Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Lisääntyvät NF-KB ovat tunnusmerkkejä haiman adenokarsinooma (PDAC) ja sekä klassista ja vaihtoehtoisia NF-KB: n aktivoitumisen reittejä ovat sekaantuneet.

Menetelmät /Principal havainnot

Tässä osoitamme, että aktivointi vaihtoehtoisen reitin on lähde suuren pohjapinta NF-KB aktiivisuuden PDAC solulinjoissa. Lisääntynyt aktiivisuus p52 /RelB NF-KB kompleksi välittyy vakauttaminen ja NF-KB: tä indusoiva kinaasi (NIK). Tunnistamme proteasomaalisten downregulation TNF-reseptoriin liittyvän tekijän 2 (TRAF2), kuten mekanismi, jolla tasoja aktiivista NIK lisääntyvät PDAC solulinjoissa. Tällaiset voimistumista NIK ilmaisun ja toiminnan tason releet lisääntyneeseen lisääntymistä ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua, mutta ei siirtämisestä tai eloonjäämistä PDAC soluja.

Johtopäätökset /merkitys

Nopea kasvu on yksi ominaisuus haimasyöpä . Tuloksemme osoittavat, että TRAF2 /NIK /NF-κB2 reitin säätelee PDAC solu tuumorigeenisyyteen ja se voisi olla arvokas tavoite terapiassa tämän syövän.

Citation: Doppler H, Liou GY, Storz P (2013) alassäätely TRAF2 välittää NIK-aiheuttama Haimasyöpä Cell Proliferation ja kasvainten muodostumiseen. PLoS ONE 8 (1): e53676. doi: 10,1371 /journal.pone.0053676

Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 26 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 3. joulukuuta 2012 Julkaistu: 03 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Doppler et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta AACR (20-08-25-STOR), National Institutes of Health myöntää CA135102, CA140182 ja P50CA102701 (Mayo Clinic SPORE in Haimasyöpä). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

transkriptiotekijät NF-KB (Nukleaaritekijä κ-kevyen ketjun-tehostajana aktivoitujen B-solujen) perheen yläreguloituja monissa ihmisen syövissä [1]. NF-KB on rooleja kaikki tunnusmerkit syövän tai syövän etenemisen, mukaan lukien suoja solukuolemaa, kasvua soluproliferaatiota, solun liikkuvuus ja etäpesäkkeiden, kasvaimen tulehduksen ja angiogeneesin [1]. Lisäksi kasvainsolut usein resistenteiksi syöpälääkkeiden (chemoresistance) säätelemällä NF-KB: n signaloinnin [2].

NF-KB-transkriptiotekijän kompleksit muodostetaan homo- tai heterodimeerejä alayksikön p65 (RelA) , RelB, c-Rel, p50 tai p52 [3]. RelA /p50 dimeerejä edustavat klassista (kanoninen) NF-κB1 ja RelB /p52 dimeerit vaihtoehto (ei-kanoninen) NF-κB2 kompleksi [4]. Sekä toissijaisesti ja klassisen NF-KB: n aktivaation reittejä tukeutua IKB-kinaasi (IKK) kompleksi, joka koostuu IKKα, IKKβ ja NEMO /IKKγ. IKKβ ja NEMO /IKKγ välittävät aktivointi kanonisen NF-κB1 reitin, jossa IKKα ei ole olennaista merkitystä. Sen sijaan, aktivointi vaihtoehtoisten NF-κB2 reitti edellyttää IKKα, mutta ei IKKβ ja NEMO [5]. Se liittyy myös NF-KB: tä indusoiva kinaasi (NIK) suorana ylävirtaan kinaasin IKKα [4]. Kun aktivoitu NIK, IKKα indusoi käsittely NF-κB2 /P100 on p52.

Koska ärsyke, NIK hajoaa nopeasti ja tämä riippuu sen yhdessä TNF-reseptoriin liittyvän tekijän 3 (TRAF3) . Sitoutuminen TRAF3 rekrytoi NIK TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 ligaasia kompleksin [6], [7]. Cellular apoptoosi-inhibiittori proteiinien (cIAPs) ovat ubikitiini ligaasit, jotka voivat edistää ubikitinaation ja proteasomaalisten hajoaminen itse, samoin kuin niiden sitoutumispartnereihin TRAF2: een ja TRAF3 [8], [9]. Molemmat cIAPs myös välittävät K48-sidottu polyubiquitination NIK, jolloin sen proteasomaalisten hajoamiseen [7]. Stimuloiduissa soluissa (ts kun CD40-reseptoriin sitoutuminen), TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 /TRAF3 kompleksit rekrytoidaan reseptoriin ja TRAF2 indusoi ubikitinaatio ja hajoaminen TRAF3 [10]. Koska TRAF3 tasojen lasku, juuri syntetisoidun NIK on vakiintunut ja aktiivinen, sillä se ei enää voi olla vuorovaikutuksessa TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 kompleksi [6].

