Krooninen sairaus

tiivistelmä

mekanismi tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) resistenssin syöpäsolujen ei täysin ymmärretä. Tässä osoitamme, että Akt selviytymisreittiin on tärkeä rooli TRAIL resistenssin ihmisen syöpäsoluja. Erityisesti olemme huomanneet, että TRAIL-käsittely aktivoi Akt selviytymisen polku, ja että inhibitio tämän reitin, jonka PI3K-inhibiittori LY294002 tai pudotus Akt herkistää resistenttien syöpäsolujen TRAIL. Koska Akt säätelee negatiivisesti kasvain vaimennin PTEN, tutkimme TRAIL herkkyyden PTEN Knockdown hiiren eturauhasen epiteelisolujen ja totesi, että PTEN

– /- solut ovat vastustuskykyisempiä kuin PTEN

+ /+ soluja, kun taas herkkyys PTEN

+/- solujen putosi välillä. Lisäksi osoitimme, että yliekspressio mutantin PTEN antaa TRAIL vastus PTEN

+ /+ soluissa, mikä tukee roolin PTEN in TRAIL herkkyyttä. Vuonna TRAIL kestävä rintojen T47D solut, yliekspressio mutantti PTEN entisestään niiden vastustuskyky TRAIL. Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että inaktivointi toiminnallisia PTEN ja seurauksena aktivointi Akt-reitin estää TRAIL: n indusoiman apoptoosin, mikä TRAIL vastarintaa. Siksi tulokset viittaavat siihen, että TRAIL kestävyys voidaan voittaa kohdistamalla PTEN tai Akt selviytymisreittiin syöpäsoluissa.

Citation: Xu J, Zhou JY, Wei WZ, Wu GS (2010) aktivoiminen Akt Survival Pathway Auttaa TRAIL Resistance syöpäsoluissa. PLoS ONE 5 (4): e10226. doi: 10,1371 /journal.pone.0010226

Editor: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 22 helmikuu 2010; Hyväksytty: 19 maaliskuu 2010; Julkaistu: 19 huhtikuu 2010

Copyright: © 2010 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain NIH /NCI apurahan R01 CA100073 ja puolustusministeriön Breast Cancer Program W81XWH-07-1-05-21. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

TRAIL (tai Apo2L) on jäsen, tuumorinekroositekijä-superperheen, joka selektiivisesti indusoi apoptoosia syöpä, mutta ei normaaleissa soluissa, joten se on houkutteleva aine syövän hoidossa. TRAIL aiheuttaa apoptoosia aktivoimalla sen kuoleman reseptorien DR4 (TRAIL-R2) ja /tai DR5 (Killer, TRAIL-R1, TRICK2) [1], [2], [3], [4]. Kun TRAIL sitoutuu DR4 ja /tai DR5 reseptoreihin, kuolema reseptorit tulla trimeroitua ja sitten rekrytoida sovitin proteiini FADD (Fas liittyvä proteiini kuolemaan domain) ja prokaspaasi 8 tai prokaspaasi 10 muodostamiseksi DISC, mikä johtaa kaspaasi 8 aktivaation [1 ], [2]. Aktivoidut kaspaasi 8 voi suoraan aktivoida efektori caspases 3, 6 ja 7 laukaisemaan apoptoosin tai välillisesti indusoi apoptoosin kautta tBid aiheuttama kaspaasi 9 välittämää mitokondrion apoptoosireitin [2], [4].

Vaikka TRAIL on houkutteleva terapeuttinen aine monet syöpäsolut ovat vastustuskykyisiä tälle aineelle [2]. Mekanismit TRAIL vastus ei täysin tunneta, mutta niitä voi esiintyä eri tasoilla sen reseptorit executor caspases sen signalointireitille [2], [4]. Tällä reseptorin tasolla, mutaatiot DR4 ja DR5 on todettu joitakin kasvaimia mukaan lukien rinta- ja keuhkosyöpää [4]. Lisääntynyt ilmentyminen decoy-reseptorien ja laski DR4 /DR5 ilmentyminen on korreloitu TRAIL vastuksen, vaikka muut tutkimukset osoittivat, että ekspressiotasot TRAIL-reseptorit eivät korreloi TRAIL herkkyys. Tällä kuoleman inducting signalointikompleksiin (DISC) taso, c-FLIP uskotaan olevan merkittävä estäjän TRAIL signalointi [5], [6]. Tuore tutkimus osoitti, että TRAIL herkkä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin koota DISC lipidilautoilla solukalvon joka johtaa kaspaasi 8 aktivointi, kun taas ei-lauttaa DISC kokoonpano johtaa rekrytointi c-FLIP ja RIP ja aktivoinnin pro-selviytymisen signalointireitteihin kuten NF-KB ja ERK1 /2 polkuja [7]. Lisäksi on osoitettu, että anti-apoptoottiset jäsenet Bcl-2-perheen, mukaan lukien Bcl-2 ja Mcl-1, ovat myös mukana TRAIL resistenssin [8], [9]. Aktivointi muiden eloonjäämisreittejä kuten Akt: n ja NF-KB: n väyliä johtaa solun eloonjäämisen ja chemoresistance [10]. Johdonmukaisesti, on osoitettu, että aktivointi Akt-reitin liittyy läheisesti lääkeresistensseihin lukien TRAIL kestävyys [11], [12]. Kuitenkin tarkka mekanismi, jolla Akt-reitillä aiheuttaa TRAIL vastus ei ole täysin ymmärretty.

