Krooninen sairaus

tiivistelmä

Paikkakohtaiset histoni muutokset ovat tärkeitä epigeneettisellä sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen. Koska sääntelyn purkaminen geenien johtaa usein monimutkaisia ​​sairauksia, korjaavat modulaatio paikkakohtaisten histonimerkkien voisi olla tehokas terapeuttinen tai sairautta ehkäisevä strategia. Tällainen modulaatio ruokavalion yhdisteitä ja tuloksena vaikutus sairauden riskin edelleen suhteellisen tutkimaton. Täällä tutkimme phenethylisothiocyanate (PEITC), yhteinen ruokavalion yhdiste johdettu cruciferous vihannekset, joilla tiedetään chemopreventive ominaisuudet koeolosuhteissa, mahdollisena modulaattori histonimodifikaation ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Esillä tutkimusraportit romaani, dynaaminen, paikkasidonnainen kemiallisia muutoksia histoni H3 geenissä-promoottori sopivalla tavalla, liittyy PEITC altistus ihmisen paksusuolen kasvainperäinen SW480 epiteelisolujen. Lisäksi, PEITC heikennetty soluproliferaatiota pitoisuudesta ja ajasta riippuvalla tavalla, todennäköisesti välittyy kaspaasiriippuvaisen apoptoottisten signalointia. Vaikutukset PEITC on histonimodifikaation ja geeniekspression muutokset saavutettiin alhainen, ei-sytotoksisia pitoisuuksia, toisin kuin suurempia pitoisuuksia tarvitaan pysäyttämään syöpäsolujen lisääntymistä. Lisääntynyt ymmärrys erityisiä epigeneettiset muutokset ruokavalion yhdisteitä voidaan kohentaa chemopreventive strategioita, joilla vähennetään terveydenhuollon taakkaa syövän ja muiden ihmisen sairauksien.

Citation: Liu Y, Chakravarty S, Dey M (2013) Phenethylisothiocyanate Alters sivusto- ja promoottori-Specific histoni Tail muutokset syöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (5): e64535. doi: 10,1371 /journal.pone.0064535

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 syyskuu 2012; Hyväksytty: 16 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 28, 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Major tuki tälle työlle tuli National Institutes of Health myöntää [R00AT4245] (MD). Lisätukia tuli South Dakota maatalouden Experiment Station myöntää 328100/318000 (MD) ja 3AH386 (SC), biologinen torjunta ja analyysi Applied Photonics: South Dakota 2010 keskus avustus 3SG163 (SC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on toiseksi suurin syy kuolemista Yhdysvalloissa [1]. Onneksi monet ruokavalion yhdisteet voivat voimakkaasti moduloida eri molekyylikohteista, mikä johtaa syövän ehkäisemiseen aloittamista edistäminen, ja etenemistä. Erityisesti hedelmät ja vihannekset sisältävät runsaasti biologisesti aktiivisia yhdisteitä, jotka ovat usein alhainen toksisuuksia mutta merkittävän tehokkuudet [2]. Aiemmin syöpä oli niukasti suunniteltiin sairaus mutaatioita, mutta uudemmat tutkimus myös liittää sairaustilaa kanssa häiritseekin matkapuhelinverkon säätelyverkkojen, sekä häiriöistä, geenien toiminnan ja geenisäätelyn nyt molemmat tunnustetaan tunnusmerkkejä syövän [3] , [4], [5]. Täten taudin ehkäiseviä toimia, joilla kohdistaa avaintekijöitä verkkojen säännellä geenien toiminnan, kuten kromatiinin, voisi olla tehokas. Korjauskierrosta paikkasidonnainen chromatin muutokset tunnetaan epigeneettiset muutokset, jotka liittyvät Clinical Oncology, koska ne liittyvät läheisesti geenien ilmentyminen ja verkon häiriöt sairaat tilassa [6], [7]. Siksi selvittämiseen ravinnosta yhdisteiden nollaamalla poikkeavaan epigeneettiset maisemat vastaa muuttunutta geeniekspressiota voi helpottaa ennaltaehkäisevää lääkäriasemien.

