Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Normaali kudos homeostaasin ylläpitää dynaamisia vuorovaikutuksia epiteelisolujen ja niiden mikroympäristön. Häiritsevät tätä homeostaasiin voi aiheuttaa poikkeavaa soluproliferaatiota, tarttuvuus, toiminta ja muuttoliike, jotka saattavat edistää pahanlaatuinen käyttäytymistä. Todellakin, poikkeava strooman-epiteelin vuorovaikutukset osaltaan haiman adenokarsinooma (PDAC) leviäminen ja etäpesäkkeiden, ja tämä nostaa esiin mahdollisuuden, että uusi peruskudoksettoman kohdistettuja terapiat lisälähestymistavoissa torjumiseksi tämän pahanlaatuinen sairaus. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää vaikutus ihmisen stroomasolujen peräisin rasvakudoksesta (ADSC) haimasyöpäkasvainsoluissa soluproliferaatioon.

Keskeiset havainnot

Co-viljelemällä haimasyöpäkasvainsoluissa kanssa ADSC ja ADSC-väliaine näytteet eri luovuttajilta esti syövän solujen elinkykyä ja lisääntymistä. ADSC-välitteisen estävä vaikutus edelleen laajentaa muihin epiteelin syövän solulinjat (maksan, paksusuolen, eturauhasen). ADSC väliaine indusoi syöpäsolun nekroosia G1-vaiheen pysähtymisen, ilman todisteita apoptoosin.

In vivo

, yksi sisäinen kasvaimen injektion ADSC mallissa haiman adenokarsinooma indusoi voimakkaan ja pitkäkestoisen eston kasvaimen kasvua.

Johtopäätös

Nämä tiedot osoittavat, että ADSC voimakkaasti estävät PDAC lisääntymistä, sekä

in vitro

ja

in vivo

ja aiheuttavat kasvainsolun kuoleman muuttamalla solusyklin etenemisen. Näin ollen, ADSC saattaa olla mahdollinen solupohjaisen terapeuttista vaihtoehtoa hoitoon PDAC, joille ei ole tehokkain lääke on käytettävissä.

Citation: Cousin B, Ravet E, Poglio S, De Toni F, Bertuzzi M, Lulka H, et al. (2009) Adult stroomassoluihin peräisin ihmisen rasvakudoksesta Provoke Haimasyöpä Cell Death sekä

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 4 (7): e6278. doi: 10,1371 /journal.pone.0006278

Editor: Irene Oi-Lin Ng, The University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 24 helmikuu 2009; Hyväksytty: 31 toukokuu 2009; Julkaistu: 17 heinäkuu 2009

Copyright: © 2009 Cousin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on tukenut avustuksin alueen Midi-Pyreneillä, Ligue Nationale Contre le Cancer ja Cancrople Grand Sud-Ouest (EMERGEANCE). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Normaali kudos homeostaasin ylläpitää dynaamisia vuorovaikutuksia epiteelisolujen ja niiden mikroympäristön. Mikroympäristöä koostuu soluväliaineen, stroomasolut, muuttavien immuunisolujen ja hermoston elementtejä tukee verisuonten verkosto, kaikki ovat miljöö sytokiinien ja kasvutekijöiden. Solut vuorovaikutuksessa microenvironment kautta monimutkainen autocrine ja paracrine mekanismeja. Useita todisteita osoittavat, että häiritsevät tätä homeostaasin voi aiheuttaa poikkeavaa soluproliferaatiota, tarttuvuus, toiminta ja muuttoliike, jotka saattavat edistää pahanlaatuisten käytös [1] – [3]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat muuttaneet käsitystä stroomasoluissa ympäröivän epiteelikasvaimet. Nämä solut eivät ole tyhjäkäynnillä sivullisia, vaan aktiivisia osallistujia, jotka muokkaavat taajuus ja ominaisuudet kasvaimia. Lisäksi syöpäsolut voivat itse muuttaa niiden vieressä stroman muodostaa salliva ja tukeva ympäristö syövän etenemistä [1] – [3].

Syöpä kantasolut ja strooman fibroblastit ovat laajasti osoitettu tukemaan neoplastisia prosessi [4 ] – [11], kun luuytimestä peräisin mesenkymaaliset kantasolut (BM-MSC) epäsuorasti suosivat kasvaimen kasvua systeemisen immunosuppression [12], tai tuotanto angiogeneesiä sytokiinien [13] – [15]. Kuitenkin vaikutukset BM-MSC: kasvaimen leviämisen vaihtelevat kasvaimen tyyppi: BM-MSC: edistää rintasyövän, melanooma ja paksusuolen syövän peräisin olevien solujen lisääntymistä [16], [17], kun estävät

in vivo

kasvu Kaposin sarkooma soluihin [18]. Rasvakudos, kuten luuytimen, sisältää stroomasolut kutsutaan ADSCs varten rasva johdettujen stroomasoluissa. Tässä populaatiossa on monia samoja ominaisuuksia BM-MSC: t, mukaan lukien immunomodulatorisia vaikutuksia [19], ja multilineage erilaistumisen potentiaalin [20] – [29]. Kun pistetään

in vivo

, ADSCs näytteille regeneratiivisen ominaisuuksia joko suoraa osallistumista vastaperustetun kudoksista ja /tai kautta kasvutekijöiden että yllä tätä uudistaminen [23], [25], [30]. Vaikka stromasoluja luuytimestä ja rasvakudos näyttävät liittyvän läheisesti, merkittäviä eroja on raportoitu [19], [31] – [34]. Kyky ADSCs tukemaan normaalia ja kasvainsoluproliferaation pitkälti keskusteltu.

