Krooninen sairaus

tiivistelmä

Uudempi sukupolvi syöpälääkkeet kohdistaminen taustalla somaattiset geneettiset kuljettaja tapahtumat ovat johtaneet korkeana yhden aineen tai yhden reitin hoitovaste valikoiduilla potilailla, mutta harvat potilaat saavuttaa täydellinen vaste ja suuri osa potilaista relapsi vuoden sisällä. Näin ollen on olemassa pakottava tarve tunnistamiseksi yhdistelmien kohdennettujen aineita, jotka indusoivat enemmän täydellinen vaste ja estää taudin etenemistä. Kuvaamme tulokset yhdistelmän näytön ennennäkemätön nisäkässoluissa suoritettiin käyttäen kokoelma kohdennettuja, kliinisesti taipuisa aineet kaikkialla suuri paneeli Melanoomasolulinjojen. Huomaamme, että jopa kaikkein yhteisvaikutukset lääke parit ovat tehokkaita vain diskreetti joukko solulinjoja, taustalla vahva yhteydessä riippuvuus synergiaa, joilla on vahva, laaja synergia usein vastaa epäspesifisen tai off-tavoite lääkkeen vaikutuksia kuten monilääkeresistenssin proteiini 1 (MDR1) transporter esto. Havaitsimme lääkkeet herkistävät solulinjoja, jotka ovat BRAF

V600E mutantin, mutta olennaisesti resistenttejä BRAF estäjä PLX4720, mukaan lukien verisuonten endoteelin kasvutekijän reseptori /kinaasi- inserttidomeenireseptori (VEGFR /KDR) ja verihiutaleperäisen kasvutekijän reseptorin (PDGFR) perheen estäjä cediranib. Yhdistelmä cediranib ja PLX4720 aiheuttaman apoptoosin

in vitro

ja kasvaimen regressio eläinmalleissa. Tämä synergistinen vuorovaikutus johtuu todennäköisesti sitoutumista useiden reseptorityrosiinikinaasien (RTK: t), jotka osoittavat potentiaalia huumeisiin sijaan geenispesifisiä yhdistelmä löytö lähestymistapoja. Potilaat, joilla on kohonnut koepala KDR ilme osoitti vähentynyt ilman taudin etenemistä-tutkimuksissa mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) kinaasireittiä estäjät. Siten suurikapasiteettisten puolueeton seulontaan kohdistuva lääkkeiden yhdistelmiä, asianmukaiset kirjasto valinnan ja mekanistinen seurantaa, voi tuottaa kliinisesti kannekelvoton lääkkeen yhdistelmät.

Citation: Friedman AA, Amzallag A Pruteanu-Malinici I, Baniya S, Cooper ZA, Piris A, et al. (2015) maiseman Kohdennettu Anti-Cancer Drug synergioita Melanooma Tarkoittaa Novel BRAF-VEGFR /PDGFR yhdistelmähoito. PLoS ONE 10 (10): e0140310. doi: 10,1371 /journal.pone.0140310

Editor: Suzie Chen, Rutgers University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 22 elokuu 2015; Hyväksytty: 24 syyskuu 2015; Julkaistu: 13 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Friedman et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Institutes of Health (P01CA163222 ja R21CA175907 DEF, 1K08CA160692-01A1 ja U54CA163125 leuka, 1U54HG006097-01 ja CHB), Dr. Miriam ja Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (DEF), Doris Duke Medical Foundation (DEF), joka on Elsa U. Pardee Foundation avustus (DEF), Fred Lovejoy Resident Tutkimus ja koulutus Award (AAF), Brigham ja naisten sairaalan Iho- NIH Training Grant T32AR007098-38 (AAF), ja avustukset Wellcome Trust (086357 ja 102696; CHB, DAA).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa .

Johdanto

Vaikka hoitovaste geneettisesti valittujen alaryhmien kiinteä kasvain syöpäpotilaille voi olla korkea, kuten 60-80% joukossa

BRAF

V600E

mutantti melanoomaa saavilla potilailla BRAF estäjää vemurafenib [1], harvat potilaat saavuttaa single-aineen täydellinen vaste. Siten huomattava määrä potilaita on luontainen vastustuskyky MAPK-reitin estäminen. Jopa potilailla, jotka reagoivat, suurin osa kehittyy hankittu resistenssi vuoden sisällä, mikä johtuu usein ylimääräisiä mutaatioiden tai ohitusleikkaus väyliä [2, 3]. Viime aikoina useat ryhmät ovat löytäneet mekanismeja kehittynyt resistenssi BRAF-täsmähoitoihin, yleensä aluksi herkillä solulinjoissa kuten A375 [4-7], osoittaen monimutkaisuus tunnistaa pelastus hoitostrategia ja harvat tutkimukset ovat käsitelleet

