Krooninen sairaus

tiivistelmä

Anti-kasvain CD8

+ T-solut ovat keskeinen yleisen eloonjäämisen potilailla leikkaushaavan resektio kiinteiden syöpäsairauksia. Käyttäen hiirimallissa syövän rokotuksen (adenovirusta, joka ekspressoi melanoomaan kasvaimeen liittyvä antigeeni (TAA) -dopachrome tautomerase (AdDCT) ja resektion jolloin suuren leikkauksen stressi (vatsan nephrectomy), me osoitamme, että kirurgiset stressi johtaa määrän väheneminen CD8

+ T-solu, joka tuottaa sytokiineja (IFNy, TNFa, grantsyymi B) vastauksena TAA. Tämä vaikutus on toissijainen vähentyneistä lisääntymistä ja heikentynyt T-solujen toiminta seuraava antigeenin sitoutumiseen. ennaltaehkäisevässä mallissa kirurginen stressi täysin kumoaa kasvain suojaus myönnetyn rokotus välittömässä leikkauksen jälkeen. vuonna kliinisesti merkittävää kirurginen resektio malli,-rokotetuista hiiristä meneillään positiivinen liikkumavara resektoimalla kirurgisten stressi oli vähentynyt selviytymisen verrattuna hiiriin positiivisella marginaalilla resektio yksin. Preoperatiivisen immunoterapia IFNa laajennetaan tuntuvasti hengissä kirurgisesti korosti hiirillä . Tärkeää on, myeloidinen johdettu vaimennin solu (MDSC) väestön määrän ja toimintakyvyn heikentymisen TAA CD8

+ T-solujen muutettiin kirurgisesti korosti hiirillä. Meidän havainnot viittaavat siihen, että syövän etenemisessä voivat johtua leikkauksesta aiheuttama tukahduttaminen kasvain CD8

+ T-soluja. Preoperatiivinen immunoterapioiden joilla pyritään kohdistaminen prometastatic vaikutuksia syövän leikkaus vähentää toistumisen ja parantaa selviytymisen syöpä potilailla.

Citation: Ananth AA, Tai LH, Lansdell C, Alkayyal AA, Baxter KE, Angka L, et al . (2016) Surgical Stress kumoaa Aiempaa Suojaava T-soluvälitteinen Anti-kasvainimmuniteetin Johtavat Leikkauksen jälkeinen syövän uusiutumiseen. PLoS ONE 11 (5): e0155947. doi: 10,1371 /journal.pone.0155947

Editor: Hiroyoshi Nishikawa, kartoittava Oncology Research Clinical Trial keskus, National Cancer Center, JAPAN

vastaanotettu: 09 lokakuu 2015; Hyväksytty: 06 toukokuu 2016; Julkaistu: 19. toukokuuta 2016

Copyright: © 2016 Ananth et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Terry Fox Research Institute, New tutkija Award (RCA); Kanadan Institutes of Health Research Fellowship (LHT); Kanadan Cancer Society Research Institute, innovaatio ja innovaatio on Impact Grant (RCA).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tärkeys immuuni- valvonnan ohjaamiseksi seuraus pahanlaatuisten solujen on tunnettu jo vuosikymmenien ajan. Periaate, että luonnossa esiintyvät T-solujen kasvainten vastainen potentiaali on olemassa ihmisen syövässä on johtanut kehittyvällä alalla syövän immunoterapian. Itse kasvainten kuitenkin pystyvät kaapata immuunijärjestelmän tukahduttaa immuuni valvonta, luoda suotuisa ympäristö, ei vain ensisijaisen vaan myös etäpesäkkeitä kasvain. Jälkimmäinen prosessi on kutsutaan ”systeeminen yllyttäminen” [1]. Tämän ymmärtäminen immunosuppressiivisia kasvain ympäristössä ja käännetään se kohdennetuilla aineilla on osoittautunut erittäin onnistunut hoito strategiaa [2].

Kirurginen resektio on tärkeä osa hoito parantava tarkoitus kiinteässä syöpäsairauksia. Vaikka täydellinen resektio, monet potilaat kehittää paikallisia uusiutumisen tai etäpesäkkeitä ja lopulta kuolevat sairauteen [3-6]. Kertyvät näyttöä yhdistyksen välillä läsnäolo CD8

+ T-soluja ja parantunut ennustetta ja eloonjäämisen useita kiinteitä pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien rinta-, munasarja-, kolorektaali-, munuaissolukarsinooma, ja pahanlaatuinen melanooma [7-9].

Tämä yhteys viittaa siihen, että läsnä on vahva anti-kasvain immuuni vasteen, erityisesti kasvaimen vastaisen CD8

+ T-soluja, voivat estää tai poistaa minimaalinen jäljellä tauti tai micrometastases seuraava täydellinen kirurginen resektio primaarikasvaimen.