In vitro

, laajennettu ADSCs välittämää tukahduttaminen allogeenisten lymfosyyttien lisääntymisen [35]. Ristiriitaisia ​​tuloksia saatiin

in vivo

, kun co-injektion ADSCs rinta-, paksusuoli-, eturauhas-, ei-pieni keuhko- tai glioblastooma syövän peräisin olevat solut johti aluksi kasvaimen kasvua tuki [36] – [38]. Selventää tällainen ristiriita, tutkimme vaikutus ADSCs haiman adenokarsinooma peräisin olevat solut. Niistä kiinteät kasvaimet, haiman adenokarsinooma (PDAC) on tunnusomaista sen erittäin tiheä desmoplastic tunkeutumisen [39], [40]. PDAC on erittäin aggressiivinen tauti ilman terapeuttista ratkaisua, ja silti viides suurin syy syöpään liittyvien kuolemien länsimaissa [41]. Koska poikkeava strooman-epiteelin vuorovaikutukset osaltaan PDAC leviämistä ja etäpesäkkeiden oletamme, että kohdistaminen kasvain strooman voi aiheuttaa ylimääräisen lähestymistapa hoitoon PDAC. Täällä osoittaa kykynsä ihmisen ADSCs (hADSCs) vähentää PDAC johdettuja syöpäsolujen kasvua,

in vitro

ja

in vivo

, ja aiheuttaa syöpää solukuoleman seuraavat G1-vaiheen pysähtymisen .

tulokset

Human ADSCs kohdistavat estävä vaikutus PDAC solulinjat

Ensinnäkin hADSC fenotyyppi määritettiin virtaussytometrialla (täydentävä teksti S1), jotta voidaan vahvistaa että käytetyt solut näytetään ilmiasun yleensä kuvattu ADSCs [22], [23]. Todellakin, FACS-analyysit vahvistivat, että ADSC olivat CD34, CD90, CD73 ja HLA ABC positiivisia taas CD45 ja CD31 negatiivinen (Täydennyskuvio S1). Sitten määritetään

in vitro

vaikutus hADSCs on PDAC kasvainsolujen kasvua. Olemme viljeltiin PDAC johdettu Capan-1-solut, kun läsnä on ADSCs eristetty 25 eri terveiltä luovuttajilta käyttäen transwell kalvoja estämään solu-solu kosketukseen. 48 tunnin kuluttua on co-viljelmiä, ADSC esillä voimakas annoksesta riippuvainen inhiboiva vaikutus PDAC johdettu solujen määrä, kuten on osoitettu kuviossa 1A. Itse asiassa, useita haimasyövän soluja väheni merkittävästi 36,5% ± 4,8%, kun läsnä on 1:01 suhde ADSCs, verrattuna kontrolliin.

. Lisääntyvä suhteet ADSC ja Capan-1-solut transfektoitiin yhtäaikaa viljeltiin, kun läsnä on transwell 48 tuntia koko kasvualustaa. Capan-1-solut leviämisen kvantitoitiin sitten solujen laskenta. Arvot ovat keskiarvoja ± S.E. Kolmen erillisen kokeen kanssa ADSCs eri luovuttajilta. B. Syöpä soluja eri alkuperää viljeltiin, kun läsnä on ADSC väliaine (CM) 48 tunnin ajan. Solujen elinkelpoisuus varmistettiin MTS käyttämällä CellTiter 96® vesikerros Solution proliferaatiomääritystä. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina arvoista, jotka saatiin hallinnassa olosuhteissa. Arvot ovat keskiarvoja ± S.E. Kolmen erillisen kokeen suoritettiin ADSC-CM eri luovuttajilta. C. Capan-1-soluja viljeltiin 48 tunnin ajan Capan-1, BM-MSC tai ADSC-CM. Capan-1 solujen määrä kvantifioitiin kuten A. Arvot ovat keskiarvoja ± S.E. Kolmen erillisen kokeen kanssa ADSCs ja MSC eri luovuttajilta. *: P 0,05. ***; p 0,001.