PI3K /Akt-signalointireitin on prototyyppinen selviytymisen polku, joka on keskeinen rooli erilaisissa solun toimintoja, kuten proliferaatiota, kasvua, selviytyminen, ja aineenvaihdunta [13]. Kun kasvutekijä stimulaatio, PI3K aktivoituu fosfory- fosfatidyyli-3, 4-bisfosfaatin (PIP2), tuottaa phosphatidylinsitol-3, 4, 5-trifosfaatti (PIP3). PIP3 sitoutuu Akt, sitten translokoituu plasmamembraanin, jossa Akt aktivoidaan peräkkäin fosforylaation T308 ja S473 jäämiä. Fosforylaation T308 välittyy PDK-1 (3′-fosfoinositidi-riippuvainen kinaasi 1), kun taas fosforylaation S473 voidaan välittää useiden kinaasien, mukaan lukien PDK-1 ja mTORC2 [13]. Aktivoinnin jälkeen Akt voi fosforyloida moniin alustoihin käyttämään sen toimintoja. Parhaiten tunnettu substraatti Akt on seriini /treoniini-kinaasi, mTOR (nisäkkään rapamysiinin kohde). Akt voi suoraan fosforyloida ja aktivoida mTOR ja epäsuorasti aktivoida mTOR fosforyloimalla ja inaktivoimalla mukulakasvit skleroosi monimutkainen 2 (TSC2). Aktivoitu mTOR muodostaa kompleksin Raptor aktivoida ribosomaalisen proteiinin S6 kinaasien (S6K) ja estävät 4E-BP, mikä lisää proteiinin käännös [13]. On tunnettua, että aktivoituminen PI3K /Akt /mTOR-reitin voi lisätä solujen eloonjäämistä ja apoptoosin resistenssin aiheuttama useita aineita, [12], [13]. Esimerkiksi yli-ilmentyminen Akt lisää TRAIL vastus [11], [14]. Toisaalta, tuumorisuppressorigeenin PTEN (fosfataasi ja tensin homologin poistetaan kromosomissa kymmenen) voidaan defosforyloivat PIP3 toimimaan negatiivisena säätelijänä PI3K /Akt /mTOR signalointi. PTEN inaktivaatio johtaa aktivoinnin PI3K /Akt /mTOR-signalointireitin. Kuitenkin tarkka mekanismi, jolla PI3K /Akt /mTOR-reitin antaa TRAIL vastus ei ole täysin ymmärretty.

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että lisääntynyt aktivointi Akt-reitillä on tärkeä rooli TRAIL vastus. Tarkemmin, osoitimme, että TRAIL aktivoi Akt-reitillä ja että saarto Akt aktivoitumisen PI3K estäjän LY294002 tai knockdovvn Akt ilmentymisen siRNA herkistää resistenttien solujen Trail. Huomasimme myös, että uudelleen villityypin PTEN osaksi PTEN tyrmäys soluihin herkistää PTEN

– /- solut Trail taas inaktivaatio PTEN PTEN

+ /+ ja PTEN

+/- solujen sotkuiset TRAIL vastus . Nämä tulokset viittaavat siihen, että aktivoitunut Akt-reitin kautta inaktivointi PTEN on tärkeä rooli TRAIL vastus.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit

LY294002 hankittiin Alexis Biochemicals (San Diego, CA). Rekombinantti TRAIL ostettiin PeproTech (Rocky Hill, NJ). Kanin polyklonaalisia vasta-aineita fosforyloidun Akt (Ser473), fosforyloitu mTOR, fosforyloitu p70S6K, fosforyloitu EIF4E, PTEN, yhteensä Akt, ja poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-aktiini-vasta-aine hankittiin Sigma. Adenovirukset ilmentävät villityyppistä ja hallitseva negatiivinen PTEN sekä ohjaus adenovirukset ilmentävät galaktosidaasia (Ad-LacZ), ystävällisesti toimitti tri Mengjer Lee (University of Louisville).