Meidän ryhmämme ja muut ovat osoittaneet, että välitön postoperatiivinen aika on ainutlaatuisen altis ajan kehittämiseksi syövän uusiutumiseen etäpesäkkeitä [3, 4, 10]. On olemassa useita mekanismeja ehdotetaan selittämään tätä ja tiedottamaan kasvainsolujen verenkiertoon [11], paikallinen ja systeeminen vapautumisen angiogeneesiä ja mitogeenisesta välittäjiä (kasvutekijän ja endoteelikasvutekijä) [3, 10, 12 ] ja syvällinen inhibitio soluvälitteisen immuniteetin [3, 10]. Olemme aiemmin sekaantuneet leikkauksen aiheuttama poistaminen (NK) solujen kehityksessä postoperatiivisen etäpesäkkeitä [3, 4] validoitu eläinmallissa kirurgisten stressiä ja etäpesäkkeitä [13].

Vaikka aikaisemmissa tutkimuksissa on raportoitu vähentäminen CD8

+ T-solujen ja laski sytokiinierityksen vastauksena epäspesifisen stimulaation [14-17], kukaan ei ole tutkinut luonne vaikutuksia kirurgisen stressiä antigeenispesifisten CD8

+ T-soluvasteiden eikä niitä osoittaneet kumota olemassa olevan suojaava anti-kasvain CD8

+ T-soluvaste. Tässä käsikirjoitus, tutkimme vaikutuksia kirurgisen stressiä suojaava CD8

+ T-soluja välittämä kasvaimen vastaisen immuniteetin. Tämän saavuttamiseksi käytämme virus–vektori perustuu kasvain rokote kutsutaan AdDCT. Tämä on replikaatiokyvyttömäksi E1 /E3-deletoidun ihmisen tyypin 5 adenovirus (Ad), joka ilmentää täyspitkää ihmisen Dopachrome Tautomerase (hDCT) geenin [18] kasvaimeen liittyvä antigeeni (TAA). Aiemmin on osoitettu, että profylaktinen AdDCT rokotus voi antaa suojan ihon alle (sc) istutettiin melanooma CD8

+ T-solu-riippuvaisella tavalla [18-21]. Tarjoamme prekliinisissä

in vivo

tuloksia, jotka osoittavat selvästi, että suuri leikkaus voi merkittävästi vaimentaa ennestään suojaavan T-solujen immuunivasteen syöpää rokotuksen ja antaa uutta käyttöä preoperatiivisen immunoterapian kääntämään tätä vaikutusta.

Materiaalit ja menetelmät

hiiret

C57BL /6, BALB /c: n ja CD1-nude-hiiriä hankittiin Jackson Laboratory (Bar Harbor). Eläimiä pidettiin patogeenivapaissa olosuhteissa ja kaikki tutkimuksia olivat vakiintuneiden ohjeiden mukaisesti on Animal Care Veterinary Service laitokseen yliopiston Ottawa (Ontario). Kanadalainen neuvoston Animal Care ja Animal Care komitean Ottawan yliopisto hyväksyi tutkimuksen.

Generation kirurgisen stressin

Säännöllinen perioperatiivisen hoidon (mukaan lukien anestesia ja kivunhoito) ja kirurgiset stressi olivat suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [3, 13]. Lyhyesti, hiiret altistettiin 2,5% isofluoraani (Baxter Corp.) induktioon ja ylläpitoon anestesian. Kirurginen stressi indusoitiin hiirissä vatsa laparotomy (3 cm keskilinjaviilto) ja vasen nephrectomy (Nx). Kaikki eläimet, joille tehdään kirurgisia toimenpiteitä saavat valmiiksi ja leikkauksen jälkeen buprenorfiini injektioita (0,05 mg /kg) annettuna SC. Ennen leikkausta, hiiret injektoidaan SC 1 tunti ennen leikkausta. Leikkauksen jälkeen, hiiret injektoitiin SC 8 tunnin välein 2 päivää. Ruumiinpaino ja muita näkökohtia eläinten hyvinvointi kirjataan päivittäin leikkauksen jälkeen (S1 taulukko). Veri tietoja ei kerätä. Hiiret lopetettiin intraperitoneaalisella (ip) injektion pentobarbitaalinatriumia (65 mg /kg).

Solulinjat

B16F10LacZ melanoomasolulinja saatiin tri K. Graham (London Health Sciences, Ontario kotoisin American Type Culture Collection) ja pitää täysin DMEM. Solut suspendoitiin uudelleen DMEM: iin ilman seerumia laskimoon (iv) injektion kautta sivusuunnassa häntälaskimoon. Kasvainsolut 95% elinkelpoisuus injektoitiin 0,1 ml tilavuus /hiiri.

hiirten rokottaminen

Nukutetut hiiret rokotettiin 1×10

6 plakkia muodostavaa yksikköä (PFU) ja AdDCT (liuottaa 100 ui PBS) tai pelkkää PBS: ää lihakseen (im) injektio kumpaankin reiteen (50 ui per reisi).