elatusainetta ADSCs estää elinkelpoisuuden monien tuumorisolujen

ei ole suoria solu-solu kosketukseen meidän koeasetelmassa sai meidät testata onko ADSCs -conditioned väliaine (CM) voi myös heikentää syöpään solujen elinkykyä. Itse asiassa liukoinen tekijät ovat aiemmin osoitettu välittävän immunosuppressiivisen vaikutuksen ihmisen ADSCs [19]. Kuten kuviossa 1B, ADSC-CM itsessään inhiboi merkittävästi ei ainoastaan ​​elinkelpoisuutta useita haiman adenokarsinooma peräisin olevia soluja (Capan-1, Capan-2, BxPC3, MiaPaca-2), mutta myös elinkelpoisuutta maksasyöpä peräisin olevien solujen ( Huh7, HepG2), paksusuolen syöpää peräisin olevia soluja (Caco-2), ja eturauhassyövän solulinja (PC3). Sen sijaan, ADSC viljelmän supernatantti oli vähän, jos lainkaan, vaikutusta HeLa-soluissa, jotka ovat peräisin kohdunkaulan syövän tai MCF-7, rintasyöpä solulinjassa. Koska havaitut vasteet voivat heijastaa ravintoaineiden häviämiselle median ja /tai epäspesifinen kertyminen aineenvaihduntatuotteita, käytimme väliaine syöpäsolujen yksinään kontrollina yhdessä BM-MSC-CM. Toisin kuin ADSC-CM, hoitoon syöpäsolujen joko Capan-1 tai BM-MSC-CM ei heikentänyt merkittävästi syöpäsolun elinkelpoisuuden vaikka suuntaus lasku havaittiin viimeinen (kuvio 1 C).

ADSC-väliaine estää kasvainsolujen proliferaatiota ja indusoi kasvainsolun kuoleman

potentiaalisten vaikutuksen ADSC-CM syövän solujen lisääntymistä, Capan-1 inkuboitiin läsnäollessa BrdU tai ilman ADSC-CM. FACS-analyysi suoritettiin jälkeen solujen denaturointi- ja inkubointia propidiumjodilla. BrdU on sisällytetty aikana S-vaiheen (portti P4), kun taas propidiumjodidilla mahdollistaa syrjiä 2n (G0 /G1, portti P2) ja 4 (G2 /M, portti P3) kromosomeja (kuvio 2A). Dot tontteja aidatulla yksittäisistä solut osoittivat, että määrä Capan-1 soluja G0 /G1 vaiheessa ollut nousussa, kun solut S-vaiheessa merkittävästi laski 10%, kun läsnä on ADSC-CM (kuvio 2B).

. Capan-1-solut viljeltiin kanssa tai ilman ADSCs kunnostettua alustaa lisättiin. 48 tuntia myöhemmin, leviämisen ja DNA-pitoisuus analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä BrdU ja propidiumjodidilla kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. Dot tontit ovat edustavat 3 itsenäistä koetta suoritettiin ADSCs näytteet eri luovuttajilta. B. kvantifiointi solusyklin analyysi käyttäen ModFit ohjelmistoa. Capan viljellään valvontaolosuhteet olivat edustettuina mustat palkit toisin Capan käsitelty ADSC-CM edustettuna auki baareissa. Arvot ovat keskiarvoja ± S.E. Kolmen erillisen kokeen kanssa ADSCs eri luovuttajilta. C. Capan-1-solut ympättiin 4-kammiossa diat 48 tuntia tai ilman ADSC-CM. DNA: n fragmentoituminen mitattiin TUNEL (edustavat kolmea erillistä koetta). D. Capan-1 viljeltiin ohjaus väliaineessa (mustat palkit) tai käsitelty ADSC supernatantteja (avoimet pylväät) analysoitiin anneksiini ja propidiumjodidileimauksella kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. Arvot ovat keskiarvoja ± S.E. Kolmen erillisen kokeen kanssa ADSCs eri luovuttajilta. ***: P 0,001.

seuraava onko ADSC-CM voisi vaikuttaa solukuolemaan. Tätä varten meidän on ensin seurataan DNA pirstoutuminen Capan-1 soluissa TUNEL määrityksessä. Kuten kuviossa 2C, PDAC peräisin oleva solu-DNA-fragmentaatiota indusoitua voimakkaasti ADSC-CM. Seuraavaksi me määrällisesti määrä syöpäsolujen pääsy apoptoosin ja /tai nekroottisen altistuminen ADSC-CM. Tulokset esitetään kuvassa 2D osoittavat, että ADSC-CM indusoi 3-kertainen propidiumjodidin-positiivisia, nekroottisia soluja, ilman näyttöä varhaisen apoptoosin seurattiin anneksiini merkintöjä. Jälleen, CM BM-MSC oli tehoton muuttamatta merkittävästi kasvaimen solujen elinkykyä (tietoja ei esitetty).

