Krooninen sairaus

tiivistelmä

Homologinen rekombinaatio (HR) vaaditaan uudelleenkäynnistyksen sortuneen DNA lisääntymään haarukat ja virheetön korjaus DNA double-säikeen katkoksia (DSB). Kuitenkin suunnittelematon tai hyperaktiivinen HR voi johtaa genomista epävakautta ja edistää syövän kehitystä. Solu tekijät rajoittavat henkilöstöprosessien nisäkässoluissa ovat vasta selvittämättä. Kasvain p53 on liitetty tukahduttaminen HR vaikka se on jäänyt epäselväksi, miksi p53 valvojana genomin, heikentäisi virheettömän korjauksen. Tässä osoitamme ensimmäistä kertaa, että p53 downregulates pesäkkeitä muodostumista RAD51 rekombinaasi vastauksena Replikoitumattoman stressiä H1299 keuhkosyövän soluja tavalla, joka on riippumaton sen roolista transkriptiotekijä. Huomaamme, että tämä downregulation HR ei ole ainoastaan ​​täysin riippuvainen sitoutumiskohdan p53 kanssa replikointi proteiini A lisäksi myös ATR /ATM seriini 15 fosforylaatiokohdan. Geneettinen analyysi osoittaa, että ATR mutta ei ATM-kinaasi säätelee p53: n toiminta HR. Tukahduttamista HR p53 voidaan ohittaa koeolosuhteissa, jotka aiheuttavat DSB joko suoraan tai välillisesti, linjassa p53 roolia valvojana genomin. Tämän seurauksena transakti–aktiivinen p53 ei vaaranna vastus H1299 solujen säikeiden- silloitteen mitomysiini C. Kaikkiaan tietomme tukevat sitä mallia, jossa p53 näyttelee anti-recombinogenic rooli ATR-riippuvaisen nisäkkäiden replikointi tarkistuspiste mutta ei ei heikennä solun kykyä käyttää HR poistamiseksi DSB aiheuttama sytostaattien.

Citation: Sirbu BM, Lachmayer SJ, Wülfing V, Marten LM, Clarkson KE, Lee LW, et al. (2011) ATR-p53 Rajoittaa homologisella rekombinaatiolla vastaus replikoitu- Stressi mutta ei rajoita DNA säikeiden- Crosslink korjaus in Lung Cancer Cells. PLoS ONE 6 (8): e23053. doi: 10,1371 /journal.pone.0023053

Editor: Janine Santos, University of Medicine ja hammaslääketieteen New Jersey, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 toukokuu 2011; Hyväksytty: 05 heinäkuu 2011; Julkaistu: 12 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Sirbu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NCI myöntää R01 CA58985 (SNP) ja R01 GM076388 (LZ), NCI Dana-Farber /Harvard Cancer Center SPORE Lung Cancer P50 CA090578 (HW, LZ), puolustusministeriön W81XWH-06-1-0309 (HW ), Federal Osuus ohjelman saamista tuloista Massachusetts General Hospital on C06 CA059267, Proton Therapy Research and Treatment Center (HW), ja Deutsche Krebshilfe (saksa Cancer Aid) 10-1843-Da (JDD). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Genetic vaihto välittyy homologisten DNA-sekvenssit on tiukasti säädeltyä säilyttämiseksi genomista vakautta [1]. Aktiivinen homologinen rekombinaatio (HR) koulutusjakson tarvitaan korjaamiseen ja uudelleenkäynnistyksen romahtanut DNA-replikaation haarukat [2]. Solut, joissa puutteita HR on heikentynyt niiden kyky poistaa DNA säikeiden- siltoja (ICL) tuottamina esimerkiksi mitomysiini C (MMC). DNA double-säikeen katkoksia (DSB) esiintyvät S-vaiheen jälkeisen replikaation tai G2 korjannut HR on tyypillisesti virheettömän tavalla, koska homologisen DNA-sekvenssin on sisarkromatidin voi toimia tarkan mallin korjattavaksi. Sen sijaan spontaani DNA vaihtoa homologisten sekvenssien mitoottisesti kasvavat solut tarvitse rajoittua ja HR toimintaa pysähdyksissä replikointi haarukat eivät ehkä aina ole toivottavaa [1], [3], [4]. Anti-recombinogenic rajoittavat tekijät HR nisäkässoluissa ovat vasta selvittämättä.