Solulinjat, viljelyolosuhteet, ja hoito

ihmisen rintasyövän T47D-solut saatiin American Type Culture Collection ja pidettiin DMEM: ssä, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Ihmisen munasarjasyöpä SKOV3-soluja viljeltiin RPMI1640 10% FBS, OVCA432 soluja viljeltiin MCDB105 /M199, jossa 10% FBS, kuten on kuvattu [15]. PTEN-hiiressä eturauhasen epiteelisolujen (PTEN

– /- ja PTEN

+/-) ja normaalien solujen (PTEN

+ /+) saatiin tri Young Chen (Wake Forest University) ja ylläpidetään DMEM, jossa oli 10% FBS: ää, kuten aiemmin on kuvattu [16]. Kaikkia solulinjoja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka koostuu 5% CO

2 ja 95% ilmaa.

siRNA transfektion pudotus Akt

Signal Silence siRNA varten Akt ja vastaava ohjaus siRNA ostettiin Cell Signaling. Transfektiot suoritettiin valmistaja ehdottaa pienin muutoksin, kuten aiemmin on kuvattu [17]. Lyhyesti, T47D solut maljattiin 6 x 10

5 kuoppaa kohti kuuden kuoppalevyillä. Seuraavana päivänä solut transfektoitiin Akt tai ei-kohde-ohjaus siRNA avulla Oligofectamine (Invitrogen). 24 tunnin kuluttua transfektoidut solut trypsinoitiin ja maljattiin 6 x 10

5 kuoppaa kohti kuuden kuoppalevyillä. 48 tuntia myöhemmin, transfektoidut solut jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin TRAIL (100 ng /ml) 24 tuntia ja sitten talteen arvioimiseksi ilmentymisen Akt ja pilkkoa PARP Western blot -analyysillä. Määrittää kemosensitiivisyys, solujen kanssa tai ilman transfektiota pantiin 8000 kuoppaa kohti 96-kuoppalevyille ja sitten käsiteltiin TRAIL 24 h, ja solujen elinkyky määritettiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2 , 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) määritykset.

MTT määrityksissä

MTT määritykset on kuvattu aikaisemmin [18].

Western blot-analyysi

menettelyt valmistamiseksi koko solun proteiini lysaatit ja Western blot-analyysi kuvattiin aiemmin [18].

Adenoviruse infektioita

PTEN

+ /+, PTEN

+/- ja PTEN

– /- hiiren eturauhasen epiteelisolujen ja ihmisen rintasyövän T47D solut maljattiin 60 mm ruokia 8 x 10

5, 6 x 10

5, 5 x 10

5 ja 8 x 10

5 solua maljaa kohden, vastaavasti. Seuraavana päivänä solut pestiin normaalia keskipitkän ja tartunnan adenovirukset ilmentävät villityyppistä PTEN, hallitseva negatiivinen PTEN, tai LacZ. Infektion aikana, soluja ravisteltiin varovasti 10 minuutin välein 1 tunnin ajan, ja sitten pidettiin adenoviruksen sisältävässä väliaineessa 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. 24 tuntia myöhemmin, infektoidut solut vaihtuu normaaliin alustaa ilman adenovirukset ja sitten jatkuvasti viljeltiin vielä 48 tuntia. 72 h infektion jälkeen solut trypsinoitiin ja maljattiin 60 mm astiaan 5 x 10

5-soluja. Seuraavana päivänä solut jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin TRAIL (100 ng /ml) 48 tuntia. Solut kerättiin Western blot -analyysiin ja MTT-määritystä, vastaavasti.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen Studentin

t

testiä. Aineisto esitetään keskiarvona ± SD, ja

P

≤0.05 katsottiin merkitseväksi.

Tulokset

karakterisointi TRAIL herkkyys paneelissa rinta- ja munasarjasyövän solujen linjat

ymmärrettävä toimintamekanismit TRAIL vastarintaa, ensin tutkitaan TRAIL herkkyys 14 syöpäsolulinjoissa myös 3 rinta- ja 11 munasarjasyövän solulinjoissa. Nämä solulinjat käsiteltiin eri annoksilla TRAIL 24 tuntia, ja solujen lisääntyminen mitattiin MTT-määrityksellä. Kuva. 1 osoittaa, että nämä solulinjat osoitti ero TRAIL herkkyys; MDA-231, DOV13, OV433 ja OVCA420 solut olivat herkkiä TRAIL kun taas muut linjat olivat resistenttejä TRAIL paitsi MCF-7-soluissa, jotka osoittivat vaatimaton kestävyys. Nämä tiedot osoittavat, että monet munasarja- ja rintasyövän solulinjat ovat vastustuskykyisiä TRAIL.

Ihmisen rintasyövän solulinjat T47D, MDA231, ja MCF7 ja munasarjasyövän solulinjoissa DOV13, E52, OV90, OV433, OVCA432, RMG- 1, TOV-21G, TOV-112D, Caov3, OVCA420, ja SKOV3 käsiteltiin erilaisilla annoksilla TRAIL 24 tuntia. Solujen proliferaatio määritettiin MTT-määrityksissä. Soluproliferaatiota tulokset ilmaistaan ​​prosentteina käsittelemättömien solujen. Edustavat kolmea riippumatonta koetta.

