Krooninen sairaus

tiivistelmä

XMRV tai ksenotrooppiset hiiren leukemiavirus (MLV) liittyvien virus, on uusi gammaretrovirus alunperin tunnistettu tutkimuksissa, jotka analysoitiin kudosta eturauhassyöpäpotilaisiin vuonna 2006 ja veren kroonista väsymysoireyhtymä ( CFS) vuonna 2009. kuitenkin suuri määrä myöhemmissä tutkimuksissa ei kyennyt todistamaan yhdyssiteenä XMRV infektio ja CFS tai eturauhassyövän. Päinvastoin, viimeaikaiset todisteet osoittavat, että XMRV on epäpuhtaus peräisin rekombinaation kahden hiiren endogeenisen retrovirukset siirtojen aikana eturauhasen -tuumoriksenografti (CWR22) hiirillä, tuottaa laboratorio-solulinjat, jotka ovat XMRV-tartunnan. Se vahvistaa tai kumoaa yhdistyksen välillä XMRV ja eturauhassyövän, analysoimme eturauhassyöpäkudoksille ja plasmaa takautuvasti kerättyjen kohortin 39 potilasta sekä arkistointia RNA ja eturauhasessa alkuperäisestä 2006 tutkimuksessa. Huolimatta kattava microarray, PCR, FISH, ja serologinen testaus, XMRV ei havaittu missään vasta kerättyjen näytteiden tai arkistointia kudoksessa, vaikka arkistointia RNA pysyi XMRV-positiivisia. Erityisesti arkistointi VP62 eturauhasen kudosta, josta prototyyppi XMRV kanta on peräisin, olivat kielteisiä XMRV on uusi analyysi. Analyysi virusgenomin ja ihmisen mitokondrioiden sekvenssit paljasti, että kaikki aiemmin tunnettu XMRV kannat ovat identtisiä ja että arkistointia RNA oli saastuttamalta XMRV-tartunnan laboratoriossa solulinjassa. Nämä havainnot osoittavat ole yhdistyksen välillä XMRV ja eturauhassyöpä, ja korostavat tulokseen, että XMRV ei ole luonnostaan ​​hankittu tartunnan ihmiseen.

Citation: Lee D, Das Gupta J, Gaughan C, Steffen I, Tang N, Luk KC et ai. (2012) perusteellinen tutkimus arkistointia ja takautuvasti Kerätyt näytteet paljastaa ole näyttöä XMRV Infektio eturauhassyövässä. PLoS ONE 7 (9): e44954. doi: 10,1371 /journal.pone.0044954

Editor: Gilda Tachedjian, Burnet instituutti, Australia

vastaanotettu: 02 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 10 elokuu 2012; Julkaistu: 18 syyskuu 2012

Copyright: © Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitollisena tunnustaa tukea NIH /NCI CA103943 (R. Silverman), sekä Charlotte Geyer Foundation, Maltz Family Foundation, ja Abbott Laboratories (R. Silverman ja E. Klein). G. Simmons tukevat avustusta 1R21HL109761 National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI). J. DeRisi tukee Howard Hughes Medical Institute. C. Chiu tukee NIH avustuksia R56-AI08952 ja R01-HL105704, sekä Abbott Viral Discovery palkinnon. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: JDG, EK, JD, RS, KL, XQ ja JH ovat mukana keksijät yksi tai useampi seuraavista julkaistu XMRV liittyviä patenttihakemuksia, jotka sisältävät joko Cleveland Clinic, Abbott Laboratories, tai sekä Cleveland Clinic ja Abbott Laboratories siirronsaajiin: kansainvälinen julkaisu Numbers WO2011 /002932; WO2011 /002936; WO2010 /075414; WO2006 /110589; WO2012 /024518 ja WO2012 /024513. Abbott on ainoa siirronsaajalle myönnetty US-patentti nro 8183349, jotka liittyvät XMRV. NT, KL, XQ, GS ja JH ovat työntekijöitä Abbott Laboratories. PO on työntekijä Novartis Institutes for Biomedical Research. Nämä potentiaaliset kilpailevat edut eivät muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Vuonna 2006 vastaavat sekvenssit uudenlainen gammaretrovirus nimeltä ksenotrooppiset hiiren leukemiaviruksen -aiheiset virus (XMRV) havaittiin kudosta eturauhasen syöpäpotilailla eturauhasen [1]. Löytö XMRV suoritettiin käyttäen laajakirjoinen microarray-määritys (ViroChip) on suunniteltu havaitsemaan kaikki tunnetut virukset sekä uudet virukset perusteella sekvenssihomologia [1], [2], [3]. Tulokset Tämän tutkimuksen paljasti myös yhdistyksen välillä läsnäolo XMRV ja potilaille, joiden tiedetään olevan homotsygoottisia R462Q variantti RNAasi L, geeni aiemmin liittyy perinnöllinen eturauhassyövän 1 lokus [4]. Mutaatiot RNAaasi L jotka heikentävät apoptoottista virusinfektioiden oletettiin heijastaa tehostetun alttiutta infektiolle XMRV ja ehdotti mahdollinen rooli viruksen karsinogeneesis- [5], [6], [7], [8]. Vaikka alkuperäinen tutkimuksessa raportoitiin linkkinä RNaasi L-variantti eturauhassyöpä ja XMRV infektio, useimmat, mutta eivät kaikki, myöhemmät tutkimukset eivät ole havaitsemaan tällainen mielleyhtymä [9], [10], [11], [12]. Koska tämä ensimmäinen löytö, XMRV ja MLV liittyvät viruksen sekvenssit muistuttavat polytrooppinen MLV (P-MLV) havaittiin myös potilailla, joilla on krooninen väsymysoireyhtymä (CFS) [13], [14].