p53-tuumorisuppressorin on keskeinen rooli ylläpidossa genomista vakauden ja tukahduttaminen solun transformaatio [1], [5] . Tämän seurauksena, villityyppisen p53-toiminto häiriintyy geneettisiä mutaatioita tai muita mekanismeja suurin, jos ei kaikki, ihmisen syövissä [5]. p53 on tullut monitoiminen säädin, joka on keskellä useita reittejä mukana apoptoosin, solusyklin kontrolli, ja DNA: n korjaukseen. Monia toimintoja p53 välittävät transkription aktivoituminen alavirran kohdegeenien [6]. Me ja muut luoneet ylimääräisen transactivation-itsenäinen rooli p53 tukahduttaminen henkilöstöprosessien monissa eri solun järjestelmien ja määritykset [7], [8], [9], [10], [11], [12] , [13]. Esimerkiksi useita p53 mutaatioita, kuten L22Q /W23S (p53QS), A138V, tai V143A, joka heikentää p53 kyvystä transaktivoida kohde- geenejä, mukaan lukien p21, ei vaaranna p53: n kykyä säätelevät vaimentaen HR [10], [14]. p53 näyttää vaikuttavan HR erilaisten suoran proteiini ja DNA vuorovaikutuksia [8], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23 ]. Suora vuorovaikutus yksijuosteinen (ss) DNA: ta sitovan Replication proteiini A (RPA) näyttää estävän HR varhaisessa vaiheessa, ja lisää vuorovaikutusta BRCA2 ja RAD51 voivat palvella samaa tarkoitusta [9], [10], [ ,,,0],24]. Downregulation HR riippuu ehjä ydin ja tetramerization domeenit p53 [7], [8], [12], kun taas C-pään tulee tarpeeton [12], [13]. Ylävirran tekijät säätelevät p53-välitteinen HR tukahduttaminen edelleen suureksi osaksi tuntemattomia [25].

Useita havaintoja linkki p53 suoraan DNA: n replikaatiota. p53 lokalisoituu sivustoja lisääntymään [26], [27], on ilmaistu rinnakkain DNA-synteesiin, kun solut kirjoittaminen uudelleen solusyklin [28], ja kulkeutuu tumaan S-vaiheessa [29], [30] . Replikointi vahingoittuneiden DNA on estänyt p53

in vitro

[31]. Eston lisääntymään pidentymisen hydroksiurean (HU), transkriptionaalisesti aktiivinen p53 kertyy S-vaiheessa [32]. Yhdenmukainen Näiden tietojen p53 downregulates HR jos replikointi pidentyminen on estetty [11], [33]. Mitä on jäänyt tuntematon onko p53: n villin tyypin transactivation aktiivisuutta tarvitaan sen ehkäisevästä roolin replikaatioon liittyvän HR.

P53 fosforyloituu suoraan tai välillisesti ATM (ataksia verisuoniluomen mutaation) ja ATR (ATM ja Rad3 liittyviä) kinaasien [34], [35], mutta toiminnalliset seuraukset näistä muutoksista osalta HR asetusta ei ole vahvistettu. ATM vastaa pääasiassa DSB: ihin ja fosforyloi verkoston alustojen [36]. ATM vaikuttaa sekä HR sekä virhealtista ja virheetön ei-homologisen end-liittymällä [37], [38], [39]. ATR kinaasi on keskeinen rooli vastauksena replikatiivista stressi ja fosforylaatiota ATR substraattien kollektiivisesti estää replikaatiota ja ylläpitää replikointi haarukat, estäen perimän epävakaisuuden [40], [41]. Tärkeää on, HR käytetään uudelleen aloittaa replikointi mutta voi myös aiheuttaa sopimattomia Strand-vaihto tapahtumia pysähtynyt haarukat jos ei säädellä kunnolla [40], [42]. Verrattuna hiiva, anti-recombinogenic toiminnot replikaation tarkistuspiste nisäkässoluissa ovat huonosti [40], [42].

Tässä osoitamme ensimmäistä kertaa, että transaktivaation-puutteellisia p53 downregulates HR vastauksena ja replikatiivisia stressiä. Me vahvistaa, että HR tukahduttaminen p53 tapahtuu vain tunnin Replikatiivisen stressi ja riippuu sekä, RPA sitoutumiskohta ja ATR fosforylaatio seriinin 15, mikä asettaa p53 nisäkkään replikointi tarkistuspiste. Toisin kuin p53: n roolia replikoituvan stressin vastaus, tukahduttaminen homologian välittämä korjaus suoraan tai välillisesti aiheuttamaa DSB näyttää rento, sopusoinnussa p53 roolia valvojana genomin.

