Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) kasvain DNA on ominaista kromosomivaurioista nimeltään kromosomi epävakaus (CIN) ja liian lyhentää telomeres. Jopa 80% CRC on microsatellite vakaa (MSS) ja on perinteisesti pidetään kromosomikoodattujen epävakaa (CIN +). Kuitenkin kasvain fenotyypitys kuvaa joitakin MSS CRC vähän tai ei lainkaan geneettisiä muutoksia, ollen siten kromosomiin vakaa (CINEMA). MSS CINEMA kasvaimia ei ole arvioitu telomere poistumaa.

Experimental Suunnittelu

MSS peräsuolen syöpiä potilailta ≤50 vuotias vaiheen II (B2 tai uudempi) tai vaiheen III tauti arvioitiin CIN, telomeeripituuden ja telomeerivasta huolto mekanismi (telomeraasin aktivointi [ ,,,0],TA] vaihtoehtoisia pidentyminen telomeres [ALT]). Suhteellinen telomeeripituuden mitattiin qPCR somaattisten epiteelin ja syöpä DNA. TA mitattiin trapetsi määrityksen, ja kasvaimet arvioitiin läsnäolon C-piireissä osoitus ALT. p53-mutaation tila arvioitiin kaikki saatavilla näytteissä. DNA kopioluvun muutoksia arvioitiin Spectral Genomics aCGH.

Tulokset

Kasvaimet luokiteltiin kromosomikoodattujen vakaa (CINEMA) ja kromosomikoodattujen epävakaa (CIN +), jonka aste DNA kopioluvun muutoksia. CINEMA kasvaimet (35%; n = 6) olivat vähemmän kopiomäärä muutoksia ( 17% niiden kloonien DNA kopio muuttuu) kuin CIN + kasvaimia (65%; n = 13), joka oli korkea kopiomäärä muuttuu 20%: sta 49% klooneista. Telomere pituudet olivat enää CINEMA verrattuna CIN + kasvaimet (p = 0,0066) ja ne, joissa telome- ei aktivoitu (p = 0,004). Kasvaimet näytteille aktivointi telomeraasin oli lyhyempi kasvain telomeres (p = 0,0040); ja näyttivät olevan CIN + (p = 0,0949).

Päätelmät

MSS peräsuolen syöpä näyttää edustavan heterogeeninen ryhmä kasvaimia, jotka voidaan luokitella sekä sen perusteella, CIN aseman ja telomeerin huolto mekanismin . MSS CINEMA peräsuolen syövät näyttävät olevan pidempi telomeres kuin MSS CIN + peräsuolen syöpiä ja hyödyntää ALT sijaan aktivointi telomerase.

Citation: Boardman LA, Johnson RA, Viker KB, Hafner KA, Jenkins RB, Riegert-Johnson DL, et al. (2013) korrelaatio kromosomaalinen Epästabiilius, telomeeripituuden ja Telomeeri Maintenance mikrosatelliitti Stable peräsuolisyövän A Molecular alaluokka peräsuolen syöpä. PLoS ONE 8 (11): e80015. doi: 10,1371 /journal.pone.0080015

Editor: Michel M Ouellette, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 30, 2013; Hyväksytty: 27 syyskuu 2013; Julkaistu: 21 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Boardman ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Cancer Institute (R01 CA132718 ja P50 CA102701 Mayo Clinic SPORE in Haimasyöpä); National Institute of Diabetes ja Ruuansulatusjärjestelmään ja munuaistautirekisteri (P30 DK084567 Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology); Lustgarten Foundation for Haimasyöpä; ja Mayo Clinic Center for Yksilöllistä Medicine. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) voidaan jakaa kasvaimia näytteille kromosomi epävakaus (CIN +) verrattuna niihin, joilla ehjä karyotyyppi ja kromosomi vakautta (CIN). Perinteisesti vain kasvaimista vialliset DNA mismatch korjaus (dMMR), joka tunnetaan myös microsatellite epävakaa kasvaimet, (MSI (H)), katsottiin olevan CINEMA, ja CIN + kasvaimet ajateltiin olevan ehjä dMMR ja olla microsatellite vakaa (MSS) . Kuitenkin, useat tutkimukset ovat osoittaneet, että jopa 50% MSS kasvaimet ovat CINEMA, ja merkittävä, mutta pienempi osuus MSI (H) ja peräsuolen kasvaimet ovat CIN + [1,2]. Vaikka MSI (H) kolorektaalisyövissä liittyy parempi ennuste kuin MSS kasvaimet, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että taso kromosomi epävakaus, eikä mikrosatelliitti tila, on hyödyllinen ennustetekijöiden markkeri [3]. Erityisiä fenotyyppejä liittyvä MSS CINEMA alatyypin ovat huono kasvain eriyttäminen, mucinous histologia ja alhaisemman p53 mutaatioita [1,4]. Lisäksi CRC että syntyy nuorempina ( 50 vuotias) on todennäköisemmin MSS diploidinen, jossa diploidiaan ollessa korvike mitta kromosomi vakautta. Kromosomikoodattujen vakaa (CINEMA) microsatellite vakaa (MSS) CRC on suhteellisen uusi luokitus CRC joka on toinen kehys ymmärtämään polkuja taustalla syöpä.