haiman adenokarsinooma syöpä (PDAC), NF-KB tasot ovat lisääntyi syöpäsolun linjat sekä potilaan näytteitä ja välittävät solujen lisääntymisen ja kestävyys kemoterapiaa [11], [12], [13]. Lisääntynyt NF-KB aktiivisuus PDAC johtuu sekä kanoninen ja vaihtoehtoisten aktivaatioteillä [14], [15]. Koska toistaiseksi ei geneettisiä muutoksia varten TRAFs, CIAP tai NIK kuvattiin tähän syöpään, mekanismeja, joilla vaihtoehtoisen reitin ylössäädellään ovat pitkälti tuntematonta PDAC.

Täällä näytämme, että PDAC solulinjoissa TRAF2-proteiinin tasot ovat vaimentua ja että tämä on mekanismi, jolla stabilointi NIK saavutetaan aiheuttaa aktivoinnin vaihtoehtoista NF-KB-reitin kautta. Olemme osoittavat lisäksi, että NIK-aktiivisuuden releet lisääntynyt solujen lisääntymistä ja kiinnittymisestä riippumattomaan kasvuun. Nopea kasvu on yksi tunnusmerkki haimasyövän ja meidän tiedot osoittavat, että TRAF2 /NIK /NF-κB2 reitti voi olla arvokas tavoite terapiassa tämän syövän.

Tulokset

NIK Expression ja toiminta lisääntyvät PDAC Cell Lines

Aktiivinen NIK yli-ilmennetään ihmisen näytteitä PDAC verrattuna normaaliin haiman kudosta (Fig. 1A). Tämä edistää meitä analysoimaan paneeli yhdeksän perustettu PDAC solulinjoissa sekä ihmisen haimatiehyen epiteelin (HDPE) solut, jotka toimi normaalisti ohjaus ilmentämiseen ja aktiivisuuden NIK. Useimmissa PDAC soluja linjat, jotka analysoitiin, NIK ekspressio lisääntyi verrattuna normaaliin HDPE-soluissa (kuvio. 1 B, yläpaneeli). Lisääntynyt ilmentyminen korreloi lisääntyneen aktiivisuuden määritettiin fosfo-spesifistä vasta-ainetta (anti-pT559-NIK), joka tunnistaa NIK fosforylaatiota sen aktivoitumisen silmukka (Fig. 1 B, keskimmäinen paneeli). Kaikkien PDAC solulinjoissa analysoitiin, vain kaksi, Capan2 ja HPAFII, eivät osoittaneet lisääntynyttä aktiivisuutta NIK. Käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR: llä, seuraavan kerran testata, jos kasvanut NIK-mRNA: n ilmentyminen saattaa olla syynä lisääntyneeseen proteiinin tasot. Vaikka me havaittu vaihtelut NIK mRNA: n ekspressio eri solulinjojen, selvä yhteys sen ekspression proteiinitasolla ei havaittu (kuvio. 1C). Tämä osoitti, että PDAC solulinjat kasvoivat NIK ilmaisua ei saavuteta lisääntynyt transkriptio vaan mekanismeilla, jotka stabiloivat proteiinin tasot.

V: Human kudosnäytteitä normaalin haiman ja PDAC olivat immunohistokemiallisesti-värjättiin yhteensä NIK ( anti-NIK) tai aktiivinen NIK (anti-pT599-NIK) ilmentymisen, tai altistetaan H lastaus valvonta). TRAF2 yli-ilmennetään HEK293-soluissa toimi ylimääräisenä molekyylipainon kontrolli. B: Näytteet mRNA näyttämän solulinjoja altistettiin kvantitatiivinen RT-PCR suunnattu TRAF2. Näytteet normalisoitiin GAPDH. C: Panc1 solut (5 x 10

