Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kohdunkaulan syöpä on suurin syy syöpään liittyvien kuolemien naisilla, erityisesti kehitysmaissa ja ihmisen papilloomavirus infektio yhdessä useiden vapautettiin signaalinvälitysreittien sotkuiset kohdunkaulan syövän synnyn. TGF-β-signalointi myöhemmissä vaiheissa syövän tiedetään indusoivan epiteelisolujen ja mesenkymaalitransitioon edistää kasvaimen kasvua. Phytochemicals, curcumin ja emodin, ovat tehokkaita chemopreventive ja kemoterapia-yhdisteitä vastaan ​​useita syöpiä, kuten kohdunkaulan syöpää. Päätavoitteena Tämän työn tavoitteena oli tutkia vaikutusta curcumin ja emodin on TGF-β signalointireittiä ja sen toiminnallinen merkitys kasvun, siirtolaisuuden ja invaasio kahdessa kohdunkaulan syövän solulinjoista, SiHa ja HeLa. Koska TGF-β ja Wnt /β-kateniinin signalointireittien tiedetään rajat puhua, joilla on yhteisiä loppupään tavoitteet, olemme analysoineet vaikutuksia TGF-β on β-kateniinin (tärkeä toimija Wnt /β-kateniinin signalointi) ja tutkitaan, curcumin ja emodin moduloida niitä. Havaitsimme, että kurkuma ja emodiinia tehokkaasti alas säädellä TGF-β signalointireittiä vähentämällä TGF-β-reseptorin II, P-Smad3 ja Smad4, ja myös tasapainottaa kasvaimia vaikutuksia TGF-β estämällä TGF-β muuttoliikkeelle ja hyökkäys. Expression of loppupään efektoreja TGF-β signalointireitin, cyclinD1, p21 ja Pin1, estyi yhdessä säätelyä alaspäin avaimen mesenkymaalisten markkereita (Etana ja Slug) päälle curcumin ja emodin hoitoa. Curcumin ja emodin havaittiin myös synergistisesti estävät solujen väestö ja muuttoliike SiHa ja HeLa-soluissa. Lisäksi olemme havainneet, että TGF-β aktivoi Wnt /β-kateniinin signalointireitin HeLa-soluissa, ja curcumin ja emodin alas säädellä reitin estämällä β-kateniinin. Yhdessä tietomme antavat mekanistinen perusta käytöstä curcumin ja emodin hoidossa kohdunkaulan syövän.

Citation: Thacker PC, Karunagaran D (2015) Curcumin ja emodin vaimennussäätelevät TGF-β Signaling Pathway in ihmisen kohdunkaulan syövän solut. PLoS ONE 10 (3): e0120045. doi: 10,1371 /journal.pone.0120045

Academic Editor: Eric Asselin, University of Quebec Trois-Rivieres, Kanada

vastaanotettu: 30 lokakuu 2014; Hyväksytty: 2. helmikuuta 2015 Julkaistu 18 maaliskuuta 2015

Copyright: © 2015 Thacker, Karunagaran. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdunkaulan syöpä on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat naista maailmassa ja yli 85% kohdunkaulasyöpätapauksista ja kuolemista tapahtuu kehitysmaissa, joista Intia on raportoitu osuus 27% koko kohdunkaulan syöpäkuolemista [1]. Taustalla mekanismi edistää kohdunkaulan kasvaimen kehittymisen on monimutkainen ja sisältää sääntelyn keskeisten signalointireittien lisäksi merkittävä rooli HPV (ihmisen papilloomavirus) infektio [2]. TGF-β signalointireitin on sekaantunut monimutkaisia ​​soluprosessien säätelevät kehitystä, erilaistumista ja homeostaasin [3]. TGF-β ligandi sitoutuu TGF-β-reseptorin II, aktivoimalla TGF-β-reseptorin I transphosphorylation, joka puolestaan ​​aktivoi R-Smad: ien (Smad2 ja Smad3) kautta fosforylaation niiden C-terminaalisten tähteiden kanssa. Aktivoitu R-Smad: ien muodostamiseksi heterocomplex jossa Smad4 ja tumaan, jossa ne aktivoivat TGF-β reagoivien geenien [4]. Alkuvaiheessa tumorigeneesin, TGF-β signalointireitin toimii tuumorisuppressorina etenemisen estämiseksi solusyklin läpi G

1 vaihe, jonka alaspäin säätely CyclinD1 ja sykliini riippuvaisen kinaasin (CDK) proteiineja ja induktio p15