Lyhennetty telomeres on yhdistetty kromosomaaliseen epävakaus (CIN) asettamisessa ikään liittyvien sairauksien liittyvien geneettisten häiriöiden ja syövän syntymistä [5]. Telomeerit koostuvat toista TTAGGG sekvenssejä, jotka suojaavat päät lineaarisen kromosomien jätetään alttiita vaurioita, ja huonosti lyhentäminen telomeres on liitetty esiasteena kromosomi epävakautta. Kriittisesti lyhyt telomeres paljastaa kromosomi päät, kytke DNA-vaurioita vastaus, ja sakka end-to-end fuusioiden ja rekombinaatiotapahtumia. Ensisijainen nisäepiteelisoluissa lyhyemmillä telomeres ovat useammin mukana mis-eriytymisen tapahtumia ja näytteille paitsi kromosomi uudelleenjärjestelyt vaan myös kromosomien lukumäärän muutoksista [6], mikä osoittaa, että lyhyempi telomeeripituuden saattaa mahdollistaa kehittämisen CIN. Telomeeripituuden sisään DNA MSS CINEMA kasvaimista ei ole arvioitu.

Telomeerit voidaan pidentää aktivoimalla ribonukleoproteiiniyti- käänteistranskriptaasin nimetty telomeraasia [7] .. Telomerase aktivointi on läsnä monissa syövissä. Kriittisesti lyhentää telomeres normaalisti aloittaa solujen vanhenemista ja apoptoosia ja lopettaa leviämisen sisältävien solujen merkittävästi vaurioitunut DNA. Telomerase aktivointi voi tehokkaasti kuolemattomiksi syöpäsoluja palauttamalla tarpeeksi telomeeripituuden suojaamaan numeerisesti /ja rakenteellisesti muuttunut DNA neutralisoida DNA vaurioita vasteen ja käynnissä solujen vanhenemista. Toinen polku on telomeerien huolto, jonka kautta telomeerit voidaan reitittää senesenssiltä on vaihtoehtoisilla pidentäminen telomeres (ALT), joka on homologisen rekombinaation mekanismi, joka käyttää DNA-templaatin säilyttää telomeeripituuden [8].

pyrittiin määrittämään, jos erilliset telomere huolto reitti (s) olisi korreloi läsnä ollessa tai ilman CIN on MSS peräsuolen syöpä. Selventää edelleen ilmiö MSS CINEMA verrattuna CIN + peräsuolen syöpä, käytimme array CGH (aCGH) arvioida kasvainten rakenteellisista kromosomi- ja osa-kromosomi geneettisiä muutoksia.

Kuten edellisessä tutkimuksessa todettiin, että lähes 50% nuorista puhkeamista MSS CRC tapaukset joka syntyi proksimaalisessa paksusuolessa tai peräsuolessa olivat diploidinen virtaussytometrialla [9], tutkittiin vain nuorena puhkeamista tapauksissa ja keskityttiin peräsuolen syövät vastaavassa. Mittasimme telomeeripituuden vastaaviin ääreisverenkierron valkosolujen, normaali viereinen paksusuoli, ja peräsuolen syöpä DNA ja arvioinut peräsuolen syöpä DNA telomeraasi- aktivointia ja ALT onko jompikumpi kahdesta mekanismeja telomere huolto olisi korreloivat tasoa CIN nuorilla puhkeamista MSS peräsuolen syöpä.

Methods

malli valinta ja käsittely

Tutkimus hyväksyi Mayo Clinic Institutional Review Board. Olemme mukana peräsuolen syöpäpotilaiden kolmesta lähteestä: (1) Biopankkiverkosto ruoansulatuskanavan Health Research, prospektiivinen arkistoon koostuu selityksin biospecimens yksilöistä, joilla CRC oli arvioinnin Mayo Clinic Rochester, MN huhtikuusta 2000 vuoteen elokuuta 2005 ja joka on suostunut arkistossa; (2) peräsuolen syöpätapausta peräisin takautuvasti kerättyjen sarjan CRC potilaista, joille tehtiin kirurginen resektio Mayo Clinic (Rochester, MN) alkaen joulukuu 1995 huhtikuuhun 1997 [10] ja (3) prospektiivinen joukon CRC potilaista, joille tehtiin leikkaus alkaen 1987 kautta 1988 [11]. Valitsimme 19 osallistujille MSS peräsuolen syöpiä puhkeamista iässä ≤50 vuotias ja jotka olivat joko vaiheen II (B2 tai uudempi) tai vaihe III. Vain osallistujille verta ja /tai normaalin paksusuolen epiteelin ja kasvaimen kerätyistä näytteistä ennen mitään Chemo tai sädehoidon valittiin tähän tutkimukseen. DNA uutettiin periferaalisen veren leukosyyteistä käyttäen Gentra AutoPure ulossuolaus kemia (Gentra, Minneapolis, MN) ja kvantifioidaan UV-absorbanssilla. DNA laatu arvioitiin 260/280 optinen tiheys suhteen. MSI tila mitattiin käyttämällä yhdistelmää Immunohistokemian ja PCR perustuva analyysi MSI. Immunohistokemiallinen värjäys MLH1, MSH2, MSH6 ja PMS2, ja mikrosatelliitti epävakaus testaus suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [12]. Mikrosatelliittimarkkerin BAT26, D17S250; D5S346; ACTC, BAT40, BAT 25, BAT 34C4, D10S197, MYCL, ja D18S55 käytettiin arvioimaan MSI asema, ja kasvain oli nimeltään MSS jos mikään markkereita osoitti MSI ja kaikki immunostains osoittivat ehjiä ilmentymistä MMR proteiinien [13].

