Krooninen sairaus

tiivistelmä

proteiinikinaasi CK2 on erilaisia ​​toimintoja edistää ja ylläpitää syöpä fenotyyppejä. Olemme tutkineet vaikutusta CK2 eston keuhkosyövän solujen T790M-välitteisen resistenssin EGFR-TK-inhibiittori. Kestää alalinjoja PC-9 gefitinibille (PC-9 /GR) ja erlotinibin (PC-9 /ER) vahvistettiin edellisessä tutkimuksessa, ja T790M toissijainen mutaatio löytyy sekä kestävä alalinjoja. Pieneneminen EGFR siRNA hoito tehokkaasti kontrolloi kasvua resistenttien solujen, mikä viittaa siihen, että heillä on edelleen EGFR-riippuvuus. CX-4945, joka on voimakas ja selektiivinen CK2 estäjä, aiheuttama autophagy PC-9 /GR ja PC-9 /ER, ja jota tuki induktion autophagic vacuoles ja mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1 kevytketjun 3 (LC3) lauseke, ja kasvu pistekeratopatiaa fluoresoivien signaalien resistenttien solujen ennalta transfektoitu vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) leimatun LC3. Kuitenkin peruuttaminen CX-4945 johti elpymistä syöpäsolujen kanssa autophagy. Huomasimme, että induktio autophagy CX-4945 sekä resistenttien solujen oli CK2 riippuvainen käyttämällä Sirna vastaan ​​CK2. Käsittely CX-4945 yksin aiheuttama minimaalinen kasvun inhibition resistentit solut. Kuitenkin yhdistetty hoito CX-4945 ja EGFR-TKI esti tehokkaasti syövän-soluproliferaatiota ja indusoi apoptoosin. CX-4945 lisäsi translokaatiota EGFR solun pinnalta autophagosome myöhemmin johtaa vähenemiseen EGFR, kun taas inhibitiota autophagy jonka 3mA tai Atg7 kohdistettu siRNA esikäsittely vähensi lasku EGFR CX-4945. Siten apoptoosin yhdistämällä CX-4945 ja EGFR-TKI tukahdutettiin 3mA tai Atg7 kohdistettuja siRNA esikäsittely, mikä viittaa siihen, että autophagosome välittämää EGFR alassäätöä olisi merkittävä rooli koskien apoptoottisen solukuoleman EGFR-TKI. Yhdistetty käsittely CK2 estäjän ja EGFR-TKI voi olla lupaava strategia voittamiseksi T790M-välitteisen vastus.

Citation: Niin KS, Kim CH, Rho JK, Kim SY, Choi YJ, Song JS, et al . (2014) Autophagosome välittämää EGFR Down-asetuksen aiheuttama CK2 estäjä Parantaa teho EGFR-TKI on EGFR-Mutant Lung Cancer Cells Resistance by T790M. PLoS ONE 9 (12): e114000. doi: 10,1371 /journal.pone.0114000

Editor: Spencer B. Gibson, University of Manitoba, Kanada

vastaanotettu: 02 elokuu 2014; Hyväksytty: 02 marraskuu 2014; Julkaistu: 08 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Eli et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä työ oli rahoitaa Korean Health Technology R Welfare (HI12C1146000013) ja avustuksen (2011-0529) alkaen Asan Institute for Life Science, Seoul, Korean tasavalta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdistaminen epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), pieni-molekyyli, tyrosiinikinaasi-inhibiittorit on tullut olennainen terapeuttinen strategia ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja EGFR-mutaatio. Kun olet vahvistanut eloonjäämishyötyä verrattuna tavanomaisiin solunsalpaajahoito [1], [2], EGFR-TKI on hyväksytty ensilinjan aineita. Huolimatta aluksi merkittävä vaste, hankittu resistenssi lopulta kehittyy, mikä rajoittaa mediaanivastetta kesto alle vuoden [3], [4]. Noin puolet vastus johtuu toisen mutaatio asemassa 790, eli T790M [5], [6]. Kookkaammat metioniinitähteen in T790M voi estää sitoutumisen lääkkeen tai lisää ATP affiniteetti ATP-sitova tasku, ja siten minimoi lääkkeen tehokkuus [5], [7].

