Krooninen sairaus

tiivistelmä

retinoideja, luonnollisia tai synteettisiä johdannaisia ​​A-vitamiini (retinoli), ovat välttämättömiä normaalissa kehittäminen eturauhasen ja on osoitettu moduloivan eturauhassyövän etenemiseen in vivo sekä moduloimiseksi kasvun useita eturauhassyövän solulinjoissa. 9-cis-retinoiinihapon ja all-trans-retinoiinihappo ovat kaksi tärkeintä metaboliittia retinolin. Aukkoliitokset, muodostuu kutsuttujen proteiinien konneksiinit, ovat kokonaisuuksista solujen väliset kanavat voidaan vaihtaa pienen kasvun säätelymolekyyleja vierekkäisten solujen. Gap junktionaalinen viestintä on keskeisessä asemassa valvonnassa solujen kasvua. Olemme tutkineet vaikutus 9-cis-retinoiinihapon ja all-trans retinoiinihappo muodostumista ja hajoamista aukkoliitokset sekä junktionaalinen viestintää androgeeni-reagoiva eturauhassyöpäsolulinja, LNCaP, joka ilmaisi retroviraalisesti käyttöön connexin32, eli konneksiini ilmaisemat onteloerityssolut ja hyvin erilaistuneita soluja eturauhasen kasvaimia. Tuloksemme osoittivat, että 9-cis-retinoiinihapon ja all-trans retinoiinihappo tehostetun kokoamisen connexin32 rakoon liittymissä. Tuloksemme osoittivat lisäksi, että 9-cis-retinoiinihapon ja all-trans-retinoiinihappo esti androgeenisäädellyn hajoamista aukkoliitokset, posttranslationaalisesti, riippumaton androgeenireseptorin välittämän signaloinnin. Lopuksi, meidän havainnot osoittivat, että muodostuu aukkoliitokset herkistynyt connexin32 ilmentävien LNCaP-solujen kasvua muuttamalla vaikutuksia 9-cis-retinoiinihappo, kaikki-trans-retinoiinihappo ja androgeenit. Siten vaikutukset retinoidien ja androgeenien kasvuun ja muodostumiseen ja hajoamiseen aukkoliitokset ja niiden toiminta saattaa liittyä niiden kykyyn moduloida eturauhasen kasvua ja syöpä.

Citation: Kelsey L, Katoch P, Johnson KE , Batra SK, Mehta PP (2012) retinoidien Säännellä muodostaminen ja hajoaminen aukkoliitokset androgeenistä reagoiva ihmisen syöpäsolujen. PLoS ONE 7 (4): e32846. doi: 10,1371 /journal.pone.0032846

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 lokakuu 2011; Hyväksytty: 31 tammikuu 2012; Julkaistu: 13 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Kelsey et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat NIH CA113903, DOD PCRP (Department of Defense Eturauhassyöpä Research Program) 081198, ja Nebraska State Grant LB506 (PPM). Kiitämme tukea Nebraska Center for solusignaloinnis- ja NCI koulutusta apurahan Kristen Johnson. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

retinoidien, luonnollisia tai synteettisiä johdannaisia ​​vitamiinin, säädellä paitsi alkion kehitystä vaan myös organogeneesin aikuisen kudoksissa [1]. Edellytyksenä vitamiinin proliferaatioon, erilaistumiseen on osoitettu monissa tutkimuksissa, joissa puute tämän vitamiinin johti useisiin kehityshäiriöitä vikoja [1] – [3]. Kaikki trans-retinoiinihappo (ATRA) ja 9-cis-retinoiinihappo (9-CRA) ovat kaksi tärkeintä metaboliittia vitamiinin (retinoli) ja erilaisiin fysiologisiin toimintoihin [1]. Retinoidit ovat jäseniä ydin–superperheen transkriptiotekijöiden ja saavat aikaan dalmatialaistäpläisiä säätelemällä ilmentyminen useiden kohdegeenien [3] – [5]. On kuusi Retinoidireseptorit eli RAR α, β, γ, jotka sitoutuvat ATRA ja 9-CRA, ja RXR α, β, γ, jotka sitoutuvat vain 9-CRA. Retinoid aloitti signalointi säätelee useiden homeostaattisina valvontamekanismit alkionkehityksen aikana ja aikuisen kudoksissa ja yksi tällainen valvontajärjestelmä todennäköisesti säänneltävä on suora solu-solu viestintä välittyy erikoisluokan on soluliitos kutsutaan aukkoliitokset (gjs) [6] – [ ,,,0],8]. Aukkoliitokset ovat kokonaisuuksista solujen väliset kanavat signaalin sallimalla suora vaihto pienten molekyylien (≤1500 Da) välissä vierekkäisiä soluja. Perustava proteiinit gjs, nimeltään konneksiinit (CXS), koodataan 21 geenejä, jotka on nimetty niiden molekyylimassan [9]. Solu-solu-kanavat ovat bicellular muodostamat rakenteet yhteistyönä kaksi solua. Muodostetaan GJ solu-solu-kanava, CXS ensimmäinen oligomeroitavan kuin heksameereja, nimeltään connexons, jotka telakka kanssa connexons näytetään vierekkäisiä soluja, [10]. Monirivisille todisteita antavat aihetta uskoa, että ajatus, että kuilu junktionaalinen viestintä on tärkeä homeostaattinen ohjaus säätelevä mekanismi solujen kasvuun ja erilaistumiseen. Esimerkiksi heikentynyt Cx ilme, tai toimintakyvyn menetystä, on patogeneesiin useita erilaisia ​​syöpiä, ja mutaatiot useissa Cx geenit on havaittu geneettisiä sairauksia ominaista poikkeava solujen lisääntyminen ja erilaistuminen [8], [10] – [12]