epigeneettisellä perusta geenisäätelystä ilmenee klo rakenteellisen yksikön kromatiinin, nukleosomin, joka on kokoonpanoa histoni oktameereistä kääritty genomista DNA. Muutokset histonien muodostavat merkittävän molekyyli- säädin kohtaan geenin ilmentymisen säätelyyn, ja nämä muutokset ovat usein muuttuneet syövissä [6], [7]. Monien tunnettujen histoni aminohappo hännän muutoksia, metylaatio ja asetylointi lysiinitähteiden on histoni H3 on tutkittu laajasti osalta geenien ja geenien säätelyn. Dimetyloimalla H3 lysiinin 9 (H3K9me2) ja trimethylation H3 lysiinin 27 (H3K27me3) liittyy usein transkription repression ja geenien [8]. Site-specific histoni lysiini metylaatioita katalysoivat histoni metyyli transferaasit (HMTs), ja poistamalla metyyli-ryhmät katalysoivat demethylases. Samoin deasetyloitumisen histonien at geenin promoottorit katalysoivat histonideasetylaaseja (HDAC: t) korreloi tiivistyminen kromosomaalisten verkkotunnuksia merkinnän alueilla transkription epäpätevyydestä ja alas-säätely siihen liittyvän geenien [9]. Vaikka in vitro -tutkimuksia ravinnosta fytokemikaalit moduloinnissa tasot HMTs ja HDAC: t ovat olemassa pieniä määriä [10], modulaation aseman erityisiä H3 lysiinin muutoksia ruokavalion yhdisteitä geenispesifistä tavalla edelleen suhteellisen tutkimaton [11] . Täällä tutkimme H3-asetylointi (H3-Ac) ja paikkakohtaisia ​​H3 lysiinin metylaatioita (H3K27me3 ja H3K9me2) yhdessä phenethylisothiocyanate (PEITC) -välitteisen geeniekspressiota modulaatio ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Tämä on jatkoa aiemmille raportteja PEITC ravinnon yhdiste mahdollisia tulehdusta toimintoja erilaisissa kokeellisissa malleissa [12], [13].

PEITC esiintyy luonnostaan ​​muodossa sen glukosinolaatti esiaste, gluconasturtiin, kasvisten kuten kaali, kukkakaali, wintercress, ja parsakaali. PEITC on osoittanut potentiaalia antioksidantti ja kemiallinen estoaktiivisuus kokeellisissa malleissa erilaisten syöpien [14], [15]. Se ei osoittanut ilmeistä toksisuutta lääketurvallisuuden tutkimuksissa [16] ja on tällä hetkellä kliinisissä kokeissa keuhkosyövän hoitojen (clinicaltrials.gov: NCT00005883, NCT00691132). Hiirillä, olemme aikaisemmin osoittaneet, että PEITC vaimentaa paksusuolen tulehdus ja moduloi useita mahdollisia biomarkkereita liittyvien tulehdus ja paksusuolen syövän syntymistä. Nämä biomarkkerit sisältyvät geenit liittyvät tulehdusreaktiota, apoptoosin, solusyklin säätelyssä, lisääntymistä, sytokiinien /kemokiinin aktiivisuutta, ja kopioinnin säätely [12], [13].

peräsuolen syöpä on toiseksi suurin syy syövän -aiheiset kuolemista Yhdysvalloissa [21]. Mielenkiintoista, mekanistinen yhdistyksen välillä krooninen tulehdus ja lisääntynyt riski syövän aiheutuvien tulehdusperäistä geneettiset ja epigeneettiset epävakaus on nyt hyvin hyväksytty [17]. Tässä avainasemassa yhdistys kuuluu transkriptiotekijöitä, kuten tumatekijä kappa B (NFKB) ja signaalimuunta- ja aktivaattorien transkription (STAT), sytokiinien /kemokiinien, ja matriisi (MMP), joka on monigeeniperheeseen sinkki-riippuvaisen ekstrasellulaarisen matriisikoodattua remodeling endopeptidaasit. Nämä solu välittäjiä, joista olemme tutkineet aikaisemmin hiirimalleissa [12], [13], ovat tärkeitä tehtäviä, jotka liittyvät ohittaminen immuniteetin, lisääntymistä, eloonjääntiä pahanlaatuisten solujen kasvaimen kasvua, angiogeneesiä, hyökkäystä, ja etäpesäkkeiden [17 ], [18], [19], [20]. Nykyinen tutkimuksessa tutkittiin chromatin muutokset yhdessä PEITC välittämää modulaatio ilmentymistä näiden välittäjäaineiden ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Drug and Chemicals