Kasvaimen indusoimaa solukuolemaa ADSC väliaine välittyy eston solusyklin etenemisen

tutkimme seuraavaksi mekanismia, jolla tuumori solukierron on pidätetty ADSC-CM. Mittasimme ekspression tärkeimmät liittyvien proteiinien solusyklin säätelyssä. Huomasimme, että ADSC-CM aiheuttama syvällinen esto Rb fosforylaation Capan-1-solut, joilla ei ole vaikutusta proteiinien ilmentyminen (kuvio 3A, 3B). Huomattavasti ilmaus CDK4 ja sykliini-D1, jotka ovat kriittisiä Rb fosforylaation laski samanaikaisesti. Expression of sykliini E, joka ei osallistu G1-S siirtyminen, pysyi ennallaan (kuvio 3A, 3B). On tärkeää huomata, mitään muutoksia ei havaittu, että ekspressiotasot pilkottiin kaspaasi-3, kaspaasi-8, kaspaasi-9, kaspaasi-6, kaspaasi-7, ja PARP käsittelyn jälkeen soluja ADSC-CM (tuloksia ei ole esitetty). Myös ekspressiotasot sytokromi C, BclXl ja Bcl2 pysyi suhteellisen muuttumattomana meidän kokeellisia asetuksia (tuloksia ei ole esitetty).

. Capan-1-solut viljeltiin kanssa tai ilman ADSC-CMfor 48 tuntia. Sitten proteiinit uutettiin ja suoritettiin immunoblottauksella varten osoitetaan proteiinien, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset edustavat vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. B. kvantifiointi immunoblot densitometrian vertailuviljelmissä (mustat palkit) tai käsitellyt viljelmät ADSC-CM (avoimet pylväät). Arvot ovat keskiarvoja ± S.E. Kolmen erillisen kokeen kanssa ADSCs eri luovuttajilta. *: P 0,05; **: P 0,01.

ADSCs vähentää

in vivo

kasvua ihmisen haiman kasvainten

seuraava laajennettu ADSCs antiproliferatiiviset inhibitioon haimatuumorien

in vivo

. Siten ihmisen PDAC kasvaimia perustettiin kateenkorvattomissa hiirissä jälkeen ihon alle Capan-1 soluja hyvin aggressiivinen malli PDAC [42], [43]. Neljätoista seitsemäntoista päivää kasvaimen siirteen toimiminen, kerta-annos ADSCs, mikä vastaa 10

3 ADSCs /mm

3 kasvaimen siirrettiin

in vivo

kasvaviin kasvaimiin. Kontrollituumorit injektoitiin joko vehikkeliä tai paraformaldehydillä (PFA) kiinteä ADSCs. Kontrollituumorit kasvoi nopeasti, keskimäärin 4076 ± 556 mm

3 kooltaan 28 päivän kuluttua implantaatiosta (kuva 4A, 4B). Sen sijaan, kasvu Capan-1 kasvainten vastaanottavan ADSC injektio esti voimakkaasti (2556 ± 232 mm

3, kuva 4A, 4B). Esto haiman kasvaimen kasvun eteneminen saavutti -58% ± 8,9% (p 0,001), kahden viikon kuluttua yhden kasvaimeen injektion ADSCs (kuvio 4C). Kasvaimen paino väheni myös merkittävästi jälkeen ADSCs istutuksen (kontrolli: 4,6 g ± 0,8 vs ADSCs saaneilla 2,2 g ± 0,2, p 0,05). Kuten kuviossa 4D, kasvainten kasvua injektoitiin joko vehikkeliä tai PFA-käsitelty ADSCs olivat vertailukelpoisia, mikä osoittaa, että kasvaimen kasvun inhibition ei johtunut epäspesifisestä vaikutuksesta kasvaimen dilacerations ja riippuvainen ADSC eritystä, vastaavasti.

Capan-1 kasvaimet istutettiin kateenkorvattomiin nude hiiriin (neljästä kuuteen eläintä ryhmää kohti), kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. Kaksi viikkoa myöhemmin, ADSC injektoitiin tuumorin sisällä, ja etenemisen sitten seurata. A. Edustavia resektoitiin kasvaimia kateenkorvattomia nude-hiirissä 15 päivän kuluttua ei saanut hoitoa (vasemmalla) tai yksi kasvaimensisäisenä annoksena 5 x 10

5 ADSCs (oikealla). B. volyymi säädin (mustat symbolit) tai ADSC käsitelty (avoimet symbolit) kasvaimia seurattiin 2 päivän välein, enintään 28 päivän kuluttua implantaatiosta (13 päivän kuluessa ADSCs injektio). C. Suhteellinen ohjaus (mustat palkit) tai ADSC käsitelty (avoimet pylväät) kasvaimen etenemistä mitattiin tuolloin ilmoittanut seuraavat