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että eturauhasen onteloerityssolut ilmaisi Cx32 ja sen ilme samaan aikaan hankkimalla eriytetyn tilan näiden solujen [13], [14]. Osoitimme, että etenemistä eturauhassyövän (PCA) peräisin androgeeniriippuvainen valtion invasiivisen, androgeeni-riippumaton valtion leimasi epäonnistuminen Cx32 koota osaksi gjs [14], [15]. Olemme lisäksi osoittaneet, että uudelleen Cx32 osaksi androgen reagoiva ihmisen PCA solulinjassa, LNCaP, hidastaa solujen kasvuun

in vivo

ja

in vitro

[14], [16]. Myöhemmin osoitimme, että androgeenien säännellään muodostumista ja hajoamista gjs muuttamalla ilmentymistason Cx32, translaation jälkeen. Koska androgeenien, suuri osa Cx32 oli hajoavan Endoplasmakalvosto liittyvät hajoamista (ERAD), kun taas niiden läsnäolo tässä jae pelastettiin hajoaminen [17]. Merkitys Näiden havaintojen alleviivaa se, että androgeenien on tärkeä rooli selviytymisen ja ylläpito sekretorisen (erilaistumisen liittyvä) funktio Ontelonsisäisen epiteelisolujen normaalin eturauhasen samoin kuin syöpäsoluja kuin androgeeniablaatio indusoi apoptoosia tai erilaistamattomuuden näiden solujen [18], [19]

kuten androgeenit, retinoidien ovat myös välttämättömiä normaalia kehitystä eturauhasen ja moduloida PCA etenemistä tietyillä hiiren malleissa sekä tukahduttaa kasvua androgeeniriippuvaisen ja – riippumaton ihmisen PCA solulinjoissa. Levyepiteelikarsinooma metaplasiaa eturauhasen havaittiin keskuudessa jälkeläiset vitamiinia puutteesta [20] ja RARy tyrmätä hiirillä [21]. Lisäksi kudosspesifisiä inaktivaatio RARa eturauhasen johti multifokaalinen intraepiteliaalisia liikakasvu [22]. Epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että vähentynyt vitamiinin pitoisuus seerumissa kasvaa PCA ilmaantuvuutta ja etenemistä, ja että palauttaminen retinoidi pitoisuus saattaa olla rooli käänteinen pahanlaatuisten fenotyypin [23], [24]. Useat tutkimukset, myös meidän, ovat osoittaneet, että kyky retinoidien tukahduttaa kasvaimen solujen kasvua ja indusoivat erilaistumista on riippuvainen niiden kykyyn parantaa aukko junktionaalinen viestintä [25] – [28]. Koska Cx32 ilmentävät luminaalisen epiteelisolujen normaalin eturauhasen, jossa se kootaan gjs ja epiteelisolujen eturauhasen kasvaimia, joissa on tehottomasti kootaan gjs [13] – [15] ja siksi muodostumista gjs on liitetty säilyttää polarisoitunut ja eriytetty tilasta epiteelisolujen [29], päättelimme, että chemopreventive, kasvua estävän ja pro-eri vaikutuksia 9-CRA ja ATRA saattaisi aiheuttaa kykynsä hallita muodostumista ja hajoamista gjs. Siksi me tutkimme, muodostumista ja hajoamista gjs koostuu Cx32 säädeltiin 9-CRA ja ATRA ihmisen PCA soluissa. Koska retinoideja on osoitettu lisäävän ilmentymistä androgeenireseptorin (AR) androgeeni-reagoiva ihmisen PCA-solulinjat [30], me rationalisoida, että ne voivat moduloida androgeenisäädellyn muodostuminen ja hajoaminen gjs ja vaikuttaa kasvuun androgen-reagoiva PCA-soluja että ilmaista Cx32. Käyttämällä androgeenin reagoiva LNCaP-soluja, jotka ilmentävät retroviraalisesti käyttöön Cx32, jonka hajoaminen on androgeenisäädellyn [17], osoitamme, että 9-CRA ja ATRA, kuten androgeenit, parantaa ilmentymistä Cx32 ja sen myöhemmän kokoamista gjs. Lisäksi olemme edelleen osoittaa tässä, että tässä soluviljelymalli, ATRA ja 9-CRA estävät androgeenisäädellyn hajoamista gjs riippumatta AR välitteistä signalointia. Lopuksi, meidän tulokset osoittavat, että ilmentyminen Cx32 ja muodostumisen gjs herkistää näiden solujen kasvua muokkaamalla vaikutuksia 9-CRA, ATRA ja androgeenien.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