Tulokset

Differential sääntely HR by transaktivaation-alentunut p53

aiemmin on osoitettu, että p53 vaimentaa HR induktion jälkeen replikatiivisen stressin [11], [33]. Se oli kuitenkin epävarmaa, p53: n transaktivaatiofunktiota aktiivisuutta tarvitaan tätä toimintoa. Käsitellä tätä kysymystä, käytimme p53-null pysyvästi transfektoitujen solujen aikaisemmin tunnettu transaktivaatiota heikentynyt p53 mutantti, p53QS [10]. Olemme indusoi muodostumista subnuclear RAD51 pesäkkeitä käsittelemällä soluja estäjien replikaation venymän, tymidiini ja HU (kuvio 1A, ja dataa ei näytetty). Vastauksena joko lääkkeen, oli tilastollisesti merkittävä suppressio RAD51 pesäkkeitä muodostumista p53QS ilmentäviä soluja verrattuna p53-null kontrolleihin (Kuva 1BC, kuvio S1A). Kontrollina suuruus tämä vaikutus oli samanlainen kuin HR estävä kyky endogeenisen villityypin p53, vaikka tämä koe suoritettiin eri solulinjassa, A549 (kuvio S1B). Sen sijaan kuviossa 1D esitetään, että p53QS ei moduloida RAD51 pesäkkeitä induktion soluissa altistetaan ionisoivalle säteilylle (IR), joka tuottaa DSB koko solusyklin, jossa sisarkromatidin DSB esiintyy leikkauksen jälkeen replikointi ja G2 korjattu HR.

(A) edustavat kuvat subnuclear RAD51 pesäkkeitä muodostumista H1299-soluissa, jotka ekspressoivat stabiilisti p53QS tai p53-null-soluissa, käsiteltiin 5 mM tymidiiniä (TdR) 24 tuntia. (B) vaikutus p53: (null vs. QS) on RAD51 pesäkkeitä muodostumiseen H1299 soluissa käsiteltiin 5 mM TdR 24 tunnin ajan. Pylväät edustavat keskiarvoa standardeilla virhe perustuva 3 riippumatonta toistoa. (C) vaikutus p53 tilan RAD51 pesäkkeitä muodostumiseen H1299 soluissa, joita käsiteltiin 1 mM hydroksiurean (HU) 24 tuntia. Pylväät edustavat keskiarvoa standardeilla virhe perustuva 5 riippumaton toistoja. (D) vaikutus p53 tilan RAD51 pesäkkeitä muodostumiseen H1299 soluissa 6 tai 16 tuntia (h) käsittelyn jälkeen 2 Gy ionisoiva säteily (IR). Pylväät edustavat keskiarvoa standardeilla virhe perustuu 2-5 riippumatonta toistoja. Kaikki y-akselit osoittavat prosenttiosuuden käsiteltyjen solujen vähintään 10 RAD51 pesäkkeitä per ydin vähentämisen jälkeen prosenttiosuus käsittelemättömien solujen taustalla tasot RAD51 pesäkkeitä. P-arvot perustuvat Studentin t-testiä (kaksisuuntainen).

mallintamiseksi DSB korjaus alustoille muistuttava linjassa sisko kromatidia, muutimme aiemmin käytetty rekombinaatio määritys, joka tekee solut vastustuskykyisiä mykofenolihapolle onnistuneen HR. Bakteerien

gpt

geenin rekombinaatiosubstraatin pDT219 inaktivoitiin insertio I-Scel-tunnistuskohdan osaksi KpnI (kuvio 2A). Sopeutuminen aiemmin tunnettu hiirimallissa tutkia transaktivaatiota riippumaton ominaisuudet p53 [13], esitimme transakti–heikentynyt p53-A135V hiiren alkion fibroblasteissa (MEF) kantavat pDT219 alustan joka satamat tunnistuskohta harvinaisten leikkaus sivusto- suunnattu I-Scel meganuclease (tuloksia ei ole esitetty). Olemme aiemmin osoittaneet, että tämä p53-mutantti kykenee tukahduttamaan spontaani HR tapahtumia, analogisesti p53QS ihmisen soluissa [10], [13]. Ensin arvioitiin vaikutus tämän mutantin tukahduttaa DSB aiheuttama HR käyttäen homologista luovuttajan sekvenssin pΔ2, joka on ko-transfektoitiin I-Scel meganuclease ekspressiovektoriin. Tässä järjestelmässä homologia välittämä korjaus välittyy osuuksilla keskeytymättömän homologiaa 202 ep ja 2333 bp ylävirtaan ja alavirtaan I-Scel päällä, vastaavasti. Emme havainneet tilastollisesti merkittävä ero DSB-indusoidun HR taajuuksien solujen välillä ja ilman p53-A135V (kuvio 2B). Ei ollut eroa transfektiotehokkuudet eri kloonia (dataa ei esitetty). Seuraavaksi muutettu donori lyhentämään jaetun sekvenssihomologia vain 188-250 bp (pKEB1). Tämän muutoksen, suppressiivinen vaikutus p53 tilastollisesti merkittävästi lisääntynyt 10-kertaisesti (p 0,01). Samoin yleisesti käytetty GFP-pohjainen rekombinaatiosubstraatin, PDR-GFP, jossa HR välittää noin 400 bp: n jaetun yhtäjaksoisen sekvenssin homologia reunustavat I-Scel-sivuston, transactivation-heikentynyt ihmisen tai hiiren p53 DSB-induced HR by moninkertaisesti (kuvio S2).