5 solua, 6 cm astiat) kotransfektoitiin kanssa TRAF2 ja vektorisäädön tai HA-ubikitiinipromoottori. 24 tunnin kuluttua solut hajotettiin, TRAF2 immunosaostettiin (anti-TRAF2) ja analysoitiin immunoblottauksella varten ubikinaa- TRAF2 (anti-HA). Blotit uudelleen koestettiin TRAF2 (anti-TRAF2). D: Indikoitu solulinjoja käsiteltiin MG-132 (20 uM) 0, 4, 8, 16 tai 24 tuntia. Solut lyysattiin ja analysoitiin endogeenistä TRAF2 (anti-TRAF2) tai β-aktiini (anti-β-aktiini, kuormituksen valvonta. TRAF2 yli-ilmennetään HEK293-solut toimivat positiivisena kontrollina. E: Panc1 solut (5 x 10

5-solut, 6 cm: n maljoihin) transfektoitiin vektorisäätö tai TRAF2: n kuten on osoitettu. 24 tunnin kuluttua solujen lysaatit analysoitiin Western-blottauksella ilmentämiseen NIK (anti-NIK), yli-ilmentyy TRAF2 (anti-TRAF2) tai β-aktiini (anti -β-aktiini) kuin latauskontrollina.

NIK sovittelee Basal NF-KB Aktiivisuus PDAC Cell Lines

kun aktivoitu NIK voi aiheuttaa ei-kanoninen NF-KB-reitin, indusoimalla käsittelyn NF-κB2 /P100 on p52. kokosoluliuotteissa of PDAC solulinjojen, kohonneeseen p52 korreloi lisääntynyt NIK ilme ja toiminta osoittaa, että aktiivinen NIK on myös toiminnallinen (vertaa Fig. 3A ja Fig. 1 B) . Havaitsimme myös lisääntynyt ilmentymä RelB,

bona fide

sitova kumppani p52 toissijaisesti NF-KB-reitin, mikä osoittaa, että lisääntynyt NIK toiminta johtaa muodostumiseen RelB /p52 NF-KB-kompleksit. Itse asiassa sekä tämän kompleksin havaittiin ytimet PDAC solulinjojen (Fig. 3B) ja EMSA supermuutoksena analyysi osoitti, että molemmilla on DNA: ta sitovaa aktiivisuutta (Fig. 3C). Huomattavaa on, että tumauutteet sisälsi myös p65 ja p50 (Fig. S2). Käyttäen lusiferaasireportterigeenianalyysissä seuraavan kerran testata, jos NIK-välitteinen NF-κB2 releet lisääntymiseen perustason tasojen NF-KB: n. Kun Panc1 solut lentivirally infektoitu shRNA tai kaksi erityistä NIK-shRNA sekvenssit (NIK-shRNA1 ja NIK-shRNA2) ja transfektoidaan sitten NF-KB-lusiferaasi-geeni reportterin, havaitsimme merkittävää laskua NF-KB: n aktiivisuutta, kun NIK oli vaimentua ilmaisumuodoltaan (Fig. 3d). Sen sijaan, kun solut transfektoitiin aktiivinen alleelin NIK (NIK.T559D) pohjapinta NF-KB: n pitoisuudet olivat nousseet (Fig. 3E).

: Solulysaatit indikoitu solujen normalisoitiin 0,5 mg /ml ja sitten 20 ug altistettiin SDS-PAGE: lla. Näytteet siirrettiin nitroselluloosalle ja analysoitiin Western blot ilmentämiseen RelB (anti-RelB), p52 (anti-p52) tai β-aktiini (anti-β-aktiini, lastaus valvonta). B: Nuclear tiivisteet ja solulimafraktiot näyttämän solulinjojen analysoitiin Western blottauksella varten RelB ja p52 sekä lisäksi p65 ja p50 (ks Supplemental kuva S2). Immuunivärjäykseen nukleoliinin toimi markkerina tumaekstraktien. Hopeavärjäys lysaatit toimi loading ohjaus. C: Nuclear uutteiden Panc1 soluja inkuboitiin anti-RelB tai anti-p52-vasta-aineita, kuten mainitaan, ja alistetaan sitten sitoutuu DNA: han analyysin avulla EMSA. 100x leimaamatonta oligonukleotidia toimi spesifisyyskontrol-. D: Panc1 solut, jotka ilmentävät ohjaus (salattu) shRNA tai NIK-shRNA (kaksi erilaista sekvenssiä, NIK-shRNA1 tai NIK-shRNA2) ne transfektoitiin lisäksi NF-KB-lusiferaasi ja renilla lusiferaasi toimittajille. 16 tuntia transfektion jälkeen reportterigeenin lusiferaasin määritykset suoritettiin. Knockdown NIK säädeltiin RT-PCR-analyysillä. RT-PCR β-aktiini-mRNA toimi kontrollina. Tähdet osoittavat tilastollista merkittävyyttä. E: Panc1 solut transfektoitiin NF-KB-lusiferaasi ja renilla lusiferaasi toimittajat sekä vektorisäätö tai NIK.T599D mutantti, kuten on esitetty. 16 tuntia transfektion jälkeen reportterigeenin lusiferaasin määritykset suoritettiin. Solulysaatit analysoitiin ilmaistuna aktiivisen NIK käyttäen Western-blot ja vastaan ​​suunnattujen vasta-FLAG-merkitty NIK.T559D (anti-FLAG) tai β-aktiini (anti-β-aktiini) latauskontrollina. Tähti osoittaa tilastollista merkittävyyttä.