androgeenisesti vastanneilla LNCaP olivat lahja tri Lin [31]. Yksi useita klooneja LNCaP-soluja, jotka ilmentävät transdusoitiin retroviraalisesti rotan Cx32, jäljempänä LNCaP-32-soluja, ja yksi useista valvonnan kloonit valittiin G418 infektion jälkeen ohjaus retrovirus, jäljempänä LNCaP-N-soluissa, oli eristetty kuten on kuvattu [17], ja niitä käytettiin esillä olevassa tutkimuksessa yhdessä vanhempien LNCaP-solut, jäljempänä LNCaP-P-soluissa. LNCaP-P-soluja kasvatettiin RPMI, joka sisälsi 5% naudan sikiön seerumia atmosfäärissä 5% CO2 /95% ilmaa ja varastossa viljelmiä pidettiin viikoittain kuten aiemmin on kuvattu. LNCaP-N ja LNCaP-32-soluja ylläpidettiin RPMI, joka sisälsi 5% naudan sikiön seerumia ja G418 200 ug /ml, kuten kuvataan [17]. Aikana näistä tutkimuksista, käytimme kaksi erillistä paljon naudan sikiön seerumia saatiin Sigma ja HyClone Laboratories, jossa on lähes sama vaikutus kasvuun LNCaP. Steroidi-köyhdytettyä (hiilellä erotettua) seerumi saatiin Hyclone Laboratories (Salt Lake City, UT). Käytimme myös fenolipunaista RPMI kokeille, joissa hiilellä erotettua seerumia käytettiin [17].

Vasta-aineet ja Immunovärjäys

Hybridoma M12.13 (lahja tri Dan Goodenough, Harvard University) on kuvattu aiemmin [14], [16], [17], [32], [33]. Hiiren anti-occludin (klooni OC-3F10) oli peräisin Zymed Laboratories Inc. (South San Francisco, CA). Kanin anti-α-kateniinin, kanin anti-β-kateniinin, kanin anti-Cx32, ja hiiren anti-β-aktiinin (klooni C-15) olivat yhtiöltä Sigma (St. Louis, MO). Hiiren anti-E-kadheriinin, hiiren anti-α-kateniinin, hiiren anti-β-kateniinin vasta-aineet avokätisesti Drs. Johnson ja Wheelock (Eppley Institute) ja niitä on kuvattu [17], [32], [33]. Kanin polyklonaalinen anti-AR-reseptorin vasta-aine oli Santa Cruz Biotech (sc-13062, San Diego, CA). Solut immunovärjättiin kiinnityksen jälkeen 2% para-formaldehydi 15 minuuttia kuten aiemmin on kuvattu [17], [32], [33]. Lyhyesti, solut (1,5 x 10

5), kylvetään kuusi hyvin sisältävät ryhmät lasipeitelevyihin ja annettiin kasvaa noin 50-70% konfluenssiin, immunovärjättiin huoneenlämpötilassa eri vasta-aineilla on sopivasti kalibroitu laimennuksen. Toissijainen vasta-aineita (kani tai hiiri) konjugoitu Alexa 488 ja Alexa 594 suoritettiin tarvittaessa. Kuvia immuno- soluja hankittiin Leica DMRIE mikroskoopilla (Leica Microsystems, Wetzler, Saksa) varustettu Hamamatsu ORCA-ER CCD-kamera (Hamamatsu-City, Japani). For co-localization tutkimukset, serial z-osat (0,5 um) kerättiin ja analysoitiin käyttäen kuvankäsittelyohjelmisto (Volocity; Improvision, Inc; Perkin Elmer).

Stock Solutions

kantaliuokset eri reagenssien valmistettiin seuraavasti: 9-CRA ja ATRA (BIOMOL, Plymouth, PA) valmistettiin etanolissa 3 mM kutakin ja varastoitiin erinä -80 ° C: ssa valolta suojattuna. Kaikki kokeet liittyvät 9-CRA ja ATRA tehtiin keltaista valoa kuvatulla [26], [27]. Kantaliuoksia synteettisen androgeenin, mibolerone (MB), (BIOMOL), ja luonnollisen androgen, dihydro-testosteroni (DHT), valmistettiin 1 mM: etanoliin ja varastoitiin -20 ° C: ssa pienissä erissä valolta suojassa. Ne laimennetaan tarkoituksenmukaisesti väliaineen aikaan hoidon.