Toisen sukupolven EGFR-TKI: , kuten BIBW2992 (afatinib) ja PF00299804 (dacomitinib), on suositeltavaa, jotta voittaa T790M välittämää vastus ottaen huomioon, että nämä voimakas, peruuttamaton EGFR-TKI enää kilpailla ATP kun ne ovat liittyneet kovalenttisesti sidottu kinaasidomeenisekvenssiin [ ,,,0],8], [9]. On kuitenkin epävarmaa, onko peruuttamaton EGFR-TKI voi voittaa johtuvan vastuksen T790M joitakin alustavia tuloksia käynnissä kliiniset kokeet ovat olleet melko pettymys kannalta voittaa vastuksen, vaikka menestyksekkäämpi, etenemisestä vapaa elossaololuku voitaisiin saavuttaa kun käytetään ensilinjan agentti verrattuna palautuvat EGFR-TKI: [10], [11]. Siksi edelleen kliinisen tutkimuksen tarvitaan, jotta tarjota tehokkaampia voittamiseen strategioita.

proteiinikinaasi CK2 on konstitutiivisesti aktiivinen ja hyvin säilyneitä, jokapaikan seriini /treoniini-kinaasi, joka on mukana erilaisissa solun liittyvä signalointi solusyklin, proliferaatiota ja apoptoosia [12] – [14]. Poikkeava CK2 ilme ja toiminta on raportoitu monissa ihmisten sairauksia, kuten syöpää [15]. Yli-ilmentyminen CK2 vaimentaa apoptoosin syöpäsoluissa, kun taas sen alassäätöä tehostaa solukuoleman aiheuttama lääkeaineen tai säteilyn, ja mikä viittaa sen tärkeä sääntelyn rooli koskien määrittämistä syöpäsolujen kohtalo [16] – [19]. CK2 riippuvaista fosforylaatiota Cdc37 tarvitaan chaperoning funktio Hsp90 useaan asiakkaan onkoproteiineja, kuten CK2, itse [20]. Koska Hsp90 on välttämätöntä onkoproteiinia kypsymisen ja vakaus, selviytyminen syöpäsolujen on kriittisesti riippuvainen sen moitteettoman toiminnan, mikä viittaa siihen, että valvonta HSP90 suoraan tai epäsuorasti estämällä CK2 olisi lupaava syövän hoitoon. Lisäksi, CK2 voi säädellä EGFR ja sen alavirran signalointia, erityisesti aktiivisuus jäsenten PI3K-Akt-mTOR-reitin [21] – [24]. Inhibitiota tämän reitin on osoitettu voimistavan vaikutuksen EGFR: n estäjien [25].

Tässä tutkimuksessa tutkimme aktiivisuutta CX-4945, joka on selektiivinen ja voimakas CX-2-estäjän, on EGFR- mutantti keuhkosyöpä solut T790M mutaatio johtaa vastustuskyvyn EGFR-TKI. Lisäksi tutkittiin, voisiko se voimistaa EGFR-TKI voittamiseksi vastus.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

Gefitinibi /Erlotinib- resistenttejä solulinjoja (PC-9 /GR ja PC-9 /ER) perustettiin aikaisemmassa tutkimuksessa [26]. Soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä (Invitrogen, Carlsbad, CA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA) 37 ° C: ssa 5% CO 2-ilmakehässä. MTT-liuos ostettiin Sigma (St Louis, MO, USA). Gefitinibi, erlotinibi, 17-DMAG, CX-4945, ja 3mA ostettiin Selleck Chemicals Co. Ltd (Houston, TX, USA).

Solun eloonjääminen määrityksiä

suorittamiseksi MTT-määritystä , solut maljattiin 96-kuoppaisille steriilejä muovilevyillä. Solut altistettiin vaihtelevia annoksia CX-4945. 72 tunnin jälkeen, 15 ui MTT-liuosta (5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin 4 tuntia. Kiteinen formatsaanikiteet liuotettiin 100 ui 10% (w /v) SDS-liuosta 24 tuntia. Absorbanssi 595 nm: ssä luettiin spektrofotometrisesti käyttäen mikrolevyn lukijaa. Validoida yhdistetyt vaikutukset CX-4945 tai EGFR riippuvuutta, soluja käsiteltiin CX-4945, EGFR-TKI, yhdistelmä CX-4945 ja gefitinibi tai erlotinibi tai EGFR suunnattu siRNA varten ilmoitettu kertaa. Solujen elinkyky määritettiin käyttämällä ADAM-MC automaattinen solulaskijalla (NanoEnTek, Seoul, Korea) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Western blot-analyysi