in vivo

ADSCs injektio. D. Kasvaimet injektoitiin joko vehikkeliä, PFA kiinteät ADSCs tai ADSCs ja niiden etenemistä mitattiin 6 päivää seuraavien kasvaimensisäisenä solun toimitus. E. histologiset osat haimatuumorien sijoitetaan tai ei kanssa ADSC analysoitiin lisääntymisen Ki67 immunovärjäyksellä (Ki67 merkintöjä indeksi, yläpaneeli) tai DNA pirstoutumista TUNEL määrityksellä (alapaneeli) 6 päivää ADSC injektion. Prosenttiosuus leimatun ytimien mitattiin 15 aloilla suurella suurennuksella (x 400) käyttäen visiolab 2000 analysointijärjestelmä. Kaikki tulokset olivat edustavat 3-4 itsenäisen kokeen (3-5 kasvaimia per ryhmä) suoritettiin ADSCs näytteet eri terveiltä luovuttajilta saatuja. Arvot ovat keskiarvoja ± S.E. *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,01.

vieressä tutkittiin mekanismeja vaikutuksia ihmisen ADSCs on PDAC kasvaimet

in vivo

. Kasvaimet käsiteltiin tai ei kanssa ADSCs käsiteltiin immunohistokemiaan ydin- antigeenin Ki67 toteamiseksi jakautuvat solut (kuvio 4E, yläpaneeli), tai tuotettu TUNEL analyysi määrällisesti kuolleita soluja (kuvio 4E, alapaneeli), 6 päivää injektion jälkeen . Kvantifiointi Immunovärjäyksen osoittivat merkittävää laskua määrän lisääntyvien solujen, in ADSCs-siirretty kasvaimia verrattuna kontrolliin (-66,5% ± 3,8%; p 0,01). Lisäksi, ADSCs indusoi 5-kertainen solukuoleman haiman kasvaimet mitattuna TUNEL-määrityksellä.

Keskustelu

osoitti tässä tutkimuksessa, että ihmisen ADSCs näytteet suuri paneeli terveitä eri luovuttajia tehokkaasti heikentynyt kasvu hyvin aggressiivinen syöpä eli PDAC, sekä

in vitro

ja

in vivo

estämällä syöpäsolujen lisääntymistä ja edistää syöpäsolujen kuolemaa seuraavan G

1 -vaiheen lohko. Jälkimmäinen estävä vaikutus ulotettiin pahanlaatuisia solulinjoja eri alkuperää.

Useat meidän

in vitro

havainnot ilmoitetaan tässä osoittaa, että ADSCs on kyky häiritä leviämisen syöpäsoluja muuttamalla solusyklin etenemisen.

in vitro

molekyyli tiedot osoittivat, että kasvainsolut, jotka olivat olleet kontaktissa ADSC-CM olivat lepotilassa (G

0 /G

1), ja säädeltiin CDK4 ja cyclinD1. Kiinnostavaa kyllä, emme pystyneet tunnistamaan joko sisäinen tai ulkoinen välittämä solukuolema altistuksen jälkeen syöpäsolujen ADSCs kunnostettu alusta. Tämä kyky häiritä solusyklin on jo kuvattu stroomasolut muista lähteistä [44], [45]. Poikkeavuuksia G

1-S siirtyminen sääntelyviranomaisten, ja tarkemmin sanottuna Rb-reitti, on kirjattu merkittäviä tekijöitä kehityksessä ihmisen syöpien. Näin ollen, modulointi CDK on tärkeä tavoite kasvainten ehkäisyyn ja hoitoon, jotka voivat selittää, miksi ADSCs estävät solujen proliferaatiota, jotka ovat peräisin useilta epiteelisyöpien.

käyttö ADSC kuten ajoneuvon syövän geeniterapiassa on äskettäin ehdottanut [36], [46], [47]. Itse ADSCs suunniteltu muuntaa anticancerous aihiolääke voi olla tehokas ajoneuvoja estävän tehokkaasti kasvua Ksenosiirretyn ihmisen paksusuolen tai eturauhasen kasvaimia [36], [46]. Kuitenkin vain harvat tutkimukset osoittavat ristiriitaisia ​​tuloksia ole tehty naiivi solujen eristetty rasvakudoksesta [36] – [38], [48]. Erot voidaan selittää prosessin ADSC eristäminen ja passage määrä ruiskutetaan solujen ja menettelyt, joilla