Androgeenien väheneminen ja muut hoidot

Solut ympättiin kuudella hyvin sisältävät ryhmät lasipeitelevyihin (1,5 x 10

5 solua kuoppaa kohti) ja 6 cm: n (2 x 10

5 solua maljaa kohden) tai IN10-cm astiat (3,5 x 10

5 solua maljaa kohti) 2, 4 ja 10 ml täydellistä viljelyalustaa, vastaavasti. Soluja käsiteltiin, kun noin 50% konfluentteja, jonka täydennystä tuoreella alustalla, joka sisälsi eri reagenssit halutussa konsentraatiossa lisättiin kantaliuoksesta siten, että lopullinen konsentraatio liuotin ei ylittänyt 0,3%. Kasvaa soluja androgen-köyhdytettyä väliaineessa, normaalien solujen viljelyalusta korvattiin androgen-köyhdytettyä soluviljelyalustassa (fenolipunaista RPMI, joka sisälsi 5% hiilellä erotettua seerumia). Säätimet sai tuoretta väliainetta, joka sisälsi normaalia seerumia.

Western Blot-analyysi ja Detergent liukoisuus Connexin32

Solulyysis, pesuaine liukenee määrityksessä 1% Triton X-100 (TX-100), ja ilmaisun taso Cx32 analysoitiin Western blot-analyysi edellä kuvatulla [17], [32], [33]. Lyhyesti, 5 x 10

5 LNCaP-P, LNCaP-N ja LNCaP-32-solua siirrostettiin 10 cm: n maljaan 10 ml: aan täydellistä alustaa ja kasvatetaan konfluenssiin, minkä jälkeen solut hajotettiin puskurissa SSK (10 mM Tris , 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10 mM NaF, 10 mM NEM, 10 mM Na

2VO

4, 10 mM jodiasetamidi, 0,5% TX-100, pH 7,4), johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoriseosta (Sigma , St. Louis, MO). Total, pesuaine-liukeneva ja -insoluble uutteet erotettiin ultrasentrifugoimalla 100000 x g 60 min (35000 rpm analyyttisen Beckman -ultrasentrifugissa; Malli 17-65 käyttäen SW50.1 roottori). Pesuaine liukenematon pelletit liuotettiin puskuriin C (70 mM Tris /HCI, pH 6,8, 8 M ureaa, 10 mM NEM, 10 mM jodiasetamidi, 2,5% SDS: ää, ja 0,1 M DTT: tä). Seuraavat normalisointi, joka perustuu solujen määrä, koko, TX-100-liukoiset ja -insoluble fraktiot sekoitettiin 4 x SDS-latauspuskuria lopulliseen pitoisuuteen 1 x ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 h (ja Cx32) ennen SDS- PAGE-analyysi.

viestintä Analyysit

Gap junktionaalinen viestintää analysoitiin microinjecting seuraavat loisteputki merkkiaineiden: Lucifer Yellow (MW 443 Da; litiumsuola); Alexa Fluor 488 (MW 570 Da, A-10436), ja Alexa Fluor 594 (MW 760 Da, A-10438). Kantaliuoksia Alexa väriaineita, saatu hydratsidi natriumsuolat Molecular Probes (Carlsbad, CA), valmistettiin veteen 10 mM. Lucifer keltainen mikroinjektoitiin kuin 2,5%: ista kantaliuosta. Eppendorf InjectMan ja Femtojet mikroinjektio järjestelmät (mallit 5271 ja 5242, Brinkmann Instrument, Inc. Westbury, NY), joka on asennettu Leica DMIRE2 avulla kuten aiemmin on kuvattu, käytettiin microinject fluoresoivia merkkiaineita. Kuvat on mikroinjektoidusta soluja kiinni tuella CCD-kamera (Retiga 2000R, FAST 1394) käyttäen QCapture (British Columbia, Kanada) ja tallennetaan TIFF-tiedostoina. Junktionaalinen siirto fluoresoivan merkkiaineen kvantitoitiin pisteyttämällä lukumäärä fluoresoivien solujen (poislukien pistetään yksi) Otetusta TIFF joko 1 min (Lucifer Yellow), 3 min (Alexa 488) ja 15 min (Alexa 594) jälkeen mikroinjektio testikenno kuvattu [14], [17], [32], [34].

Colony Formation and Cell Growth Analyysit

solun kasvu arvioitiin joko pesäkkeenmuodostuskyvyn määrityksen tai laskemalla solut, kuten on kuvattu [14], [34]. Sillä pesäkkeitä muodostavien määritystä, 2 x 10

3-soluja siirrostettiin 6 cm: n maljoille kolmena kappaleena 3 ml: ssa viljelyalustaa. 24 tunnin kuluttua yksi ml alustaa, joka sisälsi MB, 9-CRA ja ATRA lisättiin ruokia, jolloin saatiin haluttu lopullinen pitoisuus. Soluja kasvatettiin 3-4 viikon ajan (tai keskisuuren vaihtuvat 4-5 päivää sisältää sopivan pitoisuuden MB, DHT, 9-CRA ja ATRA), kun he muodostivat näkyviä pesäkkeitä. Siirtomaat ruokia fiksoitiin 3,7% puskuroitua formaldehydiä, värjättiin 0,025% liuos kristalliviolettia PBS, ja valokuvataan. Mittaamiseen solujen kasvua, 5 x 10

4-soluja siirrostettiin 6 cm: n maljoille replikaatteina ja käsiteltiin MB, 9-CRA ja ATRA joko yksinään tai yhdistelmänä, kuten on kuvattu edellä. Solujen annettiin kasvaa 9-11 päivän ajan väliaineessa muutos päivänä 5. Solut trypsinoitiin ja laskettiin hemosytometrillä.