kokosolulysaateille valmistettiin käyttäen EBC lyysipuskuria ( 50 mM Tris-HCI [pH 8,0], 120 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,3 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 0,2 mM natriumortovanadaatti, 0,5% NP40, ja 5 U /ml aprotiniini) ja sentrifugoitiin sitten. Saatu supernatantti (20 ug) erotettiin 8%: sta 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Invitrogen). Membraanit blokattiin käyttämällä 5% rasvatonta maitoa, PBS-0,1% Tween 20: tä yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ennen kuin inkuboitiin yli yön primaarisilla vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä p-CK2α, joka hankittiin Sigma (St Louis, MO, USA) ja CK2α jotka hankittiin Abcam (Cambridge, UK). p-EGFR (Tyr1173), EGFR, Caspase-3, Akt, p-Erk, Erk, ja β-aktiini saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). P-Akt (Ser473), lohkaistaan ​​PARP (Asp214), Atg7 ja LC3 ostettiin Cell Signaling Technology (Berverly, MA, USA). Piparjuuriperoksidaasikonjugoitua vasta-aineita käytettiin sekundäärisiä vasta-aineita. Kalvot kehitettiin käyttämällä ECL sarjat (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

akridiinioranssivärjäyksellä

Autophagy analysoitiin värjäämällä solut vitaaliväriaineen, akridiinioranssin (Sigma, St. Louis, MO). Solut trypsinoitiin ja inkuboitiin akridiinioranssilla lopullisessa pitoisuudessa 5 ug /ml 30 min ajan 37 ° C: ssa 5% CO2-ilmakehässä. Analyysit tehtiin FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Aineisto analysoitiin käyttämällä CellQuest -ohjelmistoa (Becton Dickinson). Tulokset edustavat ainakin kolmen, itsenäisestä kokeesta, ja virhepylväät tarkoittavat keskihajonnat (SDS).

LC3-GFP: n ilmentymisen

Solut transfektoitiin plasmidilla, pEGFP-LC3 vektori (Addgene Inc., Cambridge, MA, USA) ja niitä viljeltiin 24 tuntia. Soluja käsiteltiin sitten CX-4945: ssa 24 tuntia. Pistemäinen kuviot LC3 transfektoiduissa soluissa tutkittiin fluoresenssimikroskopialla.

apoptoosimäärityksessä

Apoptoosi kvantifioitiin käyttäen Annexin V-FITC apoptoosin kit (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) mukaisesti valmistajan ohjeita. Lyhyesti, solut trypsinoitiin, pelletoitiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen anneksiini V: n sitoutumisen puskuria (150 mM NaCl, 18 mM CaCl

2, 10 nM HEPES, 5 mM KCI, 1 mM MgCI

2). FITC-konjugoitua anneksiini V (1 ug /ml) ja propidiumjodidia (50 ug /ml) lisättiin soluihin, joita inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Analyysit tehtiin FACScan (Becton Dickinson). Aineisto analysoitiin käyttämällä CellQuest -ohjelmistoa (Becton Dickinson). Tulokset edustavat ainakin kolmen, riippumattomasta kokeesta ja virhepalkkien merkitä keskihajonnat (SDS).

Sirna transfektioon

Sirna (siRNA) oligonukleotidit spesifisiä EGFR, Atg7, CK2α ja siRNA ohjaus ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz). Solut ympättiin 60 mm: n malja, joka jätettiin sitten 24 tuntia. A2 ui alikvootti siRNA-liuosta (10 uM) ja 5 ui Lipofectamine 2000 (Invitrogen) sekoitettiin ku- takin 100 ui seerumitonta RPMI 1640-alustassa. Niitä inkuboitiin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa yhdistämisen jälkeen kaksi seosta, ja tämä lisättiin sitten soluihin, jotka oli ympätty lautasen. 24 tunnin kuluttua, korjattu solut altistettiin Western blot-analyysi. Soluja käsitellään myös solujen elinkelpoisuutta ja apoptoosin analyysillä.