(A) Plasmidi substraatti pDT219 kantaa kopio bakteeri gpt-geeni inaktivoidaan insertio I-Scel-tunnistuskohdan osaksi ainutlaatuinen KpnI ja pSV2-gpt. HR tapahtumia indusoitiin 10,1 hiiren alkion fibroblasteissa kuljettaa pDT219 samanaikainen transfektio I-Scel ekspressiovektoriin ja homologisen luovuttaja. pΔ2 on ominaista 202 emäsparin ja 2333 emäsparin yhtäjaksoisen sekvenssihomologia jaettu pDT217, kun taas pKEB1 sisältää vain 188 bp ja 250 bp homologia reunustavan tauko sivustolla. Seuraavat kotransfektoimalla pKEB1 tai pΔ2 yhdessä I-Scel ekspressiovektori, rekombinantteja pisteytettiin on pesäkemuodostusta. (B) l-Scel-indusoidun HR taajuuksia saadaan integroitua kromosomaalisesti pDT219 piirretään p53 tila, (-), joka osoittaa p53-null, (+), joka osoittaa transaktivaation-puutteellisia p53-A135V mutantti, joka on toiminnallisesti analoginen p53QS. Pylväät edustavat geometrisen keskiarvon kanssa SEM 3-6 itsenäisen kokeen. Suhteellinen tukahduttaminen HR: n läsnä ollessa p53-A135V verrattuna p53-null-soluissa on tarkoitettu kummankin luovuttajan plasmidit. Suhteellinen tukahduttaminen HR verrattiin käyttäen paritonta t-testiä (kaksisuuntainen).

Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että transactivation-alentunut p53 downregulates HR vastauksena Replikoitumattoman stressiä, mutta ei vaikuta homologiaa -välitteisen korjaus DSB jos pituus jaetun homologia yli 250-400 kp joka olisi tyypillistä välisen vaihdon sisko kromatidien. Havaittu tukahduttaminen DSB aiheuttaman HR läsnäollessa lyhyellä homologioista voi olla liity p53: n säätelijänä replikaatioon liittyviä HRR ja ei jatkettu.

HR tukahduttaminen edellyttää seriini 15 sivuston p53

vastauksena replikaatiohaarukan pysähtyminen, p53 fosforyloituu seriini 15 (kuvio S3A, B) [34], [43]. Kuitenkin toiminnalliset seuraukset tämän muutoksen olivat tuntemattomia. Loimme fosfo-mutantti p53QS ottamalla käyttöön seriini 15 alaniinimutaatio (p53QS-S15A) (kuvio 3A). Olemme myös tuotti RPA-sitova mutantti p53 (p53QM) mukaan lisäksi mutatoimalla aminohapon 53 ja 54, jotka on aiemmin osoitettu olevan tärkeä HR tukahduttaminen [10]. Kun stabiilisti ilmaistu p53-null-soluissa (kuvio S4), kaikki nämä mutantit liittyy samankaltaisia ​​solusyklin profiileja vasteena tymidiiniä hoitoon (kuvio 3B). Kuten ennustettiin, p53QM pystynyt tukahduttamaan RAD51 pesäkkeitä muodostumista tymidiinin-käsitellyissä soluissa, ja tämä havaittiin useita alakloonit (kuvio 3C, ja dataa ei näytetty). Silmiinpistävän, estämällä seriinin 15 fosforylaatiota myös kumosi kokonaan kykyä p53QS säädellä vähentä- västi RAD51 pesäkkeitä.

(A) Kuva N-päätteen p53 mutaatiot mutageneesillä. Mutantti konstruktit vakaa ekspressoitiin yhteisestä kromosomaalisen integraation paikan H1299-soluissa (katso materiaalit ja menetelmät). (B) Cell cycle jakaumat H1299 klooneja, jotka ilmentävät stabiilisti p53 N-terminaalista mutantti. TdR, 5 mM tymidiiniä 24 tunnin ajan. (C) vaikutus p53 tilan tymidiiniä indusoi RAD51 pesäkkeitä muodostumista, analogisesti kokeita kuviossa 1 p-arvo, seurauksena t-testi (two-tailed) verrataan p53QS p53-null-soluissa.

arvioida, kuinka aikaisin vastaus replikatiivista stressiä S15 sivusto p53 tarvitaan, tutkimme kinetiikkaan pesäkkeitä muodostumista. Kuvio 4 osoittaa, että RAD51 pesäkkeitä muodostuminen oli jo alentunut 6 tunnin kuluessa tymidiinin hoidon p53-null ja p53QS-S15A ilmentäviä soluja. Tämän mukaisesti havainnon, S15 fosforylaation p53QS ilmentävien solujen havaittiin 6 tunnin kuluessa hoidon (kuvio S3C). Lisäksi p53QS tukahdutti paikallinen kertyminen RPA 6 tuntia Kuten aiemmissa tietoa p53 kyvystä estää RPA sitoutumista yksijuosteisen DNA, joka on välttämätön vaihe aloittamiseksi HR (kuva S5).