Dimetyyli sulfoksidi (DMSO), lipopolysakkaridi (LPS, mistä

Escherichia coli

-kannan O55: B5), penisilliiniä /streptomysiiniä ja phenethylisothiocyanate (PEITC) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), naudan sikiön seerumia (FBS), ja TrypLE hankittiin Gibco (Grand Island, NY). Ihmisen interferoni-γ (IFNy) ostettiin R Promega, Madison, WI), käytettiin määrittämään suhteellinen määrä elinkelpoisia SW480-solujen jälkeen jäljellä PEITC hoidon, mukaan valmistajan ohjeiden. Määritys suoritettiin käsittelemällä SW480-soluja, joilla on erilaiset PEITC pitoisuuksilla, minkä jälkeen lisättiin 20 ui CellTiter reagenssi suoraan viljelykuoppiin, inkuboimalla 2 tuntia 37 ° C: ssa, ja sitten tallennetaan absorbanssi 490 nm: ssä BioTek Synergy H4 levynlukijaa ( BioTek, Winooski, VT). Taustaa 490 nm absorbanssi korjattiin valmistamalla kolmena kappaleena joukko Verrokkikuoppien (ilman soluja), jotka sisältävät samoja määriä elatusainetta ja CellTiter reagenssia kuin koekaivoja. Sama määritys suoritettiin myös käyttämällä suurempia pitoisuuksia PEITC (80 uM), ja altistamalla solut pitempiä ajanjaksoja jopa 48 h määrittää anti-leviämisen vaikutuksia PEITC in SW480-soluissa (kuvio 1). On huomattava, että jopa pienemmillä pitoisuuksilla (yli 5 uM) PEITC hoitoa enää itämisaika, kuten 48 h indusoivat merkittäviä solukuoleman ja mRNA: n hajoamisen (kuvio 1). Pitoisuuksia PEITC jossa ei ole merkittävää solun elinkyvyn menetykseen tapahtunut (ei sytotoksisia vaikutuksia) valittiin kaikkien lisäkokeita (kuviot 2, 3, 4, 5, 6). Näin ollen kaikki geenien ilmentymisen määrityksissä (RNA ja proteiini ilmaisun) ja epigeneettiset muutokset raportoidaan käsikirjoitus oli määritetty 5 h ajankohta, jollei toisin mainita. 40 uM altistumista PEITC 12 tuntia tai vähemmän eivät osoittaneet tilastollisesti merkittävän vähennyksen solujen elinkelpoisuuden (kuvio 1A). Sillä aikariippuvainen havainnot (kuvio 5 ja S1, S2, S3, S4, S5), solut 10pM PEITC hoito inkuboitiin jopa 18 h, koska tilastollisesti merkittävän vähennyksen Solujen elinkelpoisuus ei havaittu vasta tuolloin piste ( Kuva 1A).

jälkeen 12, 24, ja 48 h PEITC altistumisen ja myöhemmin 2 h inkuboinnin CellTiter vesipitoisella reagenssilla (Promega) A

490 nm mitattiin SW480-solujen BioTek Synergy H4 lukija. Prosentuaalinen solujen elinkelpoisuus on esitetty suhteessa kontrolliin (ei PEITC) keskiarvona ± SEM (A); Pitoisuudesta riippuva vaikutus PEITC 48 h DNA pirstoutuminen (B); Konsentraatio-riippuvaisen ekspression modulaatiolle liittyvien geenien apoptoosia ja solu syklin PEITC 48 h. GAPDH käytettiin housekeeping ohjaus suhteellisen kvantifioinnin geeniekspression muutoksia (C); kaikissa kokeissa n = 3. * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. Ei menetys solujen elinkelpoisuus 10gM PEITC ryhmässä verrattuna no-PEITC ryhmää havaittiin jopa 12 tuntia.

