Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta lukuisista ponnisteluista, huumeiden perustuu hoitoja potilaille, jotka kärsivät keuhkosyöpä on edelleen heikko. Lupaavana vaihtoehtona, tutkimme terapeuttista potentiaalia BC-819 hoitoon keuhkosyövän hiiren kasvainmuodoista. BC-819 on uusi plasmidi-DNA, joka koodaa A-fragmentti difteriatoksiini ja on aiemmin osoitettu onnistuneesti estää kasvaimen kasvua ihmisen kliinisessä tutkimuksessa virtsarakon syöpä. Ensimmäisessä koesarjassa, tutkimme

in vitro

tehoa BC-819 ihmisen keuhkosyövän solulinjoja NCI-H460, NCI-H358 ja A549, joka paljasti 90%: n vähennys solujen kasvua.

In vivo

tehoa tutkittiin käytettäessä potilaalle tehdä hiiren ksenografti keuhkosyöpää malli ja keuhkometastaasitestissä mallia käyttäen luminescent A549-C8-luc adenokarsinoomasolua. Nämä solut johti peri- ja sisäisen bronkiolaarinen kasvaimia upon intrabronkiaalinen sovellus ja parenkyymisolujen kasvaimia kun suonensisäisen injektion, vastaavasti. Hiiret, jotka kärsivät näistä keuhkokasvaimet käsiteltiin BC-819, kompleksoitu haarautunutta polyetyleeni-imiiniä (PEI) ja aerosolisoitua hiirille kerran viikossa ajaksi 10 viikkoa. Tämä hoito-ohjelma kasvu keuhkoputkensisäisesti aiheuttama keuhkotuumoreiden esti merkittävästi (p = 0,01), kun taas mitään vaikutusta ei voitu havaita hiirillä, jotka kärsivät keuhkojen etäpesäke. Yhteenvetona, suosittelemme että aerosolisoidussa PEI /BC-819 pystyy vähentämään kasvua vain kasvaimia, jotka johtuvat luminaaliselle osa hengitysteihin ja ovat siten suoraan saatavilla hengitettynä BC-819.

Citation: Hasenpusch G, Pfeifer C, Aneja MK, Wagner K, Reinhardt D, Gilon M, et al. (2011) Aerosolized BC-819 Estää Ensisijainen mutta ei Toissijainen Keuhkosyöpä Growth. PLoS ONE 6 (6): e20760. doi: 10,1371 /journal.pone.0020760

Editor: Dominik Hartl, Ludwig-Maximilians-Universität München, Saksa

vastaanotettu: 01 helmikuu 2011; Hyväksytty: 09 toukokuu 2011; Julkaistu: 08 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Hasenpusch et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat BMBF BioFuture ohjelma (FKZ0311898), ohjelma 13N9182, LMUexcellent (Investitionsfonds), DFG RU 911 /9-1 ja Emma Thaler Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mukaan epidemiologisiin tutkimuksiin, keuhkosyöpä on edelleen suurin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti vain 15 prosenttia kaikista potilaista USA: ssa ja 10 prosenttia kaikista potilaista Euroopassa elossa yli viisi vuotta diagnoosin jälkeen taudin [ ,,,0],1]. Tämä tilanne johtuu pääasiassa myöhäinen diagnosointi keuhkotuumoreiden ja terapeuttisen tehon puuttuminen tällä hetkellä saatavilla syöpälääkkeitä, erityisesti pitkälle edennyt tauti, kun kirurginen ablaatio ei ole mahdollista tai kasvainten uusiutuu leikkauksen jälkeen.

Jotta sulje tämä terapeuttinen aukon, geeniterapia ehdotettiin lupaava tilaisuus häiritsemään kriittisen molekyyli polkuja syöpäsolujen [2]. Viimeaikaiset strategioita yritettiin kliinisissä tutkimuksissa oli mukana induktio tuumorisolun apoptoosia korvaaminen p53 tuumorisuppressorigeenin, kasvainsolun itsemurha induktion kautta geenejä, jotka koodaavat tiettyjä entsyymejä, jotka ovat herkkiä muuten hyvänlaatuinen aineita ja aktivointi immuunijärjestelmän koodaavat geenit sytokiinit [3]. Suurin osa geenin hoitomenetelmät perustuvat virusvektoreita, jotka ovat erittäin tehokkaita mutta koska kehittyy neutraloivia vasta, epäsuotuisa toistuvaa sovelluksen. Non-virusvektoreita, joskin sopivia toistuva käyttö ovat suhteellisesti vähemmän tehokkaita, etenkin hengitysteissä [4].

Koska turvallisuuskysymyksiä, geeni terapeuttisia aineita annetaan edullisesti paikallisesti annetaan nykyisessä kliinisissä tutkimuksissa. Itse asiassa paikallinen sovellus lääkkeiden on osoitettu olevan edullinen eri keuhkosairaudet, kuten astma, COPD ja hiljattain keuhkosyövän [5]. Mikäli keuhkosyövän esimerkiksi soveltamiseksi kemoterapeuttisten lääkkeiden tarjotaan suurempi keuhkojen lääkkeen tasoja ja lisäksi pienentää systeemisiä sivuvaikutuksia [6]. Koska nämä suotuisat jakelu ominaisuuksia, aerosolit on otettu huomioon sovellettaessa geenin terapeuttisia aineita. Plasmidi-DNA, kompleksoidaan kationisten polymeerien kanssa, tuloksena onnistuneen transfektion keuhkoputkien ja keuhkorakkuloiden epiteelin reportterigeenit [7], [8] ja vähentää tuumorin kasvua, kun terapeuttisen plasmidi, joka koodaa p53 käytettiin keuhkojen kasvain hiirille [9].

Lisäksi olisi toivottavaa rajoittaa toimintaa sovelletaan plasmidi-DNA: ta keuhko- vain kasvainsoluissa, mikä jättää tervettä kudosta ennallaan. Tässä yhteydessä plasmidi BC-819 (tunnetaan myös nimellä DTA-H19), voisi olla ihanteellinen ehdokas. Plasmidi BC-819 koodaa difteriatoksiini fragmentti valvonnassa H19-promoottori. Expression of difteriatoksiini fragmentti väistämättä tuhoaa soluja välitöntä häiriötä proteiinisynteesiä ja H19 promoottori rajoittaa sen ilmentymisen kasvainsoluihin [10]. H19 on isältä painettu, emolle ilmaistuna, onkofetaalinen geeni, joka ei ole proteiini tuote [11]. Se ilmentyy huomattavia määriä useissa eri ihmisen kasvaintyypit, mutta on vain marginaalisesti ilmaistaan ​​tai kokonaan poissa normaaleissa aikuisen kudoksissa [12]. Viimeaikaiset tiedot ehdotti rooli 19N edistämisessä syövän etenemisessä, angiogeneesissä ja etäpesäkkeiden [13].

Vaikka aerosolisoidussa geenihoidon on osoitettu olevan tehokas hiiren malleissa keuhkosyöpään, me epäilivät lokalisoinnin kasvainten voi olla vaikutusta tehoon kasvaimen tietyn BC-819-plasmidi. Tästä syystä, plasmidi BC-819 on sovellettu aerosolin kaksi ryhmää hiiriä, jotka kärsivät keuhko- kasvainten joko aiheuttama keuhkoputken sisäisesti tai suonensisäisesti ihmisen keuhkosyövän soluja. Täyttääkseen ja määrällisesti kasvainten kehittymiseen

in vivo

, luminoivat soluja käytetään tuottamaan keuhkokasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

Haaroitettu polyeteeni-imiini (PEI , keskimääräinen molekyylipaino 25 kDa) saatiin Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Saksa). PEI laimennettiin tislatulla vedellä (vettä injektiota varten, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Saksa), ja pH säädettiin arvoon 7 HCl: lla. D-lusiferiini saatiin Synchem (Felsberg /Altenburg, Saksa).

Plasmidit

plasmidit pCluc ja pUC21 saatiin plasmidi Factory (Bielefeld, Saksa). Plasmidi pCluc koodit reportteri entsyymin lusiferaasi johdettu

Photinus pyralis

. Plasmidi pUC21 käytettiin negatiivisena kontrollina. Plasmidi BC-819 koodaa fragmentti difteriatoksiinin (DT-A) ohjauksessa H19 promoottorin ja on jo kuvattu muualla [10].

Solulinjat

solun A549 oli peräisin ihmisen keuhkojen kasvain ja histologisesti luokitella adenokarsinooma [14]. Solulinjat NCI-H460 ja NCI-H358 eristettiin ihmisen näytteestä samoin ja histologisesti luokitellaan storcell erilaistumaton karsinooma (NCI-H460) ja bronchioloalveolar cell carcinoma (NCI-H358). A549-C8-luc-solut ovat A549-soluja, jotka on stabiilisti transfektoitu geeni, joka koodaa toimittaja entsyymin lusiferaasi. Kaikki solulinjat saatiin DSMZ (German Collection of mikro-organismien ja Cell Cultures, Braunschweig, Saksa) lukuun ottamatta A549-C8-luc, joka hankittiin Caliper Life Sciences (Alameda, Kalifornia).

Eläimet

Koska eroja eläinten kasvaimen herkkyys eri hiirikantojen oli käytettävä induktioon ensisijaisen ja toissijaisen keuhko- kasvainten, sovelluksesta riippuen reitin tuumorisolujen. T-solujen puutteellisia nude-hiiret luonnehtia hyväksi luovuttajien intrabronkiaalisesti soveltaa kasvainsolujen äskettäin [15] ja siksi valittu induktioon ensisijaisen keuhkokasvaimia. Onnistunut sukupolven keuhkotuumoreiden kautta systeemisesti kasvainsolujen kuitenkin kerrottiin vaatia luovuttajaeläimiin korkeatasoinen immuunikato. Tästä syystä T-, B- ja luonnon tappajasolujen puutteellinen CB17.Cg-

Prkdc

scid

Lyst

BG-hiiriä käytettiin toisen kasvain malli, vain kuten on kuvattu aiemmissa kirjoittajat [16].

Ennen kokeita eläimet totutettiin vähintään 7 päivää. Kaikki lisämenettelyitä hyväksyttiin ja ohjataan paikallisen eettisen komitean (Regierung von Oberbayern) alla hyväksyntänumero 16-08 ja tehtiin ohjeiden mukaisesti Saksan lain eläimistön suojelu.

Orthotopic kasvaimen istutuksen menettelyä

keuhkoputkensisäiseen sovellus.

NMRI-

Foxn1

nu

hiiret nukutettiin läpi vatsaonteloon medetomidiinin (11,5 ug /kg), midatsolaami (115 ug /kg ) ja fentanyyli (1,15 ug /kg) ja sen jälkeen saatettu kulmikas aluksella, jotta visualisoida äänihuulten käyttäen valonlähdettä, joka on otoscope ja muunnetun lastalla (Hallowell, USA). 1 x 10

6 A549-luc-C8-solut laimennettiin 100 ul: ssa PBS: ää levitettiin orotracheally tylpällä päättyi, taivutettu 27 G neula ruostumattomasta teräksestä, joka on sovitettu 1 ml:

Injekt-F

muoviruiskulla (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Saksa). Sen jälkeen, kun implantaation menettelyä, anestesia antagonisoivat kautta ihonalaisen injektion antidoottia, joka koostuu atipamezol (50 ug /kg), flumatseniiliä (10 ug /kg) ja naloksonilla (24 ug /kg). Hiiret toipuivat nukutuksesta 15 min.

Suonensisäinen sovellus.

Conscious CB17.Cg-

Prkdc

scid

Lyst

BG -mice pantiin hiiren pidättäjä (Braintree Scientific Inc, USA) ja 1 x 10

6 A549-C8-luc solujen laimennettuna 100 ul PBS: ää ruiskutetaan suoraan selkäpuolen hännän laskimoon käyttäen 29G U-100 insuliiniruisku (BD Consumer Healthcare, Le Pont de Claix, Ranska).

In vivo kuvantamiseen

Eläimet nukutettiin juuri edellä kuvatulla tavalla. D-lusiferiini alustan (3 mg /100 ui PBS: ää per hiiri) levitettiin injektiolla vatsaonteloon ryhmässä hiiret kärsivät keuhko- kasvainten, jotka provosoi laskimoon A549-C8-luc-soluja. Hiiret kärsivät kasvaimia, jotka indusoitiin intrabronkiaalinen soveltamalla A549-C8-luc saivat saman määrän D-lusiferiini laimennettuna 50 ul: ssa PBS: ää, intranasaalista reittiä [17]. Bioluminenssi mitattiin 10 minuuttia myöhemmin, käyttämällä IVIS 100 Imaging System (Xenogen, Alameda, USA) ja kameran asetuksia: näkökenttä 10, f1 f-stop, korkearesoluutioinen laatikointi ja altistus-aika 5 min. Signaali kvantifioitiin ja analysoitiin käyttämällä Living Image Software version 2.50 (Xenogen, Alameda, USA).

valmistaminen PEI-pDNA polyplexes

Haaroitettu polyeteeni-imiini (PEI; keskimääräinen MW = 25 kDa) saatiin Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Saksa), liuotettiin veteen, ja pH säädettiin arvoon 7 HCl: llä. Polyplexes aerosoli hakemuksen formuloitiin kuten aikaisemmin on kuvattu [7]. Lyhyesti: BC-819-plasmidi, ja haarautunut PEI oli erikseen laimennettiin tislatulla vedellä 4 ml, jolloin tuloksena pitoisuuksina 0,25 mg /ml BC-819 ja 0,33 mg /ml haarautunutta PEI, vastaavasti (joka vastaa N /P-suhde oli 10) . PDNA pipetoitiin PEI liuokseen ja sekoitettiin pipetoimalla ylös ja alas, jolloin lopulliseksi pDNA konsentraatio 0,125 mg /ml. Komplekseja inkuboitiin 20 minuuttia ympäristön lämpötilassa ennen käyttöä.

Aerosol soveltaminen PEI-pDNA polyplexes

Aerosol hakemus tehtiin, kuten aiemmin on kuvattu [18]. Lyhyesti, LC STAR Nebulizer (Pari, Starnberg, Saksa) vetämänä korkeapaine, joka syntyvät BOY®SX kompressorin (Pari, Starnberg, Saksa) oli yhdistetty välike, täynnä 500 g Kuivaus helmet Orange (Sigma -Aldrich, Deisenhofen, Saksa). Välikappale puolestaan ​​oli liitetty muovinen laatikko, jossa on neljä pientä reikää vastakkaisella puolella, jotta aerosolivirtausreaktorin. Helpottaakseen korkeampia aerosoli kerrostumista keuhkoissa, eläimet kannustettiin nopeutettua hengitys ajamalla kompressori synteettistä ilmaa rikastettu 5% CO

2.

Histologia

Eläimet olivat lopetettiin injektoimalla intraperitoneaalisesti pentobarbitaalia. Tämän jälkeen keuhkot poistettiin, täytetään 4% paraformaldehydillä kautta henkitorven ja jatkojalostetaan hematoksyliini-eosiini värjäyksen mukaan vakioprotokolla.

In situ -hybridisaatio

in situ -hybridisaatio (ISH ) suoritettiin, kuten on kuvattu Ariel et al [16], käyttämällä digoksigeniinillä leimattua H19 RNA-koetin tai modifikaatiota tämän menetelmän avulla H19-LNA (lukittu nukleiinihappo) Dig-leimattu koetin syntetisoitiin Exiqon.

tilastot

tulokset raportoidaan keskiarvot ja keskihajonnat. Tilastollinen merkitys kahden ryhmän välillä määritettiin Mann-Whitney-U-Test

in vitro

tuloksia ja jonka logrank-testi

in vivo

tuloksia. Todennäköisyys (P) 0,05 pidettiin merkittävänä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen ohjelmaa StatView 5,0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA).

Tulokset

Plasmidi PBC-819 inhiboi

in vitro

soluproliferaatiota ihmisen keuhko- syöpäsoluja

in vitro

transfektiokokeis- tehtiin eri ihmisen keuhkosyövän peräisin oleva solu-linjat. Kasvavia määriä PBC-819 (0, 350 ja 700 ng) kotransfektoitiin 100 ng lusiferaasin koodaavan plasmidin. Kokonaismäärä pDNA täytettiin 800 ng kaikkien verrattiin näytteitä pUC21 plasmidin täyteaineena pDNA. Täten tehoa PBC-819 oli epäsuorasti määritettiin vähentäminen lusiferaasiaktiivisuuden, mikä osoittaa tuhoaminen transfektoitujen tuumorisolujen.

Käyttämällä Lipofectamine 2000 transfektioreagenssi, aika ja annoksesta riippuvainen väheneminen lusiferaasiaktiivisuuden havaittiin kukin käytetyt solulinjat. Vaikutus PBC-819 tuli ilmeiseksi niin varhain kuin 24 tuntia transfektion jälkeen ja vähentää näin lusiferaasiaktiivisuus yli 90%, kun 350 ng (Fig. 1A) ja enemmän kuin 95% (Fig. 1 B), kun 700 ng BC- 819 käytettiin. Yli 98%: n lusiferaasiaktiivisuuden estyi 48 tuntia transfektion jälkeen, kun 700 ng BC-819 käytettiin. Samanlainen tulos saatiin myös 350 ng, paitsi solulinja NCI-H358.

NCI-H460, NCI-H358 ja A549-solut transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000, BC-819 ja ko-transfektoitiin plasmidi, joka koodaa toimittaja entsyymin lusiferaasi. Niinkin aikaisin kuin 24 tuntia transfektion jälkeen, lusiferaasin aktiivisuus (joka epäsuorasti osoittaa solujen kasvu) oli alentunut vähintään 90%, kun 350 ng BC-819 on käytetty (A). 48 tuntia myöhemmin lusiferaasiaktiivisuudeksi vähenivät yli 98%, lukuun ottamatta solulinjaa NCI-H358. Kuitenkin lusiferaasi laski yli 98% havaittiin kaikissa solulinjoissa, kun määrä BC-819 nostettiin 700 ng (B). Vaikutus BC-819 on bioluminesoiviin A549-C8-luc tutkittiin samoin ja paljasti laski lusiferaasi ja sen seurauksena vähentyneestä solujen kasvua (yli 50%) jo 24 tunnin kuluttua (C). Suurin solun kasvu estyy saavutettiin 48 tunnin kuluttua transfektion alkaa näkyä läpi yli 75% vähennys lusiferaasiaktiivisuudessa.

Näiden tutkimusten innostanut seuloa tämän plasmidin kanssa A549-C8 luc, joka oli stabiilisti transfektoitu lusiferaasin. Mittaus lusiferaasin eri aikapisteissä transfektion jälkeen osoitti, että BC-819 oli tehokas A549-C8-luc-soluissa jo 24 tuntia transfektion jälkeen (Fig. 1 C). Alhaisempi pitoisuus (400 ng) BC-819 osoitti, että ne kykenevät vähentämään lusiferaasin aktiivisuuden yli 50%. Käyttäen 800 ng BC-819, oli mahdollista vähentää lusiferaasiaktiivisuutta yli 75%. Yhdessä nämä tutkimukset osoittivat, että vaikutus plasmidin BC-819 solujen elinkelpoisuudesta ihmisen keuhko- syöpäsoluja

in vitro

.

kasvu keuhkotuumoreiden riippuu sovelluksesta päällä syöpäsoluja

arvioimiseksi tehokkuutta PBC-819 aerosolihoitoa

in vivo

, potilaalle tehdä keuhkojen kasvaimet tuotettiin immuuni hiirissä by keuhkoputken sisäisesti tai laskimoon soveltamiseen A549-C8-luc soluissa. Huomasimme, että valinta sovelluksen reitti suurelta osin vaikutti kasvutavat tuloksena keuhkotuumoreiden ja vaikuttanut eläinten eloonjäämisen. Intrabronkiaalinen soveltaminen A549-C8-luc soluissa johti luminescent kasvaimia, aluksi lokalisoitu kaulavaltimoa alueella, 10 vuorokautta transplantaation ja sitten levittämällä kaudaalisuun- vasemmalle tai oikealle keuhko sisällä 66 päivää (Fig. 2A). Kuitenkin kasvaimia, jotka indusoitiin kautta suonensisäisen A549-C8-luc kasvainsoluja, leimasi levitetty bioluminenssina signaaleja molemmissa keuhkoissa 10 päivän jälkeen, joka sitten jatkuvasti kasvanut (Fig. 2B).

kasvu potilaalle tehdä keuhkojen kasvaimet mitattiin määritelty ajankohtina käyttäen bioluminesenssin kuvantaminen. Intrabronkiaalisesti tuumoreita (A) esiintyi aluksi kaula- alueella ja levitetään syvemmälle keuhkoihin myöhäisemmässä vaiheessa, kun taas laskimoon indusoi kasvainten (B) on rajoitettu keuhkojen alueelle vain.

Histopatologisten post mortem tarkastelu intrabronkiaalisesti aiheuttama keuhkotuumoreiden paljasti ensimmäiset todisteet kasvainkudoksen sisällä peribronkiolaarista alueella 10 päivän kuluttua (Fig. 3A). Tutkimukset myöhäisemmässä vaiheessa paljasti useita kasvaimen kyhmyjä, lokalisoitu parenchyma, The peribronkiolaarista alueen ja sisällä keuhkoputkien (Fig. 3 B-C). Keuhkot, vaikutti alkaen suonensisäisesti aiheutettujen kasvaimien kuitenkin leimasi levitetty kasvainkudoksen vain parenchyma urut (Fig. 3 D).

Kasvaimet olivat havaittavissa jo 10 päivän kuluttua intrabronkiaalinen istutettavien peribronkiolaarista alueella keuhkojen (A). Loppuun vaiheissa intrabronkiaalisesti aiheuttaman keuhkotulehduksen kasvaimia ominaista useita, peribronkiolaarista ja parenkymaalinen paikallinen kasvaimet (B) ja kasvainkudoksen sisällä luminaalinen keuhkojen alueilla sekä (C). Laskimonsisäinen injektio A549-C8-luc, johti kuitenkin kasvaimia pääasiassa kasvaa parenkyymiin keuhkoihin, mutta ei peribronkiolaarista tai sisällä keuhkoputket (D). Kuvio D esittää parenkymaalinen kasvainkudoksen lähellä keuhkoputken, mutta ei peribronkiolaarista. Alveolaarinen kudoksen paikallinen välillä kasvain ja keuhkoputken kuitenkin tiivistyy jota viereinen kasvain kyhmy.

A549-C8-luc pohjainen keuhkokasvaimia ovat vahvasti positiivisia H19 onkogeeni

Koska läsnä ei-koodaavan RNA H19 on ratkaiseva tehoa BC-819, tutkimme kasvainkudoksen läsnäolo ei-koodaavan H19-RNA. In-situ-hybridisaatio paljasti voimakkaan ilmentymisen H19 A549-C8-luc perustuvat keuhko- kasvainten, joka on merkitty ruskehtava colorization tutkittavan kudoksen (Fig. 4).

intrabronkiaalisesti indusoima keuhko- kasvain värjättiin H.E. (A) ja seulottiin 19N-aktiivisuuden avulla ISH (B). Vuonna annetun näytteen vahva ilmaus H19 havaittiin, osoitetaan ruskehtava colorization tutkittavan kudoksen.

hengittäminen PEI /PBC-819 aerosoli estää ensisijainen muttei toissijainen kasvaimen kasvua

tulosten perusteella alkaen

in vitro

kokeissa tehoa PBC-819 tutkittiin

in vivo

soveltamalla aerosolisoituneen PBC-819 plasmidin keuhkojen kasvain hiirille. Nämä kokeet tehtiin hiirillä, jotka kärsivät joko intrabronkiaalisesti tai laskimoon indusoi keuhkotuumoreita jotta jäljitellä PBC-819: n vaikutus ensisijaisen ja toissijaisen keuhkokasvaimia.

Tämän jälkeen aerosoli sovellus PBC-819 oli kompleksoitu haarautunutta PEI ja hallinnoi muutetussa koko kehon hengitysteitse kammioon. Keuhko- kasvaimen kantavien hiirten aloitettiin 21 päivää sen jälkeen, kun kasvainsolujen transplantaation, kun näyttöä keuhkotuumoreiden oli testattu käyttämällä

in vivo

bioluminescent kuvantaminen. Hoitoprotokolla sisältyi yksi inhalaatio menettely viikossa yhteensä ajanjakson 10 viikon.

Nämä kokeet paljastivat joko poistettu kokonaan tai severly heikennettyä syövän etenemisen hiirillä, jotka kärsivät intrabronkiaalisesti aiheuttama keuhkokasvaimia hoidetuilla PEI /pBC- 819 aerosoli (Fig. 5A-B). Bioluminenssi aktiivisuus on yli 2 x 10

5 fotonien sekunnissa liittyi nopeaan pienenemiseen eläimen yleiskunto (merkitty nopea laihtuminen ja hengenahdistus) ja määritellään näin ollen päätepiste-kriteerit. Tämän perusteella menettelyyn menetelmässä mediaanielossaolosta 66 päivä laskettiin eläinten hoitamattomaan verrokkiryhmään. Vastakohtana tälle, käsitellyistä hiiristä selviytyi yli 200 päivää, vaikka aerosoli soveltamista PEI /PBC-819 aerosoli lopetettiin yli 100 päivää aikaisemmin, päivänä 91. Lukuun ottamatta yhtä hiirtä, kaikki käsitellyt hiiret (n = 5), selvinneet yli 200 päivää, on joko vapaa keuhkotuumoreiden tai osoittavat hidastanut kasvaimen kasvua ja heikentynyttä yleiskunto. Yksi hiiri ei ollut merkkejä kasvaimen todisteita keuhkoissa päivänä 200, mutta todellakin yksi kaukainen etäpesäke aivoissa (tuloksia ei ole esitetty).

kasvu keuhkotuumoreiden hoitamattomilla hiirillä oli ominaista alkuperäisen kasvaimen esiintyminen kaulan alueelle ja sen jälkeen jatkuva levittäminen keuhkoissa (A). Tämä kasvumalli erosivat hiirillä, jotka saivat BC-819, jossa kasvaimet joko koko pieneni tai kokonaan kadonnut hoidon aikana.

Lopuksi päivä 200 valittiin olevan päätepisteen tutkimuksen. Tilastollinen analyysi tulokset osoittivat tilastollisesti erittäin merkitsevä ero (p = 0,01) välillä käsittely ja kontrolliryhmän osalta ajasta, joka oli tarpeen päästä päätepiste tutkimuksessa (Fig. 6A).

hiirillä intrabronkiaalisesti aiheuttamaa keuhkokasvaimia osoittivat merkittävää eloonjäämistä (p = 0,01), kun käsitellään BC-819 verrattuna eläimiin, jotka eivät saaneet mitään hoitoa (A). Ei eloonjäämishyötyä havaittu hiirillä, jotka kärsivät suonensisäisesti aiheuttama keuhkotuumoreita, riippumaton hoito BC-819 (B).

Hoito PEI /PBC-819-aerosoli osoittivat vähemmän tehokkaita hiirissä kärsii keuhko- kasvainten, jotka on tuotettu läpi suonensisäisen A549-C8-luc kasvainsoluja. Kuten edellä on mainittu, kasvaimen soluja tuli keuhkojen kautta verenkiertoon, näin ollen vaikuttaa lokalisointi ja kasvutavat keuhko- kasvainten, jolloin kasvaimet kasvavat parenkyymissä, mutta ei keuhkoputkien. Tässä tilanteessa, hoito PEI /PBC-819-aerosoli ei johtanut tilastollisesti merkitsevää eroa hoidettujen ja hoitamattomien eläinten. Vaikka suonensisäisesti tuumoreita kasvoi nopeammin, heikentynyt yleiskunto tunnustettiin heti lusiferaasivaikutusta ylittänyt 1 x 10

6 fotonit sekunnissa, joka valittiin sen vuoksi päätepisteenä hiiriä kärsivät suonensisäisesti aiheuttama keuhkokasvaimia. Mediaani aika päästä tähän päätepiste oli 43 vuorokautta käsittelemättömien eläinten ja 36 päivää hoidetuista eläimistä. Lisäksi tilastollinen analyysi Näiden tulosten ei paljastanut mitään merkitsevää eroa (p = 0,3) välillä hoidettujen ja hoitamattomien hiirissä (Fig. 6B).

Yhteenvetona näiden kokeiden tulokset osoittavat, että aerosoliksi PEI /PBC-819 on joka kykenee inhiboimaan keuhkojen kasvaimen kasvua hiirissä, jotka kärsivät intrabronkiaalisesti aiheuttama keuhkokasvaimia. Lisäksi esillä olevat tulokset osoittavat, että vertailukelpoinen vaikutus ei voitu havaita hiirillä, joka kärsi parenkymaalinen keuhkotuumoreita, suonensisäisen annostuksen jälkeen syöpäsolujen.

Keskustelu

Geeniterapia on katsoa edistävän hoidon mahdollisuuksia parantumaton keuhkosairauksien kuten monogenetic vikoja kuten kystinen fibroosi, alfa

1-antitrypsiini puutos ja monimutkainen sairaus, kuten astma ja keuhkosyövän [19]. Tässä suhteessa, paikallinen sovellus geenin terapeuttisten lääkkeiden, kuten aerosolit on katsottu olevan edullista kohdentamiseksi keuhkoihin, koska i) haluttu lääke voidaan antaa suuri määrä suoraan paikalla taudin ja ii) vakavia sivuvaikutuksia, jotka voisivat provosoitua systeeminen soveltamalla nukleiinihappojen ja /tai geenin terapeuttinen vektoreita olisi mahdollisimman pieni. Käsite aerosoli perustuvan geenihoidon tutkittiin tarkemmin esillä työssä soveltamalla plasmidin BC-819 käytettäessä potilaalle tehdä ksenograftimallia ihmisen keuhkosyöpää. Tässä suhteessa olemme tutkineet jos kasvainsolujen erityisiä plasmidit pystyivät tuhoamaan ainoastaan ​​primaaristen kasvainten luminaalisen hengitysteiden tai jos ne kykenivät myös osoittaa vaikutusta vastaan ​​sekundaarikasvaimia sijaitsee parenkyymikudokseen. Tämän kysymyksen osoittamiseksi, keuhkokasvaimet indusoitiin kahdella eri sovelluksen reittiä keuhkosyövän soluja. Kasvaimet kasvavat luumenin puolelta keuhkot saatiin, kun solut levitetään intrabronkiaalisesti ja kasvaimet kasvavat verisuonista puolelta saatiin soveltamalla soluja laskimoon. Histologiaa intrabronkiaalisesti aiheutettujen kasvaimien paljasti näyttöä kasvaimia parenchyma elimen ja keuhkoputkien seiniin. Nämä havainnot vastaavat tuloksia, joita raportoitiin muut kirjoittajat [15]. Laskimonsisäinen injektio kasvainsolujen, johti kuitenkin karsinoomat vain kasvaa parenkyymiin keuhkoihin, mutta ei keuhkoputkien seinät. Kasvaimen kasvu seuranta käyttäen bioluminesoiviin kuvantamisen edistänyt saavutetut tulokset histologia, paljastaen erilaiset kasvutavat kasvainten, jotka indusoitiin intrabronkiaalisesti ja suonensisäisesti. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että intrabronkiaalisesti aiheuttama keuhkokasvaimia syntyvät peribronkiolaarista alueella, joka viittaa siihen, että intrabronkiaalisesti sovellettu solujen täytyy kyetä hyökätä ja valloittaa keuhkoputkien epiteelin jotta asuttaa peribronkiolaarista kudosta. Tämä havainto on rohkaisevaa suhteessa tuloksiin muiden ryhmien, jotka osoittivat asuttaminen keuhkojen epiteelin leimatun geneettisesti mesenkyymikantasoluista sovellettuna kautta intrabronkiaalinen reittiä [20]. Perustuvat olettamukseen, että intrabronkiaalisesti soveltaa kasvainsolujen aluksi tunkeutuvat epiteelin kerrokset keuhkoputken alueen levisi peribronkiolaarista, ehdotimme, että hoito aerosolisoitua BC-819 tulisi olla tehokkaita tuhoamaan kasvainsoluja kuin me ja muut ovat aiemmin osoittaneet, että nebulized lusiferaasia koodaus-DNA vallitsevasti transfects keuhkoputkien ja keuhkorakkuloiden epiteelin kompleksoituna haarautunutta PEI [7], [8].

Tukeakseen olettamuksen, käsittelimme on kasvain plasmidilla BC-819, joka on äskettäin osoitettu olevan terapeuttisesti tehokas BCG-resistenttejä virtsarakkokarsinoomat potilailla [21]. Plasmidi BC-819 koodeja fragmentti difteriatoksiinin ja ohjaa H19 promoottori. Koska H19 promoottori on aktiivinen ainoastaan ​​pahanlaatuisia soluja ja alkionkehityksen aikana, kasvain kudos tuhoutuu, kun taas terve kudos pysyy vahingoittumattomana [10]. Ennen

in vivo

kokeissa tehoa BC-819 määritettiin keuhkosyövän solulinjoja NCI-H460, NCI-H358 ja A549

in vitro

, paljastaen huomattavasti estävä vaikutus solujen kasvu. Aikaisemmin on osoitettu, että ei-koodaavan H19 mRNA ilmentyy voimakkaasti, mikä osoittaa aktiivisen H19-promoottorin, keuhkosyövän solulinjat, erityisesti A549 [22]. Näin ollen, keuhkosyöpä hiirillä indusoitiin käyttämällä lusiferaasin ilmentäviä A549-C8-luc, joka oli myös osoitettu olevan herkkiä plasmidin BC-819. Lisäksi keuhkot tutkittiin post mortem varten 19N-ilmentyminen In situ -hybridisaatio, joka osoitti vahvaa näyttöä H19 ilmentymisen A549-C8-luc keuhkokasvaimia.

Tämä koe osoitti, että viikoittain aerosoli hoito PEI /BC-819 antaa merkittävän (p = 0,01) eloonjäämishyötyä hiiriä kärsivien intrabronkiaalisesti aiheuttama keuhkokasvaimia mutta ei hiirillä, jotka kärsivät laskimoon indusoi keuhkokasvaimia (p = 0,36). Näiden tulosten perusteella, me spekuloida, että PEI /BC-819 aerosoli hoito vaikuttaa vain ensisijainen keuhkokasvaimia joihin pääsee hengitettynä koska pahanlaatuisen kasvaimen pääasiassa syntyy luminaaliselle osa hengitysteihin. Vastakohtana tälle, kasvaimen kasvun suonensisäisesti indusoima keuhko- kasvainten ensisijaisesti kehittyy verisuonten myöhemmin valtaavat parenkyymiin keuhkoihin. Kuten edellä mainittiin, aerosoli, joka perustuu geenin siirto on pääasiassa rajoittunut keuhkoputkien epiteeliin. Varmasti tämä ei tarkoita, että terapeuttisia vaikutuksia ei voida saavuttaa koko elin. Itse asiassa useat tutkimukset menestyksekkäästi osoittanut vaikutuksia sumutetun pDNA toisen malleissa keuhkosyöpään [23]. Kuitenkin muita plasmidikonstrukteja käytettiin näissä tutkimuksissa, ilman syöpäsolun promoottorit ja geenit mukaan lukien vähemmän solun myrkyllisiä proteiineja, esim. tuumorisuppressorigeenin proteiinin p53. Lisäksi apoptoottinen proteiini, kuten p53 todennäköisesti johda välittömään tuhoutumiseen transfektoitu solu, siis nostaa sitä mahdollisuutta, että liiallinen p53 voitaisiin vapauttaa transfektoitu solu tai todennäköisemmin, parakriini- tai interleukiini-välitteistä signalointia voitaisiin aktivoida ympäröivän kudosta.

vaikka aerosoli sovellus näyttää lupaavalta tulevia hoitoja vakavien keuhkosairauksien, se olisi pidettävä mielessä, että tällainen hoito myös näyttää paljon kuin nuoralla kävellä. Itse asiassa, todennäköisyys vakavia sivuvaikutuksia, kuten tulehdusta tai allergisia reaktioita, kasvaa myrkyllisyyttä ja ärtyneisyys käytetyn aineita, jotka näin ollen rajoittaa etu hengitysteitse. Koskee kuten nämä ehkä harkita erityisesti aerosoli soveltamisen sytotoksisten aineiden kuten paklitakselin [6] tai doksorubisiinin [5], mutta voi myös olla merkitystä soveltamisen nukleiinihappoja. Todellakin voimakas immuunijärjestelmä toimii paitsi ulkomaisista taudinaiheuttajia, vaan myös ei-virusvektoreita ja nukleiinihapot. Kuitenkin vain hieman enemmän sytokiinejä on kuvattu aerosoli soveltamista haarautunut PEI keuhkoihin [24], [25], [26]. Sen lisäksi tulehdus johtuu immuunireaktioita, vakavia sivuvaikutuksia voisi kehittyä tuhottu kudoksesta. Tässä suhteessa erityisen arkkitehtuurin keuhkot tulisi harkita. Yleisyys verisuonten nostaa alttiuden hengenvaarallisia keuhkojen verenvuodot (hemoptysis), joka voisi indusoida solujen myrkyllisten aineiden [27]. Tämän seikka vaikuttaa todennäköiseltä, että kasvainsolu erityisiä plasmideja kuten BC-819, joka vain tuhoaa kasvain, mutta ei tervettä kudosta voitaisiin tuoda lupaavan hyötyä aerosoli hoitoon keuhkosyövässä.