Seuraavat kertomukset ovat heittäneet epäillä yhdistys XMRV eturauhassyövän tai CFS, ja todellakin siitä XMRV on jopa todettu ihmisillä (tarkistetaan [15]). Lisäksi viruksen sekvenssit XMRV-positiivisilla potilailla puuttui tason geneettisen monimuotoisuuden odotettavissa retrovirusinfektioiden [1], [14], mikä tarkoittaa, että XMRV voinut syntyä näytteestä saastumisen ja ei ole totta virusinfektio. Lähes kaikki seurantatutkimukset käyttäen spesifistä PCR ovat pitkälti epäonnistuneet vahvistaa läsnäoloa XMRV joko CFS tai eturauhassyövän ikäryhmät [12], [16], [17], [18], [19], [20], [ ,,,0],21], [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32], jolloin sulkeutuminen alkuperäisen paperit yhdistää XMRV ja P-MLV CFS [33], [34]. Vuonna 2009 tutkimuksessa todettiin yllättäen, että yhteinen laboratorio solulinjassa 22Rv1 johdettu CWR22 ihmisen eturauhassyöpäksenograftista, tuotetaan suuria tiittereitä XMRV [35]. Tätä seurasi tutkielma Garson,

et al.

Osoittavat, että samanlainen XMRV integraatio sivustoja oli jaettu oletetusti tartunnan eturauhasen kasvain kudosten ja kokeellisesti tartunnan laboratoriossa solulinjassa [36], [37], haittaa entisestään mahdollisuus, että XMRV on toisen ihmisen taudinaiheuttaja. Lopuksi, 2011 tutkimuksessa Paprotka,

et al.

Edellyttäen vahvaa näyttöä siitä, että XMRV on 22Rv1 johdettu laboratoriossa epäpuhtauden peräisin rekombinaation kahden hiiren endogeenisen retrovirukset aikana sarjareittien CWR22 nude-hiirissä [38]. Äskettäinen osoitus, että XMRV ja niihin liittyvät virukset eivät ole läsnä ensisijaista eturauhasen kasvain kudosta potilaan CWR22 lainaa lisätukea tätä hypoteesia [39].

Koska kliiniset ja kansanterveyden alalla potentiaalisia XMRV infektion ihmisissä , pyrimme se vahvistaa tai kumoaa yhdistyksen välillä XMRV ja eturauhassyöpää. Tähän mennessä suurin osa negatiivisia tutkimuksia on tehty CFS eikä eturauhassyövän, ja jotkut ovat arvelleet, että alkuperäisen löytö XMRV voi itse asiassa heijastaa

bona fide

virusinfektio mutta myöhemmät tutkimukset olivat potentiaalisesti pilalle hiiren genomin saastumisen ja /tai laajaa levitystä positiivisen kontrollin sisältävien plasmidien XMRV tarttuva molekyyli klooni VP62 [40], [41], [42]. Esitämme tässä perusteellisen tutkimuksen käyttäen näytteitä otetaan molempien prospektiivinen kohortin 39 uutta eturauhassyöpäpotilaille ja alkuperäinen 2006 Urisman

et al.

Tutkimus, jossa XMRV löydettiin [1]. Erityisesti, arkistointia eturauhasen kudosta potilaan VP62, käytetään tuottamaan VP62-klooni käytetään lähes kaikissa alavirtaan molekyyli- ja solutason tutkimuksissa XMRV [43], oli saatavilla analyysiä varten. ViroChip microarray, PCR, fluoresenssi

in situ

-hybridisaatio (FISH), serologiset ja syvä sekvensointi analyysit suoritettiin 4 eri laboratorioissa (Fig. 1). Yhdistetty havainnot ovat parhaiten sopusoinnussa XMRV liittyvä laboratorion saastuminen eturauhassyöpäkudoksille analysoidaan alkuperäisessä 2006 Urisman,

et al.