Kuusi geenit on esitetty joista PEITC liittyvät muutokset H3 muutoksia havaittiin myös . Góis joille PEITC altistuksen liittyvät H3 muutoksia ei havaittu esitetään taulukossa 3, mutta ei nykyisessä kuvassa. Vaikutukset PEITC hoitojen mitattiin suhteelliset mRNA määrä ilmaistaan ​​Indonesian käsitellyissä soluissa. MRNA määrä mitattiin käyttäen reaaliaikaista RT-PCR, jossa GAPDH sisäisenä kontrollina. Alempi arvot edustavat suurempaa estäviä vaikutuksia. Arvot ovat keskiarvo ± SEM (n = 6). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. Kun kaikki arvot alle katkoviiva vastaa samaa luokkaa

p

arvon, yksittäiset tähdet jätetään pois välttämään tungosta kuvion. Tilastollinen merkitykset mitattiin suhteessa positiiviseen kontrolliin, jotka ovat soluja, käsitelty LPS: llä ja ilman PEITC, jolla on suurin geenin induktio tasolla.

histoni H3 metylaatio muutoksia promoottorialueet mielenkiinnon kohteena olevien geenien (GOI ) in SW480-soluissa. Chromatin välillä SW480 soluista kerättiin kuluttua 5 h 10 uM PEITC hoitoa. Tulokset ChIP-analyysit (A) anti-trimetyyli-histoni H3 Lys27 (H3K27me3) ja (B) anti-dimetyyli-histoni H3 Lys9 (H3K9me2) vasta-aineita on esitetty. Out of 13 Góis testattiin SW480-soluissa, kuusi geeniä osoitti tilastollisesti merkitsevä PEITC liittyvät muutokset H3K27me3 valtioissa ja yksi geeni osoittivat tilastollisesti merkitsevä PEITC liittyvät muutokset H3K9me2 tilassa. DNA-sekvenssit määritettiin kvantitatiivisesti reaaliaikaisella PCR: llä käyttäen promoottoria alukkeita. Keskimääräinen prosenttiosuus tulo ± SEM (n = 3) kustakin kokeessa piirretään. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 verrattuna positiivista kontrolli soluja.

histoni H3 asetylointi muutoksia promoottorialueen mielenkiinnon kohteena olevien geenien (Indonesian) in SW480 solut. Chromatin välillä SW480 soluista kerättiin kuluttua 5 h 10 uM PEITC hoitoa. Out of 13 Góis testattiin SW480-soluissa, kaksi geeniä osoitti tilastollisesti merkittävää PEITC liittyvät muutokset H3-Ac tila. Tulokset Hakkeen analyysien käyttämällä anti-asetyyli-histoni H3-vasta näkyvät. DNA-sekvenssit määritettiin kvantitatiivisesti reaaliaikaisella PCR: llä käyttäen promoottoria alukkeita. Keskimääräinen prosenttiosuus tulo ± SEM (n = 3) kustakin kokeessa piirretään. * P 0,05, *** p 0,001 verrattuna positiivista kontrolli soluja.

edustavat tulokset osoittavat ajasta riippuva vaikutukset 10pM PEITC hoidon STAT1 mRNA-tasoja sekä H3K27me3 metylaatiotila . SW480-soluja käsiteltiin 10 uM PEITC osoitettuina ajankohtina (A, B). STAT1 mRNA-tasot normalisoitiin GAPDH tasoja ja ilmaistiin prosentteina suhteessa positiivisen kontrolli-solut (A). Histoni H3 metylaatiomuutokset klo STAT1 promoottorialueen SW480-soluissa määritettiin käyttämällä anti-H3K27me3 vasta-siru. DNA-sekvenssit kvantifioitiin reaaliaikaisella PCR (B). Tietopisteet ovat keskiarvo ± SEM (n = 4) kussakin kokeessa. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 verrattuna positiivista kontrolli soluja. Vihreä pisteviivat merkitsevät mahdollista käänteinen korrelaatio (tukahduttamistoimista markkaa) muutosten välinen mRNA-tasojen ja H3 muutos tila soluissa. Läsnäolo tai puuttuminen vastaavia korrelaatioita loput viisi Indonesian on esitetty kuvioissa S1, S2, S3, S4, S5.

immunoblot-analyysit osoittavat tukahduttaminen totaalisoluproteiinia STAT1 sekä aktivoitu ydin- pSTAT1 vuonna vastauksena PEITC hoidot SW480 solujen pitoisuudesta riippuvasti. (A) Immunoblot. (B) Densitomet- analyysit immunoblot. Soluja, jotka on esikäsitelty erilaisilla pitoisuuksilla PEITC 5 tuntia ennen 4 tunnin LPS aktivointi. Stimuloimattomia soluja ja stimuloi solut toimivat negatiivisina ja positiivisina kontrolleina. Kaistaintensiteettejä normalisoitiin P-aktiini. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM (n = 3) kolmen erillisen kokeen. * P 0,05, ** p 0,01.