de novo

vastustuskykyä vemurafenib yhteydessä BRAF

V600E [8]. Huumeiden yhdistelmät on mahdollista puuttua

de novo

ja hankitun resistenssin mutta ennustamiseen lääkeyhdistelmä aktiivisuutta yksittäisinä aineina ei ole vielä mahdollista osittain koska vain suhteellisen pieniä aineistoja yhdistelmähoidon olemassa. Ehdokas-pohjainen löytö yhdistelmän lääkekohteita kuten sekvensointiin kasvaimia ylimääräisiä kuljettajan somaattisten mutaatioiden [8] tai puolueeton RNAi tai cDNA näyttöjä voi tuottaa käytännöllisiä tavoitteita. Nämä lähestymistavat voi jäädä potentiaalia korkean kertaluvun vuorovaikutusta estäjien moniosaisia ​​proteiinit ja niiden kliininen merkitys voi riippua pitkiä lääkekehityksen keskitetään uusia tavoitteita. Lisäksi perustuu vahvaan yhteydessä riippuvuus nähty ainoana lääkkeenä aktiivisuus on odotettavissa, että yhdistelmät ”aktiivisuus ja synergiaa myös yhteydessä erityinen. Kuitenkin, se ei ole vielä selvää, onko yhdistelmät kohdennettujen aineiden voisi olla tehokas useilla eri kasvaimen alatyyppiä, joten ne sovellettavissa enemmän potilaita kuin heidän ainoana lääkkeenä osatekijä vai kestävyys on puututtava suuri joukko yhteydessä erityisiä yhdistelmiä käsitellään pienempiä potilasryhmissä kuin muodostavat yhden tekijöille. Useat ryhmät ovat alkaneet tunnistaa lääkeaineinteraktioita puolueettomalla tavalla syöpäsoluissa [9, 10], jotka ovat tuottaneet tärkeitä oivalluksia. Olemme aikaisemmin kuvattu massiivisesti skaalata yhden aineen lääkeseulontaan kaikkialla suuri paneeli genotyyppisesti määritelty syöpäsolulinjoissa [11]. Ymmärtää yleistä maisemaa ja mahdollisuudet skaalata lääkeainetutkimuksissa seulonta poikki syöpäsolulinjoissa alkuvaiheessa syöpäsolun-line Combination (C

3) projekti, me seulotaan suuri kokoelma Melanoomasolulinjojen poikki useita tuhansia yhdistelmiä kohdennettuja estäjiä. Melanooma valittiin valossa saatavuus suuri määrä solulinjoja kätkeminen yhteinen mutatoitunut onkogeenin (BRAF

V600E) ja validoitu täsmähoitoihin.

Tulokset

Systemaattinen yhdistelmä lääkesynergiaa löytö

saadaan käsitys maisemaan kliinisesti merkittäviä synergistisiä yhdistelmiä kohdistettuja aineita syövän, me koottu kirjaston 108 yhdisteitä. Koska olimme kiinnostuneita löytämään huumeiden yhdistelmä, jossa on potentiaalia kliinisen käännös ja joiden vaikutusmekanismi olisi taipuisa, valitsimme hyvin tunnettu onkologialääkkeistä hyväksynyt Food and Drug Administration (FDA) tai myöhään kliinisissä tutkimuksissa; kaksi kolmasosaa näistä aineista ovat olleet kliinisessä käytössä (kuvio 1A ja S1 taulukko). Otimme lupaavimmista signaalitransduktion inhibiittorit kliinisessä vaiheessa ja ne, jotka tarjosi moninaiset molekyylikohteista pääpiirteissään kattaa syövän signalointipolkujen; Tähän luokkaan muodosti valtaosa kirjastomme kello 67/108 huumeita. Me täydennettiin näitä huumeita kohdistaminen soluun lukiertosäätelijöistä, epigeneettiset modulaattorit, nukleaarihormonireseptorit, ja muut uudet mekanismit voimakasta prekliinisen tutkimuksen. Lopuksi olemme mukana rajoitettu määrä lääkkeitä edustava suurten perinteisten sytotoksisten chemotherapies. Tämä lääke paneeli laajenee huomattavasti pidemmälle raportoi äskettäin yhdistelmä näytön melanooman hyödyntäen 40 huumeita [10]. Paneeli 36 melanoomasolujen linjat valittiin edustavat suurta genotyyppisten luokat (S2 taulukko) ja sisälsi kuusi uusia potilaasta johdettujen lyhytaikainen melanooma viljelmät ( 10 kohtia biopsia). 30 aiemmin pysyviä solulinjoja 19 on kuvattava genomitasolla tarkemmin (S2 taulukko). Kaiken kaikkiaan tämä näyttö korjaa paljon suurempi määrä huumeiden yhdistelmien ja solulinjoissa kuin aiemmin raportoitu [9, 10, 12]. Koska käytännön rajoitukset seulonnan suuri määrä yhdistelmiä eri puolilla täyden annoksen matriiseja yhdistelmiä, valitsimme kaksi kiinteää-suhde annoksen yhdistelmiä. Suoritimme näytön sisäänajon kymmenessä solulinjoissa valita annokset, jotka johtivat 70% elinkelpoisuus kaapata synteettisiä tappavan tapahtumia (tuloksia ei ole esitetty). Sitten rakennettiin kirjasto kaikista 5778 yhdistelmät vastaavat kaikkia mahdollisia kahden lääkkeen yhdistelmät poikki 108 huumeita, ja yhden huumeita. Olemme turvatarkastus 1536-hyvin ultra-high-throughput muotoon korkea-pitoisuus ja automatisoitu kuva-analyysiin perustuvia lukemiselle solumäärän mukaan tumavärjäystä (kuvio 1 B). Lisäksi solulaskennan Ydinvoimalla tahra, myös systemaattisesti kartoitettu lääkeyhdistelmä vaikutuksia solukuoleman samanaikaisesti käyttäen vasta-aineita lohkaistaan ​​PARP ja normalisoi täydelliseen ydinaseiden määrän saamiseksi solukuolemaa pisteet. Kaikkiaan kaikkien lääkeyhdistelmät kahtena pitoisuutena kaikissa solulinjoissa ja mittaamalla sekä solujen määrän ja solukuoleman, me tuotti maisema 800000 kombinatorisista huumeiden datapisteitä (S3 taulukko). Koska rajoitetun kattavuuden lääkkeiden annoksen matriisi, käytimme Bliss riippumattomuus metrinen synergian edustamaan odottamattomia yhdistelmäefektit [13-15].