Tulokset

Retinoideille Paranna Cx32 Expression taso

Käytimme LNCaP-32-solut, jotka ilmentävät transdusoitiin retroviraalisesti rotan Cx32 [17], koska vanhempien LNCaP-P ja LNCaP-N solut ovat vailla havaittavissa tunnettujen CXS ja eivät muodosta toiminnallista gjs (katso Materiaalit ja menetelmät). Aiemmat tutkimukset osoittivat, että LNCaP-32 solujen androgeenit säännellään muodostumista ja hajoamista gjs ohjaamalla ilmentymistason Cx32 posttranslationaa-, pelastamalla sen ERAD välittämää hajoaminen [17]. Logiikalla edellä kuvattu (katso johdanto) ja meidän kokemuksia muiden solulinjojen [26], [27], LNCaP-32-soluja käsiteltiin 9-CRA ja ATRA 48 h tutkia, jos ne vaikuttavat Cx32 ekspressiotason. Olemme havainneet, että 9-CRA ja ATRA lisääntynyt Cx32 ilmentymistaso annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1, A). Paranevat merkittävästi, kuitenkin, havaittiin vain pitoisuus on 1 uM tai enemmän. Arvioinnin tekee pesäkemuodostusta, suurempina pitoisuuksina 1 uM olivat myrkyllisiä näihin soluihin (tuloksia ei ole esitetty) ja siten päätimme 1 uM 9-CRA ja ATRA myöhempää tutkimuksiin. Aika kurssi tutkimukset osoittivat, että lisälaite sekä retinoidien tapahtui jo 24 h jälkikäsittely ja saavutti tasanteen 72 h (kuvio 1, B). Vaikutus 9-CRA ja ATRA on Cx32 ilmentymisen taso oli verrattavissa niihin, synteettisen androgeenin, mibolerone (MB), ja ei havaittu RAR-ligandit, 13-CRA ja tetrahydrotetramethyl-nepthalenylpropanylbenzoic happo (TTNPB), tai 4-hydroksi-phenretinamide (4-HPR) (kuvio 1 C). Myös tutki 9-CRA ja ATRA lisääntynyt ekspressiotaso muiden soluliitos liittyviä proteiineja. Olemme havainneet, että sekä 9-CRA ja ATRA ei ollut merkittävää vaikutusta ilmentymistason vyöliitos proteiinien E-kadheriinin ja α- ja β-catenins kuitenkin ekspressiotaso tiiviin liitoksen liittyvän proteiinin, occludin, on parantunut jonkin verran (Kuva 1 D). Lisäksi, 9-CRA ja ATRA ei indusoi endogeenisen Cx32 vanhempien LNCaP-soluissa eikä muuttanut ekspressiotaso retrovi- transkriptoidaan Cx32-mRNA: n LNCaP-32-soluissa mitattuna semi-kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi (tietoja ei esitetty).

Cx32-ilmentävät LNCaP-32-soluja käsiteltiin 9-CRA, ATRA, MB ja muut retinoidit, kuten on ilmoitettu. A. annosriippuvaisesti parantaminen Cx32 ekspressiotason upon 9-CRA ja ATRA hoito 48 tuntia. Huomaa, että merkittävä parannus havaitaan vain pitoisuuksina yli 0,5 uM. B. kinetiikka parantaminen Cx32 ekspressiotason käsiteltäessä 9-CRA ja ATRA (1 uM) varten osoitettu kertaa. Huomaa, että lisälaite on havaittu jo 24 tuntia. C. Vain 9-CRA ja ATRA ja MB lisätä Cx32 ilmaisun tasolla. Huomaa, että RAR-spesifisiä retinoideja, TTNPB (tetrahydrotetramethyl-nepthalenylpropanylbenzoic happo), ja 13-CRA (13-cis-retinoiinihappo), ja muita, riippumattomia retinoidin, 4-HPR, ovat tehottomia. Huomaa, että MB (2,5 nM) on ainakin 300-500 kertaa tehokkaampi kuin 9-CRA ja ATRA on ekvimolaarinen perusteella. D. Effect of 9-CRA ja ATRA päälle adherens ja tiiviin liitoksen liittyviä proteiineja. Expression of vyöliitos proteiinien, E-kadheriinin ja α- ja β-catenins, ja tiiviin liitoksen liittyvän proteiinin, occludin, analysoitiin Western blot-analyysillä kokosolulysaattia (5 ug). Huomaa, että vain ilmaus occludin näyttää muuttuvan huomattavasti.