etenemisestä ajan aiheuttamaa RAD51 pesäkkeitä in tymidiinin käsitelty H1299 kloonien mitattiin analogisesti kokeiden kuviossa 1

Riippuvuus p53-välitteisen HR tukahduttaminen ATR

S15 sivusto p53 on muutettu ATM ja ATR-kinaasien [34], [44], [45], ja molemmat kinaasien on osoitettu edistävän HR soluissa, joilla on heikentynyt tai menettänyt villityyppinen p53-toiminto [39], [46], [47]. Kuten odotettua, käsittelemällä kofeiinia, joka estää ATR sekä ATM, kyky solujen muodostamiseksi RAD51 pesäkkeitä vastauksena tymidiiniä suuresti vähentynyt (kuvio 5A). Huomiota herättävää on, kyky p53QS vähentää RAD51 muodostumista verrattuna p53-null tai p53QS-S15A solujen kumottu. Erottaa toiminnon ATM vs. ATR, käsittelimme solut ATM estäjän KU55933. Tässä ympäristössä, HR tukahduttava vaikutus p53QS säilyi, osoittaa riippuvuus ATR sijaan ATM. Voit vahvistaa havainto, käsittelimme soluja vastaan ​​suunnattu siRNA ATR koska mitään erityistä ATR estäjä on saatavilla. Riittävä ATR-proteiinin vähenemistä saavutettiin seuraavat kahden siRNA transfektion, ja solut säilytetään normaalin kasvun aikana 48 tunnin kokeen ajan (kuvio 5B, ja dataa ei näytetty). Kuten aiemmin havaittiin, oli p53-riippumattoman vähentäminen HR ATR siRNA käsitellyissä soluissa: prosenttiosuus RAD51 pesäkkeitä positiivinen p53-null-soluissa laski 16% verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu ohjaus siRNA, eli 40%: sta 24% (kuvio 4C). Verrattuna hallita siRNA transfektoituja soluja, suhteellinen p53-välitteisen tukahduttaminen HR ATR siRNA transfektoiduista soluista vähemmän korostunut, vaikka ei kokonaan kumottu, joka on yhdenmukainen jäljellä p53QS toiminto. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että ATR säätelee HR kautta p53-riippuvaisten ja riippumattomien mekanismien kautta.

(A) H1299 kloonit käsiteltiin tymidiiniä (5 mM: ssa 24 tuntia), tai ilman samanaikaista kofeiinia (5 uM) tai KU55933 (20 uM) hoitoon. (B) Western blot, joka havainnollistaa siRNA välittämää köyhtyminen ATR H1299 soluissa. sc, salattu siRNA ohjaus. (C) vaikutus p53QS aseman ja ATR heikentymisen RAD51 pesäkkeitä induktio mitattuna analogisesti kuvioon 1.

p53 ei vaaranna RAD51 vastaus DSB jälkeen tymidiini tai MMC

HR hyödynnetään replikaatiohaarukan korjaus- ja uudelleenkäynnistys [2], prosessi, joka ei pitäisi vastustaa p53 koska sitä tarvitaan ylläpitotehtävissä perimän vakauden ja solujen eloonjäämistä. Kun vapautuminen 24 tunnin inkubaation tymidiiniä (kuten kuviossa 4), havaitsimme kasvu γ-H2AX pesäkkeitä, yhdenmukainen esiintyminen DSB on romahtanut replikaation haarautuu (kuvio 6A). Oli samanlainen suhteellinen kasvu RAD51 pesäkkeitä, joka oli riippumaton p53 asema ja yhdenmukainen HR-välitteisen haarukka uudelleenkäynnistyksen (kuvio 6B). Siksi tämä asetus, p53QS ei aiheuttanut tukahduttava vaikutus RAD51 pesäkkeitä muodostumiseen.

(A) Värjäys varten γ-H2AX markkerina DSB muodostumisen, joka kuvaa lisäystä DSB sekä H1299 klooneja 4 tunnin sisällä vapautumisen jälkeen tymidiiniä (5 mM 24 tuntia). (B) ajan kuluessa RAD51 pesäkkeitä induktio, analogisesti kuvioon 4, poiston jälkeen tymidiiniä. Havainnollistaa Samanlainen nousu RAD51 pesäkkeitä induktion riippumatta p53: prosenttiosuus solujen pesäkkeitä oli normalisoitu 0 hetkellä 0 tuntia (h), eli siinä vaiheessa, kun poisto tymidiiniä. (C) vaikutus p53 tilan RAD51 pesäkkeitä aiheuttamaa 4 tuntia hoidon jälkeen mitomysiini C (MMC) (0,5 ug /ml 1 tunnin ajan). Y-akselilla on niiden solujen prosentuaalinen määrä, joilla on vähintään 10 indusoi RAD51 pesäkkeitä tumaa kohti. Vastaavia tuloksia saatiin 24 tunnin kuluttua (tuloksia ei ole esitetty). (D) vaikutus p53 tilan γ-H2AX pesäkkeitä muodostuminen 24 tuntia hoidon jälkeen MMC. Y-akselilla on niiden solujen prosentuaalinen määrä, joilla on vähintään 20 indusoi pesäkkeitä tumaa kohti. (E) klonogeeninen eloonjääminen H1299 kloonien vaihtelevalla p53 tila. Kaikki tiedot pistettä perustuvat 2-3 riippumatonta toistetuista kokeista.