INK4B, p16

INK4a, jotka estävät CDK4 ja CDK6; Samoin p21

Cip1or p27

Kip1appears täyttää toiminta p15

INK4B sen puuttuessa [5, 6]. TGF-β-välitteistä apoptoosia tiedetään lisäävän suhde ilmentymisen proapoptoottiset Bax ja anti-apoptoottisten Bcl-2-proteiinien [7]. Kuitenkin pitkälle edennyt syöpä, TGF-β-signalointia myös osoitettu edistävän invasiivisuus ja etäpesäkkeiden indusoimalla ekspressio Snail ja muiden transkriptiotekijöiden mikä aiheuttaa erilaistumista epiteelin ja mesenkymaalisten fenotyyppiin [8]. Slug ja N-kadheriinin, tunnettu pelaajat EMT, aiheuttama TGF-β osallistuvat maahanmuutto- ja invaasiota [9], ja TGF-β-välitteisen induktion N-kadheriinin sisältyy Pin1 (peptidyyli-prolyyli cis /trans-isomeraasi), tunnetut tärkeä rooli TGF-β-aiheuttama muuttoliike ja invaasion syöpäsolujen [10]. TGF-β on myös osoitettu stimuloivan cyclinD1 ilmentymistä ainakin osittain aktivoimalla Wnt /β-kateniinin signalointi [11]. Wnt /β-kateniinin signalointi tiedetään säätelevän monenlaisia ​​solun prosesseja, jotka säätelevät kyky monitoiminen β-kateniinin proteiinin aktivoida geenien transkriptiota liittyi solun tarttumiseen, proliferaatiota, erilaistumista, ja muut signaalinvälitysreittien [12]. Vapauttaminen Wnt /β-kateniinin signaloinnin tiedetään vaikuttavan karsinogeneesin, ja muutokset Wnt /β-kateniinin signalointireitin on esitetty kohdun neoplasiaa [13]. Wnt ligandi sitoutuu transmembraanisen frizzled-reseptoreihin, stabilointi- β-kateniinin inhiboimalla ja glykogeenisyntaasikinaasi 3 β (GSK-3 β), joka liittyy multimeerinen syöttämällä monimutkainen koostuu ak- siini, adenomatoo- polyposis coli (APC) ja kaseiinikinaasi 1α (CK1α), jossa CK1α ja GSK-3β fosfory- β-kateniinin peräkkäin, merkintä sen ubikinaation ja proteasomaalisten hajoamista. Vastauksena aktivoida Wnt /β-kateniinin signalointia, GSK-3 β estyy epäsiisti proteiineja, jolloin, β-kateniinin kertyy sytoplasmaan ja translokoituu tumaan. Tumassa, β-kateniinin yhdessä T-solujen tekijä /lymfosyytti tehostajana tekijä (TCF /Lef) perhe- ja muut transkription kofaktoreita, aktivoi eri kohdegeenien kuten c-myc ja sykliini D1 [14]. Lähentyminen TGF-β ja Wnt /β-kateniinin signalointi edistää epiteelin ja mesenkymaalitransitioon indusoimalla ilmaus Snail ja Slug [15]. On selvästi lisääntynyt TGF-β-mRNA ja proteiini ihmisen syövissä ja korkea TGF-β korreloi myöhemmissä vaiheissa maligniteetti ja laski eloonjääminen [16]. Kohdunkaulan syövän solujen tiedetään erittävän TGF-β [17], joka pystyy kasvattamalla kasvaimeen strooman ja vähentää kasvaimen infiltraatti, parantaa kasvaimen kasvu ja etäpesäkkeiden samalla kiertää isännän immuunijärjestelmän [18]. Keskeistä asemaa TGF-β edistämisessä kasvainprogression viittaa siihen, että signalointi reitti voi olla hyvä kohde syövän hoidossa [16]. Nykyinen hoitovaihtoehdot kohdunkaulansyövän kuten sädehoito, kirurgian ja kemoterapia, erityisesti kehitysmaissa, on rajansa lähinnä epäkäytettävyyden hoitomodaliteetti, kustannukset, vakavuus sivuvaikutuksia, suuri systeeminen myrkyllisyys ja lääkeresistenssin, ja usein kehittämiseen hedelmättömyyden jälkeisen hoidon [19]. Lisäksi lisättäessä vastustuskykyä kemoterapiaa syntymässä pois vapauttamisen signa- on suuri haaste kohti tehokasta hoitoa, ja TGF-β signalointi on yksi signalointireittien tiedetään aiheuttavan kemoterapian resistenssin indusoimalla EMT [20]. Chemopreventive phytochemicals kohdistaa eri solunsisäisen signalointikaskadien estämään kasvaimen edistämisen, leviämisen ja etenemiseen [21]. Curcumin, polyfenolin johdettu

Curcuma longa

ja emodin, joka on antrakinonin läsnä juuret ja haukkuu useiden lääkekasveja uskotaan toimivan säätelemällä vapautuneilla signalointireittejä neoplastisissa soluissa [22, 23]. Kurkumiinia tiedetään indusoivan apoptoosia ja estää etenemistä kohdunkaulan syövän [24-26], ja emodiini on myös osoitettu aiheuttavan apoptoosia kohdunkaulan syövän soluihin [27, 28]. Kurkumiinia tiedetään estävän TGF-β-signalointi rinta- ja haiman syövät [29, 30], kun emodin tiedetään differentiaalisesti säädellä TGF-β-signalointi yhteydessä riippuvaisella tavalla [31, 32], mutta vaikutus näiden fytokemikaaleja on TGF -β signalointia kohdunkaulan syöpäsoluja jää tutkittavaksi.