NIK on kriittinen Regulator transformoidun kasvu PDAC Solut

Seuraavaksi arvioimme vaatimus NIK PDAC transformoitu kasvua. Siksi meidän ensin Panc1 ja MiaPaca2 solulinjoja, jotka ekspressoivat stabiilisti joko NIK-shRNA tai ohjaus salattu shRNA. Sitten käytettiin näistä solulinjoista määrittää ankkurointi riippumatonta kasvua softagar pesäkemuodostusta määrityksiä. Pudotus NIK Panc1 ja MiaPaca2 solujen vähentynyt merkittävästi kiinnittymisestä riippumatonta kasvua, ja tämä korreloi NIK-proteiinin ekspressiotasot soluissa (Fig. 4A). Ektooppinen ilmentyminen konstitutiivisesti aktiivisen NIK alleelin kasvoi ankkurista riippumattomaan kasvuun ja pesäkkeiden muodostumista Panc1 soluissa (Fig. 4B). Samanlaisia ​​tuloksia solujen kasvuun saatiin edellä käänteisen genetiikan (Fig. 4C, ylärivi) tai kohdunulkoisen yliekspressio (Fig. 4C, alin rivi) lähestyy, kun Panc1 soluja kasvatettiin 3-ulotteinen (3D) soluviljelmässä Matrigel sijasta softagar. Tuloksemme osoittavat, että NIK on välttämätön ja riittävä välittävän tuumorigeenisia kasvun PDAC solulinjoissa.

V: Panc1 tai MiaPaca2 soluja (5 x 10

5 solua, 6 cm astiat) stabiilisti ilmentävät ohjaus (salattu) shRNA tai NIK-shRNA (kaksi erilaista sekvenssiä, NIK-shRNA1 tai NIK-shRNA2) tehtiin pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritykset. Pieni osa transfektoidut solut kerättiin ja analysoitiin NIK ilmentymisen käyttäen Western-blot-analyysi, ja vasta-aineita, jotka kohdistuvat NIK (anti-NIK) tai β-aktiini (anti-β-aktiini), kuten lastaus valvonta. Tähdet osoittavat tilastollista merkittävyyttä. Mittaviivat edustaa 1 mm. B: Panc1-solut (5 x 10

5-solut, 6 cm: n maljoihin) on lentivirally infektoitu viruksella tai viruksen ekspressiolle konstitutiivisesti aktiivisen NIK (NIK.T559D mutantti) ja alistettiin pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritykset. Ennen kylvö murto-solut hajotettiin ja analysoitiin ilmaistuna aktiivisen NIK käyttäen Western-blot ja vastaan ​​suunnattujen vasta-FLAG-merkitty NIK.T559D (anti-FLAG) tai β-aktiini (anti-β-aktiini) latauskontrollina. Tähti osoittaa tilastollista merkittävyyttä. Mittaviivat edustaa 1 mm. C: Panc1-solut (5 x 10

5-solut, 6 cm: n maljoihin), jotka ekspressoivat stabiilisti ohjaus (salattu) shRNA, NIK-shRNA1 tai NIK-shRNA2 (ylärivi), tai solujen lentivirally infektoitu viruksella tai NIK.T559D mutantti (alin rivi) ympättiin 3D Matrigel kulttuuriin. Päivinä 10 (shRNA solua) tai 14 (NIK.T559D ilmentävät solut) ymppäyksen jälkeen pesäkkeen kasvua analysoitiin ImagePro. Palkki edustaa 500 um.