Konfokaalimikroskopia

soluja kasvatettiin kammioon dia läsnä ollessa tai puuttuessa CX-4945: ssa 48 tuntia. Ne kiinnitettiin 10 minuutin ajan kylmällä metanolilla ja sen jälkeen pestiin kolme kertaa PBS: llä. Soluja inkuboitiin anti-EGFR (Santa Cruz, 1:50) ja LC3 (Soluviestintä, 1:100) yön yli 4 ° C: ssa. Toissijainen vasta-inkubaatio mukana 1:100 laimentaminen joko Alexa Fluor 488 anti-hiiri tai Alexa Fluor 568 anti-kani-vasta-aineita. Tumat värjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) ja pestiin sitten ja kansi-liukastui. Objektilasit näytettiin alle LSM710 konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi (Carl Zeiss, Jena, Saksa), ja kuvat valokuvattiin.

Tulokset

CX-4945 indusoi autophagy in gefitinibi /erlotinibi kestävä PC -9 solut

Jotkut tutkimukset ovat raportoineet, että CX-4945 johti proliferaation esto ihmisen syöpäsoluissa [15], [24]. Sen tutkimiseksi, CX-4945 voi estää kasvua keuhkosyövän solujen T790M-välitteisen vastus EGFR-TKI, soluja käsiteltiin CX-4945 annoksesta riippuvalla tavalla. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, CX-4945 hoito eivät osoittaneet merkittävää kasvua inhibition gefitinibi /erlotinibi-resistentit solut. Olemme kuitenkin havainneet, että CX-4945 hoito laukaisi kertyminen autophagic vacuoles (AV), kun taas nämä solut palautettiin edellisen kunnon jälkeen vieroitusoireista (Fig. 1 B). Edelleen vahvistaa induktion autophagy CX-4945, olemme analysoineet ekspression autophagy markkerin, LC3-II, ja solujen lukumäärä värjättiin akridiinioranssilla suorittamalla Western blotting ja FACS-analyysiä. Yhdenmukainen induktion autophagic vaculoles, CX-4945 hoito kasvoi voimakkaasti määrän endogeenisen LC3-II ja prosenttiosuuden akridiinioranssin-positiivisia soluja (Fig. 1 C ja D). Lisäksi CX-4945 hoito oli tyypilliset pistemäinen kuvio LC3, kun taas ajoneuvon käsiteltyjä soluja osoittivat hajanaista ja heikkoa LC3 liittyvän vihreän fluoresenssin (Fig. E). Tämä CX-4945 aiheuttama autophagy havaittiin myös vanhempien PC-9-soluja (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittivat, että CX-4945 on kyky käynnistää induktion autophagy vanhempien soluissa sekä gefitinibi /erlotinibi kestävä PC-9-soluissa.

A, Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla CX-4945 72 h, ja nopeus esto määritettiin MTT: llä. B, Soluja käsiteltiin tai ei CX-4945 (5 uM) 48 tunnin ajan ja sitten inkuboitiin 24 tuntia lääkeaineen kanssa,-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää. Kuvat osoittavat autophagic ontelon muodostumiseen (Avós) otettiin × 20 suurennus. C ja D, Soluja käsiteltiin CX-4945: ssa 48 tuntia. Solulysaatit altistettiin Western blot-analyysi. Havaitsemiseksi kvantitatiivisesti happamien vesicular soluelimiin akridiinioranssilla värjäämällä solut määritettiin FACS-analyysillä. * P 0,01 ** p 0,001 kontrolliin verrattuna. E, Solut transfektoitiin plasmidilla, joka kantaa LC3-GFP. 24 tunnin kuluttua transfektiosta solut käsiteltiin CX-4945 (5 uM) 24 tuntia. Pistemäinen kuvio LC3 lokalisointi analysoitiin immunofluoresenssimikroskoopilla. F ja G, Soluja inkuboitiin CX-4945 (5 uM), 17-DMAG (100 nM) tai rapamysiini (20 uM) 48 tunnin ajan. Kuvia otettiin × 20 suurennus. Induktio LC3-I /II osoitettiin Western blot -analyysillä.