Ennaltaehkäisevä rokotus kasvainmuodoista

Hiiret rokotettiin AdDCT tai PBS päivänä 0. päivänä 7 hiiret injektoitiin kasvainsoluja joko sc tai iv edellisen leikkausta. Sc melanooma kasvaimissa todettiin injektoimalla 3×10

5 B16F10lacZ soluja seerumittomassa alustassa oikealla takakyljelle; kasvaimen koko mitattiin kahdesti viikossa ja kasvainten tilavuudet laskettiin käyttäen kaavaa 1/2 (L x W

2). Hiiret katsottiin olevan saavutettu päätepiste kun kasvain ylsi 1600mm

3. Systeeminen levittämismallit ympättiin 1×10

6 B16F10lacZ soluihin häntälaskimoon iv annon. Kasvain keuhkoissa värjättiin X-gal visualisoida kasvaimen micrometastases kuten aikaisemmin on kuvattu [3].

Terapeuttinen rokottaminen tuumorin mallin

Hiiret injektoitiin sc 1×10

5 B16F10lacZ solujen seerumittomassa alustassa oikealla takakyljelle päivänä 0. päivänä 7 hiiret käsiteltiin AdDCT tai PBS: llä osoitettuna annoksena (pfu). Päivänä 14, sc kasvaimia resektoitiin 2×2 mm positiivisen marginaalin puoli vastaanottaa ylimääräisiä kirurginen stressiä muodossa vatsan laparotomy ja vasemmalle nephrectomy. Kasvaimen koko mitattiin kahdesti viikossa ja kasvainten tilavuudet laskettiin käyttäen kaavaa 1/2 (L x W

2). Hiiret katsottiin olevan saavutettu päätepiste kun kasvain ylsi 1600mm

3. Sillä ennen leikkausta IFNa hoitoon (R yhteinen ihmisen ja hiiren DCT) syntetisoitiin Biomer Technology (Pleasanton, Kalifornia).

Virtaussytometria

solunulkoisen värjäystä, pernasoluja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa pimeässä fluorochrome- konjugoiduilla vasta-aineilla (laimennettu 1: 100), joka on spesifinen solun pinta-antigeenien ja kiinnitettiin 1% PFA. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: CD3-PerCP (Biolegend), CD8α- FITC (BD Biosciences), CD4-PE (BD Pharmingen), Gr-1-FITC (eBioscience), CD25-FITC (Biolegend), FoxP3-APC (eBioscience ), CD11 c-PeCy7 (eBioscience) ja CD11-PE (eBioscience). Solunsisäiseen värjäys, 1-2×10

6 pernasoluja stimuloitiin DCT peptidit (2 ug /ml) läsnä ollessa brefeldin A (GolgiPlug; BD Pharmingen, 1 ug /ml, lisättiin 1,5 tunnin kuluttua inkubaation). Seuraavat 6 tunnin inkuboinnin jälkeen solut käsiteltiin anti-CD16 /CD32 ja solun pinta-antigeenien leimattiin fluorokromilla-konjugoiduilla vasta-aineilla. Tämän jälkeen solut läpäiseviksi ja kiinnitetään Cytofix /Cytoperm (BD Pharmingen) ja värjättiin solunsisäisen sytokiinien: IFNy-PE (BD Biosciences), TNFa-PeCy7 (Biolegend) ja Granzyme B-APC (eBioscience). Tiedot hankittiin käyttäen Cyan-ADP 9 virtaussytometrillä Summit 4.3 ohjelmisto (Beckman Coulter) ja analysoitiin Kaluza 1.2 ohjelmisto (Beckman Coulter).

DCT-erityisiä MHCI tetrameerin analysointi ja ELISpotissa

pernasoluja käsiteltiin anti-CD16 /CD32 ja leimattu PE-konjugoidulla DCT

180-188 peptidi-MHC-I-tetrameerin (Baylor College), PerCP-CD3, ja FITC-CD8a (eBioscience) 30 minuutin ajan FACS puskuria (1% PBS, 5% vasikan sikiön seerumia, 2,5% Naz). Sillä ELISpotissa analyysien tarkka määrä DCT-MHC-I tetrameerin

+ /CD8

+ T-solut laskettiin virtaussytometrillä suhteessa tuloksiin ja lisätään IFNy ELISpotissa valmistajan ohjeiden mukaisesti (Mabtech).

T-solujen apoptoosin määritystä

Splenosyyttejä hoidettu anti-CD16 /CD32 ja solun pinnan antigeenejä leimattiin PE-CD3 ja FITC-CD8a (eBioscience). Sitten solut leimattiin APC-anneksiiniV ja 7-AAD (BD Pharmingen) 15 minuuttia ja tiedot hankittiin syaani-ADP (Beckman Coulter) tunnin kuluessa.