TRAF2 /NIK Signaling Säätelee PDAC Cell Proliferation

Seuraavaksi testasimme jos NIK vaikuttaa lisääntymistä, liikkuvuuteen ja chemoresistance of PDAC soluja. Siksi käytetään myös Panc1 ja MiaPaca2, jotka ilmentävät NIK-shRNA tai valvontaa salattu shRNA ja suoritetaan reaaliaikaisesti lisääntymismäärityksissä ajanjakson ajan 30 tuntia. Vuonna Panc1 soluissa, knockdovvn NIK kahdella eri shRNA sekvenssit väheni huomattavasti solujen lisääntymistä 62 – /+ 1,1 prosenttia järjestyksessä 1 ja 51 – /+ 1 prosentin sekvenssi 2 suhteessa kontrolliin (100%) päätepisteessä analyysin. Vuonna MiaPaca2 soluissa, knockdovvn NIK laski solujen lisääntymistä 49 – /+ 0,7 prosenttia järjestyksessä 1 ja 63 – /+ 1,7 prosentin sekvenssi 2 päätepisteessä analyysi (Fig. 5A). Lisäksi, Panc1 ja MiaPaca2, jotka ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen NIK.T559D mutantti osoitti kasvanutta solujen 138 – /+ 3,7 prosenttia (Panc1) ja 166 – /+ 2,7 prosenttia (MiaPaca2) suhteessa kontrolliin (100%), on päätepisteen analyysi (kuvio. 5B). Emme havainneet lisääntynyttä herkkyyttä solujen kuoleman, kun solut transfektoitiin stabiilisti NIK-shRNA (ei esitetty). Lisäksi pudotus NIK ei herkistä PDAC solulinjat kemoterapeuttisia solukuolema. Tämän testaamiseksi me verrattuna solulinjoja niiden reagoida Gemcitabine- ja 5-fluorourasiili (5-FU) (Fig. S3). Kuitenkin verrattuna käsittelemättömään valvontaan, pudotus solulinjat osoittivat laski signaalin MTT, johtuen niiden vähentynyt potentiaali lisääntyä. Lopuksi testasimme jos mahdollinen siirtää tai hyökätä on muuttaa NIK ilmaisu, mutta ei havaittu huomattavia eroja solumigraatio tai invaasion soluissa köyhdytetyn peräisin NIK tai soluista yliekspressoivat aktiivinen NIK (Fig. S4). Tämä osoittaa, että pohjapinta aktiivisuuden NIK PDAC soluissa yksinomaan vaikuttaa lisääntymistä.

V: Panc1 tai MiaPaca2 soluja (5 x 10

5 solua, 6cm malja) stabiilisti ilmentävät ohjaus (muokkaamalla) shRNA tai NIK-shRNA (kaksi eri sekvenssit, NIK-shRNA1 tai NIK-shRNA2) ympättiin E-levyille ja kiinnityksen jälkeen solujen lisääntymistä tarkkailtiin jatkuvasti reaaliaikaisesti varten osoitti kertaa käyttäen xCELLigence RTCA DP väline. Virhepalkit (harmaa) edustavat kolmea koetta. Tarkastusmääritystä naistaintumisprosenttia NIK molempien solulinjojen on esitetty kuviossa 4A. B: Panc1 tai MiaPaca2 soluja (5 x 10

5-solut, 6 cm: n maljoihin) on lentivirally infektoitu viruksella tai viruksen ekspressiolle konstitutiivisesti aktiivisen NIK (NIK.T559D mutantti). Seuraavana päivänä media muutettiin ja 48 tunnin kuluttua solut ympättiin E-levyt ja kiinnityksen jälkeen proliferaatiota seurataan jatkuvasti reaaliajassa osoitti kertaa käyttäen xCELLigence RTCA DP väline. Virhepalkit (harmaa) edustavat kolmea koetta. Pieni osa transfektoidut solut lyysattiin ja analysoitiin ilmaistuna aktiivisen NIK käyttäen Western-blot ja vastaan ​​suunnattujen vasta-FLAG-merkitty NIK.T559D (anti-FLAG) tai β-aktiini (anti-β-aktiini) latauskontrollina (esitetty MiaPaca2). Ohjaus blotit, että Panc-1-solulinjassa, on esitetty kuviossa. 4B.