Hsp90 on välttämätöntä lukuisia onkoproteiineja kypsymisen ja vakaus, mukaan lukien CK2α [20]. Lisäksi chaperoning toiminta Hsp90 tarvitaan fosforylaation Cdc37 mukaan CK2α [27], [28]. Edelleen arvioimiseksi, Hsp90 oli mukana CX-4945 aiheuttama autophagy, soluja käsiteltiin 17-DMAG, Hsp90 estäjä. Kuten on esitetty kuviossa. 1F ja G, esto Hsp90 ei osoittanut induktion autophagy. Vaikka soluja käsiteltiin samoilla annoksilla kunkin lääkkeen, CX-4945-indusoidun autophagy oli tehokkaampi kuin rapamysiini, joka on mTOR-estäjä.

Vaikka CX-4945 on selektiivisyys CK2, se voi estää muita kinaaseja, kuten FLT3, PIM1, ja CDK1. Niinpä tutki CX-4945 aiheuttama autophagy riippuu CK-2. Yhdenmukainen tulos CX-4945 hoito, tukahduttaminen CK2α indusoi vain minimaalisen kasvun estäminen, kun se johti kasvu autophagic vaculoles ja endogeenisen LC3-II (Fig. 2). Nämä tulos viittaa siihen, että CX-4945-indusoidun autophagy voi olla CK2-riippuvainen.

A ja B, transfektoitiin kontrolli tai CK2α siRNA (100 nM) 48 tuntia. Solujen lukumäärät määritettiin ADAM-MC automaattinen solulaskijaa. Kuvat osoittavat autophagic ontelon muodostumiseen (Avós) otettiin × 20 suurennus. * P 0,01 kontrolliin verrattuna. C, 48 tunnin kuluttua transfektion, CK2α ja LC3-I /II osoitettiin Western blot -analyysillä.

CX-4945 parantaa tehoa EGFR-TKI: in gefitinibi /erlotinibi-resistenttien solujen

suhde induktio autophagy ja herkkyys EGFR-TKI on controversially pysynyt [29] – [32]. Määritetään, onko CX-4945-indusoidun autophagy voi vaikuttaa herkkyyttä EGFR-TKI, soluja käsiteltiin CX-4945, EGFR-TKI tai molempien yhdistelmä 48 tuntia. Yhdistelmä CX-4945: n ja gefitinibin tai erlotinibin johtanut merkittäviin kasvun estäminen, kun taas CX-4945 aiheuttama autophagy aleni yhdistettiin hoitoon (Fig. 3A). Lisäksi yhdistetty hoito EGFR-TKI ja CX-4945 aiheuttama kaspaasi-3 ja PARP-1 pilkkominen, mikä johtaa tehostetun solukuolemaa (Fig. 3B ja C).

Soluja käsiteltiin CX-4945 ( 5 uM), gefitinibi (1 uM), ja erlotinibi (1 uM) tai yhdistelmä CX-4945: n ja gefitinibin tai CX-4945 ja erlotinibin 48 tuntia. A, Solumäärät määritettiin käyttäen solulaskijalla (ylempi paneeli). Havaitsemiseksi kvantitatiivisesti happamien vesicular soluelimiin akridiinioranssilla värjäämällä solut määritettiin FACS-analyysillä (alempi paneeli). † p 0,01 verrattuna CX-4945 yksin. B, Apoptoosi arvioitiin anneksiini V-FITC /propidiumjodidivärjäys ja virtaussytometria. Kaaviot anneksiini V-FITC /propidiumjodidianalyysi virtaussytometria edustavassa kokeessa esitellään vasemmassa paneelissa. Tulokset edustavat vähintään 3 riippumattomasta kokeesta ja virhepalkkien merkitä keskihajonnat (± SDS). C, katkaisu PARP-1 ja kaspaasi-3 osoitettiin Western blot -analyysillä. * P 0,01 ** p 0,001 kontrolliin verrattuna.