Akt /mTOR reitti aktivoituu TRAIL resistenttejä solulinjoja

Koska monet rinta- ja munasarjasyövän solulinjoissa ovat resistenttejä TRAIL, on tärkeää ymmärtää taustalla olevan mekanismin TRAIL vastarintaa. On raportoitu, että TRAIL voi aktivoida useita pro-eloonjäämisreittejä, kuten Akt, NF-KB: n ja ERK polkuja [19], [20], [21], [22]. Koska aktivaatio näistä reiteistä moduloi solujen eloonjäämistä ja chemoresistance, on mahdollista, että aktivointi näistä reiteistä edistää TRAIL vastus. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, käsittelimme neljä resistenttejä riviä T47D, SKOV3, OVCA432 ja OV90 100 ng /ml TRAIL eri aikoja ja tutki aktivointi Akt, NF-KB ja ERK polkuja sekä ilmaus Bcl -2 perheen proteiineja. Kuten on esitetty kuviossa. 2A-D tasot sekä fosforyloidun Akt ja mTOR proteiinia lisättiin jo 2 tuntia ja kesti jopa 6 h kuluttua TRAIL hoidon, Osoitimme myös, että tällainen aktivaatio ei johtunut kasvusta koko Akt ja mTOR proteiineja, joka pysyi vakiona (Fig. 2A-D). Lisäksi osoitimme, että p70S6K ja elF4E, molemmat ovat alavirtaan tavoitteita mTOR, aktivoituvat (Kuva. 2A ja D). Nämä tulokset osoittavat, että TRAIL voi aktivoida Akt /mTOR väylän TRAIL resistenttejä solulinjoja. Mikä tärkeintä, osoitimme, että Akt ja mTOR ei ole otettu käyttöön TRAIL herkkä MCF-7 ja OVCA420 soluja (Kuva. 2E ja F). Siten tulokset viittaavat siihen, että aktivaatio Akt /mTOR reitti on yleinen tapahtuma TRAIL resistenttejä syöpäsolulinjoissa ja että tämä reitti voi olla tärkeä TRAIL vastus. Lisäksi olemme havainneet, että TRAIL saattaa aktivoida MEK /ERK: n ja NF-KB: n polkujen OV90 soluissa, mutta ei muissa kolmessa solulinjoissa (tietoja ei esitetty). Lisäksi esto ERK: n ja NF-KB: n kanavat, niiden vastaavia farmakologisia estäjät eivät vaikuttaneet TRAIL herkkyyttä OV90 soluissa (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että aktivointi näiden kahden reitin voi olla tärkeä TRAIL vastus tässä solulinjassa.

T47D (A), SKOV3 (B), OVCA432 (C), OV90 (D), MCF7 (E) ja OVCA420 (F) soluja käsiteltiin 100 ng /ml TRAIL 0, 2, 4 ja 8 h (in T47D-soluissa, 6 h hoito oli mukana), ja koko proteiini uutettiin. Tasot kokonais- ja fosforyloidun Akt (

p-AKT

), ja fosforyloitu mTOR (

p-mTOR

) määritettiin Western blot-analyysi. In T47D (A) ja OV90 (D) solujen tasot fosforyloitua p-p70S6K ja fosforyloidun elF4E (p-elF4E) tutkittiin myös. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Huomionarvoista oli kaksi kaistoja Akt (Akt1- ja Akt2) sekä OVCA432 ja OV90 solut taas vain yksi bändi Akt havaittiin T47D ja SKOV3- soluja.

estäminen Akt aktivaation herkistää resistenttien solujen Trail

Koska Akt-reitin aktivoitiin kaikissa resistenttejä testatuissa solulinjoissa, kysyimme, onko esto Akt-aktiivisuutta voisi lisätä TRAIL herkkyyttä resistentit solut. Tätä varten me käsiteltiin T47D-solujen kanssa PI3K-inhibiittori LY294002 ja tutkittiin, mikä vaikutus Akt estoa TRAIL-indusoitua apoptoosia. Kuten on esitetty kuviossa. 3, TRAIL hoito lisäsi Akt: n fosforylaation T47D-soluissa, mikä poisti LY294002, joka osoittaa, että Akt aktivointi on PI3K riippuvainen. Samoin myös osoitti, että aktivointi Akt on estänyt LY294002 in OVCA432 soluissa (Kuva. 3C). Tärkeää on, että esto Akt-fosforylaation LY294002 huomattavasti TRAIL-indusoitua PARP pilkkominen verrattuna käsiteltyjen solujen TRAIL, tai LY294002 yksinään (Fig. 3A ja C). Lisäksi osoitimme, että yhdistelmähoito TRAILin ja LY294002 merkittävästi estää soluproliferaatiota verrattuna kumpaakin annettaisiin erikseen (Fig. 3B ja D). Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että aktivointi Akt on tärkeä rooli TRAIL resistenssin syöpäsoluja.