Koska edellisessä tiedot osoittavat, että NIK vakautta ja aktiivisuus PDAC solulinjoissa saavutetaan proteasomaalisten downregulation TRAF2, seuraavan kerran testata, jos uudelleen ilmentymisen TRAF2 voivat vähentää solujen lisääntymistä. Ektooppinen ilmentyminen TRAF2 vähentynyt soluproliferaatiota Panc1, MiaPaca2 ja BxPC3 soluja. Riippuvainen solulinja, soluproliferaatiota laskettiin 68 – /+ 1 prosenttia (Panc1), 82 – /+ 1 prosenttia (MiaPaca2), tai 48 – /+ 0,5 prosenttia (BxPC3) päätepisteessä analyysi (30 tuntia) . Lopulta testasimme jos aktivointi vaihtoehtoisten NF-κB2 reitin voi välittää solujen lisääntymistä normaalien haimatiehyen soluissa. Siksi meidän tartunnan normaalit HDPE soluissa NF-κB2 /P100 ja analysoitiin lisääntymistä reaaliaikainen mittaus. Sen jälkeen ilmaus NF-κB2 /P100, havaitsimme sen aktiivinen tuote p52 in HDPE soluissa korreloi hieman lisääntynyt solujen lisääntymistä 107 – /+ 1,2 prosenttia suhteessa kontrolliin (100%) päätepisteessä analyysi (Fig. 6D) .

A-C: ilmoitettu solulinjoilla (5 x 10

5 solua, 6 cm astiat) infektoitiin valvontaa tai TRAF2 adenovirus. 48 tunnin kuluttua solut ympättiin E-levyt ja kiinnityksen jälkeen solujen lisääntymistä tarkkailtiin jatkuvasti reaaliajassa 30 tuntia käyttäen xCELLigence RTCA DP väline. Virhepalkit (harmaa) edustavat kolmea koetta. Pieni osa transfektoidut solut hajotettiin ja analysoitiin Western blot TRAF2: n tai β-aktiini (kuormituksen valvonta). D: HDPE-solut (5 x 10

5 solua, 6 cm astiat) infektoitiin ohjaus tai NF-κB2 /P100 adenovirus. 48 tunnin kuluttua solut ympättiin E-levyt ja kiinnityksen jälkeen solujen lisääntymistä tarkkailtiin jatkuvasti reaaliajassa 20 tuntia käyttäen xCELLigence RTCA DP väline. Virhepalkit (harmaa) edustavat kolmea koetta. Pieni osa transfektoidut solut hajotettiin ja analysoitiin Western blot jalostettuja, aktiivinen NF-κB2 käyttämällä vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja p52 (anti-p52) tai β-aktiini (anti-β-aktiini) latauskontrollina.

korrelaatio

in vitro

tiedot, joiden kliiniset tiedot

Seuraavaksi määritetään, onko samanlainen käänteinen korrelaatio NIK ilmaisun ja toimintaa sekä TRAF2 downregulation esiintyy ihmisen näytteitä haiman adenokarsinooma. Out of 55 ihmisen PDAC analysoidut näytteet, 69% osoitti vähentynyt TRAF2 ilmaisua korreloivat lisääntynyt NIK tasot ja lisääntynyt NIK aktiivisuutta (Fig. 7A, näytteet # 58, # 27 ja # 44 punainen reunus ja Fig. 7B alkuun ympyrädiagrammina punainen alue) . Kuitenkin 18% näytteistä osoitti säätelyä TRAF2 ja NIK tasolla, mutta vähän tai ei ollenkaan NIK aktiivisuutta (Fig. 7A, näyte # 30 ja Fig. 7B ympyrädiagrammina vihreä alue). Muita 13% kaikista näytteistä osoitti säätelyä kaikkien kolmen molekyylin (Fig. 7A, näyte # 35 ja Fig. 7B ympyrädiagrammina sininen alue). Ei korrelaatio TRAF2 /NIK tasot joko ikä, sukupuoli, vaihe kasvaimen tai TNM tilassa havaittiin kuitenkin oli korrelaatio kasvaimen ja TRAF2 /NIK tasoilla. No eriytetty kasvaimet Asteen 1 osoitti joko korkea TRAF 2 ja NIK ja matalan pT559-NIK tasoja, tai oli kaikki kolme voimistunut. Kasvaimet tämän luokan näyttävät normaalia ja eivät kasva nopeasti. Sen sijaan yli 70% luokan 2 kasvaimet (kohtalaisen eriytetty) ja yli 80% luokan 3 kasvaimet (huonosti eriytetty) osoitti downregulation TRAF2 korreloivat lisääntynyt NIK tasoa ja aktiivisuutta. Kasvain solut näistä laadut näyttävät epänormaalia ja taipumus kasvaa ja levitä aggressiivisemmin, korreloi meidän

in vitro

tietoja, jotka osoittavat, että edellä kuvattu TRAF2 /NIK signalointi mekanismi voi välittää haimasyöpäkasvainsolulinjo- lisääntymistä.