BrdU T-solujen lisääntymisen määrityksessä

Pernasoluja stimuloitiin uudelleen in vitro peptidit (2 ug /ml) 37 ° C: ssa, kun läsnä on brefeldin A (GolgiPlug; BD Pharmingen, 1 ug /ml, lisättiin 1,5 tunnin kuluttua inkubaation). 3,5 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen solut leimattiin BrdU (BD Pharmingen), ja niitä inkuboitiin vielä tunnin ajan. 6 tunnin kuluttua inkubaation, soluja käsiteltiin anti-CD16 /CD32 ja solun pinta-antigeenien leimattiin PerCP-CD3: n ja PE-CD8a. Valmistajan ohjeiden mukaisesti, soluja käsiteltiin läpi sarjan permeabilizations ja kiinnitykset ja värjättiin solunsisäisen FITC-BrdU.

MDSC-T-solujen suppression määrityksessä

T-soluja eristettiin pernoista hiirten sai AdDCT rokotuksen 7 vrk ennen sadonkorjuuta. MDSCs eristettiin pernoista valvonta- ja kirurgisesti korosti hiiriä (18 tuntia leikkauksen jälkeen). T-solut valittiin positiivisesti käyttää CD90.2 mikrohelmiä (Miltenyi Biotec) ja MDSC valittiin positiivisesti käyttämiseksi Myelooisen-Derived vaimennin Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec), sekä seuraavat valmistajan protokollia. Solut suspendoitiin uudelleen 1 x 10

6 solua /50 ui cRPMI ja viljellään eri MDSC: T-suhteet (0,25: 1, 0,5: 1, 1: 1). CD3 /CD28 Dynabeads (Life Technologies) lisättiin Viljelmä 1: 1 helmi- to solusuhteen lisäksi 30 U /ml hiiren rekombinantti interleukiini-2 kohti valmistajan suosituksen. Soluja viljeltiin sitten 4 päivää CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa. 4 päivän jälkeen solut siirrettiin V pohjaan 96-kuoppalevylle uudelleen- stimuloitu DCT peptidillä käyttäen protokollaa edellä luetellut solunsisäisen värjäystä.

Tilastollinen

Yksisuuntaista varianssianalyysillä (ANOVA) ja Bonferonni jälkikäteen testi tehtiin kaikki tiedot. P-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä. Tilastollinen merkitys Kaplan-Meier selviytymisen käyrät määritettiin käyttäen log-rank testejä.

Tulokset

Kirurginen stressi heikentää antitumor immuniteetin johtaen keuhkometastaasitestissä ja ihonalainen kasvaimen kasvulta

Määritä vaikutus kirurgisen stressiä TAA-spesifisten T-solujen, kehitimme AdDCT rokotuksen leikkausta mallia. Käyttämällä perustettu B16F10lacZ melanooma keuhkometastaasitestissä leikkaus mallin [3, 13], me annettiin neoadjuvant AdDCT seurasi 7 päivää myöhemmin tuumorin istuttamisen iv-injektio ja suuri leikkaus, jossa vatsanaukaisuviillon ja nephrectomy (kuvio 1a). Rokotus 1×10

6 pfu AdDCT myönnetty 3-kertaisesti alentunut etäpesäkkeitä verrattuna PBS: llä käsiteltyihin kontrollihiiriin. Kuitenkin,-rokotetuista hiiristä altistettiin suuri leikkaus osoitti 5-kertainen etäpesäkkeitä verrattuna pelkästään rokotuksen (kuvio 1 b). Tämä viittaa siihen, että leikkaus vaimentaa antituumorivaikutuksen koskemattomuus myönnetty AdDCT rokotus.

(a) B6 hiirille annettiin neoadjuvant AdDCT 1 x 10

7 pfu. Päivänä 7 hiiret altistettiin iv kanssa 3×10

5 B16F10lacZ solujen luomiseksi syngeneeisissä keuhko melanoomaa etäpesäkkeitä, ja sitten tehtiin vatsan laparatomy ja nephrectomy (Nx) tai ei leikkausta. (B) Keuhkot uutetaan päivänä 10 (3 päivän kuluessa kasvainsoluinokulaation) PBS, Nx, AdDCT, AdDCT + Nx ja kvantifioidaan X-Gal-värjäys. N = 5 /ryhmä. (C) B6 hiiriin rokotettiin AdDCT, altistettiin sitten päivänä 7 sc 1×10

6 B16F10lacZ soluja, sitten leikattiin tai ei leikkausta. (D) Kasvaimen tilavuus käsiteltyä B16F10lacZ sc kasvainta kantavaa hiirtä tarkkailtiin päivittäin. (E) Survival käsiteltyä B16F10lacZ sc tuumoreita kantavaa hiirtä on esitetty Kaplan-Meier-käyrät. Prosenttiosuus elävien hiirten on osoitettu. N = 7-8 /ryhmä, (* P 0,05, *** P 0,001).