A ja C, vaikutus PI3K-inhibiittori LY294002 on TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Rintasyöpä solujen T47D (

) ja munasarjasyövän solujen OVCA432 (

C

) jätettiin käsittelemättä tai esikäsitellä 10pM LY294002 (

LY) B 30 minuutin ajan, ja sitten käsiteltiin kanssa tai ilman 100 ng /ml TRAIL 6 tuntia. Yhteensä proteiini uutettiin, ja pilkotaan PARP sekä kokonais- ja fosforyloidun Akt määritettiin Western-blottauksella.

B ja D

, vaikutus LY294002 on TRAIL aiheuttama kasvun esto. T47D (

B

) ja OVCA432 solut (

D

) jätettiin käsittelemättä tai esikäsiteltiin 10 uM LY294002 30 min, ja sitten käsiteltiin kanssa tai ilman 100 ng /ml TRAIL 24 tuntia. Solujen proliferaatio määritettiin MTT-määrityksissä ja ilmaistaan ​​prosenttiosuutena käsittelemättömien solujen. Edustajalle kolmen erillisen kokeen. **,

P

0,001, tilastollista merkittävyyttä; *,

P

0,01, tilastollista merkittävyyttä.

knockdovvn Akt herkistää rintasyövän T47D solut Trail

Vaikka hoito PI3K estäjän LY294002 lisääntynyt TRAIL indusoimaan apoptoosin, tulokset eivät välttämättä täysin vastaa yksinoikeudella roolin Akt vuonna TRAIL vastus koska LY294002 voivat estää muita kinaaseja. Tutkia suoran roolin Akt aktivoinnin TRAIL vastus, käytimme siRNA on pudotus Akt ilmaisun ja sitten päättää vaikutus Akt Knockdown on TRAIL herkkyys. Transfektoimme T47D solut siRNA vastaan ​​Akt (Akt 1, 2 ja 3) tai valvoa siRNA ja osoittivat, että Akt oli tehokkaasti knock pudotti jonka Akt siRNA soluissa kanssa tai ilman TRAIL hoitoa, verrattuna soluihin transfektoitu ohjaus siRNA (Fig. 4B ). Tärkeää on, osoitimme, että pudotus Akt herkistynyt TRAIL indusoi PARP pilkkominen verrattuna samoihin soluihin, jotka oli transfektoitu ohjaus siRNA (Fig. 4B). Edelleen, pudotus Akt kasvoi TRAIL-indusoidun kasvun inhibitio, kun tällaiset muutokset olivat vähäisiä transfektoiduissa soluissa ohjaus siRNA (Fig. 4A). Täten tuloksemme osoittavat, että vaikka TRAIL voivat aiheuttaa apoptoosin, se aktivoi myös Akt selviytymisreittiin vastapainoksi TRAIL: n indusoiman apoptoosin.

, vaikutus Akt Knockdown soluproliferaatioon. T47D solut maljattiin 6 x 10

5 kuoppaa kohti kuuden kuoppalevyillä. Seuraavana päivänä solut transfektoitiin Akt tai ohjaus siRNA käyttäen Oligofectamine. 2 d, solut jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin TRAIL (100 ng /ml) 24 h, ja solujen lisääntyminen määritettiin MTT-määrityksissä. Soluproliferaatiota tulokset ilmaistaan ​​prosentteina käsittelemättömien solujen. Edustajalle kolmen erillisen kokeen. *,

P

0,01, tilastollista merkittävyyttä.

B

, vaikutus Akt Knockdown on TRAIL: n indusoiman apoptoosin. T47D-solut transfektoitiin Akt tai ohjaus siRNA: t ja sitten käsiteltiin kanssa tai ilman TRAIL (100 ng /ml) 24 h, kuten on kuvattu (

). Yhteensä proteiini uutettiin analysoimiseksi koko ja fosforyloidun Akt (

p-AKT

) ja PARP Western blot -analyysillä. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Menetys PTEN antaa TRAIL resistenssin

On tunnettua, että PTEN on negatiivinen säätelijä Akt ja että lisääntynyt Akt toiminta on ollut liittyvä inaktivointi PTEN useissa syövissä. Jotta ymmärtää mekanismia Akt aktivaation välittämää TRAIL vastus, käsittelimme PTEN

+ /+, PTEN

+/- ja PTEN

– /- hiiren eturauhasen epiteelisolujen TRAIL 48 tuntia ja mitattiin solujen lisääntymistä MTT määrityksissä. Kuva. 5A osoittaa, että TRAIL aiheuttama noin 32% kasvun estyminen PTEN