V: Tissue mikrosiruja (TMA), joka sisältää 10 normaalin haiman kudosnäytteistä ja 55 haimatiehyen adenocarinoma oli H p52 /RelB). Tämä välittää solujen lisääntymisen ja kiinnittymisestä riippumattoman kasvun (kuviot. 4, 5, 6), jotka kaikki tunnusmerkit haimasyöpä. Tuloksemme tukevat edeltävä työ Schneider et al., Joka osoittaa, että p52 /RelB NF-KB kompleksi voidaan säädellä G1 S-vaiheen etenemisen PDAC solulinjoissa [18].

Monissa syöpien NF -κB aktivaatio pahanlaatuisten solujen tapahtuu vastineena tulehdusta edistävien sytokiinien [19]. Esimerkiksi, TNFa-indusoidun aktivoitumisen kanoninen NF-KB-reitin on liitetty, kuten potentiaalinen syy lisätä chemoresistance [2]. Kuitenkin on olemassa esimerkkejä syövistä, jossa stabilointi NIK ja tuloksena NF-KB: n on saavutettu luontainen mutaatioita. Noin 20% multippelin myelooman tapauksia menettämisestä toiminnon mutaatioiden TRAF2, TRAF3 ja cIAP1 /2 on tunnistettu potilailla, mikä NIK aiheuttama aktivointi sekä kanoninen ja vaihtoehtoisten NF-KB väyliä säätelemään solujen kasvua ja selviytymistä [20], [21].

toissijaisesti NF-KB-reitin puuttuessa ärsyke, NIK assosioituu TRAF3 /TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 kompleksi, joka kohdistuu sen hajoamista. Kun reseptorin stimulaatio TRAF2 /TRAF3 /cIAP1 /cIAP2 kompleksin klusteroituneet reseptorin ja TRAF2 aktivoituminen johtaa cIAP1 /2 ja /tai TRAF3 hajoaminen [6]. Tämä vakauttaa soluliman NIK ja mahdollistaa loppupään signalointi aktivoida IKKα ja NF-κB2 /p100 [6], [10]. Mutta NIK voi myös stabiloida muilla mekanismeilla. Esimerkiksi TWEAK, tunnettu indusoija vaihtoehtoisen NF-KB-reitin laukaisee hajoaminen cIAP1 /2 ja tämä aiheuttaa NIK vakauttamiseen ja NF-κB2 /p100 käsittely [7]. Ohessa kuvataan lisäksi ja eri aktivoitumismekanismi joka tapahtuu PDAC solulinjoissa. Tuloksemme viittaavat siihen pysyvästi downregulation TRAF2-proteiinin PDAC solulinjoissa normaaleissa kasvuolosuhteissa, mikä johtaa vakauttamiseen NIK ilmaisun ja aktivaation vaihtoehtoisen NF-KB-reitin.

Yhdeksästä PDAC testatuista solulinjoista, seitsemän oli negatiivinen TRAF2-proteiinin ilmentymisen ja kahden ilmaisi TRAF2 on epätavallinen molekyylipaino on noin 65 kDa: n sijaan 53 kDa: n (Fig. 2A). On mahdollista, että tämä suurempi TRAF2-proteiinin edustaa liitos muodossa tai fuusioproteiinin. Kuitenkin suurempi koko ei näytä vaikuttavan TRAF2 toimintoa kohti NIK koska molemmissa solulinjoissa, samanlainen HDPE kontrollisoluihin, NIK-proteiinin ekspressio oli vähäistä (Fig. 1 B). Luonne ja toiminta tämän TRAF2 isoformin tarvitsee enemmän perusteellisen tutkimuksen tulevaan työhön. On myös mielenkiintoista määrittää, onko TRAF2-proteiinin lisääntynyt molekyylipaino on olemassa potilailla.