Retinoideille Paranna Gap Junction Assembly ja junktionaalinen Communication

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus 9-CRA ja ATRA on kokoonpanoon Cx32 osaksi gjs ja junktionaalinen viestintää. Samanaikainen kasvun kanssa ilmentymistason Cx32, 9-CRA ja ATRA kasvoi GJ kokoonpano arvioitu immunosytokemialli- (kuva 2 A) ja biokemiallisesti Western blot-analyysi kokonais- ja Triton X (TX) -100 liukenematonta uutteita [16], [17], [35], valmistettiin eri aikoina käsittelyn jälkeen (kuvio 2 B). Lisäksi kuten taulukosta 1, parantaminen GJ kokoonpano liittyi samanaikainen lisääntyminen junktionaalinen viestinnän mitattuna junktionaalinen siirsi kolme GJ läpäisevä fluoresoiva merkkiaineiden, Lucifer Yellow (MW 443), Alexa 488 (MW 570), ja Alexa 594 (MW 760). Esimerkiksi 9-CRA ja ATRA lisääntynyt junctional siirto Alexa 594 (MW 760) 2-3 taittuu verrattuna kontrolleihin (taulukko 1). Koska E-kadheriinin on osoitettu helpottaa kokoamista CXS osaksi gjs [32], [33], ja Cx ilme on osoitettu helpottamaan kokoonpanoa tiiviiden liitosten [29], myös tutki 9-CRA ja ATRA lisääntynyt ilmentymisen taso Cx32 ja sen kokoamista gjs välillisesti helpottamalla kokoonpano muiden soluliitos arvioituna pesuaine-liukenemattomuus niiden valmistamiseen ja liittyneet proteiinit. Huomasimme, että molemmat 9-CRA ja ATRA ei ollut merkittävää vaikutusta ilmentymistason vyöliitos proteiinin E-kadheriinin kuitenkin kokoonpanoon tiiviin liitoksen proteiinia, occludin, mutta ei sen liittyvän proteiinin ZO-1, näytti on parannettu (kuvio 2 B). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että 9-CRA ja ATRA, kuten androgeenit, parantaa ekspressiotaso Cx32, ja sen myöhempi kootaan gjs, muuttamatta merkittävästi ekspressiota E-kadheriinin, joka on osoitettu moduloivan kokoonpano gjs [32], [33], [36], [37]. Kuten havaittiin aiemmissa tutkimuksissa androgeenien, kokoonpano Cx32 ja occludin osaksi soluliitos, tai päinvastoin, näyttää säänneltävä coordinately [17], [29], [38], [39].

. LNCaP-32 soluja, kasvatettu joko kuusi hyvin klustereissa tai 10-cm astioita, käsiteltiin 9-CRA ja ATRA eri aikoja. Assembly of Cx32 (vihreä) otetaan gjs arvioitiin immunosytokemialli-. E-kadheriinin näkyy punaisena. Huomaa, että GJ muodostuminen parannettu 9-CRA ja ATRA ja MB hoitoa. B. kokoaminen Cx32 osaksi gjs, tiiviin liitoksen liittyvän proteiinin, occludin ja ZO-1, ja vyöliitos proteiini, E-kadheriinin, arvioitiin biokemiallisesti TX100 liukenemattomuus määrityksessä kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. Huomaa myös, että molemmat kokonaistaso ja pesuaine liukenematon osa Cx32 kasvoi merkittävästi. Huomaa myös, että pesuaine-liukoisuus vyöliitos liittyviä proteiineja, E-kadheriinin, ei vaikuta merkittävästi kun taas tiiviin liitoksen liittyvän proteiinin, occludin, on hieman parannettu. (A), ytimet (sininen) värjätään DAPI.

Retinoideille moduloida androgeenisäädellyn muodostuminen ja hajoaminen aukkoliitokset