Aiemmin on osoitettu, että iv ruiskutetaan melanoomasoluja ovat alttiimpia NK-solun lyysin verrattuna sc melanooma, suurelta osin johtuen eroista kasvain mikroympäristössä ja immuunijärjestelmän solujen mittasuhteet [22, 23]. Poissulkemiseksi välittäjänä NK-solujen, suoritimme kasvain haaste käyttäen sc injektion B16F10lacZ kasvainsolujen takakyljelle (kuva 1c). In AdDCT–rokotetuista hiiristä, jotka eivät suoritettiin kirurgisia stressiä, 100% hylättiin myöhemmin kasvain haaste kun taas kaikki hiiret, joille tehtiin suuri leikkaus aikaan kasvaimen haaste kehitetty kylki kasvaimia samalla nopeudella kuin ohjaus- un–rokotetuista hiiristä (kuvio 1 d ja 1 e). Lisäksi havaitsimme vaimennus ennestään kasvaimen vastaisen immuniteetin kirurgisella stressi on CT26 kolorektaalisyövässä malli (S1 kuvio), mikä viittaa siihen, että leikkaus aiheuttama toimintahäiriö Kasvainten immuniteetin ei ole yksinomaan meidän melanoomamalii. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että kirurgiset stressiä AdDCT rokottamattomien hiirien kumoaa suojaava anti-kasvain immuunivasteen.

Kirurgia aiheuttama kumota suojan AdDCT rokotuksen riippuu CD3

+ T-solujen

Osoittaakseen välittäjänä varten hankittu immuniteetti kirurgiassa heikentävä suojaava AdDCT rokotus, me toistuva sc kasvain haaste malli CD-1 nude-hiiriin, jotka ovat puutteellisia T- ja B-soluissa, mutta säilyttävät NK-solujen toiminto [24] (Kuva 2a). Nude-hiirissä, AdDCT rokotus ei suojannut hiiriä muodostaa kasvaimen haaste ja kirurgiset stressi ei johda merkittäviä eroja eloonjäämisen AdDCT–rokotetuista hiiristä (kuvio 2b). Tämä viittaa siihen, että hankittu immuniteetti on välttämätön suojaavia vaikutuksia AdDCT rokotuksen ja negatiivisia vaikutuksia kirurgisten stressiä kasvaimen kasvulta mallissamme. Perustaa T-solut välittäjäksi sekä kasvaimen suojaus seuraavat AdDCT rokotusta ja herkkyyttä kasvaimen kasvua suuren leikkauksen, me siirrettiin adoptiivisesti 1.0×10

7 puhdistetun pernan CD3

+ T-solut AdDCT-rokotetuista hiiristä ja kirurgisesti korosti AdDCT rokottamattomien hiirien osaksi naiivi saajahiiret. 1 päivä seuraavat T-solujen siirron saaja hiiret altistettiin sc B16F10lacZ kasvaimia (kuvio 2c). Survival seurattiin ajan kuluessa. Hiiret, jotka saivat T-soluja rokotetuista luovuttajista 90% suojattu B16 kasvain haaste, kun taas ne, jotka saivat saman määrän T-solujen kirurgisesti korosti rokotetuista luovuttajien kaikki etenevää kyljen kasvaimia (kuvio 2d). Siirtämällä kirurgisesti korosti T-solujen ja uudestaan ​​vaikutus leikkaus suojarokotuksen, loimme että haitallinen vaikutus kirurgian AdDCT rokotus on T-soluvälitteinen.

(a) CD-1 nude-hiiriin rokotettiin 1 × 10

7 pfu AdDCT. Päivänä 7 hiiret altistettiin sc B16F10lacZ kasvaimia ja sitten leikattiin tai ei leikkausta. (B) Survival käsiteltyä B16F10lacZ kasvain CD-1 nude-hiiriin esitetään Kaplan-Meier käyrät. Prosenttiosuus elävien hiirten on osoitettu. N = 7-8 /ryhmä. (C) B6-hiiret rokotettiin 1×10

7 pfu AdDCT ja päivänä 7 hiiret tehtiin leikkaus tai ei leikkausta. Päivänä 8, perna CD3

+ -T-solut eristettiin ja siirrettiin naiivi vastaanottajalle B6 hiirissä. Päivänä 9, vastaanottajan hiiret altistettiin sc B16F10lacZ kasvaimia. (D) Survival käsiteltyä B16F10lacZ tuumoreita kantavaa hiirtä on esitetty Kaplan-Meier parannuskeinoja. Prosenttiosuus elävien hiirten on osoitettu. N = 7-8 /ryhmä.

Kirurginen stressi johtaa vähenemiseen CD8

+ T-solujen sytokiinien tuotantoa vastauksena TAA

Koska kirurgista stressiä johti vaimennus T-solu -välitteisen syöpäsolujen

in vivo

, me epäilivät AdDCT indusoi T-solujen sytokiinien tuotantoa vastauksena TAA (DCT) vaikuttaa leikkauksen. Käyttäen samaa mallia neoadjuvant AdDCT rokotuksen seurasi tuumorin istuttamisen ja suuren leikkauksen stressi 7 päivää myöhemmin, arvioimme sytokiinien eritystä DCT-CD8

+ T-solut eristettiin pernan 18 tuntia leikkauksen jälkeen. Havaitsimme merkittävä lasku osuudet CD8