DNA Fragmentation määritys Detection of Apoptosis

SW480-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla PEITC inkuboitiin 48 h ennen sadonkorjuuta genomista DNA: ta käyttämällä DNAzol (Invitrogen, Grand Island, NY) seuraten valmistajan protokollaa. DNA: n fragmentoituminen visualisoitiin käyttämällä 1,5% agaroosigeelielektroforeesilla ja GelRed värjäytymistä (Biotium, Hayward, CA).

Kokonais-RNA uuttaminen, puhdistus, ja cDNA: n synteesi

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen TRIzol -reagenssia (Invitrogen, Grand Island, NY) seuraten valmistajan ohjeita. RNA kvantitoitiin absorption mittauksia 260 ja 280 nm: ssä käyttämällä NanoDrop spektrofotometriä järjestelmän (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). RNA käsiteltiin sitten DNaasi I (Invitrogen Inc.), seuraten valmistajan ohjeita poistaa jälkiä DNA-kontaminaation. CDNA: t syntetisoitiin käyttämällä 3 ug RNA: ta kustakin näytteestä käyttäen High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), seuraten valmistajan protokollaa. RNA: n uutto, puhdistus, ja cDNA: n synteesi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [13].

Real-Time Kvantitatiivinen PCR

syntetisoitiin cDNA: t laimennettiin nelinkertaiseksi. Kaksi mikrolitraa kutakin laimennettua näytettä lisättiin 0,5 ui geenin-spesifisiä alukkeita ja 12,5 ui Virta SYBR Green PCR master mix (Applied Biosciences, Foster City, CA), ja lopullinen tilavuus saatettiin 25 ul lisäämällä steriiliä tislattua vettä. PCR-monistukset suoritettiin MX3005P järjestelmä (Roche /Stratagene) käyttäen yksi sykli 50 ° C: ssa 2 min, yksi sykli 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 40 sykliä 15 s 95 ° C: ssa ja 1 min 60 ° C: ssa ja viimeinen sykli 95 ° C 1 min, 55 ° C: ssa 30 s, ja 95 ° C: ssa 30 s, kuten on kuvattu [13]. NTC (ei mallia kontrolli), ei-RT valvonta, ja PEITC vain valvontaa käytettiin tarvittaessa laadunvalvontatarkoituksiin. Kaikki näytteet ajettiin kahtena kappaleena. Geenispesifisiä, intronin ulottuu käytetyt alukkeet olevassa tutkimuksessa on kuvattu taulukossa 1 (PEITC pitoisuudesta riippuvainen mRNA: n ekspressio) ja taulukossa 2 (ChIP kokeissa). Laskelmien suhteellisten ekspressiotasojen suoritettiin käyttäen ΔΔC

t-menetelmällä [25]. Data-arvot ovat keskiarvoja vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta ja ne ilmaistaan ​​suhteellisen mRNA määrä suhteessa positiiviseen kontrolliin, joka on normalisoitu arvoon 1,0.

Western Blot-analyysi

immunoblot-analyysit, IFNy-aloitettu, PEITC-käsiteltyjen SW480-solut aktivoitiin LPS: llä 4 h ja kerättiin käyttäen RIPA lyysipuskuria (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Na-

2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% natriumdeoksikolaatti, 2,5 mM natriumpyrofosfaatti, 1 mM β-glyserofosfaatti, 1 mM Na-

3Vo

4, 1 ug /ml leupeptiiniä). Ydinmagneettisen ote valmistelun ja proteiinipitoisuus määritys, valmistajan (Thermo Scientific, Rockford, IL) protokollat ​​NE-PER Nuclear uuttoreagenssit ja Pierce BCA Protein Assay Kit seurattiin. Proteiineja (50 ug /kaista) erotettiin 12% SDS-PAGE: lla ja tuotteet olivat elektro-siirrettiin polyvinyldene (PVDF) kalvoja (Thermo Scientific, Rockford, IL). Membraanit blokattiin kuoritun maidon 5% 1 tunti, pestiin kolme kertaa PBS: ssä, inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (kanin anti-β-aktiini Santa Cruz Biotechnology, ja kanin anti-STAT1 ja anti-fosforyloitu STAT1 [Ser727] Milliporelta) yön yli, pestiin kolme kertaa Tween-20 (0,1% PBS: ssä), ja inkuboidaan Dylight 800 anti-kani sekundääristä vasta-ainetta Li-Cor 1 h, kaikki huoneenlämpötilassa. Huuhtelun jälkeen Tween 20 (0,1% PBS: ssä), blotteja kuvaamisen kanssa Odyssey infrapuna Imaging System (Li-Cor).