altistuu myös solujen silloitteen MMC, joka johtaa sukupolvi DSB on romahtanut lisääntymään haarukat. Yhdenmukainen data kuviossa 6B, p53QS ei tukahduttaa RAD51 pesäkkeitä muodostumisen vastauksena MMC (kuvio 6C). Mikä tärkeintä, ei ollut eroa jäljellä γ-H2AX pesäkkeitä p53-null ja p53QS ilmentävien solujen 24 tunnin kuluttua MMC altistuksen, mikä viittaa siihen, että p53 ei vaaranna DSB korjaus (kuvio 6D). Lopuksi ilmaus p53QS ei heikentänyt selviytymistä MMC-käsiteltyjen solujen johdonmukainen seuraus samanlaisesta RAD51 ja γ-H2AX pesäkkeitä tasoja ilmentävä soluja (kuvio 6E). Päinvastoin, oli hieman mutta vankka resistenssin lisääntymistä MMC ekspression jonkin p53-mutantin muodossa. Mielenkiintoista, samanlainen tulos nähtiin kun ilmentävät p53-A135V mutantti hiiren alkion fibroblasteissa (kuvio S6). Mekanismeja, joilla transactivation-inaktiivinen p53 voi edistää MMC selviytymisen vielä määritettävä (katso keskustelu).

Keskustelu

Vaikka p53 roolia transkriptiotekijä, joka ohjaa apoptoosin ja solusyklin etenemisen on tukevasti perustettu, lukemattomia tutkimuksia kuluneiden 15 vuoden katsoneet monia muita biokemiallisia ja solufunktioita p53 [1], [6]. Transaktivaatiodomeenin riippumaton rooli p53 vaimennussäätely HR on toistuvasti kuvannut useissa eri laboratorioissa, mukaan lukien oma [7], [8], [10], [14], [48]. Koska huolellinen valvonta henkilöstöasioissa on tärkeää vastaus pysähtynyt tai romahtanut replikointi haarukat, selvittämiseen rooli p53 HR on kriittinen ymmärtää paremmin kasvaimen aloittamisesta ja etenemiseen.

Osoitamme täällä ensimmäistä kertaa että p53 downregulates HR vastauksena Replikoitumattoman stressiä tavalla, joka on riippumaton sen roolista transkriptiotekijä (kuviot 1, 2, 3). Tuloksemme ovat sopusoinnussa ajatus, että p53: n roolia HR riippuu vuorovaikutuksesta RPA ja ATR-kinaasia, mikä syyllistämättä p53 ATR replikointi tarkistuspisteen (kuva 3, 5). Kaiken kaikkiaan anti-recombinogenic toimintoja replikointi Checkpoint vielä täysin vakiintunut [40], [49]. Vuonna fissio Hiivassa Chk1 homologin estää Mus81 ja Rad60 toiminta estäen ei-toivottua rekombinaatio [50], [51]. Korkeammissa eukaryooteissa, ATR fosforyloi BLM, tunnettu anti-recombinogenic tekijä [52], [53]. Toisaalta, ATR on osoitettu edistävän HR [46], [47]. Yhdenmukainen Näiden tietojen havaintomme merkitse sitä, että sekä ATR ja ATM edistää RAD51 pesäkkeitä muodostumista vastauksena Replikoitumattoman stressiä p53-riippumattoman muoti (kuva 5). Näin ollen voi olla positiivinen ja negatiivinen (via p53) sääntely HR ATR.

Mitä tulee mahdollisten rajoitusten työmme, luontainen rajoitus pesäkkeitä tutkimuksissa on, että ne eivät voi suoraan mitata proteiinin toimintaa replikointi haarukat (kuvio 1, 3, 4). Kuitenkin, pesäkkeitä päätepisteet käytetään laajasti kirjallisuudessa määrittää molekyylitason mekanismeja ja geneettisen tekijöihin HR [15], [46], [54]. Toinen, vastaava rajoitus pätee myös plasmidi (kuva 2), joka ei voi olla tarkka mitta fysiologisia HR tapahtumista, jotka ovat alle p53-ohjaus. Kolmanneksi, vaikka kaikki meidän ja muiden tietojen mukaan ihmisen p53QS mutantti ja hiiren p53-A135V (tai ihmisen homologi) ovat toiminnallisesti vastaavien kannalta tukahduttaa HR transaktivaatiodomeenin riippumattomalla tavalla (esimerkiksi kuva S2) [7], [10], [12], [13], emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että tuntematon eroja voi esiintyä. Lopuksi, myös varoittaa, että tulokset, jotka saatiin yksi solulinja, kuten H1299 keuhkosyövän soluja tässä tutkimuksessa, ei voida helposti yleistää muita solulinjoja.