Tuumorikudos käsittelyä ja DNA: n eristämistä varten array CGH

Jäädytetyt kasvain näytteet käytettiin CGH array tutkimuksissa. Koko paksuudeltaan kasvain ja normaalin paksusuolen epiteelin kudokset leikattiin kirurgisista näytteistä, jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -70 ° C: ssa. Tissue leikkuu suoritettiin kryostaatissa -20 ° C: ssa. Kasvainkudoksessa oli makro-leikeltiin rikastamiseksi kasvaimen tiheys ( 70% kasvain ytimiä). Lyhyesti, 6 mikronin paksuinen jäädytetty kasvain osio värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla ja merkitty ohjeeksi dia meidän patologi (TCS) alueiden tunnistamiseksi, jotka sisältävät ≥ 70% kasvain ytimiä. Tämä dia käytettiin sitten tunnistamaan alue, joka vastaa jäädytetyn kasvaimen lohko vain alue varattu 70% kasvaimen tiheys on leikattu käytettäväksi kasvainkudoksessa lähde DNA. Oheisiin normaalia paksusuolen limakalvo, vähintään 8 cm kasvaimen raja oli microdissected varten epiteelikudosta. Osiot pantiin uuttopuskuriin ja genomista DNA uutettiin kasvain tai normaalista paksusuolen epiteelin DNA uutetaan fenoli /kloroformilla ja kvantifioidaan UV-absorbanssilla, ja DNA laatu arvioitiin 260/280 optinen tiheys suhteen. Kaikissa tapauksissa, DNA uutettiin sädehoitoa naiiveja peräsuolen syöpä.

Array CGH

aCGH suoritettiin käyttäen Spectral Chip ™ 2600 (Spectral Genomics, Houston, TX), joka sisältää 2600 BAC-kloonien täplikäs kahtena kappaleena. Sekä eteenpäin ja käänteinen merkintöjä kokeet tehtiin kunkin kasvaimen näytteitä. Leimaus ja hybridisaatio suoritettiin valmistajan protokollan varten Spectral Chip ™ 2600. Ultra-puhdasta deionisoitua H

2O käytettiin valmistettaessa kaikkien reagenssien; Promega Mies Genominen DNA (Madison, WI) käytettiin viitteenä DNA; väriaine-kääntyminen kokeita, joissa 2 mikrosiruissa tehtiin kustakin yksilöstä vastavuoroisesti merkintöjä testin ja viite DNA. Testi ja viite DNA satunnaisesti alustettu leimaamalla yhdistämällä 2 ug genomista DNA ja DDH

2O kokonaistilavuuteen 50 ui ja sonikoimalla ylösalaisin cup torvi sonicator fragmenttien saamiseksi 600 ep 10 kilotavua. DNA uudelleenjärjestäminen suoritettiin Zymo Puhdas-up Kit (Orange, CA) mukaan protokollan. Eluenttina jaettiin tasan 2 putkien ja, kuhunkin 20 ui 2,5 x satunnaisia ​​alukkeita Invitrogenin (Carlsbad, CA) BioPrime DNA Labeling Kit lisättiin, sekoitettiin hyvin, keitettiin 5 minuuttia ja laitettiin välittömästi jäihin 5 minuutiksi. Kuhunkin lisättiin 0,5 ui Spectral Labeling Buffer (Spectral Genomics), 1,5 ui Cy3-dCTP tai 1,5 ui Cy5-dCTP: tä vastaavan kunkin väriaineen kääntyminen kokeessa (PA53021, PA55021; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), ja 1 ui Klenow fragmentti (BioPrime DNA Labeling Kit, Invitrogen). Sisältöä inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Sitten putkia kuumennetaan uudelleen kiehuvaksi 5 minuutin ajan ja palautettiin jäihin 5 minuutiksi. Toinen 5 ul: n alikvootti merkintöjä puskuria lisättiin seokseen ja putkia inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä tunnin ajan. Lopussa toisen tunnin, lisäämällä 5 ui 0,5 M EDTA, pH 8,0, ja inkuboimalla putkia kuiva-hauteessa 10 minuutin ajan 72 ° C: ssa pysäytetään leimausreaktioon. Näyte ja kontrolli-DNA seokset yhdistetään sitten näyteputken, 45 ui Hyb I (estää DNA: n ja lohen sperman kantaja-DNA: ta) lisättiin kuhunkin putkeen, ja 5 M NaCl: a ja 100% isopropanolia lisättiin putkiin DNA: n saostamiseksi. DNA-pelletit pestiin 70% etanolilla X1 ja sitten kuivattiin pimeässä. Sen jälkeen uudelleen kosteuttava pellettien vedellä, HYBII (hybrisol) lisättiin seokseen ja DNA denaturoitiin kymmenen minuuttia 72 ° C: ssa sen jälkeen esihybridisoitiin 30 minuuttia ennen niiden sijoittamista array ja peitetään 24X60mm kansi lipsahdus . Laseja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa uunissa.