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että Cx32 hajosi kun androgeenireseptorin ehtyminen mukaan ERAD, ja että androgeenien parantaa GJ muodostumista uudelleenreitittämistä ERAD kohdistetun allas Cx32 solun pintaan [17]. Taustalla tiedot on esitetty kuvioissa 1 ja 2, tutkimme seuraavaksi ilmentymistason Cx32 ja sen junktionaalinen ja ei-junctional kohtalo, kun androgeeni ehtyminen läsnä ollessa ja poissa ollessa 9-CRA ja ATRA. Näitä tutkimuksia varten soluja kasvatettiin androgeeni-köyhdytettyä (hiilellä erotettua), fenoli-punaista soluviljelyelatusaineella. Yhdenmukainen aiempien tutkimusten [17], huomasimme, että androgeenireseptorin ehtyminen laski Cx32 ekspressiotaso, joka estyi lisättäessä MB ja DHT (Kuva 3). Kuitenkin olemme huomanneet, että lasku ilmentymistason Cx32 esti myös silloin, kun androgeeni-köyhdytettyä väliaine täydennettiin 9-CRA ja ATRA (kuvio 3 A). Lisäksi yhdistettynä hoidon MB ja 9-CRA tai ATRA ei ollut synergistinen eikä lisäainetta suhteessa Cx32 ekspressiotason (Kuva 3). Perustelemaan nämä tiedot arvioimme muodostumista gjs immunosytokemialli- (kuva 3 B), biokemiallisesti pesuaine liukenemattomuus määritys (kuva 3 C), ja toiminnallisesti mittaamalla junktionaalinen siirron Lucifer Yellow (MW 443 Da), Alexa 488 (MW 570 Da), ja Alexa 594 (MW 760 Da) (taulukko 2). Kuten kuviossa 3B on esitetty, androgeenin ehtyminen vähensi gjs voimakkaasti kuin Cx32-spesifinen immunovärjäyksellä harvoin havaittu solu-solu-kontakti-alueilla, kun taas gjs havaittiin helposti soluissa, kun androgeeni-köyhdytettyä alustaan ​​lisättiin 9-CRA ja ATRA ja jossa MB ja DHT (kuva 3 B). Yhdenmukainen immunosytokemialliset tietojen junktionaalinen siirto Lucifer Yellow väheni huomattavasti kun androgen ehtyminen, joka esti upon täydennystä androgeenista köyhdytettyä väliaineessa MB, ATRA ja 9-CRA (taulukko 2). Pesuaine liukenemattomuus määritys edelleen vahvistivat immunosolukemiallisten ja junktionaalinen siirtää dataa (kuva 3 C). Kuten havaittiin aiemmissa tutkimuksissa, ehtyminen androgeenien ei ollut merkittävää vaikutusta pesuaineen liukoisuutta E-kadheriinin ja β-kateniinin ja tiiviin liitoksen liittyvän proteiinin, ZO-1 (kuva 3 C). Kontrollina ehtyminen tai lisääminen androgeenien, 9-CRA ja ATRA vanhempien LNCaP-P ja G418-resistenttien LNCaP-N-solut eivät indusoi GJ kokoonpano eikä ollut mitään vaikutusta junktionaalinen siirto (dataa ei esitetty). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että 9-CRA ja ATRA estää androgeenisäädellyn hajoamista Cx32 ja parantaa GJ muodostumista LNCaP-32 soluihin. Koska yhdistettynä hoidon androgeenien ja retinoidien ei ollut synergistinen eikä lisäaine, tiedot viittaavat lisäksi siihen, että GJ muodostuminen on parantaa pelastamiseen sama pooli Cx32 joka on suunnattu ERAD kun androgen ehtyminen.

LNCaP-32 soluja, kasvatettu 70% konfluenssiin joko kuusi hyvin klustereissa tai 10-cm astioita, siirtyneiden hiilellä erotettua, androgeeni-köyhdytettyä (Strip) väliaine. Ilmentymistaso Cx32 ja muodostumisen gjs analysoitiin Western blot (A) ja immunosolukemiallisten analyysi (B) 48 tunnin kuluttua läsnä ja poissa ollessa 9-CRA ja ATRA (1 uM) ja MB (2,5 nM) ja DHT (10 nM). C. muodostuminen gjs analysoitiin myös Western blot -analyysillä yhteensä, detergentti-liukoinen ja -insoluble jakeet, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Huomaa, että Cx32 ja gjs hajoavat androgeeni-köyhdytettyä keskipitkällä ja hajoaminen on estetty, kun täydennystä 9-CRA, ATRA, MB ja DHT. Huomaa myös, että vain ilmentymistason Cx32 ja sen pesuaineen liukoisuutta muuttuneet merkittävästi kun taas E-cadhiern (E-cad), β-kateniinin (β-cat) ja ZO-1 ei vaikuttanut merkittävästi. (B), ytimet (vihreä) värjättiin DAPI. A, 10 ug kokonais-proteiinia analysoitiin.

retinoidien n parannetun Gap Junction muodostaminen Riippumaton androgeenireseptorin Function