Huomasimme, että menetys TRAF2 ilmaisun välittyy ubikitinaation proteiinin (kuviot. 2C, 2D). Ei merkittäviä muutoksia ilmentymisessä cIAP1 /2 tai TRAF3 havaittiin (Fig. 2A). Se näytettiin ennen ubikitiinipromoottori ligaasit cIAP1 ja cIAP2 edistää proteasomaalisten hajoaminen niiden sitoutumispartnereihin TRAF2 ja TRAF3 [8], [9]. Näin ollen havaittu menetys TRAF2 ilmaisun voisi johtua läsnäolo cIAP1 /2. Tässä vaiheessa on epäselvää, miksi aktivoimiseksi vaihtoehtoisten NF-KB-reitin PDAC, downregulation TRAF2 on edullista downregulation TRAF3 tai cIAPs sijaan. Selittämään, mistä sääntely voi olla, että cIAPs aikaisemmin oli osoitettu olevan merkitystä kasvainsolun eloonjäämistä [22]. Downregulation TRAF2 voi estää ärsyke riippuvaa hajoamista cIAP1 /2 [6], jotta ne ovat konstitutiivisia selviytymisen signalointi kautta IAP: t. Lisäksi TRAF2 on tärkeä telineet yhteyden cIAPs ja NIK ja menetys TRAF2 useimmissa PDAC testatuista solulinjoista, voidaan irrottaa cIAP1 /2: n välittämien eloonjäämisen signalointia niiden toiminto heikentävistä soluja NIK. Näin on tämän mekanismin PDAC solut voivat säilyttää sekä suuren kapasiteetin hengissä, sekä korkea leviämisen hinnat (Fig. 8).

Ehdotettu mekanismi, miten NIK pidetään yllä PDAC solulinjoissa. Normaalissa haimatiehyen solujen TRAF2 ilmentyy ja muodostaa hajoamista monimutkainen NIK kanssa TRAF3, cIAP1 /2. Tämä johtaa ubikinaation ja hajoamista NIK. Vuonna PDAC soluissa, TRAF2 hajotetaan ubikitinaation. Tämä estää muodostumista NIK hajoamisen monimutkainen ja NIK pysyy ilmaisi. NIK signaloi muiden kuin ensisijaisen IKK monimutkainen ja IKKα välittää NF-κB2 ja muodostumista RelB /P52 dimeerejä. Nettovaikutus tällaista signalointia on lisääntyminen haimasyövän solujen lisääntymisen.

vahvistaa mekaanistetulle

in vitro

analyysissä kartoitettiin 55 ihmisestä otetuista näytteistä PDAC (asteet 1-3) ja havaitsi, että noin 69% osoittivat vähentynyttä ilmentymistä TRAF2: n ja kohonneeseen NIK ja pT559-NIK (Fig. 7), joka vastaa kuten oli havaittu sen haimasyövän solulinjoissa (kuviot. 1 ja 2). Kuitenkin noin 31% näytteistä analysoidaan osoittivat korkeaa TRAF2 ilmaus samanlainen kuin aikaisemmin kuvattu Trauzold

et al.

[23]. Mikä tärkeintä, kaikilla näistä näytteistä NIK ilmentyminen oli myös voimistunut. On mahdollista, että tämä osajoukko potilaan näytteiden ilmaista korkeamman molekyylipainon variantti TRAF2, että meillä oli havaittujen esiintyy joissakin PDAC solulinjoissa (so HPAFII). Tämä tulee vielä hiottava tulevissa tutkimuksissa. Kun erottamalla kasvaimet palkkaluokan, huomasimme, että kasvaimia korkean TRAF 2 pitoisuudet olivat hyvin eriytetty kasvaimia luokan 1. Kasvaimia tämän luokan eivät kasva nopeasti, kun taas kasvaimet laadut 2 ja 3 ovat kohtalaisia ​​tai huonosti eriytetty, vastaavasti, ja yleensä kasvaa ja levitä aggressiivisemmin. Tämä kasvu aggressiivinen kasvu ja vähentynyt TRAF2 ilmaisun 2. ja 3. asteen kasvaimet korreloi meidän

in vitro

tietoja, jotka osoittavat, että edellä kuvattu TRAF2 /NIK signalointi mekanismi voi välittää haimasyöpäkasvainsolulinjo- lisääntymistä.

Yhteenvetona tuloksemme tunnistaa proteasomaalisten downregulation TRAF2 mekanismina, kuinka NIK vakautta voidaan säätää PDAC. Kohdistaminen tämän reitin pienentää leviämisen syöpäsolut voivat edustaa uuden strategian hoidon PDAC. Esimerkiksi, vaihtoehtoinen NF-KB-reitin on herkkä proteasomin inhibiittoria bortetsomibilla [20], [21]. Siksi yksi potentiaalinen yhdistelmähoidon lähestymistapa olisi yhdistää bortetsomibin kanssa CIAP estäjien ja /tai apoptoosin aiheuttavat lääkkeet, kuten gemsitabiini.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

TMA