Näin ollen päätavoitteena oli tutkia vaikutusta curcumin ja emodin on TGF-β signalointireittiä ja sen toiminnallinen merkitys kasvun ja maahanmuuttoon kaksi kohdunkaulan syövän solulinjat, SiHa ja HeLa. Lisäksi oli kiinnostavaa tutkia, jos yhdistetty vaikutus näiden yhdisteiden ollut synergistisiä tai additiivisia vaikutuksia. Havaitsimme, että kurkuma ja emodin alas säädellä TGF-β signalointireitin SiHa- ja HeLa-soluissa, ja myös tasapainottaa kasvaimia vaikutuksia TGF-β estämällä TGF-β-aiheuttama muuttoliike ja invaasion näiden solujen. Lisäksi, yhdistelmä kurkumiinin ja emodiinia synergistisesti inhiboi solujen elinkelpoisuuden SiHa- ja HeLa-soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit

Curcumin, emodiini, 5, 5 ’, 6 , 6’-tetrakloori-1, 1 ’, 3, 3’-tetraethylbenzimidazol-carbocyanine jodidia (JC-1) hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). 10 mM liuosta kutakin yhdistettä (kurkuma tai emodiini) valmistettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), tallennetaan pienissä erissä -20 ° C: ssa, ja sitten se laimennettiin edelleen soluviljelyelatusainetta tarpeen. DMSO: ta (0,4%) käytettiin ajoneuvon ohjaus Kaikissa kokeissa. Ihmisen TGF-β1was ostettu Peprotech (USA). Geltrex, Propidiumjodidia, Lipofectamine 2000, Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), naudan sikiön seerumia (FBS Etelä-Amerikan alkuperää) ostettiin GIBCO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Polyeteeni-imiini (PEI) hankittiin Polysciences (Warrington, PA, USA). Polyvinylideenifluoridi kalvo ja Enhanced kemiluminesenssin pakki saatiin Biorad (Hercules, CA, USA). Proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorin cocktail ostettiin Sigma (St. Louis, MO, USA). β-aktiini-vasta-aine hankittiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), ja vasta-aineita TGF-β-reseptorin I, TGF-β-reseptorin II, Smad4, N-kadheriinin, Pin1, β-kateniinin, GSK3p: n ja P- GSK3p (ser9) saatiin Santa Cruz (CA, USA). Vasta-aineita P-Smad2, Smad2, P-Smad3, Smad3, Snail, CyclinD1, Slug, Bax, Bcl-2 ja p15, p16, p21, p27 olivat Cell Signaling (Danvers, MA, USA) ja piparjuuriperoksidaasi konjugoitu sekundaarinen vasta-aine hankittiin Jackson Immuno- Inc. (USA).

Soluviljely

Ihmisen kohdunkaulan syövän solulinjat, HeLa ja SiHa, saatiin National Center for Cell Sciences (NCC) Pune, Intia . Ne viljeltiin täydellisessä Dulbeccon Modified Eagle Medium (cDMEM), joka koostuu DMEM streptomysiiniä (100 ug /ml), penisilliiniä (100 U /ml) ja 10% FBS: ää. Soluja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37

0C 5% CO

2.

Resatsuriini vähentäminen määritys

analyysi sytotoksisuuden määritettiin Resatsuriini vähentäminen määritys [33]. Solut siirrostettiin 96-kuoppaiset levyyn tiheyteen 5000 kuoppaa kohti ja kasvatettiin yön yli. Sitten soluja käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla kurkumiinin ja emodiinia kanssa tai ilman 5 ng /ml TGF-β in cDMEM 48 tuntia. Resatsuriiniväriä lisättiin edelleen median lopulliseen pitoisuuteen 0,1 mg /ml, inkuboitiin 3 h vähentämiseksi sinisen väriaineen resatsuriinia vaaleanpunainen resorufiini ja absorbanssi mitattiin 570 ja 595nm. Aineisto analysoitiin prosentteina vertailusta, jossa kontrollina kuoppia käsiteltiin yhtä suuret määrät DMSO: ta yksinään. Analysoitua tietoa edustava prosentuaalinen solujen populaatio, piirrettiin keskiarvo ± keskivirhettä (SEM). IC

50 saatiin määrittämällä pitoisuus yhdisteiden tuloksena 50%: n inhibition solupopulaation 48 tunnin kuluttua hoidon käyttämällä GraphPad PRISM ohjelmistoa (GraphPad Software, Inc.).

