten. IGF-1 R ilmentyi vastaavia määriä kuin paksusuolen ja huomattavasti korkeampi kuin maksan ja luuston lihaksen (kuviot 4A-4C). Tällä tekniikalla ei ole mahdollista suoraan verrata tasoa IR ja IGF-1 R kudosten välillä.

: edustaja Western blotit IRβ ja IGF-1Rβ maksassa, MC38 kasvaimen, paksusuolen, lihas- ja MC38-solut viljellyt

in vitro

. Kunkin näytteen 20 ug kokonais-proteiinia ladattiin geelille. B: n kvantitointi Western blotit IRβ tehtiin suhteessa keskimääräisiin juovien voimakkuudet maksan näytteitä. Suhteellinen IR taso MC38 solussa allotransplantaatteja oli verrattavissa luurankolihasten ja merkittävästi alempi kuin maksan ja paksusuolen. n = 3 tai 4 kohti kudosta, pylväät osoittavat keskiarvoa kahdesta kokeesta, virhepalkit; SEM. *** Osoittaa

P

0,0001. C: n kvantitointi Western blotit IGF-1Rβ tehtiin suhteessa keskimääräisiin juovien voimakkuudet lihaksen näytteitä. Suhteellinen IGF-1 R taso oli merkitsevästi korkeampi MC38 solussa allotransplantaatteja kuin lihas- ja maksa- ja verrattavissa paksusuolen. n = 3 tai 4 kohti kudosta, pylväät osoittavat keskiarvoa kahdesta kokeesta, virhepalkit; SEM. *** Osoittaa

P

0,0001. D: Havainnollinen Western blotit P-mTOR, P-p70S6K, P-Akt ja β-aktiini näytteissä kasvaimen allograftien kerättyjen 1 h kuluttua sc injektion HI, X10 tai IGF-1. Pitoisuudet plasmassa HI, X10 ja IGF-1 näillä eläimillä ajankohtana eutanasia ja kokoelma kudosnäytteitä on esitetty kuvassa 3A. Hoito HI, X10 tai IGF-1 aiheutti aktivointi useiden kinaasien PI3K signalointireitin.

tarkasteltiin myös toiminnallisuus IR ja IGF-1 RS kasvaimen siirteessä Western-blottauksella varten kinaasien PI3K signalointireitillä kasvainkudoksessa kerätään 1 tunnin kuluttua sc annon HI, X10 tai IGF-1 (kuvio 4D). Tämä ajankohta on lähellä enimmäispitoisuus plasmassa ja aika maksimaalinen vaikutus annettavien yhdisteiden verensokerin. Olemme aiemmin osoittaneet, että fosforylaatio Akt kasvaimen allograftien ja normaalin paksusuolen sc injektion jälkeen boluksen HI ja X10 on voimakkaasti ajasta riippuvainen [36]. Suostumuksella nämä tiedot, havaitsimme lausutaan aktivointi Akt, p70S6K ja mTOR 1 h käsittelyn jälkeen, mikä osoittaa MC38 kasvain allotransplantaatteja ovat herkkiä akuuttiin hoitoon HI, X10 ja IGF-1.

kasvu kasvain Allotranplantaatit lisääntyy merkittävästi hoidettuihin eläimiin X10 ja IGF-1

Viisi eläinkokeiden tehtiin. Keskimääräinen koko kasvainten koepäivänä 14 ja kasvaimen kasvua AUC (koepäivänä 0-14) kussakin testiryhmässä kussakin kokeessa, mukaan lukien 95%: n luottamusväli näitä keskiarvoja, on esitetty taulukossa 3, ja kaikki tiedot esitetään graafisesti kuvassa 5A-B. Paitsi experiment, lisääntymässä kasvaimen kasvua hoidon jälkeen HI, X10 ja IGF-1 havaittiin kaikissa kokeissa, ja kertaluokkamuutos kasvaimen kasvussa olivat yleensä noin samaa luokkaa kullekin hoidon.