Tutkimus [1], ja laadittava selkeä selvitys siitä, miten tällaiset saastuminen saattoi tapahtua.

värilliset laatikot viittaavat tutkimuslaboratorio, jossa kuvataan analyysi. Riskin minimoimiseksi PCR-amplikonin saastuminen, sokaisi XMRV-PCR testaus suoritettiin erikseen 3 riippumattomissa laboratorioissa.

Tulokset

XMRV ei havaittu Vasta Kerätyt eturauhassyöpänäytteissä ja arkistoinnin VP62 Tissue by microarray seulonta

ViroChip microarray [2], [3], [44], [45], käytettiin seulomaan RNA-näytteet eristettiin eturauhasen kasvaimista kerättiin takautuvasti 39 yksilöitä, joista 16 yksilöt olivat genotyyppi kuin kätkeminen R462Q RNaasia L mutaatio (QQ), 10 yksilöt olivat heterotsygoottinen tapausta (RQ), ja 13 oli villin tyypin tapausta (RR). Testaus suoritettiin täysin sokaissut jotta voidaan poistaa bias. Arkistointia eturauhasessa, joka vastaa aiemmin XMRV-positiivisia VP62 näyte (QQ) ja peräisin samasta kudoksesta lohko käytettiin alkuperäisessä 2006 Urisman

et al.

Tutkia [1], jota myöhemmin kutsutaan nimellä VP62 (2012) oli saatavilla myös microarray seulontaan. Hierarkkinen ryhmittely lämpöä kartta analyysi paljasti, että 39 kasvaimet sekä uutettiin uudelleen VP62 (2012) näyte oli negatiivinen XMRV (Fig. 2, ”2012”).

Näytteet analysoitiin käyttäen ViroChip, yleiseurooppalainen virus-DNA tunnistus mikrosiru (x-akseli). Lämpö Kartta näyttää valitun klusteri, joka koostuu 96 gammaretrovirus antureista (y-akseli) ja vastaavat saman klusterin havaittiin 2006 tutkimuksessa Urisman,

et al

[1]. Punainen värikylläisyyden ilmaisee normalisoitua suuruutta hybridisaation intensiteetti. Mikrosiruja vastaa keskeisten näytteet korostettu (nuolet). Vain eturauhassyöpänäytteissä VP35 ja VP42 todettiin johdonmukaisesti positiivisia XMRV sekä kokonais- ja polyA-RNA [1].

XMRV ei havaittu Vasta Kerätyt eturauhassyöpänäytteissä ja arkistoinnin VP62 Tissue by Nucleic Acid testaus (NAT) B

kolme eri tutkimuslaitokset (Veren Systems Research Institute, Abbott Laboratories, ja Cleveland Clinic) suorittaa riippumatonta PCR-pohjainen nukleiinihappotesteille varten

gag, pol

tai

env

geenejä XMRV, vastaavasti. RNA eturauhassyöpäkudoksille vastaten 39 yksilöiden tunnistettu ennakoivassa tutkimuksessa alun perin uutetaan erillisessä hiiri-vapaa, XMRV PCR-amplikonin vapaan laboratorio (University of California, San Francisco). Koodattu RNA rinnakkaista jaettiin sitten sokkona kuhunkin 3 laboratorioiden XMRV NAT. Herkkyys ja spesifisyys suorituskykyominaisuudet kunkin 3 nukleiinihappotesteille on arvioitu aiemmin [25], [39], [46]. Kaikissa 3 laboratoriot, yksikään 39 näytteillä oli havaittavissa XMRV sekvenssit (taulukko 1). Negatiiviset tulokset saatiin myös arkistointia VP62 (2012) näytteessä kaikki 3 XMRV

gag, pol,

ja

env

määrityksiä. Sen sijaan positiivinen kontrolli käyttämällä GADPH (BSRI tai Cleveland Clinic) ja β-globuliini (Abbott) monistettiin onnistuneesti kunkin näytteen.

XMRV Havaittu RNA uutteet Vastaa Aiemmin XMRV-Positive Eturauhassyöpä Näytteille Microarray ja NAT

rajallinen määrä kokonaan tai polyadenyloitujen (polyA) RNA-näytteet (n = 21, mikä vastaa 14 ainutlaatuinen näytettä) alkuperäisestä 2006 tutkimuksen Urisman,

et al.

[1], 6 aiemmin havaittu olevan XMRV-positiivinen ja 8 XMRV-negatiivinen, oli saatavilla riippumatonta uudelleen analyysin. 21 RNA-näytteet analysoitiin ensin käyttämällä ViroChip mikrosirulla. Yhdenmukaisia ​​aiempien tulosten kanssa [1], positiivinen hybridisaatiosignaali yksinomaan koostuu gammaretrovirus antureista ja vastaavat XMRV havaittiin vain RNA otteet 6 aiemmin XMRV-positiivista näytettä ja 22Rv1 positiivinen kontrolli (Fig. 2; Taulukko 2). Jälkeen mikrosiruanalyysi, saatavilla jäljelle jäänyt materiaali, joka vastaa 17 kokonais- ja /tai polyA RNA-näytteet (13 ainutlaatuinen näytettä) testattiin XMRV mukaan

gag

RT-PCR: llä. Kaikki PCR-tulokset olivat yhdenmukaisia ​​mikrosiru (taulukko 2), ja kaikki positiivinen PCR tulokset sekvenssi varmistettiin olevan XMRV ja toista ei MLV variantti, jossa on 98-99% identtisyys kanoninen 22Rv1 XMRV sekvenssi (GenBank FN692043 ).