Quantitative Kromatiini Immunosaostaminen (chip) Analysis

Solut tiheydellä ~3-5 x 10

6 per kuoppa 6-kuoppaisille levyille 18-24 tuntia ennen hoitoa, sitten huuhdeltiin kahdesti kylmällä PBS: llä ja kerättiin käsittelyn jälkeen [26]. Siru Määritys suoritettiin käyttäen modifioitua versiota aiemmin julkaistu menetelmä [27]. Solut suspendoitiin jääkylmään puskuri 1 (0,06 M KCL, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, 15 mM Tris-HCI, pH 7,4-7,6, 0,1 mM EGTA, 0,3 M sakkaroosia, 180 ug aprotiniinia, 5 mM natriumbutyraatilla, 0,1 mM PMSF, 0,5 mM DTT) ja puskuri 2 (0,8% NP40: tä + puskuri 1) 10 minuuttia jäillä. Solususpensiot lisättiin uusiin putkiin, jotka sisältävät Buffer 3 (0,06 M KCL, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, 15 mM Tris-HCI, pH 7,4-7,6, 0,1 mM EGTA, 1,2 M sakkaroosia, 180 ug aprotiniinia, 5 mM natriumbutyraatilla, 0,1 mM PMSF, 0,5 mM DTT). Sen jälkeen kun näytteet sentrifugoitiin, ytimet otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen MNase hajotuspuskuria (0,32 M sakkaroosi, 50 mM Tris-HCI, pH 7,4-7,6, 4 mM MgCI

2, 1 mM CaCl

2, 0,1 mM PMSF, 5 mM natriumbutyraattia), inkuboitiin 37 ° C: ssa vesihauteessa 6 min, ja 20 ui 0,5 M EGTA: ta lisättiin reaktion pysäyttämiseksi. Tällä tavalla kromatiinin pilkottiin keskimäärin DNA pituus 300-800 bp. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti sisälsi ensimmäisen liukenevan osa kromatiinin, S1. Pelletti suspendoitiin uudelleen dialyysipuskuria (1 mM Tris-HCI, pH 7,4-7,6, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 5 mM natriumbutyraattia), ne pantiin jäähän 1-2 h, ja sentrifugoitiin. Saatu pelletti oli toisen liukenevan kromatiinin osa, S2. Alikvootit kahdesta kromatiinin fraktiot (10-20 ug S1 ja 10-20 ug S2) sekoitettiin, tilavuus laimennettiin 1 ml: ksi ChIP inkubaatiopuskuria (Abcam), ja seos altistettiin immunosaostus spesifisillä vasta-aineilla, jossa kierto yön yli 4 ° C: ssa. Immunosaostettiin kromatiini uutettiin käyttäen proteiini-A Sepharose ja puhdistettiin käyttämällä DNA-puhdistava liete (Diagenode, Denville, NJ). Alikvootti kutakin immunosaostettiin DNA-templaatin (100-150 ng) käytettiin kvantitatiivista tosiaikaista PCR-analyysi käyttäen sekvenssi-spesifisiä geenin promoottori alukkeita (taulukko 2). PCR-monistettu immu- DNA signaali normalisoidaan PCR signaalin ei-immu- input DNA [28]. Saadut signaalit saostamalla kontrolli-IgG vähennettiin signaaleista, jotka on saatu spesifisten vasta-aineiden. Laskelmat perustuivat keskimäärin vähintään kolmen itsenäisen kokeen, ja tulokset ilmaistaan ​​prosenttiosuutena tulon (kuviot 3, 4, 5, S1, S2, S3, S4, S5).

Statistical analyysi

tilastollinen merkitys hoitoryhmien arvioitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Dunnettin posthoc analyysi vertailuun yksittäisten hoitoryhmän kontrolliin. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. Todennäköisyys (

p

) arvo on 0,05 tai vähemmän pidettiin kriteerinä merkittävä ero.