JC-1 värjäystä

JC-1 (5,5 ’, 6,6′-tetrakloori-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodidi) on lipofiilinen fluoresoiva kationinen väriaine, jota käytetään arvioimaan mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨm) in soluihin [34]. Ehjä ΔΨm osoittaa negatiivinen varaus, jonka avulla JC-1 väriaine päästä mitokondrioiden matriisi, jossa se kerääntyy muodostaen aggregaatteja, jotka fluoresoivat punaista vaikka mitokondrion kalvon romahtaa apoptoottisten solujen ja siten JC-1 voi kerääntyä mitokondrioissa näiden solujen, jossa se jää sytoplasmaan monomeerinen muoto että fluoresoivat vihreinä. Lasku suhteessa punaisesta vihreään väriaineen fluoresenssin on osoitus laski ΔΨm soluja. Käsittelyn jälkeen kurkumiinin ja emodiinia in läsnä ollessa tai ilman TGF-β: ssa 48 h, JC-1, joka sisältää elatusainetta (lopullinen JC-1 pitoisuus -5 ug /ml) lisättiin soluihin, minkä jälkeen inkuboidaan 20 minuuttia 37 ° C. Tämän jälkeen solut pestiin kerran PBS: llä, ja fluoresenssi mitattiin virityksellä: 485; päästöt: 535 monomeerin muodossa (vihreä fluoresenssi) ja heräte 550; päästöt 600 aggregaattien (punainen fluoresenssi), käyttäen Perkin Elmer Enspire monilevy lukija. Suhde punaisesta vihreäksi fluoresenssi analysoitiin ja piirretään asianmukaista hoitoa olosuhteissa.

Haavan paranemista määritys

Muutokset solujen kulkeutumista käsittelemällä tutkittiin käyttäen haavan paranemista määritystä. Soluja kasvatettiin kuten yksikerroksinen on 48 kuoppalevyllä ja 100% konfluenssiin; naarmu tehtiin yksikerroksista. Solut pestiin varovasti ja käsiteltiin kurkumiinin ja emodin in läsnä ollessa tai ilman TGF-β ja pidettiin seerumivapaassa väliaineessa. Cell kulkeutuminen haavan pintaan seurattiin mikroskoopilla. Kuvia naarmu otettiin 4X suurennus heti lisäämisen jälkeen emodiinia ja 48 tunnin kuluttua. Laajuus muuttoliikkeen kussakin näytteessä mitattiin peittämän alueen solut 48h käyttäen Tscratch analyysin ohjelmisto [35] ja ilmaistiin prosentteina kontrollista.

Matrigel invaasiomääritys

Kohdunkaulan syöpäsolun invaasio arvioitiin Boyden määrityksen käyttämällä transwell kammiot (8 um huokoskoko, Costar, MA, USA). Chambers päällystettiin 100 ul matrigeelin ja inkuboitiin yön yli. Seerumin puutteessa SiHa (25000) ja HeLa (50000) soluja siirrostettiin yläkammiot Matrigel-päällystettyihin kuoppiin (BD Biosciences, San Diego, CA, USA), joka sisälsi 100 ui DMEM plus haluttu hoito. Curcumin tai emodiini sisältävät DMEM kanssa tai ilman TGF-β, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, pantiin alakammioissa, ja solujen annettiin kulkeutua suodattimen läpi 48 tuntia. Solut, jotka siirto epäonnistui poistettiin yläpinnan kammioiden kaapimalla pumpulipuikolla. Solut, jotka otettu onnistuneesti läpi matrigeelin ja kalvo este alempaan kalvoon kiinnitettiin 100% metanolia ja värjättiin 2% kristalliviolettia. Kuvia värjättyä soluja jää 10x suurennuksella. Laajuus invaasion ilmaistiin prosentteina kontrolli päätellä absorbanssi kristalliviolettia vapautetaan hajottamalla solut 10%: isessa etikkahapossa 595nm.

Solusyklianalyysiä

propidiumjodidilla värjäys ja virtaus cytometry arviointiin käytettiin solusyklin jakautumisen profiilin. Käsitellyt solut pestiin PBS: llä EDTA: lla ja sitten kerättiin käyttäen 0,25% trypsiini-EDTA ja suspendoitiin cDMEM. Sitten solut pestiin PBS: llä ja sentrifugoitiin 1200 rpm 4 ° C: ssa 5 min ja suspendoitiin uudelleen 300 ui PBS: ää, kiinnitettiin 0,7 ml 70% etanolia yön yli. Kiinnitetyt solut sentrifugoitiin, pestiin 0,1% FBS: ää, joka sisälsi PBS: ssä ja suspendoitiin sitten 300 ul: propidiumjodidilla (2 ug /ml), värjäysliuos RNaasi A: lla (200 ug /ml), pimeässä, inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunti. Tiedot 10,000 Solut kerättiin jokaisesta näytteestä. Tietojen hankinta ja analysointi suoritettiin virtaussytometrillä (Beckman Coulter solu lab Quanta).

