Krooninen sairaus

tiivistelmä

hypertermia (HT) parantaa tehokkuutta syövän sädehoito ja kemoterapia. Kuitenkin HT väistämättä herättää stressistä ja lisää ekspressiota lämpöshokki- proteiineihin (HSP: t) syöpäsoluissa. Niistä HSP: itä, HSP70 tunnetaan pro-selviytymisen proteiinia. Tässä tutkimuksessa tutkimme herkistävä vaikutus pifithrin (PFT) -μ, pieni molekyyli estäjä HSP70, kun kolme ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa (LNCaP, PC-3, ja DU-145) käsiteltiin HT (43 ° C 2 h). Kaikki solulinjat konstitutiivisesti HSP70 ja HT kasvatti edelleen ilmentymistä LNCaP ja DU-145. Knockdovvn HSP70 RNA interferenssin vähensi elinkelpoisuutta ja pesäkkeitä muodostavien kyky syöpäsolujen. PFT-μ vähensi elinkykyä kaikissa solulinjoissa, yksi kymmenesosa annos Kversetiini, tunnettu HSP estäjä. Yhdistelmä hoidon optimaalinen annoksilla PFT-μ ja HT laski elinkelpoisuuden syöpäsolujen tehokkaimmin PFT-μ lisättiin välittömästi ennen HT, ja tämä yhdistelmä vaikutus poistettiin ennalta knockdovvn HSP70, mikä viittaa siihen, että vaikutus oli välittävät HSP70 esto. Yhdistelmähoito indusoi solukuoleman, osittain kaspaasiriippuvaisen, ja laski lisääntyvien syöpäsolujen, joissa vähentynyt ilmentyminen c-Myc ja sykliini D1 ja lisääntynyt ilmentyminen p21

WAF1 /Cip, mikä osoittaa pidätys solujen kasvua. Lisäksi yhdistelmähoito vähensi merkitsevästi pesäkkeitä muodostavien kyky syöpäsolujen verrattuna hoitoa joko yksinään. Lisäksi ksenografti hiirimallissa, yhdistelmähoito inhiboi merkittävästi PC-3-kasvaimen kasvua. Nämä havainnot viittaavat siihen, että polyesterikuitufilamenttitouveja-μ voidaan tehokkaasti parantaa HT aiheuttama antituumorivaikutukset kautta HSP70 eston indusoimalla solukuolemaa ja pidätykseen solujen kasvua, ja että PFT-μ on lupaava aine käytettäväksi yhdessä HT eturauhassyövän.

Citation: Sekihara K, Harashima N, Tongu M, Tamaki Y, Uchida N, Inomata T, et ai. (2013) Pifithrin-μ, estäjä Heat-Shock Protein 70, voi lisätä antituumorivaikutukset Hypertermia ihmisen syöpäsolujen. PLoS ONE 8 (11): e78772. doi: 10,1371 /journal.pone.0078772

Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 10 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 16 syyskuu 2013; Julkaistu: 14 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Sekihara et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain Grants-in-tuki tieteellisen tutkimuksen alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, and Technology, Japani (no. 18591449 M. Harada ja no. 23701074 N. Harashima), sekä Shimane University ”S-TAKUMI Medical Nanoteknologia” Project (M. Harada). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä ja kolmanneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolleisuus miehillä Yhdysvalloissa [1]. Vaikka alkuvaiheen eturauhassyöpä voidaan hyvin ohjata leikkauksen tai sädehoidon, joilla on pitkälle edennyt eturauhassyöpä hoidetaan hormonihoidon [2]. Kuitenkin, kun lyhyen aikavälin remission, elossa syöpäsolut palaavat usein lisääntynyt maligniteetti [3]. Siksi parantaa selviytymistä miesten eturauhassyövän, uusia terapeuttisia strategioita on kehitettävä.

hypertermia (HT) on tehokas hoito, joka on vähäinen, lieviä sivuvaikutuksia, ja sen on osoitettu olevan synergistinen kanssa muun tyyppisiä syövän hoitomuotoja. Lukuisat

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset ovat osoittaneet, että HT tehokkaasti parantaa tehokkuutta sädehoidon ja kemoterapia vastaan ​​erityyppisiä syöpiä [4] – [6]. Lisäksi monet kliiniset kokeet ovat osoittaneet, että lisäämällä HT sädehoitoa tai kemoterapiaa voi tuottaa enemmän täydellinen vaste [7] – [11]. Kuitenkin HT väistämättä liittyy lämpöisku- proteiinit (HSP) [12], [13]. HSP: t ovat molekyyli saattajia, jotka toimivat ensisijaisena solun puolustus vastaan ​​vahinkoa proteomiin, aloittamista uudelleen laskostumisen denaturoitua proteiinien ja säännellä hajoamista jälkeen vakavan valkuaisaineiden vahinkoja [14]. HSP: t suojaavat soluja sekä rajoittamalla vaikutuksia proteiini-haitallisia aineita kautta proteiinia chaperoning ja uudelleenlaskostukseen ja suoraan estämällä solukuolemareittejä [15] – [18]. Niistä HSP: itä, HSP70 on jännitys-indusoituva HSP jota on raportoitu olevan rooli terapiassa-resistenssin [19]. Toisin kuin sen hyvin alhaiselle tasolle jännittämättömässä normaaleissa soluissa, HSP70 ilmentyminen lisää nopeasti vastauksena erilaisiin rasituksia [20], [21]. Tärkeää on, lisääntyneen ekspression HSP70 syöpäsoluissa on raportoitu liittyvän pahanlaatuisen ominaisuuksia ja huonompi ennuste syöpäpotilaiden [22]. Lausunto ehdottaa, että HSP70 on lupaava kohde syövän hoidossa. Vähentää HSP70 tasoja joissakin viljellyissä kasvainsoluissa on raportoitu aiheuttavan solukuolemaa ja /tai herkistää niitä sytotoksisia aineita, samalla kun mitään selvää haitallisia vaikutuksia ei-tuumorisoluissa [23] – [28].

Pifithrin (PFT) -μ (2-phenylethynesulfonamide) tunnistettiin alun perin pieni-molekyylin sitoutumisen estäjä p53: n ja mitokondrioiden [29]. Sen jälkeen, tämä molekyyli havaittiin selektiivisesti vuorovaikutuksessa HSP70 ja estää sen toiminnot [30]. Tämä tieto johti meidät testaamaan hypoteesia, jonka mukaan PFT-μ voitaisiin lisätä HT-indusoitua tuumorin vastainen vaikutus ihmisen eturauhasen syöpäsoluja. Esillä olevassa tutkimuksessa sen jälkeen, kun vahvistavat, että HSP70 ilmentyy ja /tai parantaa HT, ja sillä on pro-selviytymisen rooli ihmisen eturauhasen syöpäsolujen, olemme osoittaneet, että yhdistelmä optimaalista annosta PFT-μ voidaan tehokkaasti parantaa HT-indusoitua tuumorin vastaisen vaikutuksia ihmisen eturauhassyöpään

in vitro

, ja että yhdistelmähoito voi estää kasvaimen kasvua vierassiirrännänmallissa hiirimallissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

kolme ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa (LNCaP, PC-3, ja DU-145) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA), ja niitä pidettiin RPMI 1640-alustassa (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) ja 20 ug /ml gentamysiini (Sigma-Aldrich), 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. PFT-μ ja Quercetin ostettiin Santa Cruz Biotechnology (SCB: Santa Cruz, CA, USA) ja Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA), vastaavasti.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttämällä 2- (2-metoksi-4-nitrofenyyli) -3- (4-nitrofenyyli) -5- (2, 4-disulfofenyyli) -2H-tetratsolium mononatriumsuolaa (WST-8) määritys (Nacalai Tesque, Kioto, Japani). Lyhyesti, solut ympättiin tasapohjaisille 96-kuoppaisille levyille. Kaksi päivää myöhemmin, WST-8 lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja levyt luettiin aallonpituudella 450 nm sen jälkeen, kun 3 tuntia.

Yhdistelmähoito HT ja PFT-μ

indusoimiseksi HT, syöpäsolut, jotka ympättiin 1 päivä ennen, inkuboitiin 43 ° C: ssa 2 tuntia. Syöpäsolut olivat aina viljeltiin läsnäollessa PFT-μ 2 päivää. Joissakin kokeissa, HT suoritettiin päivänä 1, 2, tai 3 käynnistyksen jälkeen viljelmä syöpäsoluja.

transfektio pieniä häiritseviä RNA: n (siRNA) B

transfektio siRNA suoritettiin käyttäen Lipofectamine ™ RNAiMAX (Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. HSP70 siRNA (sc-29352) hankittiin SCB. Ohjaus siRNA (# 6568) ostettiin Cell Signaling Technology (CST), Danvers, MA, USA. Kolmen vuorokauden kuluttua siRNA transfektion, syöpäsolut käytettiin kokeissa.

Colony muodostava määrityksessä

Solut ympättiin tasapohjaisille kuuden kuopan levyillä. Yksi päivä myöhemmin, PFT-μ lisättiin ja käsitelty tai ilman HT. Kaksi päivää sen jälkeen, kun on lisätty PFT-μ, väliaine korvattiin uudella alustalla, joka sisälsi ei PFT-μ, ja viljelyä jatkettiin vielä 10-12 päivä. Tämän jälkeen pesäkkeet fixated metanolilla ja värjättiin 0,05% kristalliviolettia, laskettiin sitten.

Immunoblotvärjäys

Solut hajotettiin nisäkkään proteiini uuttoreagenssi (M-PER, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), joka sisältää proteaasiestäjäseostabletit (Nacalai Tesque). Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin 4-12% gradientti tai 12% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin sitten polyvinylideenifluoridi kalvoja. Blokkauksen jälkeen kalvoja, blotteja inkuboitiin seuraavat ensisijaiset vasta-aineet: anti-HSP70 (hsp72; R 0,05 (Opiskelijan

t

-testi) (D) PC-3 ja DU-145, joka oli ennalta transfektoitu HSP70 siRNA tai ohjata siRNA 2 päivää ennen, viljeltiin varten pesäkkeitä muodostumisen määritys 12 päivää. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta kuoppiin. *

P

0,05 (Opiskelijan

t

-testi) (E) LNCaP, joka oli ennalta transfektoitu HSP70 siRNA tai ohjata siRNA 2 päivää ennen, viljeltiin 12 päivää, ja solujen elinkykyä (%) määritettiin käyttämällä WST-8-määrityksessä. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta kuoppiin. *

P

0,05 (Opiskelijan

t

-testi).

Kasvaintenvastainen vaikutuksia ihmisen eturauhasen syöpäsolujen aiheuttama yhdistelmähoito HT ja PFT- μ

edellä olevat tiedot viittaavat siihen, että inhibitio HSP70 voisi helpottaa eturauhassyövän hoitoon käyttäen HT. Siksi tutkimme seuraavaksi vaikutus uuden HSP70-inhibiittori PFT-μ HT-indusoitua tuumorin vastainen vaikutus. Ennen arvioidaan antituumorivaikutuksen aiheuttama yhdistelmä HT ja PFT-μ, vertasimme antituumorivaikutusta polyesterikuitufilamenttitouveja-μ kuin Kversetiini, lämpöä shock factor (HSF) -1-inhibiittori, joka estää säätely ylöspäin kaikki lämpöisku- aiheuttama geenien, kuten

HSP70

geeni [31] (Fig. 2A). Sekä Kversetiini ja PFT-μ laski elinkelpoisuuden kolmen eturauhassyöpäsolulinjoissa annoksesta riippuvaisella tavalla, mutta PFT-μ kohdistuu sen antituumorivaikutuksen lähes yksi kymmenesosa annos Kversetiini. Olemme myös vahvistaneet, että knockdovvn HSP70 jättänyt vaikuttaa ilmaisun HSP90, toinen keskeinen HSP stressiä vastereitissä (Fig. 2B). PFT-μ ei ollut vaikutusta HSP70-proteiinin ekspression, kuten on raportoitu aiemmin [30].

(A) Kolme solulinjoja viljeltiin ilmoitetun annoksilla kversetiini tai PFT-μ. 48 tunnin kuluttua, solujen elävyys (%) määritettiin käyttämällä WST-8-määrityksessä. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta kuoppiin. (B) Kaksi päivää transfektion jälkeen HSP70 siRNA tai ohjaus siRNA: n ilmentyminen HSP90 ja HSP70 arvioitiin immunoblot. Ilmaisu Näiden HSP tutkittiin myös sen jälkeen, kun hoidon PFT-μ (5 uM). β-Actin käytettiin kontrollina.

Sitten, arvioimme antituumorivaikutukset aiheuttama yhdistelmä HT ja PFT-μ. Ensin tutkitaan optimaalisen protokollien maksimoida antituumorivaikutukset aiheuttamien tätä yhdistelmää. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, kolme ihmisen eturauhassyövän solulinjaa käsiteltiin kolme eri protokollia; in protokolla-1 (P-1), HT tehtiin 24 tuntia ennen kuin lisättiin PFT-μ; in protokolla-2 (P-2), PFT-μ lisättiin välittömästi ennen HT; ja protokolla-3 (P-3), HT tehtiin 24 tuntia lisäyksen jälkeen PFT-μ. Näkyvin vaikutus havaittiin hakemuksesta P-2-protokolla (Fig. 3B). Valitut edustavat tiedot on esitetty kuviossa. 3C. Elinkelpoisuus syöpäsolujen väheni merkittävästi, kun HT yhdistettiin optimaalisella annoksella (5 uM) polyesterikuitufilamenttitouveja-μ. Olemme lisäksi määritetty, onko yhdistelmä vaikutusta ei voitu havaita syöpäsolut, jotka oli ennalta transfektoitu HSP70 siRNA (Fig. 3d); pre-knockdovvn HSP70 poisti yhdistelmän vaikutus vastaan ​​PC-3 ja DU-145. Nämä tulokset osoittavat, että optimaalinen annokset PFT-μ voi parantaa HT aiheuttaman antituumorivaikutuksen vaikutuksia syöpäsolujen kautta HSP70 eston, ja että näkyvin vaikutus saavutetaan, kun PFT-μ lisätään välittömästi ennen HT.

( A) Kolme eri protokollia on esitetty. (B) Kolmen solulinjoja viljeltiin ilmoitetun annoksilla PFT-μ perustuu kolmeen eri protokollien kanssa HT (raidallinen bar) tai ilman HT (musta palkki). HT suoritettiin 43 ° C: ssa 2 tuntia. 48 tunnin kuluttua, solujen elävyys (%) määritettiin käyttämällä WST-8-määrityksessä. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta kuoppiin. (C) Valitut tulokset esitetään. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta kuoppiin. *

P

0,05 (Opiskelijan

t

-testi) (D) PC-3 ja DU-145, joka oli ennalta transfektoitu HSP70 siRNA tai ohjata siRNA 2 päivää aiemmin, oli culured kanssa PFT-μ (5 uM) kanssa /ilman HT (43 ° C: ssa 2 h). 48 tunnin kuluttua, solujen elävyys (%) määritettiin käyttämällä WST-8-määrityksessä. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta kuoppiin. *

P

0,05 (Opiskelijan

t

-testi) NS, ei merkittävää.

Syöpä solukuolemaa jälkeen yhdistelmähoito HT ja PFT-μ

tutkimuksissa edellä kuvattua, arvioimme lähinnä antituumorivaikutuksen vaikutuksia syöpäsolujen mittaamalla elinkelpoisuus 2 päivää sen jälkeen hoidon HT ja PFT-μ. Tällainen vaikutukset elinkelpoisuus saattaa heijastaa muutoksia solukuoleman ja /tai kasvua. Siksi me seuraavaksi arvioidaan taustalla vaikutusmekanismi. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, HT yksinään ei lisätä prosenttiosuutta anneksiini V

+ soluja, kun taas hoito PFT-μ kasvoi sitä hieman. Kuitenkin yhdistelmähoito voimakkaasti kohonneet prosenttiosuutta anneksiini V

+ soluja, sekä aikaisen apoptoottiset anneksiini V

+ /PI

– ja myöhäinen apoptoottiset ja /tai nekroottisen anneksiini V

+ /PI

+, varsinkin LNCaP. Kasvu prosenttiosuuden anneksiini V

+ solut näyttivät olevan vain lisäaineen PC-3 ja DU-145. Lisäksi lisäämällä 20 uM z-VAD, yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä, osittain pelkistetyt prosenttiosuus anneksiini V

+ solujen LNCaP jälkeen yhdistelmähoidon HT ja PFT-μ (Fig. 4B). Z-VAD-indusoidun toipuminen anneksiini V

+ solujen havaittiin anneksiini V

+ /PI

– (varhainen apoptoottinen) osajoukko. Tämä annos z-VAD oli riittävä inhiboimaan TRAIL-indusoitua solukuolemaa kuoleman reseptori-ilmentävät ihmisen haimasyövän soluja [32]. Nämä tulokset osoittavat, että vaikka teho vaihtelee syöpäsolulinjoissa, yhdistelmähoito HT ja PFT-μ voi parantaa syöttämällä eturauhassyöpäsolujen, ja että yhdistelmähoito-solukuolema LNCaP on osittain kaspaasiriippuvaisen.

(A) kolme solulinjaa käsiteltiin HT (43 ° C: ssa 2 h) ja /tai PFT-μ. 48 tunnin kuluttua, virtaussytometrialla suoritettiin värjäämällä FITC-konjugoidulla anneksiini V: n ja PI. Edustava tulos näkyy. Luvut edustavat prosenttiosuudet kustakin seikasta. (B) LNCaP-soluja käsiteltiin sekä HT ja PFT-μ (5 uM), kun läsnä on z-VAD (20 uM) tai kontrolli-DMSO. 48 tunnin kuluttua, virtaussytometrialla suoritettiin värjäyksen jälkeen APC-konjugoidun anneksiini V: n ja PI. Luvut edustavat prosenttiosuudet kustakin seikasta.

yhdistelmähoitoa HT ja PFT-μ voi pysäyttää kasvun eturauhasen syöpäsolujen

lisäksi tutkittiin, solujen kasvun pysähtymistä oli mukana antituumorivaikutuksen aiheuttamia vaikutuksia yhdistelmähoito HT ja PFT-μ. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, arvioimme leviämisen ja solusyklin syöpäsolujen arvioimalla BrdU otto ja 7AAD värjäystä. Olemme havainneet, että yhdistelmähoito HT ja PFT-μ pieneni prosenttiosuus BrdU

+ S-vaiheen syöpäsolujen ja lisääntynyt että G2 /M-vaiheessa syöpäsolujen kolme solulinjoissa. Olemme myös arvioinut ilmaus solusyklin liittyviä molekyylejä ja totesi, että yhdistelmähoito johti vähentynyt ilmentyminen c-Myc LNCaP ja vähentynyt ilmentyminen sykliini D1 PC-3 ja DU-145. Lisäksi, ekspressio p21

WAF1 /Cip lisättiin kolmessa syöpäsolulinjoissa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että solujen kasvun pysähtymisen edistää antituumorivaikutukset indusoi yhdistelmähoito HT ja PFT-μ.

(A) kolme solulinjaa käsiteltiin kanssa tai ilman HT (43 ° C: ssa 2 h), ja PFT-μ (5 uM) ja 2 päivää. Viime 5 h LNCaP, 90 min PC-3, ja 3 h DU-145, soluja viljeltiin BrdU (10 uM). Sitten, korjattu solut värjättiin FITC-konjugoidulla anti-BrdU-vasta-aineen ja 7AAD ja virtaussytometria suoritettiin. Numerot ovat prosenttiosuudet kustakin seikasta. (B) Kolmen solulinjoja käsiteltiin joko tai molemmat HT ja PFT-μ (5 uM) ja 2 päivää, ja ekspressiotasot c-Myc, sykliini D1, ja p21

WAF1 /Cip-proteiinin määritettiin immunoblottaus. β-Actin ja α-tubuliinin käytettiin kontrolleina.

Yhdistelmähoito HT ja PFT-μ voi vähentää pesäkkeitä muodostavien kyky syöpäsolujen

tutkimme seuraavaksi vaikutus yhdistelmähoidon HT ja PFT-μ on pesäkkeitä muodostava kyky eturauhasen syöpäsoluja. Yhdistelmähoito vähensi merkitsevästi pesäkkeitä muodostavien kyky PC-3 ja DU-145-soluja (Fig. 6A) ja laski elinkelpoisuuden LNCaP-solujen pitkän aikavälin (12 päivän) kulttuuri (Fig. 6B). Nämä tulokset osoittavat, että yhdistelmähoito HT ja PFT-μ voi pienentää pesäkkeitä muodostavien kyky ja elinkelpoisuuden pitkällä aikavälillä kulttuuri, eturauhassyöpäsolujen.

(A) PC-3 ja DU-145 soluja viljeltiin 14 päivää, ja niiden pesäkkeiden muodostuminen kapasiteetti määritettiin. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta kuoppiin. *

P

0,05 (Studentin

t

-testi) (B) LNCaP-soluja viljeltiin 12 päivää, ja elinkelpoisuus (%) määritettiin käyttämällä WST-8-määrityksessä. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta kuoppiin. *

P

0,05 (Opiskelijan

t

-testi).

In vivo

antituumorivaikutuksen HT ja PFT-μ yhdistelmä hoidon vierassiirrännänmallissa hiirimallissa

Lopuksi arvioidaan, onko yhdistelmähoito HT ja PFT-μ aiheutti antituumorivaikutus vakiintuneisiin ihmisen eturauhassyöpää vierassiirrännänmallissa hiirimallissa (Fig. 7). Polkuanturoihin nude-hiiriin inokuloitiin PC-3-soluja, ja hiiriä käsiteltiin PFT-μ ja /tai HT. Ottaen huomioon anatomia polkuanturan, kasvaimen kasvu arvioitiin mittaamalla paitsi tuotteen kahden kohtisuoran halkaisijan, mutta myös polkuanturan paksuus. Tämän seurauksena, vaikka paikallinen anto PFT-μ ei ollut antituumorivaikutusta, vaan edistää kasvaimen kasvua, ja HT vähensi kasvaimen kasvua hieman, mutta ei merkittävästi, yhdistelmähoito HT ja PFT-μ merkittävästi tukahdutti kasvaimen kasvun verrattuna kontrolliryhmään.

BALB

nu /nu

uros hiiriin istutettiin oikeaan polkuanturaan 1 x 10

6 PC-3-solujen kanssa Matrigeliä. Päivänä 15 hiiret yhdistettiin ja jaettiin neljään ryhmään. Kukin ryhmä sisälsi kuusi hiirtä. Päivinä 0 ja 4, kun ryhmittymä, PC-3-kantavia hiiriä paikallisesti injektoitiin PFT-μ (100 ug 50 ul: ssa) ja /tai käsitelty HT (43 ° C: ssa 30 min). Nuolet edustavat hoitopäivänä. Koska ajoneuvon hallintaan, 50 ui DMSO: ta injektoitiin. HT suoritettiin 1 h kuluttua paikallisen injektion PFT-μ. Sen jälkeen, kasvaimen koko, tuotteen kahden kohtisuoran halkaisijan (A, B), ja polkuanturan paksuuden (C, D) mitattiin kaksi kertaa viikossa. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kuusi hiirtä. *

P

0,05 **

P

0,01 (Dunnettin testi) NS, ei merkittävää.

Keskustelu

Joukossa erilaisia ​​syöpätyyppejä, HT on sovellettavissa erityisesti eturauhassyövän [33]. Kuten alussa esitettiin, HT väistämättä herättää stressistä aiheutuvat syöpäsoluissa. HSP70 on voimakas lämpö-indusoituva pro-selviytymisen proteiinia, joka antaa solusuojaus vastaan ​​eri kuoleman aiheuttavia ärsykkeitä ja lisää tuumorigeenisyystesti [25], [27], [34]. Näin ollen, HSP70 on ehdotettu lupaava kohde syövän hoitoon [19]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että kolme eturauhassyövän solulinjoissa ovat olennaisesti positiivisia HSP70, ja että HT voi lisätä ilmentymistä LNCaP ja DU-145-solulinjoja. Yllättäen, ilmaus HSP70 PC-3 oli hieman vähentynyt 8 h kuluttua HT; emme pysty selittämään tätä havaintoa hetkellä. On kuitenkin huomattava, että valikoiva knockdovvn HSP70 syöpäsoluissa vähentynyt merkittävästi niiden elinkelpoisuutta ja pesäkkeitä muodostavat kyky. Tuloksemme viittaavat siihen, että HSP70 on pro-selviytymisen proteiinia eturauhasen syöpäsolujen, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [23] – [28]. Nämä havainnot johtivat meidät vaikutuksen testaamiseksi yhdistelmä HT PFT-μ, hiljattain tunnistettu HSP70 estäjä [30], ihmisen eturauhasen syöpäsolujen.

yhdistelmähoitoa HT ja PFT-μ vähensi elinkelpoisuus kolme eturauhassyövän solulinjoissa verrattuna hoitoon joko hoito yksinään. Mitä tulee taustalla mekanismi, testasimme kaksi mahdollisuutta;

ts.

, Solukuolemaan ja solujen kasvun pysähtymistä. Anneksiini V /PI-värjäyksen paljasti, että yhdistelmähoito prosenttiosuus kasvoi anneksiini V

+ solut (Fig. 4A). Vaikka yhdistelmä vaikutus oli vähäistä PC-3 ja DU-145-solut, jyrkkä ja yhteisvaikutukset korotus anneksiini V

+ solujen havaittiin LNCaP. HT yksinään ei vaikuttanut prosenttiosuus anneksiini V

+ soluja, ja vaikutus PFT-μ yksin oli myös marginaalinen. Anneksiini V:

+ /PI

+ positiivisuus ei osoita apoptoottisia soluja, koska myöhään necrotic solut ovat positiivisia myös sekä anneksiini V: ja PI. Ottaa huomioon solujen kasvun pysähtymisen, yhdistelmähoito vähensi S-faasin osa, ja lisäsi G2 /M-vaiheen osa kolmella syöpäsolulinjoissa (Fig. 5A). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​peräisin tuore raportti osoittaa, että polyesterikuitufilamenttitouveja-μ voi aiheuttaa G2 /M pidätys syöpäsoluissa [35]. Lisäksi yhdistelmähoito vähensi ilmentymistä c-Myc LNCaP ja sykliini D1 PC-3 ja DU-145, ja lisäsi ilmentymistä p21

WAF1 /Cip kolmessa solulinjoissa. Nämä muutokset solusyklin liittyvät molekyylit voivat osittain selittää pidättäminen kasvun eturauhasen syöpäsolujen vastauksena yhdistelmähoitoa.

HSP90 ja HSP70 vaikuttavat toisiinsa [36]. Koska HSP90 esto liittyy säätely ylöspäin HSP70 [37], useita ryhmiä ovat raportoineet, että co-inhibitio HSP70 merkittävästi tehostaa sytotoksisuutta HSP90 estäjien useita eri kasvaintyyppien [38]. Toisaalta, HSP70 on kriittinen co-chaperon varten HSP90 ja on mukana toimituksen asiakkaalle proteiinien HSP90 [39], ja HSP70 inhibitio voi indusoida kasvainspesifisen apoptoosin kautta HSP90-toiminto [28]. Nämä linjat tietojen mukaan knockdovvn HSP70 ja PFT-μ tehosti vaikutusta HT kautta estämällä HSP90. Siksi tutkimme vaikutus knockdovvn HSP70 tai PFT-μ ilmenemistä HSP90 syöpäsoluissa, kun taas mitään muutosta HSP90 ilmentymistä havaittiin (Fig. 2B). Kuitenkin tämä tulos ei voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että esto HSP70 tai PFT-μ vaikuttanut sitomista HSP90 asiakkaan proteiineja, kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptori, HER2 /ErbB2 ja AKT, liukenemattomaksi fraktioksi ja edistänyt niiden yhdistäminen ja inaktivaation, raportoitu [ ,,,0],40].

määrittää, onko yhdistelmähoito solukuolema LNCaP-soluja oli riippuvainen kaspaasi (Fig. 4B). Lisääminen yleiseurooppalaisen kaspaasiestäjä z-VAD laski prosenttiosuus anneksiini V

+ /PI

– varhainen apoptoottiset LNCaP, mikä tarkoittaa, että kaspaasiriippuvaisen apoptoosin oli osittain vastuussa yhdistelmähoitoa aiheuttama solukuolema LNCaP. Koska HT yksinään ei onnistunut indusoimaan solukuolemaa, tämä vaikutus näyttää perustuvan lähinnä vaikutuksen PFT-μ. Olemme raportoitiin äskettäin, että PFT-μ aiheuttaa kaspaasiriippuvaisen ja riippumattaman solukuolemaa ihmisen haimasyövän soluja [32]. Koskien kaspaasi-riippumattoman solukuoleman, HSP70 on raportoitu sitoutuvan apoptoosia indusoivan tekijän (AIF), joka indusoi kaspaasi-riippumattoman apoptoosin translokaation tumaan [41]. Kuitenkin RNA-interferenssi AIF ei ollut vaikutusta PFT-μ-solukuolema eturauhassyöpäsolujen (tuloksia ei ole esitetty). Siten AIF todennäköisesti ei osallistu yhdistelmähoidossa aiheuttama kuolema LNCaP. Vaihtoehtoisesti, HSP70 on raportoitu paikallistaa ja kalvot lysosomeihin, edistää syöpäsolujen elinkelpoisuuden, ja inhiboivat TNF-indusoidun solukuoleman estämällä lysosomaalisen kalvon läpäisevyyttä [42]. Siten HSP70 parantaa selviytymistä stabiloimalla lysosomeihin syöpäsoluissa. Koska PFT-μ sitoo HSP70, on mahdollista, että PFT-μ inhiboi HSP70-indusoitua vakauttaminen lysosomaalisen kalvon läpäisevyyttä, mikä lisää solun kuolemaan. Kuitenkin lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään tarkkaa mekanismia solukuoleman jälkeen yhdistelmähoito HT ja PFT-μ.

Kun HT yhdistetään syöpälääkkeitä, ajoitus lääkkeen annon on kriittinen [ ,,,0],13]. Näin ollen tässä tutkimuksessa vertasimme antituumorivaikutukset indusoima kolme eri protokollia, ja totesi, että HT välittömästi lisäyksen jälkeen PFT-μ tuotti suurimmat antituumorivaikutuksia (Fig. 3). Tämä viittaa epäsuorasti siihen, että HSP70 lla suojaava tehtävä heti kuumuudesta.

Arvioimme antituumorivaikutukset yhdistelmähoidon tehon pesäke-muodostumista määrityksessä. Tämä määritys suoritettiin 12 päivää, ja tulos voi heijastaa vaikutusta sekä solukuoleman ja solujen kasvun pysähtymistä. Yhdistelmä HT ja PFT-μ vähensi pesäkkeitä muodostavien kyky PC-3 ja DU-145-soluja. Kun kyseessä on LNCaP, yhdistelmähoito aiheutti tuumorin vastaista vaikutusta LNCaP pitkän aikavälin (12 päivän) solunelinkykyisyysmääritys. Näissä määrityksissä PFT-μ poistettiin alkuvaiheen jälkeen 2 päivän kulttuuri koska jatkuva läsnäolo PFT-μ, jopa suhteellisen pienellä annoksella käytetään lyhyen aikavälin solunelinkykyisyysmääritys, oli liian korkea, jotta pesäkkeiden muodostamiseksi. Oletamme, että pesäkkeitä muodostumisen määritys ja pitkän aikavälin (12 päivän) solunelinkykyisyysmääritys ovat hyödyllisiä testaamiseen pitkäaikaisia ​​vaikutuksia syöpäsolujen jälkeen ohimenevän syövän hoitoon.

Vaikka Quercetin on tunnettu HSP-inhibiittori [31], tämä lääke ei ole käytetty kliinisesti, koska suhteellisen suuria annoksia tarvitaan saamaan aikaan tuumorin vastainen vaikutus

in vivo

. Vertasimme antituumorivaikutukset kversetiini ja PFT-μ ja havaitsi, että PFT-μ voi indusoida antituumorivaikutuksen jopa yksi kymmenesosa annos Kversetiini (Fig. 2A).