Hybridisaation jälkeiset pesut suoritettiin jokaisen dian yksittäisissä syvällä Petri ruokia keinutuoli inkubaattorissa. Poistamisen jälkeen peitelevy, objektilasit lyhyesti liotettiin 0,5% SDS huoneen lämpötilassa. Kukin dia siirrettiin sitten 2X SSC, 50% deionisoitua formamidia, pH 7,5: ssa 20 minuuttia; sitten 2X SSC, 0,1% IGEPAL CA-630, pH 7,5: ssa 20 minuuttia, minkä jälkeen 0,2 x SSC, pH 7,5, 10 minuutin ajan, kukin esilämmitetty 50 ° C: seen ja sekoitettiin inkubaattorissa 50 ° C: ssa. Lopulta jokainen dia oli huuhdotaan nopeasti kaksi kylpyhuonetta huoneen lämpötilan DDH

2O ja heti puhallettiin kuivaksi puristetulla N

2 ja skannattu.

Array tietojen analysointi

Skannaus tehtiin Axon n GenePix 4000B mikrosiru skanneri (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ja kuvat analysoitiin Genepix Pro 3.0 valmistautua tiedostoihin käyräanalyysillä kanssa Spectralware ohjelmisto V2.2. (Spectral Genomics, Houston, TX). Täplät määriteltiin automaattista ruudukon piirre ohjelmistojen ja manuaalisesti tarvittaessa. Täplät näy yhtään signaalia tai ilmeisiä vikoja jätettiin data-analyysi, paikallinen tausta vähennettiin, ja yhteensä intensiteetit sekä fluoresenssin intensiteetti suhde nämä kaksi väriä, laskettiin kunkin täplän. Plot analyysi tehtiin käyttämällä online saatavilla oleva versio SpectralWare ohjelmisto (Spectral Genomics) käyttäen maailmanlaajuista keskiarvoa normalisoitumista tietoja. Lisäksi aineistot analysoitiin käyttämällä Microsoft Excel. Suorittamisen jälkeen globaali keskiarvo ja maailmanlaajuinen mediaani normalizations keskimääräinen suhteet neljä fluoresoivien signaalien (kaksi signaaleja päällekkäisiä klooni array ja kaksi signaaleja väri käänteinen koe) kunkin kloonin laskettiin. Kaikki analyysi tehtiin log

2 suhde. Vähentämään vääriä positiivisia tuloksia, kloonit osoittavat testi /Viiteosuus arvo ylittää 1,2 katsottiin saavuttanut ja kloonit osoittavat testi /viittaus suhdearvo pienempi kuin 0,8 katsottiin menetetty, mutta vain, jos tulokset kaikista neljästä fluoresoivien signaalien olivat yhdenmukaisia. Kloonit jätettiin analyysin ulkopuolelle, jos suhde arvot neljän hybridisoituneiden täplät kunkin kloonin ylittänyt raja-arvojen (0,8-1,2), joka ei ole yhtäpitävä aineen.

kvantitatiivinen PCR arviointi telomeeripituuden

telomeeripituuden arvioitiin kasvaimen DNA kaikista peräsuolen syöpätapausta ja joilla on riittävä normaalin paksusuolen epiteelin DNA käyttämällä DNA valmistettua array CGH määritys [14 ]. Kun osa tapauksista, PBL-DNA oli saatavilla ja se uutettiin käyttämällä Gentra AutoPure kemikaalien, kuten edellä on kuvattu.

Kaksi Master sekoituksia PCR reagenssit valmistettiin, jolla on T-alukeparia, toinen S-alukeparia. Viisitoista mikrolitraa T master mix lisättiin kuhunkin näytteeseen hyvin, hallita hyvin ja standardikäyrä hyvin ensimmäisen levyn ja 15 ui S master mix lisättiin kuhunkin näytteeseen hyvin, hallita hyvin ja standardikäyrä hyvin toisen levyn.