SBE ja TOPFlash lusiferaasireportterista määritys

Solut (30000 /kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevyille ja co -transfected kanssa SBE4-Luc-reportterikonstrukti, joka sisältää neljä kopiota Smad sitoutumiskohdan (GTCTAGAC) kloonattiin PBV-Luc, joka osoittaa alavirtaan transkription TGF-β-signalointireitin (Addgene plasmidi 16495) [36] tai TOPFlash, lusiferaasia reportteri on β-kateniinin-välitteisen transkription aktivaation, 7 TCF /LEF sitoutumiskohdat ylävirtaan lusiferaasia (Addgene plasmidi 12456) [37] ja PRL-TK (renilla lusiferaasi) plasmidi käyttämällä PEI (ja SBE Luciferase konstrukti) ja lipofektamiini 2000 (ja TOPFlash lusiferaasi-konstrukti) mukaisesti valmistajan ohjeiden, seerumissa ja antibiootti DMEM: ää. Kuusi tuntia transfektion jälkeen elatusaine vaihdettiin ja soluja käsiteltiin kurkumiinin ja emodin in läsnä ollessa tai ilman TGF-β in cDMEM. 24 tunnin kuluttua solut hajotettiin ja tulikärpäsen ja renilla Lusiferaasiaktiivisuudet määritettiin [38].

Protein eristäminen ja Western blotting

Solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) 48 h käsittelyn jälkeen ja kokonaisproteiinin uutettiin kaapimisen jälkeen ja keräämällä solut radioimmuunimäärityk- presipitaatioanalyysissä (RIPA) lyysipuskuria [20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM natriumkloridia, 1 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa etikkahappoa, 1 mM β-glyserofosfaatti, 1% Triton X 100 , 2,5 mM natrium pyrofosfaatti, 1 mM natriumortovanadaatti, 0,5% natriumdeoksikolaattia, 1 mM metaani sulfonyylifluoridi, 20 mM natriumfluoridi, 1% proteaasinestäjä], inkuboitiin 1 h, ja sentrifugoitiin. Solun kokonaisproteiinista supernatantissa arvioitiin käyttämällä Bradfordin määritystä, ja 30 ug proteiinia ajettiin SDS-PAGE erottamisen jälkeen se siirretään kiinni polyvinylidenedifluoride kalvo. Kaivoa inkuboitiin primääristen vasta-aineiden TGF-β-reseptorin I, TGF-β-reseptorin II, P-Smad2, Smad2, P-Smad3, Smad3, Smad4, β-kateniinin, GSK3p, P-GSK3p (ser9), N-kadheriinin , Pin1, Snail, CyclinD1, Slug, Bax, Bcl-2, p15, p16, p21, p27, CDK6 (laimennus 1: 1000), tai β-Actin (1: 10000 laimennos) yön yli, jonka jälkeen inkuboitiin kanssa HRP- konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Proteiiniviivat tunnistettiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiolla kit ja visualisoidaan käyttämällä Versa Doc kuva-analyysi-järjestelmän (Bio-Rad).

Tilastollinen

Kaksi pyrstö parittomia opiskelijan T-testiä tai kaksi- tapa varianssianalyysi käytettiin tilastollisen analyysin käsittelemättömien ja käsiteltyjen näytteiden tai yleisesti. P-arvot 0,05, 0.01and 0,001 on merkitty ”*” ”**” ja ”***”, vastaavasti.

Tulokset

Curcumin ja emodin indusoida läsnä ollessa tai poissa ollessa TGF β ihmisen kohdunkaulan syövän solujen

Olemme testanneet vaikutuksia eri pitoisuuksia kurkumiinin ja emodiinia on elinkyvyt ihmisen kohdunkaulan syövän solujen ja IC

50-arvot lasketaan näistä tiedoista on lueteltu taulukossa 1. curcumin oli suhteellisesti enemmän sytotoksinen ihmisen kohdunkaulan syöpäsoluja analysoitu tässä tutkimuksessa (taulukko 1) ja sitä käytettiin 15 um SiHa- ja 25 uM HeLa-soluissa, kun taas emodin käytettiin 40 uM SiHa- ja HeLa-solut lisäkokeita varten. Koska eritystä TGF-β osaksi strooman on usein havaittu edennyt pitkälle kohdunkaulan syöpä [18], halusimme tutkia vaikutusta näiden yhdisteiden läsnä ollessa, TGF-β. Mukaisesti aikaisemmassa raportissa, 5 ng /ml TGF-β laski solupopulaation [39], ja se esti mitokondrion kalvon potentiaalia SiHa soluissa (Kuva. 1A ja C), kun taas HeLa-solut pysyivät muuttumattomina (Fig. 1 B ja D). Kurkumiinin ja emodin havaittiin merkittävästi estävän solun kasvua (Fig. 1A ja B), havaittuna resatsuriini väheneminen määrityksessä läsnäollessa sekä ilman TGF-β näissä soluissa. Lasku mitokondrion kalvon potentiaali (Fig. 1 C ja D) tuomat curcumin tai emodin analysoituna JC-1 väriaine fluorimetriaa oli merkittävä SiHa ja HeLa-soluissa. Kuitenkin tämä vaikutus oli riippumaton TGF-β HeLa, mutta ei ollut merkittävää läsnä TGF-β SiHa- soluissa (Fig. 1 C ja D). Nämä tulokset osoittavat, että vaikka TGF-β vähensi solujen kasvua ja mitokondrion kalvon potentiaalia SiHa, mutta ei HeLa-soluissa, se ei vaikuta kurkuma tai emodiini-välitteistä kasvun esto ja mitokondrion kalvon potentiaalia näissä soluissa.