(A) Tiivistelmä kliinisen kehitysvaiheen 108 huumeiden sisältyy yhdistelmä huumeiden paneeli. (B) Esimerkki raaka UHTS tuottamien tietojen, jotka osoittavat solujen määrän kerättyjä tietoja DAPI kanavan ja apoptoosin tietoja lohkaista PARP immunofluoresenssimenetelmällä; positiivinen kontrolli HSP90 inhibiittoripastojen 17-AAG hoito näytetään. (C) Yhteenveto matriisi kombinatorisista huumeiden tietojen kanssa jokainen piste edustaa vaikutusta jonkin 5778 yhdistelmiä standardin lääkeainepitoisuuden, kuten mediaani Lääkkeen vaikutuksen yhdistelmän kaikissa 36 Melanoomasolulinjojen suhteellisesta solumäärä (vasemmalla) ja laskennallinen Bliss synergia sijoituksen että yhdistelmä (oikealla). (D) Histogrammi lukumäärän solulinjoja tietyn lääkkeen yhdistelmä osoitti synergiaa. Peak useita synergiaa havaittiin yhdessä solulinjassa, mikä osoittaa monet synergiat ovat yksityisiä. (E) Kuten (C), joka osoittaa mediaani Lääkkeen vaikutuksen yhdistelmän (vakio pitoisuus) suhteellisesta cPARP positiivisen osuuden (vasemmalla) ja lasketun Bliss yhteisvaikutus että cPARP taso (oikealla). (F) Graafinen esitys lääkkeen yhdistelmiä (lääke pareja on kaari), joka osoitti merkittävää odottamattoman korkea cPARP yli ennustettu taso annettuun solujen määrä. Solmukokoa ilmaisee huumeisiin parien että tietyn lääkkeen näkyy muiden lääkkeiden kanssa on ”yllättäen apoptoottinen” lista. Edge väri osoittaa lääkeaineen parin pitoisuus (vakio tai matala), jossa koholla cPARP todettiin; reuna kuvio kertoo, onko kohonnut cPARP löytyi asettaminen alhainen solumäärän tai normaali solujen määrä ( 80% ohjaus), koholla cPARP asettamisessa normaalin elinkelpoisuuden mahdollisesti edustaa ”hidas” kuolema kinetiikkaa yhdistelmää.

Alustava analyysi synergian arvojen osoitti, että suuri määrä yhdistelmiä osoittanut 40% Bliss itsenäisyyttä useammassa solulinjassa, mukaan lukien useita lääkkeitä, joilla on laaja kuolleisuutta ja synergiaa pariksi muita lääkeaineita poikki solulinjassa kokoelma (kuvio 1 C). Kuitenkin vain 0,3% synergistisiä yhdistelmiä osoittivat tosi synteettinen kuolleisuutta, joissa yksittäiset lääkkeet ei ollut vaikutusta ( 80% elinkelpoisuus) mutta vahva synergistinen elinkelpoisuuden 50%. Niinpä useimmat lääkkeitä synergistiset vaikutukset osoittavat joitakin mitattavissa vaikutus ainakin yhden aineen. Havaitsimme, että jotkut lääkkeet herkistyneet solut monien muiden huumeiden; näitä olivat proteasomin estäjä bortetsomibi, pro-apoptoottisten B-solulymfooma 2 (BCL2) perheenjäsen estäjä ABT263, ja mikrotubulusten estäjän vinkristiini (kuvio 1 C). Mielenkiintoista on, että suurin osa lääkkeen yhdistelmät osoittavat synergiaa osoitti, että tällaista synergiaa kolme tai vähemmän rivejä (56%; kuvio 1 D). Niinpä useimmat lääkeyhdistelmä vaikutukset riippuvat voimakkaasti solujen yhteydessä. Jopa yhdistelmät osoittavat syvällistä synergiaa osajoukko solulinjat eivät ole synergistisiä tai tehokasta muissa solulinjoissa. Kiinnostavaa kyllä, tämä on totta jopa yhdistelmiä, jotka voidaan olettaa olevan erittäin laajasti synergistinen, koska ne kohdistuvat kaksi mekaanisesti täydentävää soluprosesseihin. Esimerkiksi yhdistelmä gemsitabiinin, DNA: ta vaurioittava aine, yhdessä DNA-vaurion korjaamiseen reitin kinaasi-CHK1 estäjä AZD-7762, on vahvasti synergistinen vain osan (6/36) solulinjojen. Vaikka tämä saattaa johtua eroista DNA-vaurioiden nopeudella kaikkialla solulinjoissa, havaitsimme useita muita tapauksia vahvoja synergioita, jotka ovat nähneet vain muutamalla rivillä.