+ /+ soluissa, kun taas TRAIL ei vaikuttanut solujen lisääntymiseen PTEN

– /- solut, kun taas PTEN

+/- solut osoittivat noin 13% kasvun estäminen jälkeen TRAIL hoidon. Lisäksi olemme osoittaneet, että Akt aktivoidaan PTEN

– /- soluissa, mutta ei PTEN

+ /+, kun taas vähäinen aktivoituminen PTEN

+/- soluja. Tärkeää on, TRAIL hoito aiheutti merkittäviä PARP lohkaisu PTEN

+ /+ soluja, kohtalainen lohkaisu PTEN

+/- soluja ja täydellinen puuttuminen lohkaisu PTEN

– /- solut (Fig. 5B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että PTEN tarvitaan TRAIL-indusoitua apoptoosia hiiren eturauhasen epiteelisoluissa.

Hiiren eturauhasen epiteelisolujen villityypin PTEN (PTEN

+ /+), PTEN knockout (PTEN

+/-

) ja heterotsygoottisten (PTEN

– /-

) maljattiin 96-kuoppalevyille, ja sitten käsiteltiin 100 ng /ml TRAIL 48 tuntia. Solut proliferaatio määritettiin MTT määrityksiä ja ilmaistiin prosentteina käsittelemättömien solujen. Edustajalle kolmen erillisen kokeen. *,

P

0,01, tilastollista merkittävyyttä.

B

, vaikutus PTEN tappio TRAIL: n indusoiman apoptoosin. PTEN

+ /+, PTEN

+/-, ja PTEN

– /- soluja käsiteltiin 100 ng /ml TRAIL 48 h kuvatut (

). Yhteensä proteiini uutettiin analysoimiseksi koko ja fosforyloidun Akt (

p-AKT

), PTEN ja PARP Western blot-analyysi. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

C

, kunnostettu PTEN ilmaisu herkistää PTEN

– /- solujen TRAIL. PTEN

– /- solut (5 x 10

5) infektoitiin adenovirukset ilmentävät villityypin PTEN (

Ad-PTEN wt

) tai ilmentävät LacZ (

Ad-lacZ

). 72 h infektion jälkeen solut trypsinoitiin ja maljattiin 60 mm astiaan 5 x 10

5-soluja. Seuraavana päivänä solut jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin TRAIL (100 ng /ml) 48 tuntia. Solut kerättiin MTT määritykset (

Ylähavas

) ja Western blot-analyysi käytettiin havaitsemaan tasojen PARP ja PTEN proteiineihin (

alempi paneeli

), tässä järjestyksessä. Soluproliferaatiota tiedot ilmaistiin prosentteina käsittelemättömien solujen. Edustajalle kolmen erillisen kokeen. **,

P

0,001, tilastollista merkittävyyttä.

D,

estäminen PTEN toiminto vallitsevaa negatiivista muotoa PTEN antaa TRAIL vastus. PTEN

+ /+ ja PTEN

+/- solut infektoitiin adenovirusten ekspressoivat vallitsevaa negatiivista muotoa PTEN 72 h ja sitten käsiteltiin TRAIL (100 ng /ml) 48 tuntia. Solut joko käyttää kasvun estäminen MTT määritykset (

yläpaneeli

) tai korjattu havaitsemiseksi tasojen PARP, PTEN, ja kokonais- ja fosforyloidun Akt Western blot-analyysi (alempi kuva). Soluproliferaatiota tiedot ilmaistiin prosentteina käsittelemättömien solujen. Edustajalle kolmen erillisen kokeen. *,

P

0,01, tilastollista merkittävyyttä. **,

P

0,001, tilastollista merkittävyyttä.

Koska PTEN

– /- solut vastustuskykyisiä TRAIL, kysyimme, onko palauttaminen PTEN ilmaisun vaikuttaa TRAIL herkkyys PTEN

– /- solut. PTEN

– /- soluja infektoitiin adenovirukset ilmentävät villityypin PTEN tai LacZ. Kuten on esitetty kuviossa. 5C, PTEN ilmentyminen palautui infektoiduissa soluissa adenovirukset ilmentävien PTEN muttei infektoiduissa soluissa adenoviruksia ilmentävien LacZ. Mikä tärkeintä, pystyimme osoittamaan, että palauttaminen PTEN ilmaisun tekee PTEN

– /- solut herkkiä TRAIL aiheuttaman apoptoosin ja kasvun estäminen tällaisia ​​vaikutuksia ei havaittu infektoiduissa soluissa ohjaus viruksia (Fig. 5C). Koska PTEN

+ /+ solut ovat herkkiä TRAIL, kysyimme, onko estyminen PTEN toiminto vaikuttaa TRAIL aiheuttaman apoptoosin PTEN