Mitä molekyylitason mekanismeja, joilla S15 fosforylaatio p53 voisi tukahduttaa HR? Eräässä aiemmin julkaistu malli, varastoimalla RPA peräisin ssDNA estävät myöhemmin lastaus RAD51, ja näin on yksi keino, jolla p53 vaimentaa HR [10]. P53 N-päässä kilpailee ssDNA varten OB-kertaiseksi verkkotunnuksen RPA1 n N-päästä [55]. Niinpä spekuloida, että mekanismeja voi olla olemassa, joiden N-terminaalinen fosforylaation p53 edistää sitoutumista RPA1, mikä vaikuttaa ssDNA-sitoutumisaffiniteetti DNA: ta sitovan domeenin RPA. Esimerkiksi muuttunut ssDNA-RPA sitoutuminen voi johtaa suunnittelematon vapautumista RPA peräisin ssDNA vahingol- kunnon RAD51 lastausta tai p53 saattaa jäädä RPA on ssDNA ja viivästyttää RAD51 lastaus. On olemassa vahvoja keskinäisten riippuvuuksien N-terminaalista p53 fosforylaatiopaikat [56], [57]. Vuonna H1299-soluissa, mutatoimalla S15 johtaa vähentyneeseen S37 fosforylaation säteilytyksen jälkeen [57]. Mielenkiintoista on, Lowry et al. äskettäin löydetty todisteita sortuneen alue luonnostaan ​​jäsentymätön p53 verkkotunnus silmukka rakenne keskittynyt tähteet 34-36 [58]. Nämä kirjoittajat ehdottivat, että S37 fosforylaation voi johtaa avoimeen konformaatioon tällä alalla ja siten edistää sitoutumista RPA1. Täten mutaatio S15 heikentäisi HR välillisesti estävä vaikutus viereisiin S37 fosforylaatioon.

Käsitys, että p53 voi tukahduttaa DSB korjaus on tullut sarjan tutkimuksia tarkastellaan vaikutusta p53 paikka- suunnattua DSB in kromosomiin liittyneen plasmidin alustoille [7], [12], [59]. Olemme havainneet, että suuruus ehkäisevän p53 vaikutus korreloi pituus sekvenssihomologia läsnä (kuvio 2, S2). Oletamme, että pDT219 /pΔ2 (kuva 2) on tyypillinen sisarkromatidin korjaus koska laajuudesta käytettävissä sekvenssihomologia on vuonna kiloemäsparin alueella. Vaikka tunnustamme, että vertaillaan eri rekombinaatiosysteemien on varovaisuudella, riippuvuus p53: n estävä vaikutus on homologia pituus on erinomaisessa kanssa etukäteen tutkimuksessa Wiesmüller et al. [12]. Nämä kirjoittajat, jotka käyttivät paneeli kromosomaalisen EGFP-substraatit, osoittivat, että downregulation Geenikonversion tapahtumista p53 oli erityisen voimakasta, kun pituus jaetun homologia aleni 168-233 bp. On mahdollista, että p53 muodostaa kynnyksen välillä lyhyen ja pitkän homologioille jotka voivat auttaa estämään virhealtista korjaus- ja haitallisia uudelleenjärjestelyt väärästä kohdistamisesta toistuvia DNA. Tällainen malli olisi yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että solun p53 tila ei ole suoraa vaikutusta geenien kohdentamiseen ja sisarkormatidinvaihdokset, jotka tyypillisesti välittyvät pitkään homologiat luokkaa kiloemäksen [60]. Tämä malli ennustaa myös, että p53 ei vaikuta kielteisesti korjaamista kromatidin DSB ionisoivan säteilyn aiheuttamaa tai muita aineita, jotka on linjassa solujen selviytymistä data [61]. Tuloksemme osoittavat myös, että HR taito mitattiin I-Scel perustuva plasmidin järjestelmä kuten PDR-GFP (kuva S2) ei ole aina hyvä surrogaattimarkkerina HR-riippuvaisen korjaus eksogeenisen DNA-vaurioita. Lisäksi viimeaikaiset tiedot viittaavat siihen, että HR korjaus Kromosomi I-Scel aiheuttama DSB on solusyklin riippuvainen ja edellyttää transkription säätelyyn p53 (Rieckmann et al., Julkaisematon 2011). Siten on mahdollista, että HR-toiminta vastauksena replikaatio stressiä tai Frank DSB differentiaalisesti säätelee villityyppi- ja mutantti p53 variantteja. Emme voi myöskään sulkea pois, että sääntely vaikutukset voivat vaihdella solulinjojen.