Kunkin näytteen määritettiin, kolme identtistä 5 ul: n DNA-näytteen (15 ng /näyte) lisättiin levyyn 1 ja toinen 3 alikvootteja lisättiin samalla hyvin asennossa levy 2. Kunkin standardikäyrän , yksi viittaus DNA-näyte laimennettiin sarjana TE 1: 2-kertaisesti per laimennus tuottaa kuusi DNA: n pitoisuuksia välillä 0,78 25 ng /ul.

Viisi mikrolitraa kutakin pitoisuutta jaettiin standardikäyrä kuoppiin kullekin levylle. Tämän jälkeen levyt suljettiin läpinäkyvällä liimalla kansi, sentrifugoitiin nopeasti 800 g ja kuljetetaan jäissä ABI 7900HT väline analyysiä.

T ja S PCR: t valmistettiin identtisesti lukuun ottamatta oligonukleotidialukkeita. Lopulliset pitoisuudet reagenssit PCR oli 20 mM Tris-HCl, 0,2 mM kutakin dNTP: tä, 2,0 mM MgCl², 1% DMSO: ta, 150 nM ROX väriainetta, 0,2 x SYBR Green I (Molecular Probes), 5 mM DTT: tä, 1,25 U AmpliTaq Gold DNA-polymeraasia (Applied Biosystems). Lopullinen telomere alukekonsentraatiot oli tel 1b, 600 nM; puh 2b 900 nm. Ohjaus geeni (B2-globiini kromosomissa 11) pitoisuudet oli HBB1 300 nm; HBB2 700 nm. Alukesekvenssejä (kirjallinen 5′- 3′) oli puh 1b: CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT;

p 2b: GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT;

HBB1: GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC;

HBB2: CACCAACTTCATCCACGTTCACC.

Kaikki PCR: t suoritettiin ABI Fast Real-Time 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Lämpösykli edellytykset molempien alukkeiden paria alkoi 95 ° C: ssa inkubaation 10 minuutin aktivoimiseksi AmpliTaq Gold DNA-polymeraasia. Sillä telomere PCR, tätä seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia, 54 ° C: ssa 2 minuutin ajan. Sillä HBB PCR, tätä seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia, 58 ° C: ssa 60 sekunnin ajan ja 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Aineisto analysoitiin sitten ABI SDS ohjelmisto tuottaa standardikäyrä kutakin levylle.

Menetelmät ABI 7900HT käyttämällä SYBR Green Dye 1

SYBR Green 1 kaksijuosteinen Binding Dye sitoutuu epäspesifisesti dsDNA ja synnyttää heräte liikenteen päästöt. Kvantitatiivista PCR, SYBR Green 1 käytettiin passiivinen viitaten väriaine (ROX). 7900HT väline analysoitiin jaksosta toiseen fluoresenssin muutoksen signaalin seurauksena monistuksen aikana PCR: llä. Normaalissa monistus PCR-tuotteen kolme aluetta luonnehtivat etenemistä PCR.

telomeeripituuden analyysi

Telomeeri pituudet mitataan PCR usein raportoidaan suhde telomere (T) ja vakio-geeni (S) mittaukset (T /S). Kuten emäsparin pituus on intuitiivisesti helpompi ymmärtää, suhteet muuttuivat emäsparin pituus käyttäen aikaisemmin validoitu kaava raportoitu tekniikalla Cawthon edellä on kuvattu [14]. Tulokset tilastollisten joissa verrattiin ryhmissä ovat samoja, onko T /S-suhteet tai telomeeripituuden käytetään. Kuten emäsparin pituus on intuitiivisesti helpompi ymmärtää, Southern blotit suoritettiin sen määrittämiseksi telomeerivasta restriktiofragmentin (TRF) pituus osajoukko osallistujat (n = 16) ja lineaarisen regression käytettiin vertaamaan TRF pituus on T /S-suhde , jolloin seuraava yhtälö: bp = [T /S] * 1470,8 + 7674,5, jossa 1470,8 edustaa suoran kulmakerroin suhteellista T /S-suhde mittausta telomeeripituuden emäspareina keskimääräisellä TRF ja 7674,5 on y-leikkaus.

p53-mutaation analyysi

Riittävä määriä kasvaimen DNA oli saatavilla 17 19 kasvainten testata somaattisten p53 mutaatioita.

PCR-monistus suoritettiin kokonaistilavuudessa 12,5 ui, joka sisälsi 5 ng genomista DNA: ta, kutakin aluketta 0,2 mM dNTP 0,2 mM, 2,0 mM MgCl

2, 0,5 U Taq-polymeraasia (AmpliTaq Gold, Applied Biosystems, CA), jossa PCR-reaktio puskurilla valmistajan toimittamia. Denaturoiva korkean erotuskyvyn nestekromatografia (DHPLC) analyysit, jota seuraa suora sekvensointi PCR-tuotteiden suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu (14).

koodaava sekvenssi ja liitoskohtaan sivustoja

TP53

eksonit 5-8 monistettiin PCR: llä käyttäen 4 paria introni alukkeita seuraavasti:

Exon5F 5 ’GCC GTC TTC CAG TTG CTT 3’

Exon5R 5 ’CAA CCA GCC CTG TCG TCT CT 3’

Exon6F 5 ’GGG GCT GGA GAG ACG ACA 3’

Exon6R 5 ’TCC TCC CAG AGA CCC CAG TT 3’

Exon7F 5 ’CTT GCC ACA GGT CTC CCC AA 3 ’

Exon7R 5′ AGG GGT CAG CGG CAA GCA GA 3 ’

Exon8F 5′ AAA TGG GAC AGG TAG GAC 3 ’

Exon8R 5′ AAG TGA ATC TGA GGC ATA AC 3 ’

Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin 25 ul: n reaktiotilavuudessa, joka koostuu 10 x PCR-puskuria II (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2 mM MgCI2: ta, 2,5 mM kutakin dNTP: tä, 10 uM kutakin aluketta, 0,75 yksikköä Taq AmpliGold DNA-polymeraasia (Applied Biosystems, Foster City, CA), ja 10 ng templaatti-DNA: ta. PCR suoritettiin käyttäen Tetrad lämpösyklilaitetta (MJ Research, Waltham, MA) kanssa seuraavissa olosuhteissa: alkudenaturaatio 94 ° C: ssa 9 minuuttia, jota seurasi 35 sykliä 94 ° C 30 sekuntia, (58 ° C 30 sekuntia eksonit 5,6,7) ja (55 ° C: ssa eksonin 8), 72 ° C: ssa 45 sekunnin ajan, ja lopullinen pidentäminen 72 ° C: ssa 10 minuutin ajan. PCR-tuotteet ajettiin 2%: isessa tarkistaa geeliä. PCR-tuotteet valmistettiin sekvensoimalla DNA seurasi: 5 ui PCR-tuotetta ja 1 ui kutakin eksonukleaasi ja 10X katkaravun alkalisella fosfaatti TUF puskuri sitten sai pitkän Tetrad lämpösyklilaite seuraavin ehdoin: 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan, 80 ° C: ssa 15 minuuttia. 1.6pmol pohjamaalia yhdessä mallin sekvensoitiin ABI PRISM ™ 3700 DNA Analyzer (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA 94404) Core Facility. Mutaatio Surveyor Software (SoftGenetics LLC, State College, PA) käytettiin analysoimaan tuloksia.

Arvio telomeraasin aktivaation CRC

Telomeraasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä TRAPeze

TM telomeraasin havaitseminen pakki. (Chemicon International). Macrodissected Kasvainkudosta homogenisoitiin 200 ul: aan 1x CHAPS lyysipuskuria ja inkuboitiin sitten 30 minuuttia jäillä ja sentrifugoitiin 4 ° C: ssa ja 12000 g 20 minuutin ajan. 2,0 ui tätä supernatanttia, 5,0 ui 10X TRAP-puskuria, 1,0 ui seosta, jossa oli 10x d-NTP, 1,0 ui TS alukeseosta ja 0,4 ui TaqDNA polymeraasia lisättiin kokonaistilavuudessa 50 ui. Telomere pidennys 30 ° C: ssa 10 minuutin ajan seurasi 30 PCR-sykliä 94 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. 10 ui PCR-tuotetta ajettiin 12% polyakryyliamidigeelillä ja värjättiin SYBR

TM kulta (Molecular Probes, Eugene, OR). Geeli valokuvattiin UV läpivalaisulaitteella ja tikkaat. Telomeraasiaktiivisuuteen ilmaistiin bändi suhde tikkaat PCR-tuotteen ja sisäisen valvonnan.

Arvio ALT

telomeerisesti C-Circle DNA ovat osittain yksijuosteisia telomere DNA piireissä erityisiä soluihin näytteille ALT [15]. C-piireissä arvioitiin kasvaimen DNA käyttäen isoterminen monistaminen C-ympyrän komplementaarinen juoste ja hybridisoimalla

32P- (CCCTAA)

3 anturi Capital Biosciences (Capital Biosciences, Maryland, USA). DNA-näyte otettiin ALT + jos C-piireissä havaittiin. C-ympyrät ovat kromosomin ulkopuolisessa telomeerisesti DNA koostuu osittain kaksijuosteisen telomeerisesti ympyrät osittain kaksijuosteisen telomeerisesti DNA jatkuvalla C rikas lohkon ja epätäydellinen G rikas lohkon. C-piireissä liittyvät vahvasti läsnä ALT [15].

Analyyttinen lähestymistapa

Muodosta CIN asema perustuu kromosomi tai -tappiot, tiedot analysoitiin R käyttämällä aCGH paketin Bioconductor [16].

Suodatus on tehty poistamaan unmapped klooneja, kloonit kartoitus on Y-kromosomi, ja kloonit puuttuvat yli 25%: lla. Sitten laskennalliset puuttuu havaintoja käyttäen LOWESS lähestymistapaa. Osa osallistujille voitot tai tappiot kunkin kloonin piirrettiin kromosomi määrä ja sijainti, jonka CIN tila (kuva S1).