XMRV ei havaittu Vasta Kerätyt eturauhassyöpänäytteissä ja arkistoinnin VP62 Tissue FISH

Fluoresenssi

in situ

-hybridisaatio (FISH) käytettiin seulomaan läsnäolo XMRV genomisten sekvenssien formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kudososat VP62 (2012) ja 19 vasta kerättyjen tuumorien (alijoukon 39 yksilöiden ennakoiva tutkimus). Niistä 19 henkilöä, joiden kasvaimet analysoitiin, 11 henkilöä genotyypattiin kuin kätkeminen R462Q RNaasia L mutaatio (QQ), 3 henkilöä oli heterotsygoottinen tapausta (RQ), ja 5 olivat villin tyypin tapausta (RR). Kaikki näytteet olivat kauttaaltaan negatiivisia kanssa XMRV-spesifistä koetinta (edustaja kentät on esitetty Fig. 3, D ja JL), vaikka värjäyksen XMRV-tartunnan 22Rv1 soluissa oli positiivinen (Fig. 3A), ja positiivinen sisäinen ohjaussignaali, joka vastaa sentromeerisen kromosomin alueen 8 (CEP8) havaittiin yhdenmukaisesti (Fig. 3, C, F, ja I). Siten tutkiminen FFPE jaksoihin FISH ei ole todettu XMRV infektio eturauhassyöpäkudoksille riippumatta RNAasi L genotyypin.

Koetin hybridisaatioseosta sisältävä XMRV-SO koetin (täyspitkä XMRV VP62) ja CEP8- SA sisäisen valvonnan anturi (komplementaarinen sentromeerinen alueelle ihmisen kromosomin 8) levitettiin kunkin dian. (A) edustaja kuva XMRV-SO oranssi värjäys solusta seoksesta DU145 (infektoitumattomien; negatiivinen XMRV värjäytyminen) ja 22Rv1 (XMRV-tartunnan; vahva positiivinen XMRV värjäytyminen), jossa on kaksi positiivisesti värjäytyneiden solujen. (B) DAPI tumavärjäystä. (C) CEP8-SA aqua värjäys havainnollistaa kaksi ja kolme CEP8 aqua signaalit per 22Rv1 ja DU145 solu, vastaavasti; (D-F) edustaja kuvia FFPE eturauhassyövän kudosleikkeiden potilaasta VP62 (XMRV-SO, DAPI, ja CEP8-SA, vastaavasti). Ei XMRV-SO oranssi havaittavaa värjäytymistä. Valkoiset suorakulmio hahmotellaan alueen suurennettuna paneelit G-I (G-I) suurennettu kuva FFPE eturauhassyövän kudosleikkeiden potilaasta VP62 (XMRV-SO, DAPI, ja CEP8-SA, vastaavasti). Tällä suurennos, CEP8-SA aqua värjäytyminen on selvästi näkyvissä (paneeli I; valkoiset nuolet esiin kaksi edustavaa CEP8 aqua signaaleja). (J-L) Kuvat ovat näkyvissä mitään XMRV-SO oranssi värjäytymisen FFPE eturauhassyövän kudososat 3 edustavasta potilaasta (joukossa takautuvasti kerättyjen kohortti 39 potilasta).

Ei serologisia merkkejä XMRV Infection eturauhassyöpäpotilailla

39 plasmanäytteissä vastaavat henkilöt tunnistettu ennakoiva tutkimus seulottiin vasta-aineiden läsnäolon XMRV tai muita MLV. Poista valinta oli reaktiivisia p15E transmembraaniproteiini, ja vain kaksi näytettä olivat heikosti reaktiivisia gp70-vaippaproteiinin (Fig. 4). Kuitenkin myöhempi testaaminen kahden gp70-reaktiivista näytteitä p30 määrityksessä havaittu mitään havaittavia vasta-aineita p30 kapsidiproteiinia. Näin ollen nämä tiedot eivät tarjoa serologisia todisteita XMRV tai muiden MLV-infektion näillä potilailla.