tutkimiseksi mekanismi, jonka CX-4945 palautti antituumoriaktiivisuuksia EGFR-TKI vastustuskykyisten soluissa, me Ensin tarkasteltiin riippuvuus EGFR-signaloinnin molemmissa resistenttien solujen. Vaikka teho alas-säädellä EGFR erosivat, kasvu sekä resistenttien solujen inhiboitui merkittävästi siRNA hoitoon, ja näin ollen viittaa siihen, pysyvyys EGFR riippuvuutta huolimatta T790M-välitteisen vastus (Fig. 4A ja B). Seuraavaksi me havaittu toimintaa EGFR ja sen loppupään molekyylit, kun solut altistettiin kunkin lääkkeen. Estovaikutus yhden hoidon CX-4945, gefitinibi tai erlotinibi on EGFR ja Akt toiminta oli vaatimatonta, kun taas yhdistelmä CX-4945: n ja gefitinibin tai erlotinibin täysin tukahdutetaan EGFR ja Akt-aktiivisuutta (kuvio. 4C). Hoito CX-4945 indusoi säätely alaspäin koko EGFR nähty siRNA hoitoon. Nämä tulokset viittaavat siihen, että lisäys CX-4945 ja EGFR-TKI voi voittaa T790M välittämää vastus kautta lisääntynyt aktiivisuus EGFR-TKI tukahduttaa EGFR signaalien alaspäin säätely EGFR.

A ja B, ohjaus ja EGFR siRNA (100 nM) vietiin vanhempien tai resistentit solut, ja EGFR suppressio vahvistettiin Western blot -analyysillä. Solujen elinkyky mitattiin käyttämällä solun vasta 72 tuntia myöhemmin. * P 0,01 ** p 0,001 kontrolliin verrattuna. C, Soluja käsiteltiin lääkkeillä, kuten on esitetty. 2. Solut kerättiin, ja modulaatio EGFR signaloinnin osoitettuun solulinjoissa havaittiin Western blot -analyysillä.

inhibitio CX-4945-indusoidun autophagy vaimentaa apoptoosin gefitinibi /erlotinibi kestävä solut

Havaitsimme, että CX-4945 hoito johti alas-säätely EGFR. Sen määrittämiseksi, onko induktio autophagy liittyy alas-säätely EGFR, muutokset EGFR lokalisointi vahvistettiin konfokaalimikroskopiaa käyttämällä anti-EGFR ja anti-LC3 vasta-aine konjugoituna fluoroforin. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, CX-4945 hoito kasvoi inLC3 /EGFR kolokalisaation. Nämä tulokset osoittavat, että CX-4945-indusoidun autophagy voi sulkea sisäänsä EGFR plasmasta-kalvon autophagosome ja loukkuun proteiinit voivat hajota lysosomissa.

A, PC-9 /ER-soluja käsiteltiin CX-4945 ( 5 uM) 48 tuntia ja sitten kiinnitettiin metanolilla, immunovärjättiin anti-LC3 (punainen), anti-EGFR (vihreä), ja DAPI (sininen), ja analysoitiin konfokaalimikroskopialla määrittää solunsisäisen lokalisaation EGFR. B, tukahduttaminen Atg7 siRNA hoidon havaittiin Western blot -analyysillä. PC-9 /ER-soluja käsiteltiin CX-4945 (5 uM) 48 tunnin ajan, kun läsnä tai poissa 3mA (2 mM) ja Atg7 siRNA (100 nM). Modulaatio EGFR havaittiin Western blot -analyysillä. C ja D, Soluja käsiteltiin huumeiden kuten kuvassa. 2 alle läsnäolo tai puuttuminen 3mA ja Atg7 siRNA. Pilkkominen PARP-1 ja kaspaasi-3 osoitettiin Western blot -analyysillä. Apoptoosi arvioitiin anneksiini V-FITC /propidiumjodidivärjäys ja virtaussytometria. Tulokset edustavat vähintään 3 riippumattomasta kokeesta ja virhepalkkien merkitä keskihajonnat (± SDS). * P 0,01 ** p 0,001 verrattuna yhdistelmä CX-4945: n ja gefitinibin tai erlotinibin.