hoito LNCaP-solujen 9-CRA on osoitettu parantaa AR ekspressiotason [30]. Sen testaamiseksi, 9-CRA ja ATRA parannettu AR ilmentymistä normaalissa ja androgeenista köyhdytettyä väliaineessa, me kasvoi LNCaP-32 solujen kontrolli, androgeeni-tyhjentynyt, ja androgeenin-köyhdytettyä plus 9-CRA, ATRA ja MB sisältävässä väliaineessa 48 tuntia. Arvioituna Western blot-analyysi, huomasimme, että androgeenireseptorin ehtyminen vähensi sekä ekspressiotason AR ja Cx32, joka esti päälle täydennystä kanssa MB, DHT, 9-CRA ja ATRA (kuva 4 A). Nämä tiedot esiin mahdollisuuden, että 9-CRA ja ATRA parannettu GJ kokoonpano AR-riippuvaisella tavalla – eikä itsenäisesti. Testata tätä käsitettä, käsittelimme LNCaP-32-solujen Casodex (bikalutamidi), joka estää androgen toimintaa kilpailemalla androgeenien sitoutumisesta AR ja estämällä toiminto [40], [41], ja tutki ilmentymistason Cx32 ja GJ muodostuminen käsiteltäessä 9-CRA, ATRA ja MB läsnä ja poissa ollessa Casodexin normaaleissa ja androgeenista köyhdytettyä väliaineessa. Yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten, huomasimme, että hoito Casodex aiheuttama hajoaminen AR (kuva 4 B) sekä poisti vaikutuksen MB ja DHT Cx32 lauseketta havaittiin aiemmissa tutkimuksissa [17]. Kuitenkin hajoaminen AR havaittiin myös Casodex läsnäollessa 9-CRA ja ATRA sekä androgeeni- köyhdytettyä ja normaali välineellä. Huolimatta voimakkaasti laskeva AR ilmaisun tasolla, huomasimme, että Casodex ollut vaikutusta 9-lataustelineen ja ATRA välittämä parantaminen Cx32 ekspressiotason. Tämän väitteen lasku ja nousu Cx32 ilmentyminen oli mukana rinnakkaisia ​​muutoksia GJ muodostumiseen, tutkimme muodostumista gjs immunosytokemialli- in Casodx käsiteltyjä soluja läsnä ja poissa ollessa MB, 9-CRA ja ATRA. Gjs ei muodostunut, kun soluja käsiteltiin casodex normaalissa seerumissa tai androgeeni-köyhdytettyä väliaineessa, joka sisältää MB tai DHT (kuvio 5). Toisaalta olemme havainneet, että gjs oli runsaasti, kun soluja käsiteltiin casodex yhdessä 9-CRA tai ATRA (kuvio 5). Nämä tiedot viittaavat siihen, että mekanismi, jolla 9-CRA ja ATRA hajoamisen estämiseksi Cx32 ja parantaa GJ muodostumista, kun androgeeni ehtyminen on riippumaton AR ilmentymisen taso ja /tai tai molempia.

. LNCaP-32-soluja kasvatettiin 70-80% konfluenssiin 6 cm: n maljoille. Solut kytketään hiilellä erotettua, androgeeni-köyhdytettyä väliaineessa (ST), joka sisälsi 9-CRA ja ATRA (1 uM) ja MB (2,5 nM) ja DHT (10 nM) 24 tuntia. Solujen androgeenin sisältävässä väliaineessa (NS) tai androgeeni-köyhdytettyä väliaineessa (ST), käytettiin kontrolleina. Ilmentymistaso Cx32 ja AR analysoitiin Western-blottauksella. Huomaa, että ilmentymistaso sekä Cx32 ja AR pienenee kun androgen ehtyminen ja lasku estetään käsittelemällä 9-CRA, ATRA, MB ja DHT. B. LNCaP-32-solut, ympätty kuten edellä, käsiteltiin 9-CRA ja ATRA (1 uM) ja MB (2,5 nM) ja DHT (10 nM) läsnä ollessa ja puuttuessa Casodex (10 uM) normaalien ja androgeenin köyhdytettyä väliaineessa. Ilmentymistaso Cx32 ja AR tutkittiin jälkeen Western blottauksella. Huomaa, että Casodex sisältävässä väliaineessa, ekspressiotaso Cx32 ei vähene läsnäollessa 9-CRA ja ATRA (1 uM) in hiilellä erotettua keskitason huolimatta alhainen AR ilmaisua. Tätä ei havaittu megatavua ja DHT.

LNCaP-32-solut, kylvetään kuusi hyvin sisältävät ryhmät lasipeitelevyihin, annettiin kasvaa 70% konfluenssiin. Sitten soluja kasvatettiin vielä 24 h tavanomaisessa väliaineessa (NS), ja hiili-riisuttu, androgeeni-köyhdytettyä pelkällä väliaineella (ST), normaalissa seerumissa, joka sisälsi casodex (NS + CDX), ja androgeenin-köyhdytettyä väliaineessa, jota oli täydennetty MB ( ST + MB), jossa MB ja Casodex (ST + MB + CDX), jossa on 9-CRA (ST + CRA), 9-CRA ja CDX (ST + CRA + CDX), jossa ATRA (ST + ATRA), ja joissa ATRA ja CDX (ST + atra + CDX). Hajoaminen ja solunosasijaintia Cx32 analysoitiin immunosytokemiallisesti, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Huomaa, että gjs (vihreä) eivät hajoa soluissa käsitelty 9-CRA ja ATRA molemmat läsnä ja poissa ollessa casodex vaikka ne hajoavat normaalissa seerumissa ja androgen-vähene, vaan MB täydennetty alustassa, joka sisältää Casodex.

10.

Näytä Article

PubMed /NCBI

Google Scholar

11.

Näytä Article

PubMed /NCBI

Google Scholar

23.

Näytä Article

PubMed /NCBI

Google Scholar

27.

Näytä Article

PubMed /NCBI

Google Scholar

28.

Näytä Article

PubMed /NCBI

Google Scholar