Monien lääkkeiden aiheuttama lisääntynyt solukuolema mitattuna cPARP mukaan lukien ABT263 ja laaja-inhibiittori midostauriini (kuvio 1 E). Vähemmän huumeiden osoittaa laaja synergia cPARP induktio verrattuna solujen määrää; Yksi poikkeus oli nilutamidi, androgeenireseptoriantagonistin. Yleisesti, lääkeaineiden yhdistelmä, joka vähentää solujen määrä 72 tunnin kuluttua osoitti myös kasvua prosentteina positiivisten solujen cPARP värjäytymistä ( ”nopea” kinetiikka). Kuitenkin osajoukko yhdistelmien lisääntynyt cPARP vaikuttamatta solujen määrä (S1A ja S1B kuviossa). Oletamme, että tämä alaryhmä todennäköisesti edustaa yhdistelmä, jossa on ”hidas” kinetiikka solukuoleman induktion. Olemme kehittäneet regressiomallin tämän suhteen tunnistaa nämä harha apoptoosia indusoivien yhdistelmät kussakin solulinjassa. Kaiken kaikkiaan 4% yhdistelmät osoittivat liikaa lisääntynyt cPARP suhteessa solujen määrä. Tiettyjen huumeiden aiheuttaman apoptoosin yllättäen useammin tässä yhdistetty joukko (kuvio 1 F). Ei ole yllättävää, ABT263 aiheuttama korkea cPARP laajasti suhteessa solujen määrän ja rikastui sekä ”nopeasti” ja ”hidas” kineettiset yhdistelmiä. Mielenkiintoista, fingolimodin, osittainen agonisti SP1R, reseptori ajatellaan osallistuvan apoptoottiseen solutunnistuksessa immuunisolujen sijaan solujen autonominen apoptoosin säätelyyn ja bortetsomibilla osoitti ”nopeasti” kuvio kuoleman induktion. Sen sijaan, FK866, nikotinamidijohdannaista fosforibosyylitransferaasigeeniä estäjä osoitti ”hidas” kuvio apoptoosin induktion.

lääkesynergiaa ja off-tavoite vaikutukset

priorisoida synergistisiä yhdistelmiä edelleen mekanistinen leikkely, ensin analysoidaan lääkeaineinteraktioita vahvin Bliss riippumattomuus tulokset poikki suurin määrä solulinjoja. Useat näistä yhteisvaikutuksista on aikaisemmin kuvattu kirjallisuudessa, validointi näytön tunnistamisessa

bona fide

synergistiset vaikutukset. Näistä mukana MK1775, wee-1-estäjä, ja AZD7762, joka on CHK1 /2-estäjä (S2A kuvio); dual esto sekä solusykliä tarkistuspiste kinaasien on aiemmin kuvattu useita kasvaintyypeissä soluviljelmässä ja

in vivo

[16]. Synergistinen vuorovaikutus kohdennettuja inhibiittorit ja BCL2 perheenjäsen inhibition on aiemmin kuvattu [17, 18], ja meillä on myös havaittu tällaista vuorovaikutusta suuria annoksia CHIR265, pan-Raf-estäjä, ja ABT263 (S2B kuvio). ABT263 myös herkistyneet useita solulinjoja ( 10) ensisijaisen näytön bortetsomibiin ja phytochemical indoli-3-carbinol. Erityisen voimakas synergistinen vuorovaikutus nähtiin välillä BI78D3, JNK estäjä ja TZDZ8, GSK3p estäjä (S2C kuvio). Emme kuitenkaan pystyneet noudattamaan synergiaa RNAi knockdovvn joko kohdistaa luokan yhdessä lääkehoidon (S2D kuvio) välillä tai laajennettu kokoelma muita JNK ja GSK3p työkalu yhdisteiden (S2E kuvio); Lisäksi tämä synergia nähtiin useilla muiden transformoitujen ja ei-transformoitujen solujen (S2F kuvio), mikä viittaa tämä oli laaja, omaleimaista, ja off-tavoite sytotoksisten synergistinen vuorovaikutus todennäköisesti ole kliinisesti käyttökelpoinen johtuen sen aktiivisuutta ei-transformoituja soluja.