SiHa (A) ja HeLa-soluissa (B) käsiteltiin 15 ja 25 uM curcumin, vastaavasti tai 40 uM emodin läsnä (TGF-β) tai puuttumisen (UT) ja 5 ng /ml TGF-β: ssa 48 h ja analysoitiin solujen elinkykyisyys by resatsuriini vähentäminen menetelmällä. Prosentuaalinen solujen elävyyden laskettiin normalisoimalla absorbanssi käsiteltyjen näytteiden vastaan ​​DMSO-kontrollin (n = 3, keskiarvo ± SEM). Curcumin tai emodiini käsiteltiin SiHa (C) ja HeLa (D) solujen läsnä ollessa (TGF-β) ja poissa ollessa (UT) TGF-β määritettiin JC-1, jossa käytetään Fluorimetristä menetelmää, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset esitettiin graafisesti kertainen muutos keskimääräisen fluoresenssin voimakkuus (MFI) suhteessa DMSO-kontrollin (n = 3, keskiarvo ± SEM).

Koska 5 ng /ml TGF-β ei ole merkittävää vaikutusta solujen elävyys tai mitokondrion kalvon potentiaalia HeLa-soluissa, onko erilainen pitoisuus TGF-β olisi samanlainen tai erilainen vastaus tutkittiin. Tässä suhteessa, HeLa-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla TGF-β ja sen vaikutus sen signaloinnin arvioitiin analysoimalla aktiivisuuden TGF-β-reagoiva SBE-Luc-reportterikonstrukti, read-out-määrityksessä. Havaittiin, että 2,5 ng /ml TGF-β merkittävästi indusoi SBE lusiferaasiaktiivisuus, mutta ei ollut merkittävää eroa Induktion laajuuden kasvaessa sen pitoisuus (Fig. 2A). Lisäksi, HeLa-solut, joita käsiteltiin eri pitoisuuksilla TGF-β in läsnä ollessa tai ilman kurkuma tai emodiinia arvioitiin muutoksia solujen elinkelpoisuuden ja mitokondrion kalvon potentiaalia. Eri pitoisuuksilla TGF-β ei ollut merkittävää vaikutusta solujen elinkykyä (Fig. 2B) tai mitokondrion kalvon potentiaali (Fig. 2C), ja se ei vaikuta inhibitiota solujen elinkykyä (Fig. 2B) tai mitokondrion kalvon potentiaali (Fig. 2C) by curcumin ja emodin näissä soluissa. Nämä tulokset osoittavat, että puute reagoida HeLa-solujen TGF-β kohti solujen elinkelpoisuutta ja mitokondrioiden kalvojännite pitoisuudesta riippumaton, ja myös TGF-β ei vaikuttanut kasvua inhiboivaa aktiivisuutta kurkuma tai emodiinia.

HeLa-solut (A) transfektoitu SBE tulikärpäsen lusiferaasi ja TK-Renilla lusiferaasi konstruktit käsiteltiin (6h tuntia transfektion) 2,5, 5, 10 ja 20 ng /ml TGF-β ja lusiferaasiaktiivisuus 24 jälkikäsittelyä. Transfektiotehokkuutta normalisoitui laskemalla suhteellinen suhde tulikärpäsen ja Renillan lusiferaasiaktiivisuudet ja tulokset esitettiin graafisesti kertainen muutos suhteessa käsittelemätön kontrolli. HeLa-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla TGF-β läsnä ja poissa ollessa kurkuma tai emodiinia ja määritettiin solujen elinkelpoisuus resatsuriini pelkistysmenetelmällä (B), ja mitokondrion kalvon potentiaalia analysoimalla JC-1-aktiivisuutta (C) käyttäen Fluorimetristä menetelmää sen jälkeen kun 48h kuvatulla Materiaalit ja menetelmät (n = 3, keskiarvo ± SEM).