+ T-solut erittävät IFNy (kuvio 3a ja 3b), TNFa (kuvio 3c) ja Granzyme B (kuvio 3d) vastauksena DCT peptidin stimulaatio ja vähentämällä määrä CD8

+ T-solut erittävät IFNy vasteena ei-spesifisen stimulaation PMA: lla ja ionomysiinillä (S2 kuvassa). Lisäksi teimme IFNy ELISpot määritys vahvistaa myös virtaussytometrialla ja löydettyjen samanlainen vaimennuksen määrä DCT-CD8

+ T-solujen tuottamiseksi IFNy suuren leikkauksen (kuvio 3e ja 3f). Nämä tiedot viittaavat siihen, että kirurgiset stressi johtaa väheneminen TAA CD8

+ T-solu erittävät sytokiineja, kun DCT peptidin stimulaatio.

B6 hiiret saivat neoadjuvant rokotus 1 x 10

7 pfu AdDCT. Päivänä 7 hiiret altistettiin iv kanssa 3×10

5 B16F10lacZ solujen luomiseksi syngeneeisissä keuhko melanoomaa etäpesäkkeitä, ja sitten leikattiin tai ei leikkausta. Päivänä 8, hiiret tapettiin, ja sille tehtiin pernan immuunijärjestelmän solujen arviointi. Prosenttiosuus DCT-specific (a) IFNy

+, (c) TNFa

+, (d) Granzyme B

+ CD8

+ T-solut reagoivat DCT

180-188 peptidi altistuminen . (B) edustaja virtaussytometrialla pistekuvioita DCT-IFNy

+ /CD8

+ T-solut reagoivat DCT

180-188 peptidi altistumista. (E) kvantifiointi SFU IFNy ELISPOT-määrityksessä. (F) Vastaavat edustavat kuvat IFNy ELISPOT-määrityksessä CD8

+ T-reagoivat DCT

180-188 peptidi altistumista. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001).

Kirurgisesti painotti T-solut näyttää alentunut sytokiinieritystä, lisääntymistä ja kasvaimen tunkeutuminen vastauksena TAA

Aiemmat raportit ovat osoittaneet maailmanlaajuista vähentämistä CD8

+ T-solujen leikkauksen jälkeen [10, 14]. Käyttämällä mallia AdDCT rokotuksen seurasi suuri leikkaus 7 päivää myöhemmin, olemme myös osoittaneet väheneminen globaali määrä CD8

+ T-solut eristettiin pernan 18 tuntia leikkauksen jälkeen (kuvio 4a). Tämä vähennys ei ollut toissijainen lisääntynyt solukuolema, mitattuna anneksiiniV ja 7AAD värjäytymistä (kuvio 4b), mutta oli yhteydessä vähenemiseen T-soluproliferaatiota mitattuna BrdU seuraavat DCT-peptidin stimulaatio (kuvio 4c). Me seuraavaksi pyrittiin määrittämään, onko määrän väheneminen CD8

+ T-solut erittävät sytokiinin vasteena DCT oli toissijainen lasku osuus DCT-CD8

+ T-solujen (eli T-soluja, jotka kykenevät sitoutumaan DCT ) tai toiminnallinen vajaatoiminta sytokiinierityksen seuraavista DCT-stimulaatiota. Käyttämällä MHC-luokan I DCT-erityisiä tetrameeri, osoitimme ei heikkene osuutta DCT-CD8

+ T-solujen kirurgisen stressin rokotetuilla hiirillä (kuvio 4d ja 4e). Sen varmistamiseksi, että DCT-CD8

+ T-solut toiminnallisesti heikentynyt leikkauksen jälkeen, me päällystetty yhtä monta DCT tetrameeri-sitova CD8

+ T-solujen ELISPOT seuraavissa DCT peptidin stimulaatio ja havaittiin merkittävä väheneminen IFNy eritys (kuvio 4f). Lisäksi arvioimme kinetiikka IFNy ilmentymisen DCT-CD8

+ T-solujen eri ajankohtina rokotuksen jälkeen ja leikkauksen seisten toipumisaika T-solujen toiminnallisuuden välillä leikkauksen jälkeinen päivä (POD) 7 ja POD 28 ( S3a ja S3b kuvassa). Havaittu elpyminen T-solujen funktion POD 28 korreloi myös tuumorinvastaisen immuunivasteen kuin leikkaus-takaisin hiiret pystyivät hylätä B16lacZ sc kasvain haaste yhtä tehokkaasti kuin mitään leikkausta valvontaa (S3C kuvio). Lopuksi arvioidaan, onko CD8

+ T solujen vaeltamiseen kasvaimeen vaikuttivat kirurgisen stressin. Tilanteen korjaamiseksi, me rokotettu hiiriä AdDCT seurasi 7 päivää myöhemmin sc injektiona kasvainsolujen sekoitetaan matrigeelin tulppa ja suuri leikkaus. Matrigel tulpat arvioitiin tunkeutuvia lymfosyyttejä 3 päivää istutuksen jälkeen. Meidän tiedot osoittavat, että CD8