Valitsimme yksi näistä vahvoja synergistiset vaikutukset edelleen mekanistinen tutkimus. Havaitsimme vahvan vuorovaikutuksen lapatinibi EGFR perhe estäjä, ja vinkristiini, mikroputkeen estäjä (kuvio 2A). Vinkristiiniä käytetään harvoin melanooman hoito-ohjelmia ja EGFR perheenjäsenet eivät tiettävästi ole kuljettaja rooli ihosyövän paitsi mukautuva vastustuskykyä BRAF inhibiittorit [7]. Olemme vahvistaneet vahva ~ 10X herkistää joitakin, mutta eivät kaikki, melanooma solut vinkristiinin kanssa lapatinibi kanssa Bliss arvon 50% ja Yhdistelmä Index (CI) 0,37 [19] (kuvio 2B ja S3A ja S3B kuvassa), ja useita muita EGFR perheenjäsen estäjien erlotinibi (S3C kuvio). Emme kuitenkaan pystyneet herkistää A375 soluja vinkristiini kerta tai kombinatorinen knockdovvn Lapatinibin tavoitteiden EGFR ja HER2 (S3D kuvio). Lisäksi solusyklin analyysi osoitti synergististä pidätys G

2 /M kanssa vinkristiinin-lapatinibi yhdistelmä, kuten voisi odottaa yhä vinkristiinin annoksen (kuvio 2C). Lapatinibi ja muut 4-anilinokinatsoliiniyhdisteiden johdettu tyrosiinikinaasi-inhibiittorit on kuvattu inhibiittoreina P-gp perheen monilääkeresistenssin (MDR) kuljettajat [20, 21]. Verapamiili, joka on kanoninen MDR1 estäjä, johti samankaltaiseen synergistinen vuorovaikutus vinkristiinin (S3E kuvio). Koska voimakas synergia vinkristiini ja lapatinibi A375 muttei WM451Lu soluja, me tutkimme, ero MDR perhe ilmentyminen voi taustalla solulinja spesifisyys synergistisen vuorovaikutuksen. Kaiken havaitsimme yleistä suuntausta kohti lisääntyvää synergian vinkristiini ja lapatinibi solulinjoissa korkeamman MDR1 mRNA ilmaisun. (S3F kuvio). Koska yksittäisen solun yhteydessä voi vaikuttaa luotettavuutta yleinen suuntaus, me nimenomaan vertailtiin herkkä tunteeton solulinjaan. Havaitsimme 8-kertainen ekspression MDR1 mRNA A375-soluissa vs. WM451Lu soluja (kuvio 2D). Lisäksi lapatinibi lisääntynyt retentio MDR alustan väriaine samalla verapamiilin (kuvio 2E). Knockdovvn MDR1 RNAi A375-soluissa herkistyneet solut vinkristiini solukasvuneston (kuvio 2F ja S3G kuvassa). N yli-ilmentyminen MDR1 vuonna WM451Lu soluissa indusoi resistenssi vinkristiini on lapatinib riippuvalla tavalla (kuvio 2G ja S3H kuvassa). Siten huolimatta ”kohdennettu” luonne joidenkin estäjät, niiden aktiivisuus MDR perheenjäsenet voivat tuottaa synergistisen vaikutuksen liity ensisijaisiin kohteisiinsa. Tämän mukaisesti, havaitsimme synergiaa vinkristiini ja lapatinib monilla muiden nopeasti lisääntyvien solujen (S3I kuvio). Samanlaisia ​​havaintoja siveetön synergistiset vaikutukset kautta hyötyosuus on löydetty hiivan anti-sieni huumeiden yhdistelmän näyttöjen [22]. Suuri määrä yhdisteitä monilla rakenteellinen luokat voivat näyttää MDR esto, joka tukee havaintomme, että vinkristiinin oli herkistynyt suuri joukko muita lääkkeitä (kuvio 1 D).

(A) Seulonta osoittavat vaikutuksia molemmat pitoisuudet vinkristiinin ja lapatinibi yksilöllisesti, ja yhdistelmänä, joka osoittaa voimakas synergia useimmissa melanoomasolulinjojen kuten korkeat Bliss synergia tulokset. (B) vahvistaminen synergiavaikutuksesta yhdistelmän Lapatinibin (5 uM) A375 (

n

= 19), mutta ei WM451Lu (

n

= 14) soluja. Virhe pylväät edustavat S.D. mittauksen jäljittelee. (C) edustaja virtaussytometrialla tiedot osoittavat lapatinib voimistaa G

2 /M shift A375 solupopulaation sopusoinnussa lisääntynyt vinkristiinin vaikutus. (D) Log