+ /+ soluja. Tätä varten me tartunnan PTEN

+ /+ ja PTEN

+/- solujen adenovirusten ilmentävät vallitsevaa negatiivista muotoa PTEN tai LacZ, ja käsitellään tartunnan saaneiden solujen TRAILin kanssa 48 tuntia. Kuva. 5D esittää, että käyttöönotto dominantti negatiivinen muoto PTEN lisääntyi p-Akt tasolla PTEN

+ /+ soluja. Tärkeää on, käyttöönotto dominative negatiivinen muoto PTEN tekee PTEN

+ /+ ja PTEN

+/- solut vastustuskykyisiä TRAIL (Fig. 5D). Yhdenmukainen roolin Akt estämisessä apoptoosin, TRAIL indusoi PARP pilkkominen väheni dramaattisesti PTEN

+ /+ ja PTEN

+/- soluja kun he olivat viruksia ekspressoivat vallitsevaa negatiivista muotoa PTEN. Lisäksi osoitimme, että TRAIL aiheuttama kasvun estäminen in PTEN

+ /+ solut infektoitiin adenovirus ekspressoivat vallitsevaa negatiivista muotoa PTEN oli noin 5%, mutta noin 27% samoissa soluissa tartunnan ohjaus adenovirukset (Fig. 5D ). Osoitimme myös, että PTEN

+/- infektoitujen solujen hallitseva negatiivinen muoto PTEN, solujen lisääntymisen oli noin 102% verrattuna samaan solut infektoitu viruksia, joissa solujen lisääntymisen noin 81%, kun TRAIL käsittely (kuvio . 5D, yläpaneeli).

rooli PTEN vuonna TRAIL herkkyys rintasyövän T47D solut

Koska rintasyövän T47D solut villityypin PTEN olivat resistenttejä TRAIL (Fig. 1 ), kysyimme, onko modulaatio PTEN toiminta vaikuttaisi TRAIL herkkyyttä T47D-soluissa. Tätä varten me tartunnan T47D solut adenovirusten ekspressoivat vallitsevaa negatiivista muotoa PTEN tai valvonnan viruksia ja käsiteltiin sitten infektoituneiden solujen kanssa TRAIL (100 ng /ml) 48 h, ja vaikutus tällaista hoitoa TRAIL herkkyys määritettiin. Kuva. Kuvio 6 esittää, että solut infektoitiin adenoviruksella ekspressoivat vallitsevaa negatiivista muotoa PTEN ilmaista korkeampi p-Akt kun tällainen lisäys ei havaittu infektoiduissa soluissa adenovirukset ilmentävät LacZ, joka viittaa siihen, että PTEN-toiminto inhiboitui vallitsevaa negatiivista muotoa PTEN (Fig. 6B). Yhdenmukainen roolin Akt estämisessä apoptoosin, halkaistut PARP väheni merkittävästi soluissa, jotka ilmentävät vallitsevaa negatiivista muotoa PTEN verrattuna soluihin, jotka ilmentävät ohjaus viruksia (Fig. 6B). Lisäksi yliekspressio dominantti negatiivinen muoto PTEN tekee T47D solut vastustuskykyisiä TRAIL verrattuna samoihin soluihin, jotka on infektoitu ilmentävillä viruksilla LacZ (Fig. 6). Siksi nämä tulokset viittaavat siihen, että lisääntynyt Akt aktivoitunut siksi inaktivaatio PTEN voisi antaa TRAIL resistenssin syöpäsoluissa.

, vaikutus estämällä PTEN toiminnon soluproliferaatioon. T47D-solut (8 x 10

5) infektoitiin adenoviruksella, joka ilmentää dominantti negatiivinen muoto PTEN tai adenovirusten ilmentävät LacZ: ssa 72 tuntia ja käsiteltiin sitten TRAIL (100 ng /ml) 48 tuntia. Solujen proliferaatio määritettiin MTT-määrityksissä. Soluproliferaatiota tulokset ilmaistaan ​​prosentteina käsittelemättömien solujen. Edustajalle kolmen erillisen kokeen. *,

P

0,01, tilastollista merkittävyyttä.

B

, vaikutus estämällä PTEN toiminnon apoptoosin. T47D-solut infektoitiin adenovirukset, kuten on kuvattu kohdassa A käsiteltiin TRAIL (100 ng /ml) 48 tuntia ja sitten talteen analysoimiseksi tasot PARP, PTEN, kokonais- ja fosforyloidun Akt-proteiinien Western blot -analyysillä (

alempi paneeli

). β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että TRAIL aktivoi Akt selviytymisen väylän TRAIL kestävä syöpäsolun linjat. Lisäksi osoitetaan, että alla oleva mekanismi voi johtua menetys toiminnallisten PTEN koska PTEN hiiressä eturauhasen epiteelisolujen ovat resistenttejä TRAIL taas solujen ehjät PTEN ovat herkkiä TRAIL. Palauttaminen PTEN ilme sulatettu PTEN