Curcumin ja emodin estävät solujen kasvua, muuttoliikkeen ja invaasio läsnä ollessa tai poissa ollessa TGF-β SiHa- ja HeLa-soluissa

TGF-β tiedetään vaikuttavan proliferaatio ja migraatio aikana syövän syntymistä [40]. Huomasimme, että TGF-β aiheuttama G

0 /G

1 pidätys SiHa-, mutta ei HeLa-soluissa (kuvio. 3A) ja vaikutus curcumin ja emodin solusyklin profiilin näissä olosuhteissa analysoitiin edelleen. Curcumin aiheuttama G

2 /M pidätys SiHa- soluissa merkittävästi, kun taas emodin vaikutuksesta G

2 /M vaihe ei ollut tilastollisesti merkitsevä, vaikka pidätys oli näkyvissä (P-0,08). Läsnäolo TGF-β ei merkittävästi vaikuta curcumin vaikutuksesta; kun taas emodin välittämä osittainen G

2 /M pidätys havaittiin neutralisoituisivat TGF-β. Kuitenkin sekä curcumin ja emodin lisäsi sub G

0 /G

1 väestöstä (alustava apoptoosin), läsnä ollessa sekä ilman TGF-β merkittävästi HeLa-soluissa (kuvio. 3A). Lisäksi, kuten havaita haavan määrityksessä, TGF-β muuttoliikkeelle sekä SiHa- ja HeLa-solut ja kurkumiinin ja emodin havaittiin inhiboivan siirtymisen vaikka läsnä TGF-β (Fig. 3B ja C). Lisäksi invaasiomääritys käyttäen Matrigel päällystettyjä siirtokuoppaan insertit osoitti, että TGF-β aiheuttama invaasio sekä SiHa ja HeLa-solut ja curcumin ja emodin estämällä sekä pohjapinta sekä TGF-β aiheuttama invaasion näissä soluissa (kuvio. 4). Nämä tulokset viittaavat siihen, että kurkuma ja emodin aiheuttaa G

2 /M pidätyksen SiHa- ja apoptoosin HeLa-soluissa, vastaavasti. Ne estävät merkittävästi maahanmuutto- ja hyökkäys SiHa ja HeLa-solut ja pystyvät myös tasapainottaa TGF-β aiheuttaman muuttoliikkeen ja invaasion näissä soluissa.

SiHa- ja HeLa (A) Soluja käsiteltiin curcumin tai emodin läsnäollessa tai puuttuminen TGF-β: ssa 48 h, ja altistettiin solusyklin analyysi käyttäen virtaussytometriaa. Prosentuaalinen jakautuminen eri vaiheiden solusyklin on piirretty Y-akselilla vastaan ​​osoitetun hoidon olosuhteet X-akselilla. SiHa (B) ja HeLa (C) solut ympättiin yksisolukerroksena. 16h jälkeen kylvö, naarmu tehtiin mikro kärki, ja asianmukaista hoitoa annettiin seerumivapaassa väliaineessa. Naarmuuntunut pinta kuvioitiin klo 0h ja 48h hoidon jälkeen. Laajuus muuttoliikkeen kussakin näytteessä mitattiin peittämän alueen solut 48h käyttäen TScratch ohjelmistoja ja edustettuina prosentuaalinen muutos suhteessa DMSO-kontrollin (B) (n = 3, keskiarvo ± SEM).

SiHa (25000) ja HeLa (50000) solut ympättiin Boyden kammion päällystetty matrigeeliä, käsiteltiin curcumin, emodiinia ja /tai TGF-β: ssa 48 h. Jälkikäsittely, solut värjättiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät, ja kuvattiin käyttäen mikroskooppia (A). Kvantifiointi tunkeutuneet solujen (B ja C), tehtiin lukemalla absorbanssi kristallivioletilla 595nm. Prosenttiosuus invaasio laskettiin kertaluokkamuutos suhteen käsittelemätön kontrolli (n = 3, keskiarvo ± SEM)