2 suhteellinen ilmentyminen tietyn monilääkeaineresistenssi transporter A375 versus WM451Lu soluja, jotka osoittavat lisääntynyt MDR1 ilmentymistä A375-soluissa. Virhe pylväät edustavat S.D. Mittauksen näytteitä (

n

= 9). (E) Kalseiiniväriä siuminvirtauskokeista esittää lisääntynyt fluoresenssi-intensiteetin (osoittaa vähentynyt MDR flux), kun läsnä on Lapatinibin tai valvonnan MDR-inhibiittoria verapamiili (sekä 5 uM); kvantitoimiseksi solujen harmaat arvot vasemmalla. Virhe pylväät edustavat S.D. Mittauksen näytteitä (

n

= 4, 200 solua per rinnakkaisnäytettä). (F) MDR1 pudotus siRNA aiheuttaa synergistinen vaikutus solujen elinkelpoisuuteen, kun läsnä on 5 nM vinkristiinin. Virhe pylväät edustavat S.D. Mittauksen näytteitä (

n

= 7). (G) yli-ilmentyminen MDR1 (verrattuna GFP kontrolli) WM451Lu pienenee herkkyys vinkristiini, vaikutus palautuva kanssa 5 uM lapatinib. Virhe pylväät edustavat S.D. Mittauksen näytteitä (

n

= 4)

VEGFR /PDGFR antagonisteja synergoida BRAF estäjien

tunnistamiseen tarkempia synergistisiä yhdistelmiä, keskityimme yhdistelmiä, jotka saattavat osoitteen luontainen resistenssi BRAF estäjä vemurafenib. Olemme tunnistaneet useita BRAF

V600E solulinjoja, mukaan lukien ISTMel1 ja RPMI7951, joka näkyy vastuksen PLX4720 jopa suurilla annoksilla ( 5 uM, kasvun inhibitio 50%), verrattuna herkkien linjojen, kuten UACC62 ja SkMel28 (IC

50 500 nM) (kuvio 3A). Monet 107 muiden lääkkeiden kirjastomme osoittivat synergististä vuorovaikutusta PLX4720 spesifisissä solu- ympäristöissä (S4A kuvio). Käytimme tilastollinen analyysi microarray (SAM) lähestymistapa [23] tunnistaa yhdistelmä, jossa PLX4720 jotka olivat nimenomaan synergistisiä vuonna PLX4720 kestävä solulinjoissa (S4b kuvio). Näistä kuului HDAC estäjä vorinostat, äskettäin todettu synergoida BRAF estäjien joissakin Melanoomasolulinjojen [24]. Totesimme merkittävä synergia RTK-estäjän cediranib ja PLX4720 näissä resistenttejä solulinjoissa (kuvio 3B), jossa on CI 0,35 (S5a kuvio), mutta ei herkkä linjat, myös alhaisilla annoksilla PLX4720. Synergy havaittiin myös välillä cediranib kanssa MEK estäjän selumetinib (AZD6244), ja jossa kolmoisyhdistelmä cediranib, PLX4720, ja selumetinib, mikä viittaa yleisesti vuorovaikutuksen cediranib ja eston BRAF-ajettu MAPK signalointia (S5B ja S5c kuvassa). Pitkän aikavälin kasvu määrityksissä vahvisti vahva synergistinen vuorovaikutus (kuvio 3C). Yhdistelmä cediranib ja PLX4720 nopeasti aiheutti apoptoosia resistentit solut, kuten on esitetty anneksiini V-värjäyksellä ja cPARP Western-blottauksella (kuvio 3D). Vaikka yksittäinen agentti PLX4720 hoito aiheutti solukierron pysähtymisen herkillä solulinjoissa, ei ollut merkittävää vaikutusta lääkkeen yhdistelmästä solusyklin (S5d kuvio). Toisin kuin tulokset lapatinib, ei havaittu olevan herkistymistä resistenttien riviä PLX4720 kanssa MDR-inhibiittorin verapamiili (S5E kuvio).

(A) vaikutus PLX4720 (PLX4720) poikki melanoomasolujen ensiölajittimen, osoittavat joitakin

BRAF

mutantti ihosyövän näyttää luontainen vastustuskyky BRAF esto. Resistance (määritelty 50% elinkelpoisuuden 5 uM PLX4720) näitä rivejä vahvistettiin toisen määrityksissä (alla). (B) Cediranib näkyy synergistisiä vaikutuksia PLX4720 useissa luontaisesti resistenttejä rivit ensisijainen näyttö; nämä vaikutukset tarkastettiin standardin kasvun määrityksissä toisen näytöissä (alla, jossa 2 uM cediranib). BRAF-estäjä-herkkä linjat UACC62 ja SkMel28 osoittanut mitään synergiaa missään PLX4720 annoksella, kun taas kestävä ISTMel1 ja RPMI7051 linjat osoittivat vahvaa synergia cediranib (Bliss 30%). Virhe pylväät edustavat S.D. Mittauksen näytteitä (