in vivo

tai

in vitro

tutkimuksissa. Itse asiassa joissakin tutkimuksissa, ADSC ruiskutettiin

in vivo

yhdessä syöpäsolujen, on siis vaikea verrata vaikutuksia ADSC asennettujen kasvain (tässä tutkimuksessa) versus kasvava kasvain [36] – [38 ]. Lisäksi jotkin tiedot on saatu hiiren soluihin [38], kun taas meidän malli on valmistettu ihmisen soluja, ja syövän soluja eri alkuperää käytetty, vaikka osoitimme, että ADSC-CM ei vaikuttanut kasvainsolujen elinkelpoisuuden samassa määrin. Viime eikä vähiten, luonne ADSC vaihtelee eri tutkimuksissa, koska useimmissa tapauksissa siirrostettiin soluja käytettiin [36] – [38], [48] kun taas suoritimme kokeiluja primääriviljelmien. Tämä voi olla tärkeää, koska ADSC fenotyyppi ja mahdollisesti toiminto modifioidaan kohtien [49]. Tämä vaihtelevuus mahdollisia vaikutuksia stroomasolujen syövän solujen lisääntymistä on kuvattu myös tutkimuksissa, joissa käytettiin luuytimen mesenkymaalisten kantasolujen [16] – [18], mikä viittaa siihen, että erilaiset mekanismit saattavat olla mukana mukaan useita tekijöitä, joita ei ole vielä tunnistettu. Esimerkiksi osoitamme tässä, että solusta soluun kontakti ei ole täysin välttämätön, koska antiproliferatiivisia vaikutuksia havaittiin sekä suorissa yhdessä viljelemisen -tutkimukset transwell (ei solu yhteyttä) ja kokeissa käytetään ADSCs kunnostettu alusta. Sen sijaan Khakoo

et al

viime aikoina osoittaneet, että BM-MSC: kohdistama voimakas antioncogenic vaikutus Kaposin sarkooma läpi solusta soluun kontakti ja Akt inaktivaation [18]. Tämä oli myöhemmin vahvistanut

in vitro

by Ramasamy

et al

[45].

tunnistaminen mekanismeja strooman ja syöpäsolujen vuorovaikutusta ja erityisesti eritetty tekijä vastuussa antiproliferatiivinen vaikutus ADSC tutkitaan parhaillaan. Monet ehdokkaat erittyy ADSCs (kuten TGF β1, SDF1, RANTES), interleukiinit (esimerkiksi IL6, IL1 β, IL8, GSF, IL11) tai prostaglandiinien (PGE2, PGI2, PGJ2) tiedetään aiheuttavat anti-proliferatiivinen /pro -apoptotic vaikutus. Muuttavien tutkimukset suoritettiin Capan paljasti, että ADSC-CM aiheudu kemoatrak- aktiivisuutta (Täydennyskuvio S2, ja teksti S1), mikä viittaa siihen, että tekijä osallistuu ADSC antiproliferatiivinen vaikutus ei ole kemokiini. Viime aikoina, PG on osoitettu välittävän ADSCs sekalymfosyyttireaktio inhibition [35]. Valmistelun aikana tämän käsikirjoitus, tutkimus ehdotti, että DKK-1 voi olla yksi näistä tekijöistä (48). IL-6 on hiljattain suojeluun osallistuvat normaaleissa ja premalignien epiteelisolujen apoptoosia koliitti liittyy syöpään (50). Tämä viittaa siihen, että tämä interleukiini voi olla päinvastainen rooleja riippuen tulehduksellinen tila, kasvain vaihe ja /tai tyyppiä.

In vivo

, saimme mutta tehokas, mutta ohimenevää antiproliferatiivinen vaikutus kasvaimen etenemiseen. GFP-leimatun ADSCs havaittiin ympäröivä reuna-kasvain alukset sekä sisällä keskus- ja ääreishermoston acellular ja nekroottinen alueet kasvaimen, enintään 5 päivää injektion jälkeen (Täydennyskuvio S3 ja teksti S1). Perustuen tähän havaintoon, pitoisuus ja /tai puoliintumisajan liukoisen tekijöistä antiproliferatiivista /antituumorivaikutus ovat luultavasti eivät riitä pitämään kasvainsolujen lepotilassa pitkään, mutta ovat riittävät aluksi antagonisoivat syöpä solujen lisääntymistä. Tällainen tilapäinen vaikutus voidaan pelastaa useita, kasvaimeen injektio ADSCs. Tuloksia ihmisen soluja hiiren ksenosiirrettyjä ihmisen syöpäsoluja saattaa johtaa epäspesifistä ksenogeeniset immuunivasteen vastaanottavassa torjua

in vivo

kasvainten synnyssä. Kuitenkin, koska (i) Capan-1-solut eivät ilmennä MHC-luokan I ja II (tietoja ei ole esitetty), ja (ii) kateenkorvattomissa hiirissä immuunijärjestelmää (vain välittämää NK-solujen) on vähemmän tärkeää kuin immuunivasteen eläimissä, olemme kohtuullisen pois epäspesifisen immuunivasteen havaittu vaikutus. Ottaen kyky ADSC osallistua verisuonten kaltainen rakenteen muodostuminen [23], emme voi sulkea pois tietyn angiogeneesiä vaikutus ADSC yhteydessä haiman kasvaimen kasvua. Kuitenkin tämä vaikutus, jos sellainen on, näyttää olevan vähäinen vaiheessa taudin, eli aikana eksponentiaalisen vaiheen kasvaimen kasvun testasimme tässä työssä. Lisäksi olemme pystyneet tunnistamaan muutokset verisuonitiheydessä joko hiiren tai ihmisestä peräisin seuraavista kasvaimeen injektion ADSCs (tuloksia ei esitetty). Vaihtoehtoinen muutokset ADSCs fenotyyppiin seuraavissa kasvaimensisäistä injektion tulee seurata huolellisesti. Olemme todellakin osoittivat äskettäin, että ADSCs nopeasti ja massiivisesti hankittu korkea fagosytoosiaktiivisuutta ja indeksin, kun pistetään vatsaonteloon nude-hiirten [51].