Tulokset

vaikutus PEITC Gene Expression in Human Cells

uudelleen kyseisen geenin ilmentymisen tulokset vastauksena PEITC hoitoja saatu edellisessä tutkimuksessa hiiren makrofagien [12], suoritimme määrityksen optimointeja käyttäen kolmea ihmisen solulinjoja: ihmisen monosyyttistä solulinjaa THP-1 ja ihmisen paksusuolen epiteelin solulinjoja HT-29 ja SW480. Optimointi mukana induktio parametrit tulehdusreaktio soluissa käsitelty LPS: llä tai LPS + IFNy ja erilaisia ​​ei-sytotoksisten PEITC pitoisuudet ja altistuksen kesto. Tietoja ei ollut kirjallisuudessa noin PEITC vaikutuksia SW480 ja THP-1-soluissa. Edellisessä tutkimuksessa [12], 21 LPS-indusoidun geenit tukahdutettiin kolminkertaiseksi tai enemmän 10 uM PEO (PEITC Essential Oil) verrattuna LPS aktivoinnin yksin RAW 264.7 hiiren makrofagisoluissa. (PEO on PEITC saatu

Barbarea verna

siemenet [15]. Sekä PEO ja kaupallisesti ostetut PEITC koostuvat 95% PEITC. Nykyisessä tutkimuksessa THP-1, HT-29, ja SW480 solut, olemme mukana kaksi geenejä, MMP7 ja MMP-9, yhteensä 23 lopullinen kiinnostavia geenejä (Indonesian). PEITC tukahdutetaan 9, 3, ja 13 niistä 23 geenien THP-1, HT-29, ja SW480-solut (taulukko 3). tulokset osoittivat myös, että SW480-solut olivat reagoivat IFNy-pohjustetaan LPS induktio kolmesta testatuilla solulinjoilla. 13 geenit alas-säädellä PEITC käsittely SW480-soluissa ovat keskeinen solun toimijoita tulehdus ja syöpä. Siksi kaikki myöhemmät geenin ilmentyminen suoritettiin kokeita näiden 13 geenin SW480-soluissa. 10 geeniä, jotka seulottiin, mutta eivät indusoi /ilmaistuna ihmisen solulinjoissa ei käsitellä enempää tässä käsikirjoituksen. sen jälkeen, kun geenin ilmentymisen analyysit muutokset histonimodifikaation (H3K27me3, H3K9me2, ja H3-Ac) on promoottorialueet kukin näistä 13 geenien tutkittiin. Havaitsimme ero H3-muutoksia suhteessa kontrolleihin vain kuusi näistä 13 geenejä, joita käsitellään yksityiskohtaisesti käsikirjoituksen. Kaikki 13 geenit, onko H3 muutoksia havaittiin niiden promoottorialueiden yhdessä PEITC altistumista, on lueteltu taulukossa 3.

vaikutus PEITC on Colon Cancer (SW480) Cell Proliferation

Useat valitut geenit havaittu moduloivan PEITC on SW480-soluissa säätelevät solujen lisääntymisen aikana karsinogeneesissä (taulukko 3). Siksi me tutkimme, PEITC ollut antagonistinen vaikutus kasvainsoluproliferaation todeten, että PEITC heikennettyjä elinkelpoisuuden SW480 solut ajasta ja pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio 1A). Mielenkiintoista on, että PEITC pitoisuudet ja valotusaikaa tarpeen pysäyttää syövän solujen jakaantumista ovat korkeampia ja kauemmin, vastaavasti, kuin tarvitaan aiheuttamaan muutokset kromatiinin kemian (kuviot 3, 4, 5, S1, S2, S3, S4, S5) ja geenien ilmaisu (kuviot 2, 6, S1, S2, S3, S4, S5). Jos konsentraatio on alle 80 uM, vähintään 24 h altistus oli tarpeen merkittävästi aiheuttaa syöpää solukuolemaa (kuvio 1). Useimpien jäljellä kokeissa (kuviot 2, 3, 4, ja 6), käytimme PEITC altistusta 5 h tai alle 15 uM. Kuvioissa 5 ja S1, S2, S3, S4, S5, 10 uM PEITC on käytetty eri ajankohtina SW480-soluissa jopa 18 h PEITC valotusaikaa. 10 uM pitoisuutena PEITC vaikuttanut merkittävästi solujen elinkelpoisuuden tai yli 24 tuntia (kuvio 1A), ja DNA-pirstoutuminen määritys (kuvio 1 B) paljasti, että antiproliferatiivinen vaikutuksia PEITC voi johtua apoptoottisiin ylössäätöä kuten myös osoituksena suurempi ekspressio kaspaasi 3 ja 8 (kuvio 1C). Puuttuminen merkittäviä muutoksia solusyklin proteiini CyclinD1 (CCND1) osoittaa, että PEITC ei suoraan inhiboi solusykliä (kuvio 1 C).