n

= 3-4). (C) Pitkäaikaiset kristalliviolettia-värjätty pesäkekasvun määritykset vahvisti kestävää synergia PLX4720 (PLX) ja cediranib (CED) vastustuskykyisten ISTMel1 ja RPMI7951 linjat, mutta ei PLX4720 herkkä linjat UACC62 ja SkMel28. (D) anneksiini V määritykset osoittivat, että cediranib indusoiman apoptoosin, kun se yhdistetään PLX4720 vastustuskykyisten ISTMel1 soluissa, verrattuna herkkien UACC62, ja vahvistettiin Western-blottauksella pilkotaan PARP (alla). Virhe pylväät edustavat S.D. Mittauksen näytteitä (

n

= 3). (E) Western blotting varmisti of cediranib tavoitteiden PDGFRβ, ja vaihtelevasti, KDR ja PDGFRα in PLX4720-tunteeton ISTMel1 ja RPMI7951 soluja, joissa heikompi tai puuttuu ilmentymistä PLX4720 herkillä UACC62 ja SkMel28 soluja. Kaksikymmentäneljä tuntia hoidon PLX4720 kohtalaisen tukahdutetaan KDR ja aiheuttama PDGFRβ ilme, malli myös nähnyt

in vivo

(S9A kuvio). (F) Western blotting vahvistettu torjuttaviin tukahduttaminen PDGFRα ja PDGFRβ fosforylaatiota (jälkimmäinen jälkeen immunosaostus ja blottauksella fosfo-tyrosiinia annetaan vähäisessä määrin). KDR fosforylaatio oli liian heikko, joita on noudatettava Western rutiininomaisesti kulttuuriin mutta nähtiin

in vivo

(katso S9A kuvio). (G) RNAi-välitteinen knockdovvn KDR (vasemmalla) ja altaat tai yksittäisiä siRNA osoitti synergiaa ~ 30%; synergia oli verrannollinen KDR taintumisen (katso S7A kuvio). Virhe pylväät edustavat S.D. Mittauksen näytteitä (

n

= 6). Oikealla keskimääräiset Bliss arvot usean toistojen osoitti kasvava synergia samanaikainen knockdown useiden cediranib tavoitteiden KDR ja PDGFRβ, ja heikommin, PDGFRα. Virhe pylväät edustavat S.D. Mittauksen näytteitä (

n

= 5-8).

Cediranib on voimakas ja selektiivinen PDGFR ja VEGFR perhe reseptorityrosiinikinaasien kliinisissä tutkimuksissa käytetään pääasiassa antiangiogeeninen agentti [25]. Vaikka PDGFRα ja β yli-ilmentyminen on aiemmin yhdistetty hankittu vemurafenib vastus [6, 7, 26], tämä perhe ei ole osallinen soluun epäitsenäisiä ensisijainen vemurafenib vastus. Edelleen ymmärtää mekanismia lääkeyhdistelmän testasimme laajennetun listan RTK-estäjien nykyisin kliinisessä käytössä tai kehitystä. Jotkin, mutta eivät kaikki, samanlainen estäjät osoittivat synergiaa PLX4720, ja joissakin mutta ei kaikissa resistenttejä linjat (S6A kuvio). Mielenkiintoista on, että vain cediranib ja tivozanib, ei tarkempia inhibiittorit axitinib (VEGFR) tai crenolanib (PDGFR), osoitti johdonmukaisesti ja voimakas synergistinen aktiivisuus PLX4720 monilla annoksilla, mikä viittaa tietyn inhiboiva vaikutus näiden yhdisteiden osajoukon tavoitteiden . Solulinja ilme tietokantoja osoittivat ilmentymistä cediranib tavoitteiden resistenttejä solulinjoja (S6b kuvio), jota vahvistettiin Western-blottauksella (kuvio 3E). Yleensä olemme myös havainneet, että Melanoomasolulinjojen ilmentävät korkeampia KDR kuin mikään muu sollinjaan laaja kokoelma syöpäsolulinjojen (S6c kuvio), mikä viittaa tiettyyn soluun epäitsenäisiä rooli KDR melanooman kehityksessä. Olemme havaittu kohde-tukahduttaminen cediranib fosforylaation sekä PDGFRα ja PDGFRβ (kuvio 3F). Seuraavaksi yritimme kerrata synergiaa PLX4720 ja cediranib mukaan knockdown sen pääkohteita. siRNA Knockdown KDR osoitti synergistisen lasku solujen määrä yhdistettynä PLX4720 hoidon verrannollinen pudotus tehokkuutta; Lisäksi samanaikainen knockdown useiden cediranib tavoitteiden lukien PDGFRα ja PDGFRβ parantaa yhteisvaikutusta BRAF esto (kuvio 3G ja S7A ja S7b kuvassa). Vaikka emme voi sulkea pois mahdollisuutta, että osa synergistinen aktiivisuus on estämällä muita RTK tavoitteita ei sisälly analyysimme, nämä tulokset viittaavat siihen, että erityisen voimakas synergistinen aktiivisuus cediranib yhdessä PLX4720 johtuu esto KDR ja niihin liittyvät RTK lukien PDGFRα ja PDGFRβ.