Kaikkiaan työmme on ensimmäinen tutkimus, jossa käytettiin ei-muokatut solut kohdella PDAC. Tämä anti-proliferatiivista vaikutusta ADSC haiman syöpäsoluissa välittyy ainakin osittain erittyvä tekijä, mutta se on myös houkuttelevaa spekuloida, että

in vivo

ADSC voi muuttaa mikroympäristöä kasvain ja siten estävät sen leviämisen . Lopuksi ADSCs kyky estää G

1-S-vaiheeseen siirtymistä ja sen jälkeen estää syöpäsolujen lisääntymistä

in vitro

ja

in vivo

voi olla tehokas ja toteuttamiskelpoinen lähestymistapa käsittely 85% PDAC potilaista, joita ei saa käyttää parantava tavalla johtuen paikallisesti edennyt sairaus.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen lausunto

Ihmisen rasvakudoksessa oli saatu jäte esteettinen kirurgia menettelyt. Kaikki potilaat antoivat kirjallisen suostumuksen. Menettelyt hyväksyi alueellisen eettisen komitean ”Comité de suoja des personnes Sud Ouest et Outre Mer I”.

Kemikaalit

rasvakudoksessa ruoansulatusta, kollagenaasi ostettiin Roche (Roche Diagnostic, Saksa). Naudan seerumin albumiini (BSA), deksametasoni, askorbaatti-2 fosfaatti, pantoteenihappo, ja insuliini-transferriini-natriumseleniittiä täydentää ostettiin Sigma Aldrich (St. Quentin Fallavier, Ranska). Sikiön vasikan seerumia (FCS), trypsiini, DMEM, RPMI-1640, Fungizonea, penisilliiniä, streptomysiiniä, ja PBS: ää, jonka Invitrogen (Cergy-Pontoise, Ranska). Naudan sikiön seerumia (FBS) ja ADSC kulttuurin hankittiin Perbio (Pariisi, Ranska). Antimycoplasma agentti, Plasmocin ™ saatiin InvivoGen (Toulouse, Ranska).

Kasvain soluviljelmässä

Capan-1, Capan-2, BxPC-3, MiaPaca-2 ja Panc-1 solulinjat ovat peräisin ihmisen PDAC viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [52]. Huh7 ja HepG2-soluissa, jotka ovat peräisin maksasyövän, viljeltiin kuten on kuvattu muualla [53]. PC3 (ihmisen eturauhassyöpä) ja Caco-2-soluja (ihmisen paksusuolen karsinooma) viljeltiin DMEM 1 g /l glukoosia, jota oli täydennetty 10% FCS: ää. Hela (ihmisen kohdunkaulansyövän), viljeltiin DMEM 4,5 g /l glukoosia, jota oli täydennetty 10% FCS: ää. Kaikki alustat täydennettiin Fungizonea, antibiootit, L-glutamiinia, ja antimycoplasma reagenssia (Plasmocin ™, InvivoGen). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO2.

Ihmisen ADSCs valmistelu ja kulttuuri

Ihmisen ADSCs otettiin näytteet 20 terveiltä luovuttajilta. Stroma verisuonten jae eristettiin ihmisen rasvakudos saatu vatsan dermolipectomy vuonna plastiikkakirurgian osaston Rangueil Hospital (Toulouse, Ranska) kuten aiemmin on kuvattu [19]. Lyhyesti, SVF solua maljattiin T75-pulloissa yön yli DMEM-F12 (01:01), jota oli täydennetty 5% FBS: ää, 100 ug /ml pantoteenihappo, 100 uM askorbiinihappo, 16 uM biotiinia, 250 ug /ml amfoterisiini, 5 ug /ml streptomysiiniä ja 5 U /ml penisilliiniä. 24 tunnin kuluttua viljelmät pestiin perusteellisesti PBS: lla jäljelle jääneen tarttumattomat solut. HADSC kasvua jatkettiin kunnes solut saavuttivat 75% konfluenssiin (passage 0).