Lisäksi Wilcoxonin testiä käytetään arvioimaan eron CRC kasvaimen telomeeripituuden välillä: 1) CIN + ja CINEMA peräsuolen syöpä, 2) ALT + ja Alt-näytteitä, ja 3) telomeraasi- + ja telomerase- näytteet [17]. Chi-neliö kokeet tai Fisherin testiä käytettiin arvioimaan yhdistyksen välillä ALT tila ja CIN tila, ja välillä telomeraasi- aktivoinnin tilan ja CIN tila. Spearman korrelaatio peräsuolen syövän kasvaimen telomeeripituuden ja prosenttiosuus klooni -tappioista laskettiin.

Tulokset

Array CGH evinced laaja vaihtelu DNA kopiomäärä vaihtuu

Tutkimme 19 nuorta ilmaantuvia MSS peräsuolen syövät todisteita CIN avulla aCGH koostuu noin 3000 BAC: ien. Olemme osoittaneet, että on olemassa MSS peräsuolen kasvaimia, jotka ovat hyvin alhaiset DNA kopioluvun muutoksia. Kuusi kasvaimet (32%) oli alhainen kromosomi häiriö 1%: sta 17% klooneista, joilla DNA kopiomäärä muutoksia ja luokiteltiin CINEMA mukaan aCGH. Kolmetoista kasvaimet (68%) oli 20% klooneista osoittaa DNA kopiomäärä muutoksia ja luokiteltiin CIN + ryhmä. MSS CINEMA kasvaimet oli 0 vähemmän kuin 5 kromosomi käsivarret, jotka olivat täysin saanut tai menettänyt verrattuna CIN + ryhmä, joka oli 8-18 kromosomi käsivarret osoittaa täydellistä voitto tai tappio (kuva S2).

Fraktio voitot tai tappiot CIN + ja CINEMA peräsuolen syöpä

osa osallistujille voittojen ja tappioiden kohden kromosomialueen henkilöille, joilla on CIN + peräsuolen syöpä verrattuna niihin, joilla CINEMA peräsuolen syövän näkyvät kuvassa S1. Erot voitot tai tappiot havaittu koko genomin, jossa voimakkain erot kromosomien 13, 17 ja 18 CIN + peräsuolen syöpä oli enemmän voittoja /tappioita kuin CINEMA peräsuolen syöpä (keskiarvo: 33,1 vs. 9,7, p = 0,0007, taulukko 1 ).

CIN +

CINEMA

Keskiarvo (SD) tai% Keskiarvo (SD) tai% p-valueFraction voitot /tappiot, keskiarvo (SD) 33,08 (8,76) 9,66 (7,92) 0,0007 telomeeripituuden, keskiarvo (SD) 8211 (308) 9178 (1396) 0.0066Telomerase0.0949 Yes80.0% 25,0% No20.0% 75,0% ALT0.2335 Yes50.0% 100,0% No50.0% 0,0% p530.3348 Yes36 0,4% 66,7% No63.6% 33,3% Taulukko 1. Ominaisuudet CIN + ja CINEMA peräsuolen syöpä.

Kolorektaalisyöpä kasvaimia arvioida array CGH luokiteltiin 1) CINEMA jos 20% klooneista osoittivat DNA-kopion numero muuttuu tai kun 2) CIN + jos ≥ 20% klooneista osoittivat DNA kopioluvun muutoksia. CIN + CRC oli suurempi määrä tapauksia, joissa havaittiin voittoja ja tappioita per geenivirhe verrattuina CINEMA CRC. CIN + CRC on huomattavasti lyhyempi kasvain telomeres (8211 emäsparia) kuin CINEMA CRC (9178 emäsparia; p = 0,0066). CIN + kasvaimet olivat todennäköisesti osoittaa aktivoitumisen telomeraasin kuin oli CINEMA CRC, vaikka ei ollut mitään korrelaatiota kanssa CIN asema kasvaimen ja kuinka usein kasvaimen käyttää vaihtoehtoista pidentämisestä telomeres kuin telomere huolto mekanismi (p = 0,2335). Läsnäolon p53 mutaatioita ei korreloi CIN tilan kasvain (p = 0,3348). CSV Lataa CSV

telomeeripituuden CIN + ja CINEMA peräsuolen syöpä

peräsuolisyövän telomeeripituuden oli merkitsevästi yhteydessä CIN asema, niin että CINEMA peräsuolen syöpä oli pidempi telomeres kuin CIN + peräsuolen syöpä (p = 0,0066, Kuvio 1). Telomeeripituuden myös korreloi merkitsevästi prosenttiosuus kloonien tai -tappioita (r = -0,50, p = 0,0310).