Activation tai uudelleen aktivointi suuria polkuja alavirtaan RTK kuten mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) ja fosfatidyyli-3-OH-kinaasi (PI (3) K) -AKT reittejä aiemmin on liitetty vastuksen kohdennettuja hoitomuotojen kuten vemurafenib sekä

in vitro

ja kliinisiä tutkimuksia [8, 27-32]. Toisin kuin useimmat tutkimukset resistenttien solulinjojen, PLX4720 täysin tukahdutetaan ERK aktivaation luonnostaan ​​kestävä linjat; Lisäksi kaksi esto MAPK-reitin kanssa PLX4720 ja selumetinib osoittanut mitään synergististä vuorovaikutusta (S8A ja S8B kuvassa), ja cediranib jatkui synergian kolmoissidoksen sekä PLX4720 ja selumetinib (S5c kuvio). Nämä tulokset viittaavat ylimääräisiä polkuja yli MAPK liittyvät cediranib toimintaa. Cediranib tukahdutti S6K fosforylaatio sekä herkkä (UACC62) ja resistenttejä (ISTMel1) linjat, ja yhdistelmä tukahdutettiin aktivoinnin kestävä riviä useimpien Akt-reitin komponenttien polku fosfo-vasta-paneelit (S8C kuvio). Sen määrittämiseksi, onko tämä oli yksinkertaisesti markkeri RTK eston ja /tai synergia, tai mekanismi havaittu synergiaa, testasimme PI3K /Akt-reitin inhibiittorit voisivat toimia synergisesti PLX4720. Mielenkiintoista, Akt-reitin estäminen osoitti vain muuttuva ja kohtalainen synergia PLX4720 huolimatta vahva koulutusjakson tukahduttaminen (S8D ja S8E kuvassa). Nämä tulokset viittaavat siihen, että tukahduttaminen MAPK tai PI3K signalointi myötävirtaan KDR /PDGFR RTK rahoittaa vain osan synergiaa cediranib ja PLX4720 ja terapeuttisesti taipuisa luontainen resistenssimekanismeja ulottuvat näiden kahden reittejä. Potentiaalisten alavirran polku vaikuttaa PI3K /Akt-reitin suppressio havaittiin, että lääkeyhdistelmä, β-kateniinin on tunnetun substraatin GSK3p, joiden aktivointi voi seurata pienentynyt Ser9 fosforylaatio yhdistelmällä havaittu. Vaikka useita β-kateniinin reitin modulaattorit ei havaittu antagonismia tai synergia PLX4720 meidän ensisijainen näyttö (S9A kuvio), ja GSK3p on useita tunnettuja substraatteja [33], tämä reitti voi olla yksi mahdollisista efektorien lääkeyhdistelmän.

Seuraavaksi testasimme, onko synergistinen kasvun esto-melanoomasoluihin cediranib ja PLX4720 voitaisiin toisteta

in vivo

. Kahdessa ksenograftimalleja kanssa resistenttien linjojen ISTMel1 ja RPMI7951, havaitsimme vahva vuorovaikutus estäjiä kasvaimen etenemiseen (kuvio 4A ja S9A-S9C Kuva). ISTMel1 esti kohtalaisesti alkuperäisen herkkyys PLX4720, mutta cediranib tukahdutti myöhemmin kasvainten kasvua ollessaan PLX4720; Sen sijaan RPMI7951, yhdistelmä cediranib ja vemurafenib vähentynyt alkuperäisen kasvaimen kasvua yli vaikutusta kummankaan lääkkeen yksin.

(A) ISTMel1 ksenograftit muodostettiin immuunipuutteisilla hiirillä (

n

= 8 ryhmää kohti), jotka oli käsitelty PLX4720 tai valvontaa ruokaa ja annetaan cediranib tai vettä suun kautta letkulla. ISTMel1 ksenografteissa osoitti ensimmäisenä vastauksena PLX4720 hoito yksinään noin kahden viikon kuluttua, jossa joitakin muita, mutta ei-merkitsevä vaste cediranib hoitoon. Arvot on esitetty keskiarvona +/- SEM alueet, joilla on merkittäviä eroja kasvaimen keskimääräinen koko Sekä PLX4720 ja PLX4720 ja cediranib käsitellyillä hiirillä verrattuna ohjata hoitoon ANOVA. Kuitenkin yhdistelmä viivästyi merkittävästi etenemistä (määritellään 500 mm

3 koko) pidemmälle ensimmäinen vastaus (oikealla,

p

0,002 välillä PLX4720 ja PLX4720 + cediranib aseiden log-rank-testi) . (B) poiketen ISTMel1 ksenografteja, RPMI7951 ksenografteissa osoitti merkittävää eroa ANOVA testin ensimmäisen vastauksen PLX4720 vs. PLX4720 ja cediranib hoidon kolmen viikon kuluttua, ja oikea, osoitti pitkittyneen viiveen etenemisen (määritelty kasvaimen 250 mm