Evaluation of 39 plasmanäytettä eturauhassyöpä potilaiden vasta-aineiden läsnäolon ja XMRV /MLV käyttämällä yhdistelmä-pohjainen XMRV p15E ja gp70 chemiluminsescent mikrohiukkasten immunomääritykset (CMIAs) [70]. X-akseli edustaa CMIA signaali ilmaistaan ​​yksikköinä luonnon log-muunnetun signaalin suhde näytteen cutoff (log N S /CO); arvo on suurempi kuin 0, pidetään positiivisina. Signaalit positiivisten kontrollien (PC1 ja PC2), joka vastaa XMRV-tartunnan makakit plasma ja negatiivisen kontrollin (NC), joka vastaa normaalia verenluovuttajana on korostettu tummanvihreä.

Full-Length genomien XMRV ovat läsnä RNA Otteita Aikaisemmin Positive eturauhassyöpänäytteissä

alkuperäisessä 2006 paperin Urisman,

et al.

[1], kolme täyspitkää ~8.2 kb genomien XMRV saatiin talteen by PCR ja sekvensointi kloonattujen PCR-fragmenttien 3 eri eturauhassyöpänäytteissä (VP35, VP42, ja VP62). Luonnehtia niiden virusgenomeja syvällisemmin, me analysoitiin RNA otteita näistä 3 näytteistä puolueeton seuraavan sukupolven, tai ”syvä” sekvensointi. Noin +14,6-+18.300.000 satunnainen haulikko lukee kertyi näytettä kohti, ja 4713, 34192, ja 2131 lukee kartoitettiin sen XMRV genomien vastaava VP35, VP42, ja VP62, vastaavasti (kuvio. 5). Kartoitettu lukee edustaa kattaa koko genomin kunkin näytteistä, syvimmällä kattavuus saavutetaan VP42.

De novo

kokoonpanoon 1 kb alueita ilman viittausta genomin tuotetaan peräkkäisiä sekvenssejä (jatkumot), jotka kohdistettu eniten samankaltaisuutta XMRV genomit eikä niihin liittyviä MLV (tuloksia ei ole esitetty). Ei lukee vastaavat hiiren mitokondrioiden tai intrakisternaalisen A-hiukkasten (IAP) sekvenssit havaittiin näissä 3 näytettä syvä sekvensointi ja erityiset RT-PCR: llä (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että täyspitkä XMRV genomi on läsnä kaikissa 3 kliinisissä näytteissä, ja vastustavat mahdollisuus sekainfektio muiden MLV-retrovirusten tavoin. Syvä sekvensointi RNA otteita uudelleen uutettu arkistointi VP62 (2012) kudos suoritettiin myös. Tärkeää on, kun taas RNA-näytteestä VP62 uutetaan vuonna 2006 oli positiivinen XMRV, RNA: ta samalla eturauhasen kudoksen 2012 todettiin olevan negatiivisia paitsi ViroChip ja PCR: ää (Fig. 2, taulukko 1), mutta myös syvä sekvensoinnilla, ilman XMRV sekvenssit havaittu 4 miljoonasta syvä sekvensointi lukee (Fig. 5).

RNA otteita 22Rv1 ja LNCaP, eturauhassyöpä kudoksia 2006 Urisman,

et al.

tutkimus [VP35, VP42, ja VP62 (2006)], ja uutettiin uudelleen kudosta VP62 näytteestä, VP62 (2012), analysoitiin puolueeton syvä sekvensoinnilla. Lukee kartoitetaan aiemmin sekvensoitu XMRV genomin vastaavat kutakin näytteistä, lukuun ottamatta lukee LNCaP, jotka on kartoitettu 22Rv1 liittyvän genomin (Genbank-numero FN692043). Kattavuus (y-akseli) saavuttaa kussakin asemassa pitkin ~8.2 kB XMRV genomin (x-akseli) on merkitty logaritmisella asteikolla. Lyhenteet: nt, nukleotidi.

puute moninaisuuden XMRV paljasti Deep Sequencing

Vuonna 2011 Paprotka,

et al.

Raportoitu että XMRV todennäköisesti alkunsa kautta rekombinaatiolla 2 hiiren endogeenisen retrovirukset, PreXMRV-1 ja PreXMRV-2, aikana

in vivo

siirrostamalla ihmisen eturauhassyövän ksenograftin CWR-R1, jolloin perustaminen XMRV-tartunnan 22Rv1 solulinjassa [38]. Konsensussekvenssi 22Rv1 liittyvän XMRV on lähes identtinen virusgenomien eristetty eturauhassyövän ja CFS potilaille, mukaan lukien VP35 (13 epäsuhta), VP42 (8 epäsuhta), ja VP62 (5 epäsuhta). Määrittää tarkka suhde sekvenssien konsensus 22Rv1 genomin ja 3 XMRV genomien talteen alkuperäisessä 2006 Urisman,

et al.

Tutkia [1], yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) analyysi nukleotidin erot 22Rv1 konsensus-sekvenssin ja aiemmin julkaistu sekvenssit VP35, VP42 tai VP62 suoritettiin (Fig. 6). SNP-analyysi paljastaa, että raportoitu vaihtelua julkaistun genomit 2006 todennäköisesti seurausta virheistä aikana lisättyä PCR tai sekvensointi UCSF eikä luontainen phylogenetic monimuotoisuutta XMRV [47]. Kun nämä virheet korjataan perusteella tarpeeton syvä sekvensointi kattavuus, lopullinen konsensussekvensseihin VP35, VP42, ja VP62 ovat keskenään identtisiä, ja että 22Rv1 konsensussekvenssin, kuten aiemmin on kuvattu luonnon polymorfismi (A → G) asemassa 790 [23], [38].

SNP-analyysi, yhden nukleotidin eroja sekvenssit 22Rv1 liittyvien XMRV ja XMRV genomien on havaittu eturauhassyöpäkudoksille [VP35, VP42, ja VP62 (2006)] ( punainen tikkareita) korjataan syvä sekvensointi kattavuutta data (musta tikkareita). Syvyys luku kattavuus saavutetaan nukleotidin asemassa, joka vastaa kunkin SNP alla näkyy x-akselin. Kaikki lukee kattaa tietyssä asennossa tuotti saman (korjattu) nukleotidi, mikä osoittaa, että edellinen nukleotidin eroja julkaistu genomien [1] (punainen tikkareita) johtuvat sekvensointi virheestä. Luonnollinen A → G polymorfismi XMRV genomissa [23], [38] on läsnä asemassa 790 (syaani tikkari). Huomaa, että XMRV konsensus genomeja liittyy 22Rv1, LNCaP ja 3 XMRV-positiivisten eturauhassyöpäkudoksille ovat identtisiä.

XMRV Infektio on 2003 LNCaP Cell Line paljasti Deep Sequencing

epäonnistuminen havaita XMRV palauttamisessa uutettu arkistomateriaalia päässä VP62 näytteestä ja puute sekvenssidiversiteetin joukossa XMRV VP35, VP42, ja VP62 konsensus genomien esiin mahdollisuuden saastumisen eturauhassyöpänäytteissä vuonna 2006 Urisman,

et al.

tutkimuksen laboratoriossa johdettu solulinja joko tiedetään saaneen XMRV, kuten 22Rv1 [35], [38], tai pystyy tukemaan XMRV infektio ja mahdollisesti tartunnan, kuten LNCaP [43], [48]. Me perusteltu, että saastuminen XMRV-tartunnan LNCaP-soluissa todennäköisempää koska laboratoriossa Cleveland Clinic suorittaa nukleiinihapon uuttokertaa 2004 samanaikaisesti kanssa LNCaP ja oli vain työskennellyt 22Rv1 on yli 2 vuotta ennen. Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi, alikvootit 2003 LNCaP-soluja Cleveland Clinic laboratorio- ja 2012 LNCaP solut UCSF Cell Culture Facility testattiin XMRV mukaan

gag

RT-PCR: llä (Fig. 1). LNCaP-solut käsitellään laboratoriossa vuodesta 2003 olivat positiivisia XMRV, kun taas LNCaP vuodesta 2012 olivat negatiivisia. XMRV-positiivisten 2003 LNCaP jälkeen solut analysoitiin edelleen puolueeton syvä sekvensoinnilla. Kaikkiaan 10896742 raaka syvä sekvensointi lukee, 40844 lukee oli kartoitettu 22Rv1 liittyvän XMRV genomin (Fig. 5, ”LNCaP (2003)”), ja tuloksena saatu konsensus kokoonpano havaittiin olevan identtinen 22Rv1 liittyviä XMRV (Fig. 6, ”LNCaP (vuodesta 2003 konsensus)”).

Whole-Genome XMRV ja mitokondrio SNP-analyysi tukee todennäköisyys näytteen epäpuhtauksien XMRV-Infected LNCaP Cell Line

luonnehtia sisäisen kannan monimuotoisuutta LNCaP- ja 22Rv1 liittyvä XMRV genomeja, SNP analyysi koottu XMRV genomien 471X ja 540X keskimääräinen kattavuus, vastaavasti, suoritettiin. Variantteja sisällä XMRV genomit havaittiin olevan harvinaisia, ja vain 25 SNP: havaittu LNCaP ja 19 SNP: havaittu 22Rv1 taajuudella cutoff 3% (Fig. 7A ja B, taulukot S1 ja S2). Mielenkiintoista, kolme yleisintä SNP variantit havaitut LNCaP ja 22Rv1 liittyvä XMRV genomien, edellä mainittu A → G polymorfismi asemassa 790, A → G polymorfismi asemassa 4264 ja C → G polymorfismin asemassa 8112, voi myös olla löytyy VP35, VP42, ja VP62 XMRV genomeja, sillä poikkeuksella, että C-→ G-polymorfismi ei ole havaittu VP35 puutteen vuoksi sekvenssin kattavuus. Kaiken kaikkiaan enemmän SNP mistä LNCaP-liittyvä XMRV niinkään 22Rv1 liittyvät XMRV havaittiin jaetaan eturauhassyövän XMRV genomeja. Lisäksi, variantin SNP taajuuden polymorfisen 790 asentoon, joka vaihtelee välillä 13,6% ja 16,4% eturauhasen syöpä XMRV genomeja, oli verrattavissa LNCaP-liittyvä XMRV (18,3%) kuin varten 22Rv1 liittyvän XMRV (3,4% ) (Fig. 6). Nämä havainnot lainataan lisätukea lähtökohta eturauhassyöpäkudoksen saastuttamia XMRV-tartunnan LNCaP, eikä 22Rv1 solut.