Curcumin ja emodin estävät TGF-β signalointireittiä SiHa- ja HeLa-soluissa

tutkimaan, ovatko nämä yhdisteet estäisivät TGF-β signalointi, TGF-β aiheuttama SBE lusiferaasiaktiivisuuden SiHa ja HeLa-soluissa analysoitiin ja havaittiin estyä sekä curcumin ja emodin (Fig. 5A ja B). Ymmärtää, jos TGF-β signalointi on estetty vaikuttamalla ilmaus sen reseptorien, tutkittiin vaikutusta näiden yhdisteiden TGF-β-reseptorin proteiineja. Kuten havaitaan Western blottauksella, niin SiHa ja HeLa-solut, curcumin ja emodin merkittävästi säädeltiin TGF-β-reseptorin II, kun taas TGF-β-reseptorin olin säädeltiin vain HeLa-soluissa, ja vähäisemmässä määrin (kuvio. 5C ja D). Vaikka sekä SiHa ja HeLa-soluista käyttäytyivät samalla tavalla, vaikutukset olivat syvällisiä HeLa-soluissa ja siten ne valittiin lisätutkimuksiin. Tässä suhteessa ilmentämiseen Smad proteiinien käsittelemällä näiden yhdisteiden läsnä ollessa ja ilman TGF-β analysoitiin western-blottauksella. TGF-β tiedetään merkittävästi aiheuttaa fosforylaation Smad2 ja Smad3 välillä 15min tunnin hoidon [41, 42], ja näin ollen fosforylaatiota Smad2 ja Smad3-proteiinit analysoitiin HeLa-soluissa esikäsitelty kurkumiinin ja emodiinia 48 tuntia, ja sitten käsiteltiin TGF-β: ssa 30 minuuttia. TGF-β indusoiman fosforylaation Smad2 ja Smad3 merkittävästi (Fig. 6A). Curcumin ja emodin estivät merkittävästi induktion fosforylaation Smad2 ja Smad3 HeLa-soluissa (kuvio. 6A). Edelleen, koska muutokset ilmaus alavirtaan tavoitteiden TGF-β sekä -efektiboksejamme liittyvät EMT yleensä noudattavat 24 72 [42], oli kiinnostavaa tutkia vaikutusta yhteistyössä hoitoon curcumin tai emodin TGF-β jälkeen 48h TGF-β hoidon keskeiset toimijat, alavirran tavoitteet sekä -efektiboksejamme TGF-β signalointireitin. 48 tunnin kohdalla inkuboinnin myös, TGF-β havaittiin indusoivan fosforylaation Smad2 /Smad3, ja ilmaus Smad4-proteiinin ja pohjapinta sekä TGF-β-indusoima on alas säätelevät kurkumiinin ja emodiini, kun koko Smad2 ja Smad3 ilme pysyi ennallaan (kuvio. 6B). Näin ollen on todettu, että kurkuma ja emodin alas säädellä TGF-β signalointireittiä alaspäin säätelemällä TGF-β-reseptorin II, P-Smad2, P-Smad3 ja Smad4.

SiHa (A) ja HeLa soluissa (B) transfektoitu SBE tulikärpäsen lusiferaasi ja TK-Renilla lusiferaasi-rakenteet ja käsiteltiin kurkumiinin ja emodin in läsnä ollessa tai ilman TGF-β, määritettiin lusiferaasiaktiivisuus. Transfektiotehokkuutta normalisoitui laskemalla suhteellinen suhde tulikärpäsen ja Renillan lusiferaasiaktiivisuudet ja tulokset esitettiin graafisesti kertainen muutos suhteessa käsittelemätön kontrolli. Edustava koe esitetään, toinen erillisellä kokeella tulokset olivat samanlaiset. Kokosoluliuotteista ja SiHa (C) ja HeLa (D) käsiteltyjen solujen kurkuma tai emodiini in läsnä ollessa tai ilman TGF-β: ssa 48 h ja alistettiin immunoblottauksella TGF-β-reseptorin I (TGFRI), TGF-β-reseptorin II ( TGFRII) tai β-Actin (latauskontrollina) vasta-aineita. Edustava blot näkyy ja arvot edustavat densitometristä analyysi Proteiinijuovan suhteen p-Actin ja samanlaiset tulokset vahvistettiin toisessa erillisellä kokeella.

kokosoluliuotteista HeLa-solujen esikäsitelty curcumin ja emodiinia 48 tuntia, ja sitä käsiteltiin TGF-β: ssa 30 minuuttia suoritettiin immunoblottauksella P-Smad2 ja P-Smad3-proteiinit (A). Kokosolulysaattia HeLa-solujen käsiteltiin curcumin tai emodiini, läsnä ollessa tai poissa ollessa TGF-β: ssa 48 h saatettiin immunoblottaus P-Smad2, P-Smad3, Smad2, Smad3, Smad4 ja β-Actin (kuormituksen valvonta) vasta-aineita ( B). Edustava blot näkyy ja arvot edustavat densitometristä analyysi Proteiinijuovan suhteen p-Actin ja samanlaiset tulokset vahvistettiin toisessa erillisellä kokeella.

Curcumin ja emodin vaikuttaa loppupään pelaajia sekä -efektiboksejamme TGF-β-signalointireitin

Smad-transkriptiotekijän kompleksien tiedetään säätelevän CDK6 inhibiittorin p21: [5]. Havaitsimme, että ilmentyminen p21 ja CyclinD1 havaittiin indusoituvan TGF-β, mutta alas säädellään kurkumiinin ja emodin hoitoon (Fig. 7A). TGF-β-muuttoliikkeelle edistävät Pin1 [10] ja odotetusti, Kurkumiini ja emodin sääteli Pin1 merkittävästi (Fig. 7A). Huomasimme, että kurkuma ja emodin merkittävästi alas säädellä ilmentymistä p15, p16, CDK6, p27 vaikka curcumin voinut estää p16: n läsnä ollessa TGF-β (Fig. 7B). Bax ja Bcl-2 suhde viittaa alttiuteen solujen solukuolemaan [43], ja se on jopa säännelty kun kurkuma ja emodin hoito (Fig. 7C).