In vitro

solujen määrä arvioida

50 x 10

3 Capan-1-soluja viljeltiin täydellisessä RPMI-väliainetta 24 tuntia 35 mm: n annoksia, ennen seerumistarvaatio 16 tuntia. Soluja viljeltiin kolmena kappaleena läsnä vai ei ADSCs tai BM-MSC: väliaine vielä 48 tunnin ajan. Ohjaus-soluja viljeltiin DMEM-F12 (01:01), jota oli täydennetty 5% FBS: ää. Solujen kasvu mitattiin solulaskennan käyttämällä Coulter-laskimella malli ZM. For co-luviljelymäärityksistä, Capan-1-solut ensin maljattiin soluviljelmässä lisätään 4 um huokosia (BD Biosciences) täydellisessä väliaineessa 24 tunnin ajan. Sen jälkeen, kun 16 tunnin pituinen vaihe, Capan-1-solut siirrettiin 35-mm: n annoksia, kun läsnä on ADSCs erilaisilla suhteilla. Kaikki kokeet suoritettiin ADSCs ja MSC puhdistettiin eri terveiltä luovuttajilta saatuja.

In vitro

solunelinkykyisyysmääritys

kohdesoluja (15 x 10

3) viljeltiin täydellisessä väliaineessa tasapohjaisille 96-kuoppaisille levyille 24 tuntia, ennen kuin seerumistarvaatio 16 tuntia. Soluja viljeltiin kolmena kappaleena läsnä vai ei ADSC-väliaine vielä 48 tunnin ajan. Ohjaus-soluja viljeltiin DMEM-F12 (01:01), jota oli täydennetty 5% FBS: ää. Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTS-määritys, mukaan valmistajan suositusten (CellTiter96 vesipitoinen määritys, Promega France, Charbonnieres, Ranska). Kokeet suoritettiin ADSCs puhdistettiin eri terveiltä luovuttajilta saatuja. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina saadut arvot kontrolloiduissa olosuhteissa.

Virtaussytometrianalyysi proliferaation ja solukuoleman

Capan-1-soluja viljeltiin ja käsiteltiin ADSCs-CM kuvatulla

”in vitro solujen määrä arviointi”

osiossa. Soluja inkuboitiin BrdU 10 uM (Sigma Aldrich), 4 h 37 ° C: ssa. Capan kerättiin, pestiin kerran PBS: ssä kiinnitettiin sitten jääkylmään 70% etanolia 1 h 4 ° C: ssa. Solut kerättiin sentrifugoimalla 600 g, pestiin PBS: ssä, joka sisälsi BSA: ta 0,5% ja Tween-20 0,5%, ja suspendoitiin uudelleen 2 N kloorivetyhapossa, ja inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen solut suspendoitiin natriumboraattipuskuriin (0,1 M, pH 9) neutraloimiseksi jäljellä happoa. Solut värjättiin anti-BrdU monoklonaalisen vasta-aineen (Becton Dickinson) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen, Capan-1-solut suspendoitiin uudelleen propidiumjodidivärjäys liuosta (5 ug /ml), ennen kuin analyysi virtauksen cyotmeter (CantoII, Becton Dickinson). Sillä anneksiini-V ja propidiumjodidilla havaitseminen, Soluja leimattiin joko anneksiini-FITC (Apoptotest FITC, DakoCytomation) tai propidiumjodidin (Invitrogen) kohti valmistajan suosituksen. Apoptoottisia ja nekroottinen solut kvantitoitiin käyttäen BD FACS Calibur (Beckton Dickinson) ja Cell Quest pro ohjelmisto (Beckton Dickinson).

TUNEL

määrityksissä

havaitseminen solukuoleman TUNEL-määritys on Capan-1 kasvainten tehtiin, kuten on kuvattu muualla [42]. Sillä

In vitro

solukuolemaa määrityksissä, 50 x 10

3 Capan-1-solut ympättiin 4-hyvin objektilaseille (Lab-Tek II kammio slide, Nalge Nunc International, Naperville IL) in täydellistä alustaa 24 tuntia. Sen jälkeen, kun seerumistarvaatio 16 tuntia, soluja viljeltiin kolmena kappaleena läsnä vai ei ADSC-CM vielä 48 tunnin ajan. Ohjaus-soluja viljeltiin DMEM-F12 (01:01), jota oli täydennetty 5% FBS: ää. Havaitseminen alkuvaiheessa kromosomi erittely suoritettiin käyttäen Apopdetek seuraten valmistajan suositusten (ApopDETEK, Enzo biotieteiden, Farmingdale, NY, USA).

Western Blot analyysi

Proteiinit poimittiin Capan-1-solut, eroteltiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille, kuten muualla on kuvattu [53]. Sen jälkeen huoneen lämpötilassa esto 1 h, blotteja inkuboitiin vasta ostettu Santa Cruz Biotechnology, Inc (Heidelberg, Saksa) vastaan ​​nostetut cyclinD1 (sc-124), CDK4 (sc-260), sykliini (sc-247), βactin (SC- 8432) tai glyceraldehydes-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) (sc-24778). Rb ja fosfospesifiselle Rb-aineet olivat peräisin Cell signalointi Technology (Ozyme, St Quentin en Yvelines, Ranska). Toissijainen HRP-konjugoiduilla vasta-aineilla (Perbio Science, Erembogdegem-Aalist, Belgia) lisättiin, ja blotteja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa.