Krooninen sairaus

tiivistelmä

Metastaattinen solut vaeltavat paikalle primaarikasvaimen kautta strooman vereen ja imusuonten lopuksi siirtomaita useiden muiden kudosten muodostamaan toissijainen kasvaimia. Lukuisat tutkimukset on tehty tunnistamaan ärsykkeitä, jotka ajavat metastaattinen Cascade. Tämä on johtanut tunnistamiseen useiden biokemiallisten signaaleja, jotka edistävät etäpesäke. Kuitenkin tietoa roolista mekaanisten tekijöiden syövän etäpesäkkeitä on ollut rajoitettu vaikuttaa noudattamista. Mielenkiintoista on, että kasvaimen mikroympäris- on runsaasti monissa solutyypeissä, mukaan lukien erittäin supistuvien solujen, jotka ovat vastuussa laajaa uudistumista ja tuotannon tiheä soluväliaineen ympäröivästä syöpäkudoksen. Oletamme, että mekaaniset voimat tuotetaan remodeling toimintaa solujen kasvaimen mikroympäristössä osaltaan hyökkäyksen tehokkuuden metastaattisen soluja. Olemme havainneet merkittävää eroa laajuus invaasion mekaanisesti stimuloi jakeissa ei-stimuloitujen soluviljelmässä ympäristöissä. Lisäksi tämä mekaanisesti parannettu invaasio riippuu alustalle proteiinikoostumus, ja vaikutteita topografia. Lopuksi, on havaittu, että proteiini cofilin tarvitaan havaitsemaan mekaanisia ärsykkeitä, joka parantaa hyökkäystä. Olemme päätellä, että muun tyyppisiä mekaanisten signaalien kasvaimen mikroympäristössä, lisäksi jäykkyys, voi parantaa invasiivisen kyvyt syöpäsolujen

in vitro

. Olemme lisäksi ehdotetaan, että

in vivo,

ei-syöpäsolujen sijaitsevat kasvain mikro-ympäristö voivat kyetä tarjoamaan tarvittavan mekaanisen ärsykkeen aikana remontin soluväliaineen ympäröivä kasvain.

Citation: Menon S, Beningo KA (2011) Cancer Cell Invasion tehostuu Applied Mechanical Stimulation. PLoS ONE 6 (2): e17277. doi: 10,1371 /journal.pone.0017277

Editor: Donald Gullberg, University of Bergen, Norja

vastaanotettu: 15 elokuu 2010; Hyväksytty: 27 tammikuu 2011; Julkaistu: 17 helmikuu 2011

Copyright: © 2011 Menon, Beningo. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellinen tuki on jonkin Wayne State University Faculty Research Grant ja KAB ja Wayne State University Graduate Research Award ja Enhancement rahastojen SM. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

hetki luokituksessa kasvain hyvän- vai pahanlaatuisia piilee kasvainsolut kyky rikkoa tyvikalvon. Laajentaminen invasiivisia rakenteita, kuten invadopodia, sallii kasvainsolujen tunkeutumisen tyvikalvon ja interstitiaalinen strooman entsymaattisen ja fysikaalisin keinoin [1] – [3]. Kuitenkin kasvainsolu ei mennä ilman ylimääräisiä kyky siirtää. Kasvain solut hankinta invasiivisia ja muuttavien ominaisuuksien tarjota keinot ja poistunut imusuonten tai verisuonistoon ja perustaa sekundaarikasvaimia ulkomaan kudoksessa, täydentäen näin monimutkainen tapahtumasarja sisällä invaasio-etäpesäkkeitä cascade [4], [5] . On nämä sekundaarikasvaimia joiden osuus on yli 90% syöpäkuolemista, mutta käsityksemme invaasio ja etäpesäkkeiden on epätäydellinen. Suuri osa tutkimuksesta on keskittynyt luontaisia ​​geneettiset ja biokemialliset tekijät, jotka laukaisevat ensisijainen kasvaimen muodostumisen ja myöhemmän etäpesäkkeiden. Kuitenkin uudemmissa tutkimuksissa on todettu, sekä fyysistä ja biokemiallisten tekijöiden sisällä kasvain microenvironment jotka myös edistävät syövän etenemiseen [6], [7].

strooman ympäröivä kasvain muuttuu jatkuvasti koostumukseltaan ja rakenne kuin primaarikasvaimen solut etenevät ja metastaasit, prosessi kutsutaan stromagenesis [8], [9]. Kasvain strooman tulee rikastettu soluväliaineen (ECM) proteiineja ja ei-tuumorisoluissa, mukaan lukien fibroblastit, makrofaagit, adiposyyttien, ja perisyyteissä [8] – [12]. Biochemical signaloinnin strooman kasvainsoluihin voi edistää proliferaatiota ja invasiivisuus. Esimerkiksi kasvaimeen liittyvät makrofagit perustaa EGF-CSF-1 paracrine signalointia silmukka kasvainsolujen kanssa, jotka edistävät kasvainsolun liikkumista [10]. Mekaaniset ominaisuudet strooman voi myös parantaa syövän etenemiseen. Esimerkiksi strooman ympäröivä kasvain on rikastettu sekä tyypin I kollageenin ja fibronektiinin, luoda tiheämpi ja mekaanisesti jäykän kudoksen verrattuna normaaliin kudokseen [7]. Tämä lisääntynyt jäykkyys parantaa kasvainsoluproliferaation ja levittämiseen [13] – [15]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat myös, että fyysisesti venytys fibronektiini voi laukaista mekaanisen vastereitissä normaaleissa fibroblasteissa [16] – [18]. Kun otetaan huomioon lisääntynyt määrä fibronektiinin strooman, nämä havainnot voi ehdottaa mahdollisia mekanismi mekaanisen vasteen kasvainsoluja.

On olemassa useita mekaanisia voimia, lukuun ottamatta muutosta noudattaen, jotka voivat vaikuttaa etenemistä syöpä. Yksi tällainen voima voisi olla peräisin stroomasolujen liikkeitä tai matriisin remodeling aktiivisuus erittäin supistuvien solujen strooman, mukaan lukien fibroblastit ja myofibroblastien. Myofibroblasteja on osoitettu erottamaan normaalista kudoksesta fibroblasteista, ja niiden tuotanto ja remontin ECM parantaa leviämisen ja levittämisen kasvaimen soluihin [19], [20]. Kertyminen strooman myofibroblasteja ovat määrittävä piirre desmoplasia yleisimmin liittyy invasiivisia rinta-, mahasuolikanavaa, keuhkot, haima, ja levyepiteelikarsinoomien muutamia [9]. Sen lisäksi, että korkea tyypin I kollageenin tuotantoa, myofibroblasteja yksilöidään ilmaus alfa-sileän lihaksen aktiini [7], [9], [21], [22]. Alfa-sileän lihaksen aktiini kumppaniaan kuin lihaksen myosiinin muodostaen erittäin supistuvien microfilamentous yksiköt päättyy pinnalla myofibroblastin on fibronexus [23]. Nämä ovat tunnusomaisia ​​piirteitä myofibroblasteja ja muodostavat menettelyn ulkopuolelle transduktiojärjestelmää joka toimii nurinpäin ja ulkopuolella-voimansiirtokosketuksessa [23] – [25]. Remodeling ECM sisällä strooman myofibroblasteja tuottaa mekaanisen ärsykkeen koska ne hinaaja ja vedä kuidut [26]. Tämä johtaa meidät kysymykseen me käsittelemme tässä tutkimuksessa. Voisi soveltaa mekaaniset voimat syntyvät remodeling ECM ja vetämällä ECM stroomasolut edistää invasiivisia ominaisuuksia kasvainsolun? He voivat tarjota ”tule tänne” ärsyke, joka rohkaisee kasvainsolut jättää kasvain?

Kirjoittajat raportoivat, että mekaaninen ärsyke vetämällä ja vapauttamalla levitetään kollageenimatriisissa

in vitro

tekee todellakin parantaa hyökkäys syöpäsolujen fibronektiiniä riippuvaisella tavalla. Tämä kyky vaikuttaa olevan ainutlaatuinen syöpäsoluja, joiden tiedetään olevan erittäin invasiivinen, kuten huonosti invasiivisia ja normaalit solut eivät reagoi samalla tavalla tämän ärsyke. Lopuksi, käyttäen geenien havaitsimme cofilin, normaali osa invadopodia, tarvitaan aistia tämä mekaaninen signaali parantaa hyökkäystä. Tämä tutkimus viittaa siihen, että fyysiset tekijät, kuin sääntöjen noudattamista, on mukana edistämässä nykyisten invasiivisen käyttäytymisen syöpäsoluissa ja että mekaaniset signaalit, jotka lähetetään liikuntaa solujen sisällä strooman saattaa voimistaa syövän etenemisessä.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

HT1080 ihmisen fibrosarkoomasoluissa, B16F10 hiiren melanoomasoluja ja hiiren alkion fibroblasteja (MEF) soluja käytetään tässä tutkimuksessa, hankittiin ATCC ja viljellään ja ylläpidetään Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine – high glukoosia (Sigma) ja 10% FBS: ää (Hyclone). Solut johdetaan trypsinoimalla käyttämällä 0,25% trypsiini-EDTA: a, reaktio lopetetaan täysin media. Kulku määrä mitä tahansa solutyyppiä koskaan ylitä kahdeksaa kohtia.

Invasion Matriisit

Voit luoda kulttuuria hyvin paksu (1 mm) matriiseja, aktivoitu peitelasi [27] kiinnitettiin tyhjiö rasvalla pohjaan viljelymaljalle (Nunclon), johon 20 mm: n reikä oli porattu.

matriisi koostuu 2,5 mg /ml (tai 4,5 mg /ml, kuvio S2) tyyppi I kollageenin (PureColl ja Nutragen, Advanced Biomatrix), 20 ug /ml fibronektiiniä (Sigma) ja 4 ui 1-2 um karboksyloitujen paramagneettisia helmiä (Polysciences Inc.). PH seos säädettiin 7,4 ± 0,2 0,1 N NaOH: lla ja 10X PBS: llä. Sillä ”Kollageeni vain” substraatit, kaikki paitsi fibronektiini lisätään matriisiin sekoitetaan. Kaikki komponentit olivat jäähdytetty ja sekoitettiin 4 ° C: ssa. 500 ui matriisin lisättiin jäähdytettyyn kulttuurin hyvin, ja 25 mm: n peitelasi tiputettiin geelin seoksen litteän pinnan aikaansaamiseksi. Polymerointiin, matriisi liuos pantiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Seuraavat polymerointi, 3 ml median lisättiin alustoissa ja ylhäältä peitelevy oli poistettu. Substraatit steriloidaan kulttuurissa huppu ultraviolettivalossa 15 minuuttia etäisyydellä 25 tuumaa valonlähteeseen.

invaasiomääritys

Solut ympättiin 1,5 x 10

4 solua /ml päälle steriloitu matriisi ja annettiin kiinnittyä 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa /5% CO

2. Kutakin koetta varten, yksi kylvetään matriisi inkuboitiin 37 ° C: ssa /5% CO

2 1,5 cm harvinaisten maametallien magneetti 12100 Gauss (25 mm halkaisijaltaan, ja 5,5 mm paksu). Toinen kylvetään matriisi inkuboitiin ulkopuolella magneettikenttä. Magneetti pyöritettiin alle kulttuuri 160 rpm (2,6 Hz) kiertoradan alalla 2 cm kiertoravistimella (Barnstead Thermolyne, Roto Mix-Type 50800). Tämä kierto taajuuden pidettiin sama kaikissa kuvatuissa määrityksissä. Invaasio määritys suoritettiin myös magneetti pyöritetään alemmilla taajuuksilla (8 ja 90 rpm (0,13 ja 1,5 Hz)), kuten. Soluvasteen kirjattiin 25 satunnaisesti valittua mikroskooppikenttää 24 tuntia käyttäen 10X vaihe tavoitteen Olympus IX81 mikroskooppi. Solulaskennat kirjattiin kahdeksan välein 100 nm /askel sisällä z-tason matriisin. Prosenttiosuus invaasio laskettiin prosenttia hyökkäsi solujen verrattuna solujen kokonaismäärään. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen kaksisuuntainen opiskelijoiden t-testiä.

peptidi-inhibiittorin Kokeet suoritettiin kuten edellä; 1,5 x 10

4 solua /ml ympättiin substraattien sen jälkeen 100 ug /ml GRGDS peptidin tai GRGES (kontrolli) peptidi (Bachem Americas Inc.) suspendoitiin veteen. Prosentuaalinen invaasio laskettiin 24 tuntia aloittamisen jälkeen stimulaation.

Ylöspäin Invasion Pitoisuus

Culture kuoppiin ilman, että substraatit valmistettiin kuten edellä on kuvattu. Kuitenkin solut ensin siirrostettiin suoraan lasipeitinlevyn päällystetty ohuella tyypin I kollageenin (200 ug /ml) ja fibronektiinin (62,5 ug /ml), ennen kuin overlay matriisin. Solujen annettiin kiinnittyä yön yli mediassa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Väliaine poistettiin ja solut peitetään polymeroimaton kollageeni /fibronektiini matriisi, kuten edellä on kuvattu. Media korvattiin seuraavalla polymerointia. Kutakin koetta, yksi kylvetään Tasoja matriisi viljeltiin 1,5 cm alle harvinaisten maametallien magneetti 12100 Gauss (25 mm halkaisijaltaan ja 5,5 mm paksu) ja toinen pidettiin ulkopuolella magneettikenttä. Magneetti pyöritettiin yläpuolella kulttuuri pidettiin kantaa saatettu kiertoravistimella (Barnstead Thermolyne, Roto Mix-tyyppi 50800) ja pyöritettiin 160 rpm (2,6 Hz) kiertoradan alalla 2 cm. Prosenttia invaasion ja tilastollinen analyysi tehtiin edellä kuvatulla tavalla.

Actin depolymerointi

HT1080-solut ympättiin kollageeni /fibronektiini substraatteja. Sen jälkeen, kun solut olivat tarttuneet ja levittää alustoille, 2 uM sytokalasiini B (Sigma) suspendoitiin DMSO: ssa tai vastaava määrä DMSO: ta lisättiin erillisiin levyille. Sitten ne käytettiin suoraan invaasiomääritys.

Cofilin Knockdown

CFL1 siGENOME SMARTpool ja Off-kohde siRNA (Dharmacon RNAi Technology, Thermo Scientific) käytettiin vaientaa ilmaus Cofilin ja kontrolleina vastaavasti. RNA: t viedään soluihin nucleofection käyttäen Amaxa Nucleofector II ja ratkaisuja Kit T. Proteiinit uutettiin western analyysi vaiennetaan ja ohjaus HT1080-soluihin käyttäen kolmen pesuainetta lyysipuskuria (100 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 0,5% natrium- deoksikolaattia, 0,2% SDS, 2% Nonidet P 40), joka sisältää proteaasi-inhibiittori Cocktail (Sigma) 24, 48 tunnin ja 72 tunnin kuluttua nucleofection vahvistaa pudotus. Anti-cofilin monoklonaalinen vasta-aine, ab54532 (Abcam) ja anti-hiiri-HRP-leimattu vasta-aine (Amersham) käytettiin koetin western blotit ja havaitaan ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (Amersham).

Invasion Assay käyttäminen Cofilin siRNA ja Sytokalasiini B käsitelty HT1080 Cells

Invasion analyysi suoritettiin käyttäen Ohjaus siRNA ja Cofilin siRNA käsiteltiin HT1080 soluja. Koska cofilin pudotus on tehokas 48 tunnin kuluttua nucleofection, käsitellyt solut ympättiin alustoille 48 tunnin kohdalla. Sen jälkeen, kun solut olivat tarttuneet, yksi kylvetään matriisi kullekin olosuhteet asetettiin yläpuolelle magneetti pyörivät nopeudella 160 rpm (2,6 Hz), kun taas toinen on sijoitettu ulkopuolelle magneettikentän. Määritys suoritettiin myös käyttämällä Sytokalasiini B tai DMSO käsiteltyihin soluihin. Kussakin tapauksessa yksi kylvetään matriisi annettiin magneettinen stimulointi 160 rpm (2,6 Hz), kun taas toinen matriisi on sijoitettu ulkopuolelle magneettikentän. Soluvasteen kunkin neljän olosuhteissa mitattiin 24 ja 48 tunnin kuluttua alusta stimulaation. Prosenttiosuus invaasio laskettiin ja tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen kaksisuuntaista opiskelija T-testiä.

Western Blot of fibronektiinin eritys HT1080 Cells

1,5 × 10

4 solua /ml HT1080 soluja kasvatettiin seerumittomassa DMEM-alustassa, ja ympättiin kollageenilla ainoastaan ​​matriisit, jotka on valmistettu kuten edellä on kuvattu, ja tavallinen invaasiomääritys suoritettiin. 24 tunnin kuluttua stimulaatio, viljelmät raaputettiin mikrofugiputkeen sisälsi 2 mg /ml kollagenaasi tyyppi 4 (Worthington Biochemical Corporation) Hanks Balanced Salt Solution (Gibco, Invitrogen). Kollageenimatriksin liuotettiin 10 minuuttia ravistamalla putki 37 ° C: ssa ja solut pelletoitiin sentrifugoimalla 2000 rpm: ssä 5 min ajan, supernatantti käytettiin analyysiin. Solu otteita HT1080 soluja ja MEF-solut viljellään 100 mm polystyreenikalvon viljelymaljoilla 80%: n konfluenssiin 48 tunnin aikana valmistettiin myös. Solun hajoamista ja proteiinin uutto suoritettiin, kuten on kuvattu edellä. Vakio SDS-PAGE suoritettiin käyttäen 30 ug kokonais-proteiinin MEF ja HT1080 solu-uutteiden ja 35 ui kollagenaasin jousitus. Western blotit valmistettiin ja tutkittiin hiiren monoklonaalisen [IST-9] fibronektiiniin (1:300), ab6328 (Abcam) 5% maitoa TBS: ssä, jota seuraa HRP vuohen anti-hiiri-Ig: tä (BD Pharmingen) sekundaarisella vasta-aineella (1: 1000) ja tunnistetaan yllä.

tulokset

rakennesuunnittelu Mechanical invaasiomääritys

tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, onko sovellettu mekaanista stimulaatiota, kuten simuloimalla uudelleen mallintaminen soluväliaineen, voisi lisätä prosessi hyökkäystä. Kääntymään hypoteesin, suunnittelimme uuden määritysjärjestelmä, jossa mekaaninen stimulaatio voitaisiin soveltaa ilman erittyvän biokemiallisten tekijöiden. Tarkoituksenamme oli luoda määrityksen, jota käytetään kaupallisesti saatavilla komponentteja, vaaditaan vakiovarusteena, edellyttäen valvonta biokemiallisten ja mekaanisten parametrien, kaikki puitteet joka oli optisesti yhteensopiva tavallisen fluoresenssimikroskoopilla. Päätimme käyttää tyypin I kollageenin matriisin yleisesti käytetty invaasio määrityksissä päättelyn että strooman on hyvin rikastettu tässä soluväliaineen proteiinia. Karboksyloitu fluoresoiva paramagneettinen mikro-helmiä matriisiin upotettu antaa mekaanista stimulaatiota. Tuottaa ohimenevä magneettisen vetovoiman, ilman tarvetta mikronin koko sähkömagneetti, me pyöritetään harvinaisten maametallien magneetti pyörivässä sekoittimessa alapuolella kulttuuri viljely taas keskeytettiin yläpuolelle magneetin (kuvio 1A). Koko kulttuuri järjestelmä voidaan ylläpitää vakio kudosviljelyinkubaattorissa (kuvio 1 B, C).

A) Hyvin on luotu 60 mm viljelyastia ja täytetty tyypin I kollageenin /fibronektiinin matriisi, joka sisältää 2 um paramagneettisia helmiä. Solut ympätään pinnalle matriisin ja joko viljeltiin ulkopuolella magneettikentän tai viljellyistä 1,5 cm pyörivä harvinaisten maametallien magneetti. Stimuloituessaan, solujen hyökätä matriisi. B) 60 mm levy, jossa on 20 mm: n reikä porattiin sen, aktivoidun peitelasi liimattu pohjaan, luo hyvin matriisin. C) Viljelmä suspendoitiin 1,5 cm harvinaisten maametallien magneetti asetetaan kiertoravistimella tyypillisessä soluviljelmässä inkubaattorissa. Katso menetelmät yksityiskohdat osasta.

Jos haluat varmistaa, että magneetti kykeni tuottamaan tarpeeksi magneettinen voima ja että upotettu helmiä vastasi voima ohimenevää tavalla, käytimme magnometer mittaamaan magneettinen voima määritellään kokeellinen etäisyyksillä. Havaitsimme magneettinen helmi kiinteässä pisteessä keskellä kulttuurin, voitaisiin kohdistaa erilaisia ​​500-80 Gauss koska harvinaisten maametallien magneetti pyörii 1,5 cm alle viljelymaljalle samalla täydentämään kiertoradalla 2 cm 160 rpm (2,6 Hz) (kuvio 2A). Simulointi näillä etäisyyksillä mikroskoopilla johti helmi siirtymät noin 0,5-5 um (kuvio 2B, Movie S1, elokuva S2). Helmet havaittiin ponnahtaa takaisin alkuperäiseen asentoonsa x-y-tasossa, kun magneetti poistettiin, osoittaa niiden kiinnitystä kollageenimatriksiin ja eheyden säilymisen geelin verkkoon. Voit selvittää fysiologista merkitystä tämän siirtymän, totesimme voisimme määrän laskemiseksi voima, joka levitettiin helmen magneetin kuitenkin konkreettisempaa testi olisi tarkkailla MEF-solut ulos vetämisen ja sisään laajennukset meidän hallinnassa kulttuurin järjestelmä. Me tallennettu helmi siirtymät x-y-tasossa solu- laajennukset MEF-soluja, jotka vaihtelevat 0,08-5,1 um (kuvio 2C, elokuva S3). Tämä on varovainen verrattuna tyyppisiä siirtymät, joita voi esiintyä stroomaan koska useimmat supistuvien solutyypistä löytyy siellä, myofibroblasteja, tuottavat huomattavasti enemmän voimaa kuin MEF [28], [29].

A) harvinaisten maametallien magneetti sijoitetaan 1,5 cm alle matriisi tuottaa gradienttikentän vaihtelee 500G 80 g matriisiin sen pyöriessä 2 cm: kiertoradalla. Paramagneettinen helmi asemassa X saisi magneettinen voima 500G, ~300G ja ~200G kun magneetti on kiertoradalla asemissa P1, P2 ja P3 vastaavasti. B) Sarjan neljä kuvaa kuvaa siirtymä helmien magneetin kun pidetään paikallaan tehtävissä kiertoradalla. Klustereita helmiä vastata mekaanisiin ärsykkeisiin ja osoittaa asennon muutos on rajatut käyttäen ympyrä, neliö ja nuoli. Vasemmalta oikealle, kuva yksi on ulkopuolella magneettikenttä kun taas toinen ja kolmas kuvat otettiin magneetti pidettiin asemissa P1 ja P2 vastaavasti. Lopullinen kuva osoittaa helmiä palaavat alkuperäiseen asentoon sen jälkeen, kun magneetti on poistettu. C) MEF cellular laajennuksia aiheuttaa loisteputki helmi siirtymä. Neljä kuvaa (0, 15, 30 ja 60 minuuttia) yhdestä polttotaso valittiin sarja 30 vaiheen otettujen kuvien 2 minuutin välein on MEF solun sisällä kollageeni /fibronektiini matriisi. Cell ääriviivat ja vastaava loisteputki helmi kuvia näytetään. Lisätään helmi läpikäymässä siirtymä on hahmoteltu käyttäen valkoinen suorakulmainen laatikko. Alueella laatikon sisällä kaikista neljästä kuvat on laajentunut ja näytetään upotettavat hallitsija näyttää helmi siirtymä selvemmin. Kontrasti suurennetun kuvat on muutettu vastaamaan paremmin asemaa helmi kussakin tapauksessa. Mag. Bar = 10 pm.

Mekaaninen stimulaatio Parantaa Invasion syöpäsolujen

Invasiivisen rakenteita on kuvattu aikaisemmin sekä luonnostaan ​​normaalissa invasiivisia soluissa ja ne, jotka ovat saaneet invasiivisen kapasiteettiaan syövän etenemisessä [30]. Me perusteltu, että on epätodennäköistä, että mekaaninen stimulaatio, aiheuttaa aikaisemmin ei-invasiivisia solutyyppiä hyökätä ja siten testasimme solujen tiedetään olevan erittäin invasiivisia meidän koejärjestelmässä. Päätimme testata ihmisen fibrosarkoomasolulinjoilla HT1080 ja hiiren melanoomasolulinja B16F10, kun taas ei-invasiivisia MEF solulinja toimi kontrollina.

Nämä solutyyppejä testattiin erikseen niiden kykyä vastata mekaanisen stimulaatio edellyttäen määrityksessä. Lyhyesti, solut ympättiin valmistettiin matriiseja, kuten on kuvattu menetelmiä, ja annettiin tarttua 30 minuuttia ennen aloittamista stimulaatiota. Soluja viljeltiin matriiseilla koostumus identtinen, mutta ei kohdistu magneettinen stimulointi, toimivat kontrolleina. Soluja viljeltiin matriiseilla puuttuu magneettisia helmiä, mutta jota koskevat magneettinen stimulointi toimi ylimääräisiä tarkastuksia. Invasion havaittiin mikroskoopilla, joka alkaa 5 um pinnasta syvyyteen 800 um matriisin (kuvio 3A). Määrä tunkeutuvat ja ei-tunkeutuvat solut laskettiin 24 tunnin kuluttua stimuloinnin ja lasketaan prosentuaalinen hyökkäyksen.

A) HT1080 fibrosarkooma-solut ympättiin tyypin I kollageenin /fibronektiini sisältävät matriisit paramagneettiset helmet ja viljeltiin joko magneettinen stimulointi tai ilman stimulaatiota. Yhdistetty vaihe ja fluoresoiva kuva mekaanisesti kannustanut kulttuuri asetettiin päällekkäin. Kiinteä nuoli soluun, joka on tunkeutunut. Katkonuolen osoittaa toisen solun sisällä toinen polttotasoilmiöksi. Tyhjät Nuoli osoittaa fluoresoivaan paramagneettinen helmi. Mag. Bar = 50 pm. B) Invasion HT1080 soluja mekaanisesti stimuloidaan ja ei-stimuloiduissa olosuhteissa suoritettiin matriiseja, jotka sisältävät joko tyypin I kollageenin (2,5 mg /ml) tai sekä tyypin I kollageenin ja fibronektiinin, tai kollageeni /fibronektiiniin läsnä ollessa tai ilman RGD-peptidin. 25 aloilla solut laskettiin 24 tuntia ymppäyksen jälkeen useissa eri syvyyksissä kussakin matriisissa, joka alkaa 5 pm pinnan alla matriisin ja etenee kohti kauimpana syvyys 800 um. Prosentuaalinen hyökkäävän solujen oli 2-kertainen stimuloiduissa kulttuureissa verrattuna kontrolleihin (

P

0,05) matriisit sisältävät sekä ECM proteiineja. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun kontrolli-peptidiä GRGES lisättiin media. Prosentuaalinen hyökkäys oli suunnilleen sama tai ilman stimulaatiota kun fibronektiinin oli poissa. Lisääminen GRGDS peptidin johti myös estoon tehostetun hyökkäyksen yhteydessä mekaanista stimulaatiota. C) 20-kertainen ero taajuus stimulaatio ei vaikuta prosenttia soluinvaasiota. Prosentuaalinen hyökkäävän solut 24 tunnin kuluttua stimulaatiota magneettinen kierrosluvuilla 8, 90 ja 160 rpm (0,13, 1,5 ja 2,6 Hz). Merkityksetön ero välillä havaittiin stimuloitujen solujen 8 ja 160 rpm (

P

0,05). Data edustaa kolmen erillisen kokeen, 25 aloilla. D) Tyyppi I kollageenin /fibronektiini sisältävät matriisit paramagnetc helmiä esi-stimuloitiin 24 tunnin ajan. Nämä matriisit ympätään sitten HT1080-solujen ja lasketaan 24 tuntia ymppäyksen jälkeen, jona aikana sekä pre-stimuloitu ja ohjaus- levyjä ei stimuloitu (vasen paneeli). Näitä viljelmiä sitten joko jatketaan tai asetetaan magneetin (oikea paneeli), tiedot on saatu 24 tunnin stimulaation jälkeen. Data edustaa kahden riippumattoman määrityksissä 15 aloilla solujen syvyys alueella 800 um. Kaksisuuntainen analyysi käyttäen opiskelija T-testiä.

Alussa ympätty solumme päälle matriisit käsittävät vain tyypin I kollageenin. Stimuloituessaan emme noudata parannettu invaasiota (vaihtelee 5 ja 10% hyökkäyksen stimuloi ja ei-stimuloiduissa viljelmissä). Kuitenkin, ei vain on tyypin I kollageenia runsaasti strooman, mutta kollageeni sitova ECM fibronektiini on myös rikastunut [7], [31]. Niinpä kun matriisit koostuvat kollageenin yksin kuin sekä kollageenin ja fibronektiinin kanssa ja ilman stimulaatiota. Näissä olosuhteissa emme havaittiin merkittävä ero määrä tunkeutumaan solujen mekaanisesti stimuloitiin jakeissa ei-stimuloitujen kulttuurin ympäristöjä invasiivisen solutyypeissä, kun kollageeni /fibronektiini matriiseja on käytetty (kuvio 3B). Kahden-kertainen nousu prosenttiosuus tunkeutumaan solujen stimuloidun (23%) verrattuna ei-stimuloitu matriisin (10%) havaittiin yhdenmukaisesti Näiden viljelmien (P 0,05). Nämä tulokset osoittivat, että sovelletaan ärsyke oli omiaan parantamaan hyökkäystä syöpäsoluja, mutta tarvitaan läsnä fibronektiinin mekaanisen vasteen. Lisäksi olemme havainneet, että ei-invasiivisen MEF-solut eivät hyökätä sekä läsnä ollessa tai ilman mekaanista stimulaatiota osaksi kollageeni /fibronektiini matriiseja, mikä viittaa siihen, että tarvitaan solu on ennalta määritelty kyky hyökkäystä.

vahvista tärkeyden fibronektiinin mekaanisen vasteen me esti solun fibronektiinin vuorovaikutusta RGD estävä peptidejä. Soluja käsiteltiin GRGDS peptidin tai ohjaus GRGES peptidi jälkeen ymppäämällä päälle kollageeni /fibronektiini matriiseja. Prosentuaalinen hyökkäys oli normaali, kun läsnä on ohjaus- GRGES peptidiä (28%: n stimulaation ja 13% ilman stimulaatiota), kun taas mekaanisesti stimuloitu hyökkäystä estyi RGD-peptidi (9%: n stimulaatio ja 11,5% ilman stimulaatiota, P 0,05). Nämä tulokset eivät vain tukea sitä, että fibronektiini on välttämätön mekaanisesti stimuloidun hyökkäystä, mutta ehdottaa ”pohjapinta” taso ~ 10% invaasio havaittiin kollageeni /fibronektiini (ei-stimuloitu) ja kollageenin (stimuloi ja ei-stimuloiduissa) viljelmät on fibronektiinin itsenäinen. Lisäksi, nämä tulokset viittaavat siihen, että mikä tahansa fibronektiinin erittävät HT1080-solut matriiseihin (vaikka ei havaita Western blot, kuvio S1) on vain vähän vaikutusta mekaanisen vasteen.

Koska heterogeenisuus solutyyppien ja solujen numeroita strooman oli epäselvää millä taajuudella ärsyke olisi sovellettava. Sen määrittämiseksi, onko taajuus helmi stimulaatio oli tekijä parannettu invaasio, me säätää nopeuden pyörivän magneetin, joka pyöri nopeudella 8, 90 ja 160 rpm tai 0,13, 1,5, ja 2,6 Hz, vastaavasti. Prosenttia invaasion eivät eronneet merkittävästi toisistaan ​​viljelmiä stimuloidaan 8 ja 160rpm (

P

0,05, kuvio 3C). Nämä tulokset osoittivat, että vain 20-kertainen taajuusalue, tehostetun invaasio vastauksena mekaaninen stimulaatio on ennallaan.

Invasiivisen solut kohtaavat fyysisiä esteitä sidekudoksen tai kasvain strooman ja todennäköisesti polkua pienimmän vastuksen [32]. Lisäksi, ne ovat todennäköisesti hyökätä polkuja pitkin, jossa matriisi liittyy liukoisen tekijät on julkaistu [19], [33] – [36]. Tämän tiedon perusteella, oli tärkeää varmistaa, että kumpikaan näistä tekijät vaikuttivat tehostetun hyökkäyksen havaittu meidän määrityksessä.

Yksi tapa, jolla matriisi voisi tuottaa polkuja pienimmän vastuksen soluinvaasiota olisi läpi pysyvä remodeling luotu liikkeen upotettu helmien. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, me pre-stimuloidun matriisien yli pyörivän magneetin 24 tuntia ennen solujen ymppäämisen. 24 tunnin kuluttua viljelyn pre stimuloimaa matriiseja, mutta ulkopuolella magneettikentän, emme tarkkailla parannettu invaasiota (kuvio 3D, vasen paneeli). Lisäksi, media pre-stimuloitu matriisi ei muuttunut ennen ymppäämällä solut. Tämä poistaa mahdollisuudet, että liukoinen tekijät matriisissa olivat vapautuu nykäisevän ja helmiä matriisin ja edistää tehostetun hyökkäystä. Kuitenkin, kun nämä samat soluviljelmiä kasvatetaan ennalta stimuloitu matriisin annettiin sen jälkeen magneettinen stimulointi, parannettu invaasio havaittiin jälleen (kuvio 3D, oikea paneeli). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että remontin tai vapautuminen liukoisen tekijät matriisista johtuen liikkeestä magneettisten helmien ei edistä tehostetun hyökkäyksen vietämme kun mekaaninen stimulaatio.

The Invasion Response on tehostettu, onko Stimulus on toimitettu ylhäältä tai alhaalta

dimensionaalisuus ympäristön tiedetään vaikuttavan solujen käyttäytymiseen. Erityisesti HT1080-solujen on osoitettu muuttamaan siirtonopeutta ja pysyvyys kolmiulotteisesti [37]. Meidän Alkukokeissa, solut ympätään päälle matriisin, tunkeutuvat ylhäältä alaspäin, mikä aloitti kaksiulotteisesti ja liikkuvat kolmeen. Vastatakseen vaikutuksen dimensionality mekaanisiin invaasio muutimme suunta ärsyke, jotta solut hyökkäävät ylöspäin. Voit tehdä tämän, ensin kylvetään solujen päälle kollageeni /fibronektiini-pinnoitettu peitelaseja ennen päällekkäin ja polymeroimalla kollageeni /fibronektiini /magneettihelmi ratkaisu päälle (kuvio 4A). Magneettikenttä levitettiin sitten päälle viljelmän kiertämällä magneetin yläpuolella stationääriviljelmässä (kuvio 4B). 24 tunnin stimulaation, löysimme solut tunkeutuu aivan samoin kuin he tekivät, kun he ympättiin päälle matriisit ennen stimulaatiota (6% hyökkäys ei-stimuloiduissa ja 13% stimuloiduissa viljelmissä) (kuvio 4B). Kuitenkin löysimme 48 tunnin erotus ei-stimuloitua hyökkäyksen ja kannustanut hyökkäys oli vielä suurempi niin, että 12% soluista tunkeutuu ei-stimuloiduissa versus 41% hyökkäyksen stimuloitua kulttuureissa. Siten vielä suurempi parannus invaasion tapahtuu vastauksena sovellettu mekaanista stimulaatiota kun solut alkoivat kolmiulotteisessa ympäristössä.

A) HT1080 fibrosarkoomasoluissa ympättiin kollageeni /fibronektiini päällystetty peitelevyllä alareunassa kaivon. Sen jälkeen, kun solut olivat tarttuneet, tyypin I kollageeni /fibronektiini, joka sisälsi paramagneettiset mikrohelmien päällystettiin päälle soluihin ja annetaan polymeroitua. Viljelmät joko altistettiin magneettinen stimulointi tai kasvaneet ulkopuolella magneettikenttä. B) Magneetti pyöritetään yllä viljelmän solut alkavat hyökätä ylös matriisiin. C) HT1080-solut ympättiin kollageeni-fibronektiinin päällystetyn peitelasi ja peitettiin kollageeni /fibronektiini matriisi viljeltiin joko läsnä ollessa tai ilman magneettikenttää. Prosentuaalinen invaasio laskettiin 24 ja 48 tunnin stimulaation jälkeen kolmesta itsenäisestä tutkimuksista (15 kentät laskettiin viljelmää kohti).