Panel V: telomeeripituuden kasvaimen DNA kromosomikoodattujen vakaa (CINEMA) peräsuolen syöpä on huomattavasti pidempi kuin kromosomiin epävakaa (CIN +) peräsuolen syöpä (p = 0,0066). CIN asema määräytyy CINEMA jos alkaen 20% klooneista osoittavat DNA: n kopioiden määrä voittoja ja tappioita. Peräsuolen syöpä on CIN + jos enemmän kuin 20% klooneista on voittoja ja tappioita.

Paneeli B: aktivointi telomeraasin (Telomerase +) in peräsuolen syövän korreloi lyhyempi kasvaimen telomeeripituuden kuin kasvaimia, jotka eivät käytä telomeraasin (Telomerase -) kuin telomere huolto mekanismi (p = 0,0040).

joukossa CINEMA kasvaimet, telomeerit olivat enää kasvaimen DNA verrattuna niiden vastaavassa normaalissa epiteelisolujen DNA. Sen sijaan, telomeres CIN + kasvaimen DNA olivat lyhyempiä kuin vastaavassa normaalissa epiteelissä DNA. (P = 0,0039).

lisäksi arvioitava, ovatko erot telomeeripituuden tai CIN tila voi liittyä aktivoinnin telomerase tai ALT. Havaitsimme, että kasvaimia lyhyemmillä telomeres olivat todennäköisemmin aktivoituminen telomeraasin (p = 0,0040; kuvio 1, paneeli B), mutta kasvain telomeeripituuden ei korreloinut läsnäolo ALT (p = 0,4923; taulukko 2). CIN + kasvaimet olivat todennäköisesti osoittaa aktivoitumisen telomeraasin kuin oli CINEMA kasvaimet (p = 0,0949; taulukko 1], mutta ei ollut eroa voitot /tappiot välillä CRC telomeraasi- aktivointi ja CRC ilman telomeraasin aktivointia (p = 0,3168; taulukko 1 ). päinvastainen oli totta suhteen ALT. CINEMA kasvaimet olivat todennäköisemmin kuin CIN + kasvaimia merkkejä ALT (p = 0,2335; taulukko 1), vaikka niiden kasvainten, jotka olivat Alt-oli enemmän voittoja /tappioita kuin ALT + CRC (keskiarvo : 39,3 vs. 22,6, p = 0,0091; kuvio 2, taulukko 2). kasvaimet, jotka pidentyneet telomeerit kautta esillä C-Circle muodostumista ei esiinny Alt-kasvaimia (kuvio 3).

telomeeripituuden

Fraction voitot /tappiot

keskiarvo (SD) B p-arvo

Mean (SD) B p-arvo

CIN Status0.00660.0007 CIN + 8211 (308) 33,1 (8,8) CINEMA 9178 (1396) 9,7 (7,9) Telomerease0.00400.3168 Yes8193 (295) 28,8 (14,3) No9307 (1512) 19,2 (16,4) ALT0.49230.0091 Yes8676 (1208) 19,6 (13,5) No8226 (397) 38,7 (7,9) p530.54140.7726 Yes8443 (370) 26,3 (17,0) No8676 (1281) 22,9 (12,0) Taulukko 2. telomeeripituuden ja osa kloonin voitot /tappiot kasvainten ominaisuuksiin.

peräsuolesta syöpäkasvainten arvioida array CGH luokiteltiin 1) CINEMA jos 20% klooneista osoittivat DNA kopioluvun muutoksia tai 2) CIN + jos ≥ 20% klooneista osoittivat DNA kopioluvun muutoksia. Kasvaimet lyhyemmillä telomeres olivat todennäköisemmin CIN + (p = 0,0066) ja saada aktivoitua telomerase (p = 0,0040). Kumpikaan läsnäolo vaihtoehtoisen pidentäminen telomeres (ALT) (p = 0,4923) eikä läsnäolon p53 mutaatiostatus korreloivat kasvaimen telomeeripituuden (p = 0,5414). CIN + peräsuolen syöpä oli suurempi osa klooneista osoitti voittoja ja tappioita kuin CINEMA kasvaimet (p = 0,0007). Kasvaimet tai ilman aktivointia telomeraasi ei ollut merkittävästi erilainen osa voitot tai tappiot klooneja (p = 0,3168). Kuitenkin kasvaimia näytteille ALT osa voittoja ja tappioita kloonien oli alhaisempi kuin kasvaimia ei ollut näyttöä ALT (p = 0,0091) .Ei ero nähdään osa kloonin tai -tappioita välillä kasvainten kanssa ilman p53 mutaatioita ( p = 0,7726). CSV Lataa CSV

Kasvaimet, jotka olivat Alt-eläintutkimuksissa merkitsevästi enemmän kromosomi voitot /tappiot kuin ALT + peräsuolen syöpä (p = 0,0091).

Paneeli A. hematoksyliinillä ja eosiini kudososat MSS CINEMA ALT +, Telomerase- peräsuolen syöpä (vasemmalla) ja MSS CIN +, Alt-, Telomerase + peräsuolen syöpä. Molemmat ovat kohtalaisen eriytetty adenokarsinooman.