Modulation kemokiinien mukaan PEITC Human Colon Solut

Kemokiineillä on tärkeä rooli ylläpitämisessä tulehduksellisten prosessien paksusuolen. Tuotannon kemokiinien suolistossa perustetaan kemotaktinen kaltevuus, joka kykenee lisäämään muuttoa monosyyttien /makrofagien, granulosyyttien ja lymfosyyttien verenkiertoon läpi endoteelin läpi sekä limakalvon ja submucosa aikana krooninen tulehduksellinen suolistosairaus (IBD) [29]. Aiemmin, havaitsimme, että PEITC vähentää tulehdusta, ehtyminen pikarisoluja, ja tulehdussolujen hiiren limakalvon ja submukoosan [12]. Esillä olevassa tutkimuksessa, pitoisuudesta riippuvainen PEITC-välitteisen vaimennus mRNA-tasojen neljä proinflammatoristen kemokiinien /sytokiinien (CCL2, CSF2, CXCL10, ja IL8) havaittiin SW480-soluissa (taulukko 3, kuvio 2). Yksittäiset ChIP kokeita seuraavilla kemo- promoottorit paljasti hyper-trimethylation H3 lysiinin 27 (lisääntynyt H3K27me3 valtiot) ympäröivä promoottorialueiden IL8 ja CCL2 ja lisäksi laski asetylointi ympäröivä promoottorialueiden IL8 liittyy 10pM PEITC altistus (taulukot 3- 4, Kuviot 3A ja 4). Kuitenkin ajasta riippuva käänteinen korrelaatio havaittiin H3K27me3 (tukahduttavia merkki), mutta ei H3-Ac kanssa IL8 mRNA ekspressiotasot (taulukko 4, kuva S5). Kun kyseessä on CCL2, mRNA ja H3K27me3 valtioiden havaittiin vaihtelevan yhdessä, sulkee pois mahdollisen syy-yhteys (taulukko 4, kuva S4). Vaikka Polycomb tukahduttavaa kompleksin 2 (PRC2) -catalyzing H3K27 trimethylation on mukana sytokiinigeenin uudelleenohjelmointia vasteena tulehduksellisiin ärsykkeisiin [30], [31], näennäinen selektiivisyys PEITC yhteydessä histonimodifikaation ympäröivästä promoottorialueet kohdennettujen kemokiinien /sytokiinien saa meidät uskomaan, että PEITC ei todennäköisesti suoraan vaikuta PRC2.

PEITC Altistuminen häiritsee transkriptiotekijä Toiminta Human Colon Solut

NFκBs ja tilastot kaksi tärkeää perheiden transkriptiotekijät aktivoituvat vasteena erilaisille ärsykkeille säädellä useita soluprosesseja, mukaan lukien immuunivastetta ja karsinogeneesiin. NFκBs ja STAT on erilaiset sekä synergiavaikutukset alavirtavaikuttajainhibiittorit geenin induktion [32]. Rooli NFKB IBD [33] sekä vaikutus PEITC on NFKB toimintaa [34], [35], [36], [37] ovat hyvin tutkittu. Täällä havaitsimme PEITC välittämää alaspäin sääntelyä eri NFKB perheenjäsenten, nimittäin NFκB1, NFκBiα, ja REL proteiineja, jota ei ole aikaisemmin raportoitu SW480 soluja (taulukko 3, kuva 2). Kiehtovan, ajasta riippuva nousu H3K27me3 tilassa liittyi ajasta riippuva väheneminen NFκB1 ilmentymisen PEITC-altistetuissa soluissa, mikä viittaa mahdollisten epigeneettiset sääntelyn NFκB1 että ansioista tulevaisuudessa validointi (taulukko 4, kuviot 3A, S1).