Jotta voitaisiin edelleen tutkia, CX-4945 aiheuttama autophagy johtaa suoraan alas-säätely EGFR, arvioimme taso EGFR: n läsnä tai poissa ollessa autophagic inhibiittorin (3-metyyliadeniini, 3mA) ja Atg7 siRNA hoitoon. Määrä autophagosomes oli merkitsevästi pienempi esikäsitellyt solut 3mA (tuloksia ei esitetty), ja 3mA tai Atg7 siRNA käsittely palautuu toimintaan sekä kokonaistaso EGFR (Fig. 5B). Lisäksi esto autophagy jonka 3mA tai poistaminen Atg7 laski kaspaasi-3 ja PARP-1 lohkominen ja näin ollen johtanut siihen, että vähentäminen apoptoottisen solukuoleman (Fig. 5C ja D). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että induktio autophagy CX-4945 voi olla tärkeä rooli voittamisessa T790M välittämää vastus EGFR-TKI.

Keskustelu

Tutkimukset tarjota tehokkaita strategioita voittamiseksi T790M-välitteisen vastus ovat erittäin tärkeitä, koska suurin osa potilaista hoidettiin EGFR-TKI hankittu resistenssi ja T790M oli syynä vastus puolet näistä potilaista [5], [6]. Koska toisen sukupolven, peruuttamaton EGFR-TKI, kuten afatinib ja dacomitinib, ei voittaa vastuksen aiheuttama T790M [33], [34], muita toimenpiteitä, kuten EGFR dual kohdistaminen Setuksimabihoitoa ja afatinib [35] ja kolmas -geneneration, mutantti-selektiivisiä EGFR-TKI: [36] – [38] ovat aktiivisesti arvioidaan. Alustava raportteja koskien tehoa mutantti-selektiivisiä EGF-TKI ovat varsin lupaavia [39]. Nämä uudet lääkkeet odotetaan olevan kliinisesti saatavilla lähitulevaisuudessa potilailla, joilla T790M-välitteisen vastus. Kuitenkin, koska kasvain heterogeenisuus ja perimän epävakaisuuden, resistenssin näille lääkkeille näyttää olevan väistämätön vaativat muita terapeuttisia strategioita.

Chen et al. osoittivat, että EGFR-spesifisiä siRNA: t inhiboivat voimakkaasti solun kasvun ja indusoi apoptoosia H1975 -solut sekä L858R ja T790M [40]. Jopa knock-down että T790M transkriptin jonka siRNA: t, yhdistettynä afatinib, oli tehokas valvontaan T790M-mutantti, keuhko- syöpäsoluja. Tämän mukaisesti olemme myös vahvistaneet pysyvyys EGFR riippuvuuden T790M-mutantti, keuhko- syöpäsoluja. Tämä on teoreettisesti uskottavaa ottaen huomioon, että T790M ainoastaan ​​vähentää biding affiniteetti EGFR-TKI, mutta ei aktivoi tarpeeton mekanismi syövän solujen selviytymistä paitsi harvoissa tapauksissa, joilla muun samanaikaisen, kestävä mekanismeja. Siksi alas-säätely EGFR voisi käyttää syövän vastaisia ​​vaikutuksia syöpäsolujen EGFR riippuvuuden sekä parantaa tehoa EGFR-TKI: in asettaminen tason alenemiseen EGFR. Tutkimuksemme ensinnäkin osoitettu, että EGFR alassäätöä aiheuttama CX-4945 parannettu teho EGFR-TKI on EGFR-mutantti keuhkosyöpään solujen T790M välittämää vastus.

Tähän asti se on ristiriitaisesti pysynyt onko autophagy liittyy herkkyys tai resistenssi EGFR-TKI. Kuitenkin jotkut papereita äskettäin ehdotettu, että induktio autophagy on tarpeen sytotoksista vaikutusta EGFR-TKI: perus- ja resistentit solut, joissa mutantti EGFR [29], [32], [41]. He osoittivat myös, että tehostettu autophagy tarvitaan hengissä EGFR-riippumaton EGFR-mutantti keuhkosyöpäsolua [41]. Tutkimuksessamme sekä resistentit solut oli vielä EGFR-riippuvuuden ja esto autophagy johti vähentää solukuolemaa. Yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten tuloksemme osoittivat, että induktio autophagy on tärkeä rooli voittaa kehittynyt resistenssi EGFR-TKI vaikka mekanismeja houkutella autophagy voi olla erilainen.