+ T-solut vähenivät puoli kasvaimissa kirurgisesti korosti hiirillä, mikä osoittaa, että leikkaus vaikuttaa kasvaimen immuunijärjestelmän tunkeutumista (kuvio 4g). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että suuri leikkaus johtaa maailmanlaajuista vähentämistä CD8

+ T-solujen, joka ei ole toissijainen lisääntynyt solukuolema, mutta liittyy lisäkasvun estäminen. Osuus DCT-spesifisten T-solujen ei ole vähentynyt suhteessa maailmanlaajuiseen numero, mutta jäljellä olevat DCT-spesifisten T-solujen ovat vahingollisia niiden kyky erittää IFNy vastauksena tuumoriantigeeni. Lopuksi CD8

+ T-solujen tunkeutuminen Kasvainten heikentää myös leikkaushaavan stressiä.

B6 hiiret saivat neoadjuvant rokotus 1 x 10

7 pfu AdDCT. Päivänä 7 hiiret altistettiin iv kanssa 3×10

5 B16F10lacZ solujen luomiseksi syngeneeisissä keuhko melanoomaa etäpesäkkeitä, ja sitten leikattiin tai ei leikkausta. Päivänä 8, hiiret tapettiin, ja sille tehtiin pernan immuunijärjestelmän solujen arviointi. (A) kokonaismäärä CD8

+ T-solut, (b) kokonaismäärä anneksiini V

– /7-AAD

– /CD8

+ T (live), anneksiini V

+ /7-AAD

– /CD8

+ T (varhainen apoptoosin), anneksiini V

+ /7-AAD

+ /CD8

+ T (myöhäinen apoptoosin) soluja, (c ) prosenttiosuus BrdU

+ /CD8

+ T-solut, (d) prosentuaalinen ja (e) edustaja pistekuvaajan DCT-tetrameerin

+ /CD8

+ T-solut reagoivat DCT

180-188 peptidi altistuminen, (f) määrällinen SFU DCT-tetrameerin

+ /CD8

+ T-solut reagoivat DCT

180-188 peptidi altistuminen IFNy ELISPOT-määrityksessä. (G) kokonaismäärä CD8

+ /CD3

+ T-solut per mg kasvaimen B6 hiirissä sc B16F10lacZ kasvaimia sekoittaa matrigeelin päivänä 7. Päivänä 10, matrigeeliä tulpat poistettiin ja arvioitiin immuuni infiltraatiota virtaussytometrialla. N = 4-6 /ryhmä. (* P 0,05, *** P 0,001).

Kirurgia heikentää rokotteen toiminto terapeuttisessa B16 mallin minimaalinen jäljellä tauti (MRD) ja voidaan osittain pelastettiin leikkaussalin IFNa

Kun otetaan huomioon rajoitukset profylaktinen mallin syövän rokotus, olemme kehittyi kliinisesti merkittävä terapeuttinen B16 mallin minimaalinen jäljellä tauti (MRD) (kuvio 5a). Tässä mallissa kaikki hiirillä oli kylki istutettujen kasvaimien päivänä 0 ja sen jälkeen AdDCT rokotuksen päivänä 7, resektio heidän ensisijainen kasvain, jossa on 2 mm: n positiivinen marginaali päivänä 14 simuloida MRD ihmisen syöpä potilaita, jonka jälkeen ylimääräinen kirurgisen stressin. Samanlainen profylaktinen mallia, havaitsimme, että AdDCT rokottamattomiin hiiriin jotka resektio yksin selvisivät huomattavasti kauemmin kuin AdDCT rokottamattomien hiirien ylimääräisiä kirurgisten stressi (kuva 5b). Koska tukahduttava vaikutus leikkauksen ennestään DCT-CD8

+ T-solu immuniteetti, me annetaan ennen leikkausta sytokiinien immunoterapian muodossa IFNa hoito pelastaa T-solujen toimintaa ja parantaa selviytymistä (kuvio 5c). Havaitsimme, että mediaanielossaolosta AdDCT rokotettujen hiirten että koki resektion ja nephrectomy oli 17 päivää, kun taas eloonjäämismediaani laajeni 27 päivän leikkaussalin IFNa käsitellyissä hiirissä (kuvio 5d). Seuraavaksi suoraan tutki IFNa hoidon yhteydessä AdDCT rokotuksen toimintojen parantamiseksi DCT-spesifisten T-soluvasteiden. Mielenkiintoista, preoperatiivinen IFNa- hoito ei merkittävästi vaikuta sytokiinien erityksen (IFNy ja TNFa) DCT-CD8

+ T-solujen (S4 kuvio). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että voimme yhdistää immunoterapia suuri leikkaus pidentää hengissä leikkauksen jälkeen. Kuitenkin muut efektorisolujen (kuten NK-soluja) voi olla rooli lisäksi DCT-CD8

+ T-solujen välittämässä hyödylliset vaikutukset IFNa.