SNP analyysiä syvä sekvensointi lukee vastaavat XMRV genomien 22Rv1 (A) ja LNCaP ( B), sekä mitokondrioiden genomit näiden kahden solulinjan (C) suoritettiin. (A ja B) SNP variantteja sisällä XMRV genomin 22Rv1 ja LNCaP (x-akseli) on esitetty yleisyyden mukaan alenevassa järjestyksessä (y-akseli). Jaettu SNP XMRV genomien vastaa 3 XMRV-positiivisten eturauhassyöpänäytteissä (VP35, VP42, VP62) ja LNCaP (z-akseli) taajuudella sulku 0,5% piirretään kuvaaja, keskeisten SNP korostettu punaisella. SNP kanssa variantti taajuuksilla 0,5% piirretään nolla; puuttuvat arvot (tyhjä neliöt) viittaavat SNP kantoja, joiden osalta kattavuus on 10X. (C) SNP variantteja sisällä mitokondrioiden genomin 22Rv1 ja LNCaP esitetään (x-akseli), jossa taajuus kunkin 22Rv-1- /LNCaP-liittyvä SNP koko väestön, joka määritetään populaation tason ihmisen mitokondrioiden tietokanta [50], suluissa. Kunkin eturauhasen syöpään liittyvän mitokondriaalisen genomin (z-akseli), vähemmistö SNP taajuus (y-akseli) on piirretty solulinja liittyvä SNP variantti (x-akseli), käyttäen rajataajuusominaisuudet 3%. Jokaisen vähemmistö SNP tunnistettu, variantti taajuus ja kattavuus vastaavassa nukleotidipositiossa näkyy. Vähemmistö SNP kanssa variantti taajuuksilla 3% piirretään nolla; puuttuvat arvot (tyhjä neliöt) viittaavat SNP kantoja, joiden osalta kattavuus on 30X. Huomaa, että VP62 näyte osakkeiden 146C mitokondriaalisen SNP kanssa LNCaP (tähdellä).

tutkia tätä mahdollisuutta, me seuraavaksi etsittiin todisteita suoraan saastumisen eturauhassyöpänäytteissä by XMRV-tartunnan LNCaP tai 22Rv1 käyttäen mitokondrion RNA (mtRNA) profilointi strategiaa. ~16.5 Kb mitokondrioiden genomien 22Rv1 ja LNCaP olivat koottu 555977 ja 171418 mtRNA syvä sekvensointi lukee, vastaavasti. Oli 6 nukleotidin eroja LNCaP mitokondrion genomiin ja 13 eroja 22Rv1 mitokondrion genomissa suhteessa ihmisen mitokondrioiden Cambridge Reference Sequence (CRS) (GenBank NC_012920) [49]. Mitokondrioiden genomit VP35, VP42, ja VP62 sitten koota talteen mtRNA lukee ja skannattiin vähemmistön SNP: joka viittaisi esiintyville saastuminen LNCaP tai 22Rv1 cell line-liittyvän mitokondriaalisen sekvenssejä (Fig. 7C). Käyttämällä sulku 3% määritellä vähemmistö SNP, 6 6 SNP yhteistä on mitokondrioiden genomien VP42 ja LNCaP ja 5 6 SNP yhteistä on VP35 ja LNCaP havaittiin. Muihin hajallaan vähemmistö SNP: t havaittiin jaettava mitokondrioiden genomit VP35, VP42, VP62, LNCaP ja 22Rv1. Ei SNP: t, jotka vastaavat joko LNCaP tai 22Rv1 mitokondrion genomissa havaittiin tahansa XMRV-negatiivisista näytteistä, mukaan lukien arkistointia VP62 (2012) näyte. Läsnäolon lisäksi SNP: joka yksilöi VP35, VP42 tai VP62 (tietoja ei esitetty) vahvistaa, että eturauhasen kudosta RNA oli läsnä, ja siten, että jaettua vähemmistö SNP: t olivat seurausta LNCaP ja /tai 22Rv1 saastumista. Perustuen osuudet SNP variantteja ihmisen väestön arvioitu populaatiosta tason mitokondrioiden tietokanta (mtDB) [50], todennäköisyys jakaa kaikki 6 SNP yhteistä välillä VP42 ja LNCaP sattuman arvioidaan olevan alle 0,00146 %.