EGFR solun pinnalla on tiukasti kontrolloitua monimutkainen, endosyyttinen mekanismi [42]. Sen jälkeen, kun ligandi-välitteisen aktivaation ja sisäistämisen, EGFR on joko kierrätetään takaisin solun pinnalle tai kuljetetaan lysosomaalisen hajoamisen [42] – [44]. Muuttaminen tämän herkän tasapainon voi muuttaa tasoa EGFR solun pinnalla. Lisääntynyt autophagosomes sytoplasmassa voisi fuusioitua endosomeihin sisältävien EGFR, ja mikä aiheuttaa muodostumista amphisomes. Myöhemmin autolysomes kehittämää fuusiolla lysosomin saattaa johtaa EGFR hajoamista (Fig. 6). Tutkimuksessamme CX-4945 indusoi autophagosomes voimakkaammin kuin rapamysiinin, tunnettu mTOR-estäjä EGFR-mutantti, keuhkosyöpä solut T790M. Vähentynyt EGFR näissä soluissa CX-4945 aiheuttaisi prosessin aiemmin mainittiin. Tätä tukee tulokset osoittavat, että lisääntynyt internalized EGFR at autophagosomes CX-4945 voitiin visualisoida fluoresoiva sytokemiallisten värjäystä ja esto autophagy mukaan 3mA tai Atg7 siRNA hoito palautti EGFR tasolla. Näin ollen, induktio autophagy mikä lisää EGFR hajoaminen, kun se yhdistetään EGFR-TKI voi olla yksi lupaavista terapeuttisia vaihtoehtoja EGFR-TKI-resistenttien syöpäsolujen EGFR riippuvuutta.

EGFR toimitetaan solukalvon aikaisin endosomeista endosyyttisiin rakkulat. Nämä rakkulat ovat takaisin solukalvon läpi kierrätyksen kautta. Kuitenkin rakkulat voivat myös fuusioituvat authophagosomes, ja sitten suoraan lysosomeihin johtaa hajoamiseen EGFR.

CX-4945 aiheuttama autophagy saa välittämä esto chaperoning funktio Hsp90 koska 17-DMAG voinut aiheuttaa autophagy. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että tukahduttaminen CK2 indusoi autophagic solukuolemaa kautta modulaatioon mTOR ja MAPK signalointi ihmisen glioblastoomasoluissa [45]. Tämän mukaisesti, huomasimme, että downregulation tai esto CK2α voisi johtaa induktioon autophagy keuhkosyövän solujen EGFR-mutaatio. Kuitenkin solukuolemaa ei tapahdu, kun resistenttejä soluja käsiteltiin CX-4945 tai CK2α siRNA. Tämä tulos saattaa johtua ominaisuus EGFR-mutantin syöpäsoluja. Downstream signaloinneista (PI3K /AKT ja MAPK) solujen EGFR-mutaatio ovat erittäin riippuvaisia ​​EGFR toimintaa. Siten inhibitio vain CK2 ei voi olla riittävä modulaatio mTOR ja MAPK signalointia näissä soluissa. Yksityiskohtaisemmat mekanismit tulisi tutkia seuraamalla tutkimuksissa.

Olemme kuitenkin ehdottaneet, että CX-4945 voisi olla hyötyä hoidettaessa EGFR-mutantti keuhkosyöpä kanssa T790M-välitteisen vastus. Kuitenkin, sen kliiniseen käyttöön, turvallisuuden ongelma liittyy tämän uuden lääkkeen näyttää ratkaista, koska se voi estää toiminnan Hsp90 mikä on tärkeää kypsymisen ja vakauden sekä normaalien proteiinien ja onkoproteiineja. Siksi on epävarmaa, onko se voi saavuttaa tehokkaita seerumin ilman merkittäviä haittavaikutuksia ottaen huomioon, että olemme enimmäkseen käytetään 5 um CX-4945 tutkimuksessamme. Siksi lisätutkimukset ovat tarpeen käsitellä sopiva annos CX-4945 ja turvallisuusprofiilit.

Yhteenvetona autophagosome välittämää EGFR alassäätöä aiheuttama CX-4945, joka on voimakas ja selektiivinen CK2 estäjä, lisää teho EGFR-TKI on EGFR-mutantti keuhko-syöpäsolujen kanssa vastarintaa T790M.