(a) B6 hiiriin injektoitiin sc kanssa 1×10

6 B16F10lacZ soluja. Päivänä 7 hiiret rokotettiin AdDCT. Päivänä 14, kasvaimet resektoitiin (Res), jossa on 2 mm marginaali +/- kirurgisen stressin (Res + Nx). (B) Survival käsiteltyä B16F10lacZ tuumoreita kantavaa hiirtä on esitetty Kaplan-Meier-käyrät. N = 7-8 /ryhmä. c) Preoperatiivinen hoito päivänä 10, 1 suuri annos (10000 IU /hiiri) ja päivinä 11 kautta 13 3 pienillä annoksilla (1000 IU /hiiri) rekombinanttia mIFNα vuonna MRD rokotuksen mallissa. Survival käsitellyn B16F10lacZ tuumoreita kantavaa hiirtä on esitetty Kaplan-Meier-käyrät. N = 5-6 /ryhmä.

Surgery aiheuttama laajeneminen granulosyyttistä MDSC heikentää T-solujen sytokiinin erityksen

Lopuksi tutkimme mekanismeja T-solujen suppression tuumoria kantavissa hiirissä vastaanottaa rokotus ja käynnissä kirurgiset stressiä. Myeloidinen Johdettu vaimennin Cells (MDSC) edustavat populaatio kypsymättömiä myeloidisolujen jotka laajentavat dramaattisesti kasvainprogression ja heikentää immuniteetin [25]. Hiirillä on kaksi populaatioita MDSC määritelty niiden suhteellinen ilmentyminen Gr1 ja toiminnallisen tilan [26, 27]. Erityisesti havaitsimme merkittävän osuuden kasvu perna granulosyyttisten MDSC (gMDSC) kirurgisesti korosti ja rokotettujen hiirten (kuvio 6a), mutta ei monosyyttistä MDSC (mMDSC) (kuvio 6b) verrattuna rokotettujen valvonnan ilman leikkausta. Sitä vastoin emme noudata mitään eroja pernan T sääntelyn (Treg) populaatiot ajan rokotteen ja kirurgian (kuvio 6c). Analysoida kyky leikkauksen johdettujen gMDSC tukahduttaa rokotteeseen aktivoitunut T-solu-toiminto, pernan gMDSC eristettiin ohjaus ja kirurgisesti korosti hiirillä ja viljellään T-solut Ad-DCT–rokotetuista hiiristä. Kun läsnä on leikkaus johdettu gMDSC, tuotanto IFNy (kuvio 6d) ja TNFa: n (kuvio 6e) CD8

+ DCT-spesifisten T-solujen vaikutuksesta inhiboitui merkittävästi vasteena DCT-peptidin. Lisäksi olemme arvioineet preoperative IFNa hoito voi kääntää kertymistä gMDSCs pernassa hiirten rokotuksen jälkeen ja leikkauksen (S5 kuvio). Lähemmässä tutkimuksessa havaitsimme, että ennen leikkausta IFNa hoito ei vähennä laajentamista gMDSC hiirillä verrattuna rokotettujen hiirien leikkauspotilaiden. Olemme osoittavat lisäksi, että gMDSC ilmentyminen solun pinnalla aktivoitumisen /kypsytys merkkiaineita CD80 /CD86 eivät muutu seuraavat ennen leikkausta IFNa viittaa siihen, että IFNa-käsittely ei vaikuta suoraan gMDSC rakenne ja toiminta perna.

B6 hiiret altistettiin B16F10lacZ kasvaimia, sai AdDCT rokotuksen jälkeen (päivä 7), ja sitten leikattiin, kuten edellä on kuvattu. Päivänä 8 hiiret tapettiin ja tehtiin pernan MDSC eristettiin laskentaa varten ja funktionaalisissa määrityksissä. Prosenttiosuus (a) granulosyyttistä MDSC, (b) monosyyttisiä MDSC ja (c) T sääntelyn soluja. Prosenttiosuus DCT-specific (d) IFNy

+ ja (e) TNFa

+ CD8

+ T-solujen valvonnan tai rokotetuista hiiristä reagoivat DCT

180-188 peptidi altistus 4 päivää kulttuuri ohjaus- tai kirurgisesti korosti MDSC. N = 4-6 /ryhmä. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001).

Keskustelu

Kirurginen resektio on tärkeä osa hoidon vahvimmista maligniteettien, mutta siitä huolimatta täydellinen resektio, monet potilaat satama MRD ja lopulta kuolevat toistumisen [28]. Cancer rokotteita sopivat parhaiten hävittämiseksi MRD [22, 23, 29], luodaan vahva perusta yhdistää kirurgian ja immunoterapiassa syövän kliinisissä kokeissa. Kuitenkin loogisesti suunniteltu kliininen tutkimus syövän rokotus on otettava huomioon vaikutus kirurgisen stressiä TAA-spesifisiä T-soluvasteita ja vastaavien mekanismien se.

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että ohimenevä, mutta