keskustelu

tässä tutkimuksessa tutkimme oletetun yhdistyksen välillä XMRV ja eturauhassyöpää yhdistämällä microarray, PCR, FISH, serologiset ja syvä sekvensointi lähestymistapoja. XMRV ei havaittu uusi sarja 39 takautuvasti kerättyjen eturauhasen kasvaimia (kanssa tai ilman RNaasi L mutaatioita) PCR määritykset suoritettiin itsenäisesti 3 eri laboratorioissa tai ViroChip mikrosirun. Lisäksi XMRV ei havaittu arkistointia VP62 kudoksen aiemmin havaittu olevan XMRV-positiivinen [1]. Nämä negatiiviset löydökset tukivat epäonnistuminen havaita XMRV sekvenssien 19 vastikään kerättyjen eturauhassyöpänäytteissä ja arkistointia VP62 kudoksen FISH. Lisäksi emme onnistuneet havaitsemaan vasta-vasteita XMRV plasmassa näytteitä 39 potilaalla, joilla on eturauhassyöpä, päätelmä havaittiin myös hiljattain toisessa tutkimuksessa [51] Yhdessä esitetyt tiedot tässä vahvasti siihen, että ei ole yhdistyksen välillä XMRV infektio ja eturauhasen syöpä, riippumatta RNAasi L tilan.

alkuperäisessä 2006 tutkimus Urisman, et ai. sekä 2010 tutkimuksen Arnold et al. [1], [9], XMRV havaittiin pienellä osalla ei-pahanlaatuisten stroomasolujen FISH. On epäselvää, miksi XMRV havaittiin FISH näissä aiemmissa tutkimuksissa, mutta ei nykyisessä tutkimuksessa, jossa uutta analyysia arkistointia VP62 kudosta. Tässä käytimme suoraan leimatun täyspitkä plasmidi XMRV koetin on korkea etiketti inkorporaationopeutta [52], joka tuotti selvän pistemäistä värjäytymistä kuvio 22Rv1 soluissa FISH (Fig. 3A). Huomattavaa on, että tämä uusi sondirakenne pystyi havaitsemaan ihmisen papilloomaviruksen (HPV) kohdunkaulan syöpäsolut kätkeminen 1-2 kopiota integroituneen HPV-16 solua kohden sekä kohdunkaulan syövän kudosleikkeiden (tuloksia ei ole esitetty). Jos siis integroitu XMRV oli läsnä kudoksissa tutkittiin tässä tutkimuksessa, se olisi pitänyt havaita FISH. On todennäköistä, että alhaisen taajuuden XMRV FISH-positiivisten eturauhasen solujen havaittiin aiemmissa tutkimuksissa [1], [9] edustavat epäspesifisen sitoutumisen artefakteja.

Sen tutkimiseksi, löytö XMRV saattanut aiheuttaa tahattoman laboratorio saastuminen, me uudelleen analysoitu saatavilla arkistointia RNA otteita eturauhassyöpänäytteissä otettu alkuperäisestä 2006 tutkimuksen Urisman,

et al

[1]. Microarray ja PCR-analyysi, aikaisempia havaintoja, että joissakin näistä näytteistä kanna XMRV sekvenssit toistettiin (Fig. 2; Taulukko 2). Lisäksi puolueeton syvä Sekvensointianalyysin 3 XMRV-positiivista näytettä (VP35, VP42, ja VP62), paljasti, että koko virusgenomin oli läsnä (Fig. 5). Epäonnistuminen havaita hiiren mitokondrio tai IAP sekvenssit näissä 3 näytteet myös tukevat väitettä, että nämä näytteet satama XMRV eikä liity hiiren endogeenisen gammaretroviruses.

Yksi havainnoista vastaan ​​puhuu laboratorion saastuminen mahdollisena lähteenä XMRV on ollut aste sekvenssimuuntelun havaittu XMRV genomien, jopa 2%

gag

ja

pol

fragmentteja [1], [14]. Vaikka raportoitu monimuotoisuus on erittäin alhainen retrovirusten yleensä [53], tietyt retrovirukset kuten HTLV-1 voi esiintyä verrattain alhainen luonnon sekvenssimuuntelun, on kantoja, luonnossa, jotka ovat 96-99% identtisiä [54]. Kuitenkin, SNP tietojen perusteella, syvä sekvensointi paljastaa, että konsensus-sekvenssit XMRV VP35, VP42, ja VP62 genomit ovat itse asiassa identtisiä toistensa ja konsensus 22Rv1 liittyvän XMRV kannan (Fig. 6). Näin ollen, aiemmin raportoitu sekvenssin monimuotoisuus eri kantojen välillä vuonna 2006 tutkimuksen, jonka Urisman,

et al.

[1] ja oletettavasti muiden oi- keudet tai osittain sekvensoidaan XMRV genomien esiintyvällä Taq-polymeraasin virheistä käyttöön PCR: n aikana