– /- solut herkkiä TRAIL. Edelleen, inaktivointi PTEN parantaa tasoa TRAIL resistenssin T47D-soluissa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että aktivaatio Akt selviytymisen reitti on kriittinen rooli in TRAIL kestävyys ja että Akt-reitillä on mahdollinen terapeuttinen kohde tehostaa TRAIL-pohjainen terapia.

aktivointi Akt-reitillä on liitetty suojella soluja monet kuoleman ärsykkeet, en näin solujen eloonjäämistä [10], [13]. Aiemmat tutkimukset ehdotti, että yli-ilmentyminen Akt ja sen alkupään säädin PI3K kasvoi TRAIL vastus rinta- ja munasarjasyövän solujen [23], [24]. Kuitenkin taustalla olevan mekanismin sen kestävyys ei ole täysin ymmärretty. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että vaikka TRAIL indusoi apoptoosia syöpäsoluissa, se myös aktivoi useita eloonjäämisreittejä, joka voi kumota TRAIL-indusoitua apoptoosia, mikä johtaa vastus. Monissa TRAIL kestävät rinta- ja munasarjasyövän solulinjoissa, mutta ei ole herkkä solulinjojen Akt-reitillä on aktivoitu (Fig. 2), viittaa siihen, että aktivaatio Akt-reitillä voi olla yhteinen tapahtuma TRAIL resistentit solut. Yhdenmukainen käsitystä, huomasimme, että esto Akt aktivoitumisen farmakologisen estäjä LY294002 tai knockdovvn sen ilmentymisen siRNA herkistää TRAIL-resistenttien solujen TRAIL. Yhdessä nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että aktivointi Akt selviytymisreittiin on keskeisessä asemassa TRAIL resistenssin munasarja- ja rintasyövän solujen ja merkitse, että esto tämän selviytymisreittiin voisi voittaa TRAIL vastus.

Osoitimme myös, että esto PI3K toiminta estetty Akt aktivaation TRAIL resistenttejä solulinjoja. Koska PI3K voi toimia ylävirran positiivisena säätelijänä Akt, nämä tulokset viittaavat siihen, että lisääntynyt Akt aktivaatio on ainakin osittain kautta aktivoitunut PI3K. Alavirran tasolla, se on hyvin tiedossa, että Akt saa aikaan biologisia toimintoja fosforyloimalla sen loppupään alustoilla mTOR. Aktivointi mTOR voi lisätä proteiinin translaation, jolloin solujen eloonjäämistä [13]. Tämän mukaisesti olemme havainneet, että TRAIL hoito voi aiheuttaa mTOR fosforylaation ja myöhempää aktivointia. Tuloksemme viittaavat siihen, että TRAIL saattaa aktivoida PI3K /Akt /mTOR-reitin torjua TRAIL-indusoitua apoptoosia, mikä johtaa TRAIL vastus.

syöpäsoluja, Akt selviytymisreittiin voidaan aktivoida useilla mekanismeilla, mukaan lukien inaktivaatio sen alkupään negatiivinen säätelijä PTEN. By defosforyloimaan ja puhelinta PIP3 sen PIP2, PTEN estää Akt aktivointi ja myöhemmin herkistää soluja kuolemaan [10], [13]. Yhdenmukainen roolia PI3K /Akt väylän TRAIL vastus, huomasimme, että menetys PTEN hiiren eturauhasen epiteelisolujen antaa TRAIL vastus taas sama solujen ehjät PTEN ovat herkkiä TRAILin kun PTEN

+/- solujen välimuutoksia vastus. Nämä tiedot viittaavat siihen, että PTEN todellakin on tärkeä rooli TRAIL herkkyyttä. Lisäksi osoitimme, että uudelleen mutantti muoto PTEN osaksi TRAIL resistenttien T47D solut entisestään TRAIL vastus. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että TRAIL resistentit solut, menetys PTEN myötävaikuttaa Trail vastarintaa. On tunnettua, että heikkeneminen tai PTEN ilmaisun esiintyy vähintään 50%: rinta- ja munasarjasyövän syöpiä [25]. On mahdollista, että TRAIL kestävä rinta- ja munasarjasyövän solut ovat alentuneet PTEN, jotka tarvitsevat lisätutkimuksia. Edelleen, tuore tutkimus osoitti, että yli-ilmentyminen miR-221 222 alas säätelee PTEN, mikä lisää aktivointia Akt ja myöhempien TRAIL kestävyys [26]. Lisäksi TRAIL kestävä leukemia solut ilmensivät korkeampi fosforyloidun inaktiivinen muoto PTEN, mikä johti kasvuun Akt aktivointi ja TRAIL kestävyys [27]. Sen lisäksi, että asema PTEN säätelyssä Akt aktivointi, useat tutkimukset ovat osoittaneet, että Akt aktivaatio TRAIL-käsittely voi johtua muista mekanismeista.