Lisäksi p53 ei vaaranna RAD51 pesäkkeet vasteen ja solujen eloonjäämistä altistuksen jälkeen silloitteen MMC (kuva 6). Päinvastoin, oli jopa hieman lisääntynyt solujen eloonjäämistä ilmennettäessä transaktivaation-puutteellinen p53-mutantit (kuvio 6E, S6). Taustalla mekanismi on vielä määrittämättä, vaan voivat koskea mahdolliseen vakauttaminen usean proteiinin kompleksit klo replikaatiohaarukan p53 (LMM, HW, julkaisematon data). Havaittu kasvu MMC vastus on yhdenmukainen muiden käy ilmi, että ilman apoptoosin, läsnäolon p53 liittyy sisplatiinin vastus [62], [63], [64]. Sen sijaan solu- järjestelmissä tai määrityksissä alttiita apoptoosin, vastustuskyky DNA: ta vaurioittavat aineet tyypillisesti aiheuttaa menetys villityyppisen p53: n [65], [66]. Kaiken rooli p53 määritettäessä solujen eloonjäämistä vasteena DNA vahingoista on selvästi monimutkainen ja heijastaa p53: n useita toimintoja apoptoosin, solusyklin kontrolli, ja DNA: n rekombinaation. Tutkimuksessa näistä kysymyksistä on määritelty lusysteemit on lupaava avenue tutkimuksen mahdollista kliinistä merkitystä pahanlaatuisten kasvainten joista useimmat ovat menettäneet p53-toiminto. Lisäksi biologista merkitystä p53: n toiminta HR asetuksessa, erityisesti sen osassa kasvaimen tukahduttaminen, on vahvistamatta.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

NCI-H1299 keuhkosyövän soluja (p53-null) saatiin ATCC: stä, ja niiden käyttö on julkaistu aiemmin [10]. A549 keuhkosyövän soluja saatiin myös ATCC. Hiiren alkion fibroblastit (BALB /c 3T3 10,1 klooni, p53-null) olivat lahja tri Arnold Levine ja niiden käyttö on julkaistu [14], [61]. H1299 /FRT-kloonit, jotka kantavat eri p53 mutanttia mukaisesti valmistajan ohjeiden (Flp-In, Invitrogen). Lyhyesti, H1299-solut elektro-transfektoitiin pFRT /LacZ seurasi Zeocin (100 ug /ml, Invitrogen) valinta määrittää kromosomi-integrantteja. Yhden kopion integranttien matalan transkriptionaalinen aktiivisuus perustuu yhteistyöhön integroitu β-galaktosidaasi toimittaja valittiin transfektion eri pcDNA5 /FRT-p53 konstruktioita, samanaikaisesti pOG44 kohdennettua integroitumista FRT akseptorikohdassa. Sen jälkeen valinta 400 ug /ml Hygromycin (Invitrogen), pesäkkeitä laajennettiin ja kokosolulysaateista saatu arvioimaan proteiinin ilmentymisen. Joitakin kokeita, H1299-solut kantavat satunnaisesti integroitu p53QS rakentaa (pRc /CMV- L22Q /W23S, ystävällisesti Anindya Dutta) käytettiin. MEF-soluihin transfektoitiin ekspressiovektorilla, p53-A135V ja valitaan 500 ug /ml G418: aa (Fisher Scientific), kuten aiemmin on kuvattu [13]. Kaikki testatut solulinjat mycoplasma-vapaa.

RNA-interferenssi

ATR oli kohdistettu aiemmin käytetty ja validoitu siRNA oligonukleotidia, 5’CCUCCGUGAUGUUGCUUGAtt -3 ’(Applied Biosystems) [67]. Eksponentiaalisesti kasvavat H1299-solut maljattiin 16 tuntia ennen transfektiota. ATR siRNA tai sekoitettua kontrollipeptidiä laimennettiin 100 ui Opti-MEM (Roche), jolloin saatiin lopullinen konsentraatio oli 100 nM, ja sekoitettiin 10 ui X-tremeGENE transfektioreagenssia (Roche) 100 ui Opti-MEM. Kompleksin muodostumisen annettiin edetä 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ennen tipoittain soluihin. siRNA komplekseja inkuboitiin solujen kanssa 4 tuntia, jona aikana solut muutettu normaaliin kasvualustaa. Transfektio suoritettiin kahdesti, 24 tunnin välein, optimaalisen knockdown. Kokosolulysaateille saatu 24 ja 48 tuntia. Lysaatit denaturoitiin ja vähentää, ja ajettiin sitten 3-8% Tris-asetaatti geeli (Invitrogen) 2,5 tunnin ajan 150 V: n näytteet siirrettiin PVDF-kalvolle, jossa on puolikuiva laite (BioRad) 1 tunnin ajan 12